專利名稱：液質聯用檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及液質譜聯用技術，具體來說，涉及液質聯用技術(UPLC-MQ檢測貝肉中腹瀉性貝毒。
背景技術：
在世界很多國家都爆發(fā)過有害的赤潮，海洋貝類可在體內富集赤潮藻毒素并通過食物鏈對人和動物產生危害。廣泛調查顯示，中國雙殼貝類已經受到了赤潮藻毒素的污染，其中腹瀉性貝毒(DSP)存在比較普遍。DSP是由有毒赤潮藻類鰭藻屬Dinophysis和原甲藻屬ftOrocentrum中部分藻種產生的一類脂溶性天然化合物，其主要成分為軟海綿酸 (okadaic acid, OA)及鰭藻毒素DTXl。0A、DTX1是腫瘤促進因子，具有遺傳毒性，可導致DNA 加合物的形成。如果貝肝臟內OA和DTXl的含量分別超過2 μ g/g和1. 8 μ g/g，就不宜食用。歐盟對OA、DTXl采用的食品安全限量標準分別是20μ g/100g、16y g/100g貝類鮮肉。 因此，建立快速、準確的DSP檢測技術對食品安全和赤潮監(jiān)測都具有十分重要的意義。常用的DSP檢測方法有小鼠生物法、ELISA、免疫金標、HPLC法等。生物法和免疫法不穩(wěn)定，常伴有假陽性、假陰性結果。0A、DTX1沒有紫外吸收，單純HPLC檢測樣品需經繁瑣的衍生過程，檢測時間長，誤差大。液-質聯用技術可確證分析藻類和貝類中的各種生物毒素，但對樣品前處理要求高，前處理繁瑣且耗時長是液質聯用檢測的缺陷。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于，克服現有液質聯用技術檢測DSP中的OA和 DTXl是樣品前處理復雜、耗時長的缺陷，應用超高效液相色譜四級桿飛行時間質譜(UPLC/ Q-T0FMS)快速檢測OA和DTX1，并將其用于市售海產貝類的檢測，以期為有毒赤潮研究和食品安全檢驗提供快捷、高效的檢測技術。本發(fā)明所要解決的技術問題在于，液質聯用快速檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法， 包括如下步驟(1)貝類樣品的制備將貝樣勻漿，加入75-85%甲醇水溶液，混勻振蕩后，4°C離心，上清液加入正己烷萃取后，合并甲醇相，加入含乙酸的水，用三氯甲烷重復萃取，最后通入N2蒸干去掉有機相；殘渣用甲醇再溶解定容，高速離心或過濾膜，待UPLC/MS檢測；(2)UPLC/Q-T0FMS分析ESI_模式，選擇離子化后的0A、DTX1的分子離子[Μ_Η]_作為前體離子進行TOFMS掃描、測定；①色譜條件超高效液相色譜儀UPLC Acquity BEH色譜柱2. ImmX 100mm，1. 7μπι ；流動相Α相為含甲酸的水，B相為含甲酸的乙腈；
梯度洗脫采用A B從Omin的85 15到25min的1 99 ；、流速0. 2 0. 5mL/min ；柱溫35 40°C;進樣量20yL;②質譜條件離子源ESI_電離源，噴霧電壓2 2. 6kV，霧化氣流量500 800L/h，去溶劑溫度300 350°C，離子源溫度100 150°C，碰撞能量3 4eV ；掃描時間0. 3s，掃描間隔時間0. 02s，掃描范圍m/z 50-1500 ；選取亮氨酸腦啡呔用于外標校正。(3)0A和DTXl標準曲線的制作，求出回歸方程和相關系數，結果顯示0A和DTXl 的標準曲線分別為 y = 0. 2504x-0. 978，R2 = 0. 999 ；y = 0. 2417χ_0· 557，R2 = 0. 998，其中，χ為峰面積，y為濃度，根據標準曲線以確定被檢查貝類中OA和DTXl的含量。為了使實驗數據更加精確，所述的步驟還包括回收率實驗。優(yōu)選地，所述的步驟(1)貝類樣品的制備中，將貝樣勻漿，加入75-85%甲醇水溶液，漩渦混勻l_3min，超聲振蕩l-;3min，5000r/min，4°C離心5min ；上清液加入正己烷，漩渦混勻，靜置分層棄去上層正己烷，合并甲醇相，加入含0. 2 %乙酸的水，用三氯甲烷重復提取，合并下層的三氯甲烷相，用旋轉蒸發(fā)儀通入N2蒸干去掉有機相；殘渣用甲醇再溶解定容，高速離心10000r/min，lOmin，待UPLC/MS檢測。優(yōu)選地，所述的步驟(1)中，殘渣用甲醇再溶解后定容，過濾膜；待UPLC/MS檢測。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1、應用范圍廣。赤潮爆發(fā)季節(jié)貝類中的腹瀉性貝毒(DSP)的存在比較普遍，不論是保障食品安全還是赤潮監(jiān)測都需要針對DSP的快速、準確的檢測方法。因此本研究具有重要應用價值。2、液-質聯用可準確分析藻類、貝類中的生物毒素，及時有效地監(jiān)測毒素的污染情況。應用UPLC/Q-TOFMS檢測DSP中的OA和DTXl有如下優(yōu)勢與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC 的速度、靈敏度要高數倍。Q-TOF MS兼具高靈敏度、高分辨率的特點，可以在極低的濃度下作全譜掃描、提供精確質量，能對微量腹瀉性貝毒OA、DTXl進行鑒別和測定。3、樣本預處理快，相對于傳統(tǒng)的液質聯用檢測，單個樣本預處理時間節(jié)省0. 5-lh。 經比較選擇貝肉樣，提取流程經簡化，再比消化腺樣本節(jié)省提取時間約lh。4、儀器自動進樣，適于大批量生物樣品的篩查。5、UPLC/Q-TOFMS可以對樣本中的其它未知毒素進行鑒定。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合實施例對本發(fā)明作進一步闡述。
在液質聯用快速檢測貝肉中腹瀉性貝毒的應用中，首先根據實施示例中樣本快速前處理流程提取DSP，研究UPLC/Q-T0FMS對DSP粗體液的分析檢測效果；針對貝肌肉樣和消化腺樣，再研究比較堿水解處理對染毒文蛤消化腺樣本和肌肉樣本中OA和DTXl含量的影響。結果表明，UPLC/Q-T0FMS能檢測分析快速提取樣本中的DSP，堿水解后染毒文蛤消化腺中OA和DTXl的含量相對于水解前劇烈增加，肌肉中毒素含量略有增加。鑒于水解過程耗時長(約Ih/樣本)，為簡化預處理，決定選擇肌肉樣本，不經水解，可實現貝樣的快速前處理。實施例1.稱取2g已勻漿人工投喂染毒的文蛤肌肉樣品于IOml離心管中，加入3mL 80% 甲醇水溶液。漩渦混勻lmin，超聲振蕩lmin，4°C離心(5000r/min，5min)。上清液移入另一干凈離心管，殘渣再按上述方法提取一次。合并上清液，加入5mL正己烷，漩渦混勻，靜置分層棄去上層正己烷，重復一次，合并甲醇相，加入Iml水(含0. 2 %乙酸)，用6ml三氯甲烷重復提取兩次，合并下層的三氯甲烷相，用旋轉蒸發(fā)儀通入隊蒸干去掉有機相，殘渣用HPLC 級甲醇再溶解，并定容至Iml (相當與2g肌肉/ml)。高速離心(lOOOOr/min，IOmin)或過 0. 22 μ m濾膜，待UPLC/MS檢測。2. UPLC/Q-T0FMS分析電噴霧負離子模式，選擇離子化后的OA、DTXl的分子離子[M-H]-作為前體離子進行TOFMS掃描、測定。色譜條件UPLC Acquity BEH色譜柱 (2. ImmXlOOmm, 1. 7 μ m)；流動相A相為含0. 1 %甲酸的水，B相為含0. 1 %甲酸的乙腈；流速0. 4mL/min ； 采用A B從Omin(85 15)到25min(l 99)的梯度程序洗脫；柱溫40°C，自動進樣量 20 μ L0質譜條件超高效液相色譜儀UPLC Acquity BEH, ESI電離源，負離子方式檢測時噴霧電壓為2. 6kV，霧化氣流量700L/h，去溶劑溫度350°C，離子源溫度100°C。碰撞能量為 4eV。掃描時間0.3s，掃描間隔時間0. 0k。掃描范圍m/z 50-1500。選取200mg/L亮氨酸腦啡呔用于外標(Lock Spray)校正，流速0. 05mL/min。3.標準曲線的制備分別取OA和DTXl標準母液，用無毒文蛤肌肉樣的基體加標配成 0. 01,0. 02,0. 05,0. 10,0. 20,0. 50 μ g/mL 的 OA 禾口 DTXl 標準溶液系列。以 LC-MS 測得的提取離子的峰面積為橫坐標，相應的濃度為縱坐標，作標準曲線，求出回歸方程和相關系數。結果表明，OA和DTXl的標準曲線分別為y = 0. 2504χ-0. 978，R2 = 0. 999 ；y = 0. 2417x-0. 557，R2 = 0. 998 (χ 為峰面積，y 為濃度)。4.回收率實驗精密稱取無毒的貝肌肉樣品2g，定量加入標準品，使添加量相當于0. 2 μ g/g、0. 4 μ g/g、0. 8 μ g/g，測定加樣回收率?；厥章?樣品實測濃度/樣品理論濃度X 100%。結果OA的回收率為101. 58% -107. 14%，平均回收率103. 51%,DTXl的回收率為98. 06% -103. 93%，平均回收率100. 20%。對OA和DTXl基體加標溶液(0. 2 μ g/g) 進行6次重復進樣分析，測得峰面積，分別計算其相對標準偏差(RSD)。OA和DTXl的RSD 分別為4. 30%,4. 00%。相對標準偏差均在5%以內，符合定量分析的要求。根據信噪比S/ N = 10，計算最低定量限濃度。當OA、DTXl濃度達2 μ g/L時，20 μ L上樣，此時OA和DTXl 基體加標樣品的檢出限均為40pg(相當于2X 10_3μ g/100g貝類鮮肉)，遠低于人們對0A、 DTXl的控制標準(EU/SANC0，2001 20 μ g/100g, 16 μ g/100g貝類鮮肉)，能夠滿足食品安全檢測需要。 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。
權利要求
1.液質聯用快速檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法，包括如下步驟(1)貝類樣品的制備將貝樣勻漿，加入75-85%甲醇水溶液，混勻振蕩后，4°C離心，上清液加入正己烷萃取后，合并甲醇相，加入含乙酸的水，用三氯甲烷重復萃取，最后通入N2 蒸干去掉有機相；殘渣用甲醇再溶解定容，高速離心或過濾膜，待UPLC/MS檢測；(2)UPLC/Q-T0FMS分析ESI_模式，選擇離子化后的OA、DTXl的分子離子[M_H]_作為前體離子進行TOFMS掃描、測定；(3)OA和DTXl標準曲線的制作，求出回歸方程和相關系數，結果顯示0A和DTXl的標準曲線分別為 y = 0. 2504x-0. 978，R2 = 0. 999 ；y = 0. 2417χ_0· 557，R2 = 0. 998，其中，χ 為峰面積，y為濃度，根據標準曲線以確定被檢查貝類中OA和DTXl的含量。
2.如權利要求1所述的液質聯用檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟O)的色譜條件為超高效液相色譜儀UPLC Acquity BEH色譜柱2. ImmX 100mm, 1. 7 μ m ；流動相A相為含甲酸的水，B相為含甲酸的乙腈；梯度洗脫采用A B從Omin的85 15到25min的1 99 ；流速0. 2 0. 5mL/min ；柱溫35 40°C。
3.如權利要求1所述的液質聯用檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟O)的質譜條件為離子源ESI-電離源， 噴霧電壓2 2. 6kV, 霧化氣流量500 800L/h， 去溶劑溫度300 350°C， 離子源溫度100 150°C， 碰撞能量3 ^V。
4.如權利要求3所述的液質聯用檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟O)的質譜條件中，掃描時間0.3s，掃描間隔時間0. 02s，掃描范圍m/z 50-1500 ；選取亮氨酸腦啡呔用于外標校正。
5.如權利要求1所述的液質聯用檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟(2)UPLC/Q-T0FMS分析的色譜條件，其中，A相為含0. 1 %甲酸的水，B相為含0. 甲酸的乙腈。
6.如權利要求1所述的液質聯用檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟(2)UPLC/Q-T0FMS分析的色譜條件，其中，流速為0. 4mL/min ；柱溫40°C，自動進樣量 20 μ L0
7.如權利要求1所述的液質聯用檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟O)UPLC/Q-T0FMS分析的質譜條件，其中，負離子方式檢測時噴霧電壓為2. 6kV，霧化氣流量700L/h，去溶劑溫度350°C，離子源溫度100°C ；碰撞能量為如V。
8.如權利要求1所述的液質聯用檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述的步驟(1)貝類樣品的制備中，將貝樣勻漿，加入75-85%甲醇水溶液，混勻l-3min，振蕩 l-3min，離心；上清液加入正己烷，漩渦混勻，靜置分層棄去上層正己烷，合并甲醇相，加入酸性水，用三氯甲烷重復提取，合并下層的三氯甲烷相，用旋轉蒸發(fā)儀通入隊蒸干去掉有機相；所述高速離心轉速為10000r/min，時間為lOmin。
9.如權利要求7所述的液質聯用檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中，殘渣用甲醇再溶解后定容，過濾膜；待UPLC/MS檢測。
10.如權利要求1所述的液質聯用檢測貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述的步驟還包括回收率實驗。
全文摘要
針對現有液質聯用技術檢測DSP存在樣品前處理復雜、工作量大、成本高、耗時多的問題。研究了貝樣中DSP的快速提取流程，應用液質聯用技術中的UPLC/Q-TOFMS檢測，并將其用于市售海產貝類的實際檢測，以期為有毒赤潮研究和食品安全檢驗提供高效、準確的檢測技術。
文檔編號G01N30/06GK102213702SQ201110129800
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權日2011年5月18日
發(fā)明者何培民, 馮子慧, 唐晨, 汪卿, 胡樂琴, 賈睿, 饒濤 申請人:上海海洋大學