專利名稱：用延遲熒光光譜檢測(cè)作物逆境生理與抗逆性鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及光譜測(cè)試，尤其涉及一種用延遲熒光光譜檢測(cè)作物逆境生理及抗逆性 鑒定的方法。
背景技術(shù)：
影響植物生長(zhǎng)發(fā)育及農(nóng)作物產(chǎn)量的逆境脅迫有很多，例如干旱、水澇、冷脅、熱脅、 凍脅、鹽脅、輻射、水污染、土壤污染、大氣污染、農(nóng)藥、病蟲害等。開展植物尤其是農(nóng)作物逆 境生理檢測(cè)及抗逆性鑒定技術(shù)的研究，對(duì)于準(zhǔn)確判斷作物的抗性大小，快速篩選抗性新品 種，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)作物品種改良，保障農(nóng)作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，確保農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論意 義和應(yīng)用價(jià)值。目前在植物逆境生理檢測(cè)中應(yīng)用得較廣泛的主要有兩種方法，一種為檢測(cè) 光合能力大小的紅外線氣體分析法，另一種為檢測(cè)熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線參數(shù)的葉綠素?zé)晒?分析法。除此而外，還有一些傳統(tǒng)的逆境生理檢測(cè)及抗性鑒定的理化分析方法。紅外線氣 體分析法是利用二氧化碳對(duì)紅外線的吸收率檢測(cè)紅外光能量的被吸收量的多少來實(shí)現(xiàn)逆 境脅迫下光合能力檢測(cè)的方法，由于其檢測(cè)方法的特殊性，存在受外界環(huán)境因素影響大、測(cè) 量時(shí)間長(zhǎng)等問題。而葉綠素?zé)晒夥治龇ㄊ抢眉す庹T發(fā)熒光技術(shù)進(jìn)行逆境下熒光參數(shù)檢測(cè) 及分析的方法，雖然是現(xiàn)今用得最多的逆境生理檢測(cè)法，但存在著信號(hào)微弱、參數(shù)混雜、參 數(shù)波動(dòng)性較大(熒光參數(shù)易受外界環(huán)境與植物自身生理狀況等因素的影響)等問題。傳統(tǒng) 的理化分析方法也存在著實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、工作量大、靈敏度不高等缺點(diǎn)?？梢姡?現(xiàn)有的進(jìn)行植物逆境生理檢測(cè)及抗逆性鑒定的方法都有著各自不同的缺點(diǎn)，因此在實(shí)際應(yīng) 用中存在一些問題，不利于在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣和普及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種操作簡(jiǎn)單、可控性 好、受外界環(huán)境因素影響小，可以準(zhǔn)確偵斷作物逆境脅迫損傷程度及抗逆性大小的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種用延遲熒光光譜檢測(cè)作物逆境生理與抗逆性鑒定的方法，其特征在于包括下 述步驟1. 1選擇生長(zhǎng)狀態(tài)相似的作物和/或該作物葉片不同生長(zhǎng)部位的若干組葉片，一 般為5 10組，每組選擇5 8片相似的葉片進(jìn)行逆境生理檢測(cè)與抗逆性鑒定的樣品；1. 2將整株作物和/或樣品進(jìn)行逆境脅迫處理；所述逆境脅迫系指對(duì)作物和/或 樣品創(chuàng)造的諸如干旱、水澇、冷脅、熱脅、凍脅、鹽脅、輻射、水污染、土壤污染、大氣污染等環(huán) 境因子；1. 3在室溫下測(cè)量作物葉片的延遲熒光發(fā)射光譜，其工藝過程為1. 3. 1將作物葉片置于室溫下具有磷光或延遲熒光檢測(cè)功能的熒光光譜儀的樣品 室中暗適應(yīng)30min ；1. 3. 2光譜的激發(fā)光源選擇波長(zhǎng)為藍(lán)光470 500nm與紅光650 680nm范圍，強(qiáng)度為 0 2500 μ mol · m2 · s-1；1. 3. 3激發(fā)光源均勻輻照葉片的時(shí)間為0 1min ；1. 3. 4停止激發(fā)到采集葉片延遲熒光光譜的間隔時(shí)間為0. 01 Is ；1. 3. 5延遲熒光光譜采集的接收波長(zhǎng)范圍為185 900nm，放大增益為IXlO8 ；1. 4對(duì)逆境脅迫條件下作物葉片的延遲熒光發(fā)射光譜進(jìn)行分析，采用商用化 ORIGIN軟件對(duì)所述光譜儀輸出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找發(fā)射光譜特征峰685nm和730nm附近 的最高峰值，分別記錄為F685與F730，由此計(jì)算得到F730/F685 ；1. 5測(cè)量作物在不同逆境脅迫下的延遲熒光發(fā)射光譜峰值比F730/F685的值；1. 6將健康生長(zhǎng)條件下作物的F730/F685值記錄為最適宜比值F。p，逆境脅迫生理 條件下的F730/F685值記錄為Fsteess ；1. 7比較F。p與Fstress的差異，對(duì)作物遭受逆境脅迫后光合功能的損傷狀況進(jìn)行判 斷；1. 8比較不同作物在相同逆境脅迫下F。p與Fstress的差異，即可對(duì)不同作物的抗逆 性大小進(jìn)行鑒定。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，植物葉片的延遲熒光發(fā)射光譜能有效地反映出逆境脅迫下 植物光合功能受到傷害的程度以及抗逆性的大??；在不同的脅迫環(huán)境下，延遲熒光發(fā)射光 譜發(fā)生明顯改變，尤其是685nm與730nm附近的特征峰的最大峰值F685與F730 ；兩個(gè)最 大峰值的比值F730/F685隨脅迫情況的變化更為顯著，且與凈光合速率及葉綠素?zé)晒鈪?shù) Fv/Fm有很好的正相關(guān)性；植物的凈光合速率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm與植物生長(zhǎng)發(fā)育的 環(huán)境有直接關(guān)系，是逆境脅迫下植物生理檢測(cè)的有效表征?？偟膩碚f當(dāng)植物生長(zhǎng)在脅迫環(huán) 境中時(shí)，葉片的凈光合速率和Fv/Fm要比最適宜生長(zhǎng)環(huán)境中對(duì)應(yīng)的值要低，且隨著脅迫的 加深，降低的程度加劇，相應(yīng)地，葉片的延遲熒光發(fā)射光譜特征峰值比F730/F685也隨之降 低，其下降程度可以有效反應(yīng)作物遭受逆境脅迫傷害的程度，通過分析不同作物在相同逆 境脅迫下特征峰值比F730/F685的變化差異，從而可以判定作物的抗逆性大小。室溫下延遲熒光發(fā)射光譜的685nm附近特征峰被公認(rèn)為來自于光系統(tǒng)II，而 730nm附近的特征峰被認(rèn)為是光系統(tǒng)I與II共同貢獻(xiàn)的結(jié)果，因此特征峰值比F730/F685 是植物葉片兩大光系統(tǒng)光合效能的直觀體現(xiàn)。它取決于植物的類型、生長(zhǎng)發(fā)育狀況、體內(nèi)與 體外環(huán)境狀況。在一致的測(cè)量條件(如激發(fā)波長(zhǎng)、激發(fā)時(shí)間、激發(fā)光強(qiáng)度、測(cè)量時(shí)間長(zhǎng)度、暗 室內(nèi)溫度)下，通過檢測(cè)同品種、同生長(zhǎng)發(fā)育狀況的植物葉片在不同脅迫環(huán)境下的延遲熒 光發(fā)射光譜，計(jì)算其特征峰值比F730/F685，與健康環(huán)境下特征峰值比進(jìn)行比較，可以準(zhǔn)確 而有效地反應(yīng)出植物的逆境生理狀況及損傷程度，并可進(jìn)行植物抗逆性大小的鑒定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)由于植物的光合作用被認(rèn)為是對(duì)逆境脅迫最敏感的生理過程，因此通過光合 作用或光合器官活性的檢測(cè)是判定植物逆境生理的一個(gè)有效方法。在植物體內(nèi)的兩大光合 作用系統(tǒng)(光系統(tǒng)I與光系統(tǒng)II)遭受不同的逆境脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，引起發(fā)射光 譜發(fā)生改變，尤其是延遲熒光光譜中來自于光系統(tǒng)II的685nm譜峰與光系統(tǒng)I(PSI)與光 系統(tǒng)II (PSII)共同作用產(chǎn)生的730nm譜峰的峰值強(qiáng)度發(fā)生了明顯的變化，從而導(dǎo)致特征峰 值比F730/F685隨著逆境脅迫的影響升高或降低。所以本發(fā)明方法通過測(cè)量植物延遲熒光 光譜特征峰值比F730/F685來檢測(cè)逆境脅迫的損傷程度以及進(jìn)行抗逆性鑒定具有直觀、簡(jiǎn)單、有效的特點(diǎn)。(2)本發(fā)明方法是從檢測(cè)植物受激后發(fā)出延遲熒光的光譜變化尤其是特征峰值比 變化的角度進(jìn)行光合功能強(qiáng)弱的分析，是對(duì)植物體內(nèi)光合能力大小的一種判斷，這就避免 了傳統(tǒng)方法易受外界環(huán)境干擾，參數(shù)波動(dòng)性大等缺點(diǎn)。另一方面，對(duì)植物進(jìn)行的光誘導(dǎo)是由 暗室內(nèi)的激發(fā)光源產(chǎn)生，激發(fā)光源的強(qiáng)度可以調(diào)節(jié)，激發(fā)波長(zhǎng)可以選擇，且是在停止激發(fā)后 才進(jìn)行延遲熒光光譜信息的采集，因此，本發(fā)明方法具有不受外界環(huán)境干擾、穩(wěn)定、可控性 好、高信噪比、快速等優(yōu)點(diǎn)。(3)本用延遲熒光光譜檢測(cè)作物逆境生理及抗逆性鑒定的方法操作過程簡(jiǎn)單、容 易實(shí)現(xiàn)、參數(shù)直觀。


本發(fā)明有附圖4幅，其中圖1為本發(fā)明的實(shí)施流程圖。圖2為利用本發(fā)明實(shí)現(xiàn)大豆與玉米樣品在不同溫度脅迫下的F730/F685值的統(tǒng)計(jì)表。圖3為利用本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)溫度脅迫下大豆作物光合功能損傷判斷及抗逆性鑒定。圖4為利用本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)溫度脅迫下玉米作物光合功能損傷判斷及抗逆性鑒定。
具體實(shí)施例方式如圖1所示，一種用延遲熒光光譜檢測(cè)作物逆境生理與抗逆性鑒定的方法，包括 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)相似的作物和/或該作物不同部位的若干組葉片作為進(jìn)行逆境生理檢測(cè)與 抗逆性鑒定的樣品和將整株作物或葉片進(jìn)行逆境脅迫處理的步驟，其特征在于還包括下述 步驟(1. 1)測(cè)量作物在不同逆境脅迫下的延遲熒光發(fā)射光譜峰值比F730/F685的值；(1. 2)比較健康生長(zhǎng)條件與逆境脅迫條件下作物的F730/F685，對(duì)作物遭受逆境 脅迫后光合功能的損傷狀況進(jìn)行判斷；(1. 3)通過對(duì)不同作物相同逆境脅迫后F730/F685的變化差異，判斷作物的抗逆
性大小。下面結(jié)合附圖，對(duì)其工藝過程進(jìn)行具體描述圖1為本發(fā)明方法檢測(cè)作物逆境生理與抗逆性鑒定的流程圖。根據(jù)圖1，先對(duì)需要 鑒定的作物進(jìn)行選取，目的在于對(duì)作物進(jìn)行相似生長(zhǎng)狀態(tài)的逆境生理檢測(cè)及抗逆性評(píng)價(jià)， 以保證鑒定結(jié)果的合理性；對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)相似的多株作物分別進(jìn)行健康生長(zhǎng)條件培養(yǎng)與逆境 (高溫、低溫、鹽、大氣污染、紫外輻射等)脅迫處理；將健康的或處理后的作物葉片置于具 有延遲熒光光譜檢測(cè)功能的光譜儀中進(jìn)行延遲熒光發(fā)射光譜采集；對(duì)延遲熒光發(fā)射光譜數(shù) 據(jù)用商用化ORIGIN軟件進(jìn)行特征峰值F685與F730的提??；計(jì)算特征峰值比F730/F685 ； 記作物在健康生理下的F730/F685為F。p，逆境生理下F730/F685的為Fsteess ；比較不同逆境 脅迫下同一作物的Fstass與F。p的差異，即可對(duì)作物在相應(yīng)逆境下光合功能的受損程度進(jìn)行檢測(cè)分析；比較不同作物在相同逆境脅迫下Fstress與F。p的差異，即可對(duì)不同作物的抗逆性 大小進(jìn)行判斷鑒定。實(shí)施例1本實(shí)施例旨在對(duì)一種大豆品種和一種玉米品種在高溫和低溫脅迫下光合生理的 受損程度進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)這兩個(gè)品種的抗逆性大小進(jìn)行判斷。實(shí)驗(yàn)選擇京黃大豆品種(苗 期)與晉單36號(hào)玉米品種(苗期)，選取8組不同生長(zhǎng)部位，每組5片相似生長(zhǎng)狀態(tài)的葉片 為樣品。溫度的處理范圍為5 50°C，溫度處理間隔為5°C。測(cè)量時(shí)，將活體作物置于設(shè)置 好脅迫溫度(5 50V )的植物培養(yǎng)箱中適應(yīng)2小時(shí)，植物培養(yǎng)箱保持自然光照，濕度保持 在75%。經(jīng)不同溫度處理后再將葉片置于具有磷光檢測(cè)功能的商用化熒光-磷光光譜儀 LS55的暗室內(nèi)暗適應(yīng)10分鐘(暗室內(nèi)溫度為室溫25°C )，用波長(zhǎng)為660nm的激發(fā)光源對(duì) 葉片進(jìn)行光激發(fā)0. ^，延遲0. ^，接收延遲熒光光譜信號(hào)。將延遲熒光發(fā)射光譜數(shù)據(jù)傳給 PC機(jī)，用商用化軟件ORIGIN進(jìn)行發(fā)射光譜分析，尋找發(fā)射光譜的685nm和730nm附近的兩 個(gè)特征峰值值F685與F730，并計(jì)算F730/F685。分析數(shù)據(jù)時(shí)，計(jì)算玉米或大豆樣品8組各 5片共40片葉片的延遲熒光發(fā)射光譜F730/F685的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以平均值作為F730/ F685的數(shù)據(jù)點(diǎn)，而標(biāo)準(zhǔn)差作為數(shù)據(jù)的偏差，兩種實(shí)驗(yàn)樣品的F730/F685值與溫度的變化如 統(tǒng)計(jì)表附圖2和變化曲線圖3，圖4所示。對(duì)圖2及圖3的進(jìn)一步分析可知京黃大豆樣品的最適宜生長(zhǎng)溫度為25°C，F(xiàn)730/ F685為0. 67476，記為該作物的F。p。在大豆植株適宜的生長(zhǎng)溫度20 30°C范圍內(nèi)，20°C 時(shí)F730/F685值5優(yōu)是0. 65062，降低為Fop的96. 4%。相應(yīng)地，當(dāng)溫度為15°C時(shí)F15o降低 為F。p的92. 4%，表現(xiàn)出顯著的低溫?fù)p傷(*)，當(dāng)溫度低于15°C，10°C時(shí)的Fltrc降低為F。p的 呂^^，^降低為？㈤的？？^^，可見，樣品出現(xiàn)了極顯著低溫?fù)p傷(**)。高溫情況也有類 似的規(guī)律，相較于最適宜生長(zhǎng)溫度，30°C時(shí)的F3trc降低為F。p的97. 9%，F(xiàn)35O降低為96. 0%, 當(dāng)溫度為40°C，相應(yīng)的F4crc降低為91.8%，表現(xiàn)出顯著的高溫?fù)p傷(+)，超過40°C，樣品表 現(xiàn)出極顯著高溫?fù)p傷(++)，F(xiàn)45o降低為F。p的85. 3%，F(xiàn)5crc降低為F。p的76. 7%。由此可以判斷20 35°C是該大豆樣品的適宜生長(zhǎng)溫度范圍，最適宜溫度為 25°C，在最適宜生長(zhǎng)溫度處延遲熒光光譜峰值比F730/F685比值最高記為F。p ；當(dāng)溫度低于 20°C時(shí)該大豆樣品表現(xiàn)出明顯的低溫逆境傷害，當(dāng)溫度高于35°C時(shí)該大豆樣品表現(xiàn)出明顯 的高溫逆境傷害；隨著逆境傷害的加劇，延遲熒光光譜峰值比F730/F685比值顯著下降。對(duì)圖2及圖4的進(jìn)一步分析可知晉單36號(hào)玉米樣品的最適宜生長(zhǎng)溫度為35°C， F730/F685為0. 601，記為該作物的F。p。在玉米植株適宜的生長(zhǎng)溫度25 40°C范圍內(nèi)，F(xiàn)4crc 為F。p的98. 3%，F(xiàn)3trc* F。p的98. 1%，F(xiàn)25o降低為F。p的93. 2%。當(dāng)溫度為20°C時(shí)，相應(yīng) 的F2trc降低為F。p的80. 5%，可見，相較于最適宜生長(zhǎng)溫度情況，20°C時(shí)作物表現(xiàn)出顯著的 低溫?fù)p傷㈩。當(dāng)溫度低于20°C, F15o降低為20°C的71. 0%, Fltrc降低為65. 6%, Frc降低 為61.8%，可見，在5 20°C的低溫逆境下，樣品出現(xiàn)了極顯著低溫?fù)p傷(**)。高溫情況 也有類似的規(guī)律，相較于最適宜生長(zhǎng)溫度，F(xiàn)45o降低為F。p的91. 8%，表現(xiàn)出顯著的高溫?fù)p傷 ⑴，F(xiàn)5crc降低為88. 3%，樣品表現(xiàn)出極顯著高溫?fù)p傷(++)。由此可以判斷25 40°C是該玉米樣品的適宜生長(zhǎng)溫度范圍，最適宜溫度為 35°C，在最適宜生長(zhǎng)溫度處延遲熒光光譜峰值比F730/F685比值最高，記為F。p ；當(dāng)溫度低于 25°C時(shí)該玉米樣品表現(xiàn)出明顯的低溫逆境傷害；當(dāng)溫度高于40°C時(shí)該玉米樣品表現(xiàn)出明顯的高溫逆境傷害；隨著逆境傷害的加劇，延遲熒光光譜峰值比F730/F685比值顯著下降。
綜合對(duì)大豆與玉米樣品的溫度脅迫光合損傷檢測(cè)結(jié)果的分析，可明顯發(fā)現(xiàn)大 豆實(shí)驗(yàn)樣品的最適宜生長(zhǎng)溫度低于玉米實(shí)驗(yàn)樣品；大豆樣品出現(xiàn)顯著低溫傷害的溫度 (15°C )高于玉米樣品(20°C )；大豆樣品出現(xiàn)顯著高溫傷害的溫度(40°C )低于玉米樣品 (45°C )；大豆樣品抗高溫脅迫的能力低于玉米樣品；大豆樣品抗低溫脅迫的能力高于大豆 樣品。
權(quán)利要求
1. 一種用延遲熒光光譜檢測(cè)作物逆境生理與抗逆性鑒定的方法，其特征在于包括下述 幾個(gè)步驟1.1選擇生長(zhǎng)狀態(tài)相似的作物和/或該作物葉片不同生長(zhǎng)部位的若干組葉片，一般為 5 10組，每組選擇5 8片相似的葉片進(jìn)行逆境生理檢測(cè)與抗逆性鑒定的樣品；1. 2將整株作物和/或樣品進(jìn)行逆境脅迫處理；所述逆境脅迫系指對(duì)作物和/或樣品 創(chuàng)造的諸如干旱、水澇、冷脅、熱脅、凍脅、鹽脅、輻射、水污染、土壤污染、大氣污染等環(huán)境因 子；1. 3在室溫下測(cè)量作物葉片的延遲熒光發(fā)射光譜，其工藝過程為 1. 3. 1將作物葉片置于室溫下具有磷光或延遲熒光檢測(cè)功能的熒光光譜儀的樣品室中 暗適應(yīng)30min ；1. 3. 2光譜的激發(fā)光源選擇波長(zhǎng)為藍(lán)光470 500nm與紅光650 680nm范圍，強(qiáng)度為 0 2500 μ mo 1 · πΓ2 · ；1. 3. 3激發(fā)光源均勻輻照葉片的時(shí)間為0 Imin ； 1. 3. 4停止激發(fā)到采集葉片延遲熒光光譜的間隔時(shí)間為0. 01 Is ； 1. 3. 5延遲熒光光譜采集的接收波長(zhǎng)范圍為185 900nm，放大增益為IX IO8 ； 1. 4對(duì)逆境脅迫條件下作物葉片的延遲熒光發(fā)射光譜進(jìn)行分析，采用商用化ORIGIN軟 件對(duì)所述光譜儀輸出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找發(fā)射光譜特征峰685nm和730nm附近的最高峰 值，分別記錄為F685與F730，由此計(jì)算得到F730/F685 ；1. 5測(cè)量作物在不同逆境脅迫下的延遲熒光發(fā)射光譜峰值比F730/F685的值； 1. 6將健康生長(zhǎng)條件下作物的F730/F685值記錄為最適宜比值F。p，逆境脅迫生理?xiàng)l件 下的F730/F685值記錄為Fsteess ；1. 7比較F。p與Fstress的差異，對(duì)作物遭受逆境脅迫后光合功能的損傷狀況進(jìn)行判斷； 1. 8比較不同作物在相同逆境脅迫下F。p與Fstass的差異，即可對(duì)不同作物的抗逆性大 小進(jìn)行鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用延遲熒光光譜檢測(cè)作物逆境生理與抗逆性鑒定的方法，包括選擇生長(zhǎng)狀態(tài)相似的作物不同部位的若干組葉片作為進(jìn)行逆境生理檢測(cè)與抗逆性鑒定的樣品和將整體操作物或葉片樣品進(jìn)行逆境脅迫處理的步驟，其特征在于還包括檢測(cè)逆境脅迫下活體作物葉片光誘導(dǎo)延遲熒光發(fā)射光譜特征峰值比F730/F685，來反映逆境脅迫下作物生理變化情況，結(jié)合最適生長(zhǎng)環(huán)境下作物的峰值比F730/F685特性，由此判斷出作物逆境脅迫損傷狀況及抗逆性大小。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、可控性好、受外界環(huán)境因素影響小，可以準(zhǔn)確偵斷作物溫度脅迫損傷程度及抗逆性的大小。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102147367SQ20101061368
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者李瑛 , 董麗麗, 許文海 申請(qǐng)人:大連海事大學(xué)