專利名稱：：全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法及其分析儀器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種醫(yī)療檢測儀器類血細胞分析方法及儀器，特別涉及一種全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法及其分析儀器。
背景技術(shù)：
：1、歷史回顧血細胞分析儀，也稱血細胞計數(shù)儀，是對血液中各種組成細胞進行計數(shù)和分類分析的最常用的重要臨床檢驗儀器的一種。1852年就有人試圖對紅細胞計數(shù)，1855年出現(xiàn)了用于血細胞計數(shù)的方法。這種用顯微鏡人工鏡檢的方法既費時又費力，需專業(yè)訓(xùn)練的操作人員，在大批量標本檢查時難以及時給出報告，并存在人為計數(shù)誤差。1949年，美國人瓦萊思·庫爾特(WallaceH.Coulter)順利地在美國提交了發(fā)明專利，并在1953年獲得了此項專利USPatent2656508“MEANSFORCOUNTINGPARTICLESSUSPENDEDINFLUID"(〃懸浮在液體中粒子的計數(shù)方法〃)。同年，庫爾特送交了兩臺庫爾特血細胞計數(shù)儀原型給(美國)全國衛(wèi)生研究所NationalInstitutesofHealth(NIH)作鑒定。NIH不久就在發(fā)布的兩篇關(guān)鍵性文章中，肯定了血細胞計數(shù)的庫爾特方法的準確性和便利性。也是在同年，庫爾特在美國全美電工大會(NationalElectronicsConference)上發(fā)表了他一生中唯一的技術(shù)論文《高速自動化血細胞計數(shù)和細胞大小分析儀》(“HighSpeedAutomaticBloodCellCounterandCellSizeAnalyzer")。用顯微鏡方法需要30分鐘的人工鏡檢時間，用庫爾特血細胞計數(shù)儀在15秒的時間內(nèi)即可完成，同時檢測樣本的大小也增加了100倍，并且誤差降低了近10倍。1958年，瓦萊思·庫爾特(WallaceH.Coulter)和他的弟弟約瑟夫·庫爾特(JosephCoulter,Jr.)共同創(chuàng)建了"庫爾特電子公司“，開始銷售庫爾特血細胞計數(shù)儀。從此開啟了血細胞計數(shù)和分析自動化的新紀元。瓦萊思·庫爾特(WallaceH.Coulter)因其發(fā)明的庫爾特原理(CoulterI^inciple)于1960年獲得了享有崇高聲望的約翰斯葛特科學(xué)成就獎(JohnJcottAwardforScientificAchievement)，這一為有獨創(chuàng)性的男女設(shè)立的科學(xué)成就獎創(chuàng)始于1816年，是專門頒發(fā)給對人類具有革命性發(fā)明的發(fā)明家，迄今獲此殊榮的發(fā)明家中，大家較熟悉的有發(fā)明電燈的愛迪生(ThomasEdison)，發(fā)現(xiàn)原子裂變的居里夫人(MarieCurie)，無線電通信的奠墓人馬可尼(GuglielmoMarconi)等著名科學(xué)家和發(fā)明家。2、庫爾特原理(CoulterPrinciple)(參見圖2)一個容器(圖2中的微孔池21)被分成兩個部分(圖2中的微孔管22)，兩個部分由一個微孔25連結(jié)，兩個電極沈、27分別置于容器的兩個部分，于是電流就在通路中形成(圖2中的微孔電流觀)，當懸浮在弱電解質(zhì)溶液中的一個粒子(例如血細胞24)通過微孔時，由于粒子的阻抗比電解質(zhì)溶液的阻抗大，在微孔25兩端就有一個瞬時的阻抗增加。微孔阻抗改變的區(qū)域形成了一個"敏感區(qū)"。阻抗的瞬間變化產(chǎn)生一個電脈沖，通常被稱為直流(DirectCurrent)脈沖，簡稱DC脈沖。這一DC脈沖的幅度與通過微孔25的粒子的體積成正比。這就是庫爾特原理。利用庫爾特原理就可以對通過微孔的粒子進行計數(shù)并分析粒子的大小，這種方法也被稱為直流阻抗法或庫爾特阻抗法。庫爾特原理可以對各種不同的粒子進行分析，不僅適用于血細胞，還可用于其他細胞、動物血細胞、其他微小粒子，對材料有顆粒度及粒子內(nèi)部成分有要求的各個工業(yè)領(lǐng)域，諸如食晶、制藥、化工、石化工業(yè)等，航空航天工業(yè)中同樣也用來檢測燃料的純度。庫爾特原理和庫爾特阻抗法是血細胞計數(shù)及分析的最為經(jīng)典的原理和方法，自發(fā)明一直沿用至今，是任何一臺血液分析儀器所必不可少的組成部分，而其原理和方法幾十年來基本上沒有什么根本的改變。3、血液成分，參見圖6及參考文獻1)血液由血漿61(58%)和有形細胞成分62(42%)組成。有形分成主要包括紅細胞64(每微升4-5百萬個，RBC為紅細胞RedBloodCell的簡稱)、白細胞65(每微升59千個，WBC為白細胞WhiteBloodCell的簡稱)和血小板63(每微升20-40萬個，PLT為其Platelet的簡稱)三大類。白細胞65可以粗分為粒性白細胞(Granulocyte)，淋巴細胞69(Lymphocytes)和單核細胞610(Monocyte)。粒性白細胞包括嗜堿粒細胞68(Basophil)，嗜酸粒細胞67(Eosinophil)和中性粒細胞66(Neutrophil)。所以白細胞可以細分為五個亞細胞群，即淋巴細胞69、單核細胞610、中性細胞66、嗜酸細胞67、嗜堿細胞68。4、三分類和五分類血細胞分析儀由于庫爾特原理是以粒子通過微孔時電阻抗的變化產(chǎn)生的DC脈沖的幅度來鑒別不同體積的血細胞，而白細胞中的中性、嗜酸、嗜堿三種細胞的體積很接近，所以僅用庫爾特原理制成的血細胞分析儀只能將白細胞分為三類，故稱為三分類儀器，即中性粒細胞(GRN)，淋巴細胞(LYM)，和中間細胞群(MID，包括嗜堿粒細胞、嗜酸粒細胞、中性粒細胞)。能鑒別白細胞中的五種組分(即淋巴、單核、中性、嗜酸、嗜堿細胞)并分類計數(shù)的血細胞分析儀就是通常所稱的五分類血細胞分析儀。為了達到五分類的目的，90年代，激光光散射、射頻、化學(xué)染色計數(shù)等方法相繼被應(yīng)用于對細胞特性的分析，出現(xiàn)了五分類血液分析儀。5、基于流式細胞儀原理的激光光散射方法為利用激光光散射，90年代開始出現(xiàn)基于流式細胞儀原理的光散射血細胞分析儀，其基本原理可用圖7來說明。核心部分是通稱為流式細胞盒71(FlowCell)的提供液體和粒子通道的小盒，如圖8所示。在一個約4毫米x4毫米x8毫米的石英長方柱體沿長軸在中心以某種方法(譬如激光)鉆出一條直徑約50微米的直通微孔，然后從直通孔的兩端磨出相對對準的兩個圓錐83，直至在方柱體的中心留有約70微米長的微孔，稱為微通孔(道)84(0rifice)，如圖8所示，這就是流式細胞盒。激光束81從水平方向射入并聚焦在微通孔84的中心，當粒子沿垂直方向通過微通孔84的中心時，就會和激光相互作用，產(chǎn)生前向、側(cè)向和后向等各個方向的光散射(LightScattering，縮寫為LS)，即前向光散射(forwardlightscatter)，側(cè)向或90°光散射(sidelightscatter)，和后向光散射(backlightscatter)，一般縮寫為FLS，SLS和BLS。側(cè)向或90°光散射可由90°光散射或熒光探測裝置79來檢測，而前后向光散射和軸向光損失可由前后向光散射和軸向光損失檢測裝置710來檢測(在參見圖7)。82表示鞘套流束，85表示樣本(粒子)流束。5在圖7所示的儀器中，照明方式是激光光源77的光束的轉(zhuǎn)播方向(圖中是水平方向)與粒子的流動方向(圖中是垂直方向)相互正交，這里我們稱之為正交照明方式，以便與本發(fā)明的共軸照明方式加以區(qū)別。現(xiàn)今世界上所有基于流式細胞儀原理的光散射血細胞分析儀都是用這種正交照明方式。為了能使粒子一個一個相繼的通過微通孔的中心，除了適當?shù)南♂寫腋×Ｗ拥娜芤旱臐舛韧?，還需用鞘流束流體包圍含有被測粒子的樣本(粒子)流束，這就是通稱為流體聚焦法(HydrodynamicFocusing)。在上下兩個圓錐內(nèi)各安裝一個電極73，當粒子通過微(通)孔72時，就會產(chǎn)生前述的庫爾特直流脈沖(DC)，微孔電流74。這樣，當每一個粒子通過微通孔72時，就可以同時得到三個以上的信號，如DC，F(xiàn)LS和SLS。如在上述的兩個電極上再加上高頻電源，就可以同時多得到一個信號，這也是庫爾特先生的另一個重大發(fā)明，(USPatent3502974)稱為射頻法，簡稱為(RF)JPRadioFrequency的縮寫。圖中，71.是流式細胞盒；75是鞘套流束；76是樣本(粒子)流束；78是表示聚焦透鏡；79.90°光散射或熒光探測裝置；710是前向光散射及軸向光損失檢測裝置。對粒子內(nèi)部組成成分和結(jié)構(gòu)敏感的測試方法有90度光散射(SLS)，射頻法(RF)，熒光染色技術(shù)，后向光散射(BLS)等。其中又以后向光散射最為敏感，只是由于技術(shù)上的瓶頸目前還沒有解決，至今在市場上的高端血液分析儀器只利用了其它幾種方法，如CoulterMAXM、STKS等用VCS技術(shù)，即Volume(DC)，Conductivity(RF/DC)，和Scattering(FLS)。SysmexSE-9000,XE-2100等則用了DC、LS和熒光染色技術(shù)，ABBOTT則有90度光散射的專利，它的儀器一般用DC、FLS和SLS。本發(fā)明的高端血液分析儀器只用DC、FLS和BLS，是迄今世界上第一次把后向光散射用于商業(yè)化的實用高端血液分析儀器。6、后向光散射在激光散射粒子分析技術(shù)中，相對于其它方向的散射，后向散射對粒子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)具有更高的敏感性。1979年，KerkerM，參考文獻幻等指出，只有后向光散射對細胞內(nèi)部形態(tài)和結(jié)構(gòu)有敏感性，1983年Kerker，參考文獻幻，從對彈性光散射理論基礎(chǔ)的回顧進一步指出，有關(guān)細胞的形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的信息可以最好的從后向的光散射信號來獲得。1986年，Sloot和Figdor，參考文獻4)在其理論文章中指出，為了最優(yōu)化的探測混雜在一起的有核血細胞中不同的細胞類型，需要同時探測前向、側(cè)向和后向的散射光。文中的計算表明，后向散射光的強度取決于細胞核對細胞質(zhì)的比例及細胞核和細胞質(zhì)的光學(xué)密度的變化。文中的分析特別強調(diào)了后向散射光的強度與細胞核的透明度之間的直接相關(guān)性。2004年DakotaWatson，參考文獻5)等也對各個方向的光散射強度與細胞形態(tài)的關(guān)系作了較詳細的論述，并作了相應(yīng)的實驗。在以上這些工作的基礎(chǔ)上，近年也有一些關(guān)于后向光散射的美國專利，如USPatent6743634B2(Kramer,June1，2004)和USPatent6869569B2(Kramer,March22,2005)0這些專利所給出的方法，都是用多根光纖和多個光電倍增管作后向散射光信號的探測，其結(jié)構(gòu)和成本都與實用的商業(yè)儀器的要求相距甚遠。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種創(chuàng)新的照明方式，即對經(jīng)典的庫爾特微孔直接的共軸軸向照明，共軸軸向照明的意思就是光束傳播的方向的光軸與庫爾特微孔軸重合(同軸)的照明，這種照明方式的采用，可以徹底摒棄現(xiàn)有的基于流式細胞儀原理的血細胞分析儀器中所必不可少的昂貴的流式細胞盒和復(fù)雜的流體聚焦系統(tǒng)，使對粒子內(nèi)部組成成分和結(jié)構(gòu)特別敏感的后向光散射探測首次應(yīng)用到商業(yè)血液分析儀器中，從而極大的提高了儀器的鑒別能力，不僅能完成血細胞的五分類分析計數(shù)，還能提供更多參數(shù)的綜合檢測和分析，使本發(fā)明的儀器成為一臺高性價比的高端血液分析儀器(HematologyAnalyzer)。本發(fā)明的高端血液分析儀器只用直流脈沖信號(DC)，前向光散射信號(FLS)和后向光散射信號(BLS)，是迄今世界上第一次把后向光散射用于商業(yè)化的實用高端血液分析儀器。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，它使光散射法可以直接應(yīng)用于傳統(tǒng)的庫爾特微孔，其特征在于，將照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸。另外，為使庫爾特原理的微孔池能形成光束的通道以照明庫爾特微孔，微孔管改制成把微孔池分隔為兩部分的微孔板，并在微孔池相對微孔的前后開兩個光學(xué)窗口。進一步所述微孔池相對微孔的前后的兩個光學(xué)窗口，每一所述光學(xué)窗口可以是一光學(xué)平板或一對透鏡或其它光學(xué)元件。本發(fā)明也提供一種庫爾特微孔的共軸照明血液分析儀器，它包括照明光學(xué)系統(tǒng)、安裝有通光窗口的微孔池、前向和后向散射光信號探測光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，所述照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸。本發(fā)明的優(yōu)點及達到的技術(shù)效果表現(xiàn)在以下幾個方面1)定義整個庫爾特微孔區(qū)為探測敏感區(qū)，探測敏感區(qū)可以包括整個庫爾特微孔，也可以是微孔的中部、微孔的前部、微孔的后部，或微孔的幾個部分的組合。2)由于微孔池壁上的光學(xué)窗口離庫爾特微孔中心(聚焦激光束的光腰)的距離較遠，光學(xué)窗口上的激光強度遠小于光腰處的激光強度，使從光學(xué)窗口上反射的光強度大為降低，從而大為降低了后向散射光探測時的噪音背景。這也是基于流式細胞儀原理的血液分析儀器中探測后向散射光時不可克服的技術(shù)瓶頸(usPatent6646742,Gangsteadetal.,Nov.11，2003)。如圖8所示，在探測后向散射光時，聚焦激光束要先照到長方柱體的表面(距庫爾特微孔中心約2mm)，然后再照到庫爾特微孔的園柱形表面(距庫爾特微孔中心約25微米)，因為這里的聚焦激光束強度很大，反射的光強度相應(yīng)也較大，使原本強度就很弱的后向散射光(比前向散射光強度小約3個數(shù)量級)的探測因器壁反射產(chǎn)生的噪音背景太大而無法達到可接受的信噪比要求。而本發(fā)明的照明方法正可克服這一后向散射光探測的技術(shù)瓶頸。3)如
背景技術(shù)：
5中所述，現(xiàn)今世界上所有基于流式細胞儀原理的光散射血細胞分析儀都是用的正交照明方式。在本發(fā)明由于照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸，這樣光束與粒子相互作用的區(qū)域就為整個庫爾特微孔，這在光束與粒子相互作用的區(qū)域和時間上，本發(fā)明的共軸照明方式具有絕對的優(yōu)勢。例如，本發(fā)明的共軸照明方式中，光束與粒子相互作用的區(qū)域為整個庫爾特微孔(見圖9右，標號4a，約100微米長，直徑50微米的圓柱)，而在正交照明方式中，光束與粒子相互作用的區(qū)域僅為約20微米的聚焦光束尺寸(見圖9左，標號94)。光束與粒子相互作用的時間，本發(fā)明的共軸照明方式約為正交照明方式的5倍，所探測到的散射光信號的時間寬度也相應(yīng)的增寬，這就對探測器的時間響應(yīng)的要求相應(yīng)的下降，從而可以使用較大面積的光電探測器，及增加接收角度范圍的選擇性。4)以上共軸照明方式的優(yōu)點，可使散射光信號強度至少增加5倍，再結(jié)合下述的只對空間某特定區(qū)域敏感的信號探測光學(xué)系統(tǒng)，可以使后向散射光信號的信號對噪音比(S/N)大為提高，從而大為提高了儀器對不同種類細胞的鑒別能力。5)本發(fā)明使用只對空間某特定區(qū)域敏感的信號探測光學(xué)系統(tǒng)，即只對圖5中的探測敏感區(qū)中的粒子(圖中血細胞B)產(chǎn)生的光散射信號有響應(yīng)，對探測敏感區(qū)外的粒子(圖中血細胞A、C、D)，即使處于照明光束中，其所發(fā)出的光散射信號也不能到達光電探測器。至于從微孔池壁上的光學(xué)窗口(圖3、4中元件37)反射的構(gòu)成后向散射的背景噪音更無法進入光電探測器。這一特殊設(shè)計的光學(xué)系統(tǒng)使本發(fā)明的儀器特別在后向僅有極低的噪音，后向散射光的信號對噪音比(S/N)甚至高于DC的(S/N)，如圖13所示。6)本發(fā)明是對庫爾特微孔直接照明，因而徹底擯棄了現(xiàn)有的基于流式細胞儀原理的血細胞分析儀器中所必不可少的昂貴的流式細胞盒和復(fù)雜的流體聚焦系統(tǒng)，所以有“簡單的結(jié)構(gòu)、低故障、低成本、易操作“等一系列優(yōu)點。本發(fā)明以獨特的照明方法巧妙的結(jié)合了庫爾特阻抗法和光散射法，不需任何附加的試劑處理和熒光染色等增加儀器操作復(fù)雜性的任何方法，以其后向光散射探測而得到的高鑒別率、簡單的結(jié)構(gòu)、低故障、低成本、易操作等一系列優(yōu)點，與世界上現(xiàn)有的占市場主導(dǎo)地位的基于流式細胞儀原理的高端血液分析儀器相比，具有明顯的性價比和市場優(yōu)勢。這種方法不僅可以用于血液分析儀器中，還可用于其他細胞、動物血細胞、其他微小粒子，及對材料有顆粒度及粒子內(nèi)部成分有要求的各個工業(yè)領(lǐng)域，諸如食晶、制藥、化工、石化工業(yè)等。航空航天工業(yè)中同樣也可用來檢測燃料的純度等。圖1是說明本發(fā)明的激光束光軸與庫爾特微孔軸同軸的共軸照明。其中標號說明41.庫爾特微孔(直徑50微米)42.圓片(100微米厚的庫爾特微孔板)43.激光光束光軸與庫爾特微孔軸(同軸)44.血細胞45.聚焦激光束圖2是庫爾特原理示意圖。其中21.庫爾特微孔池22.庫爾特微孔管23.血細胞懸浮液24.血細胞25.庫爾特微孔26.外電極27.內(nèi)電極28.微孔電流29.真空圖3是具有光通道的庫爾特微孔池的示意圖。其中，31.庫爾特微孔池32.庫爾特微孔板33.血細胞懸浮液34.血細胞35.庫爾特微孔36.內(nèi)外電極37.光學(xué)窗口38.微孔電流39.真空圖4是用透鏡做窗口的庫爾特微孔池的示意圖。其中，31.庫爾特微孔池32.庫爾特微孔板33.血細胞懸浮液34.血細胞35.庫爾特微孔36.內(nèi)外電極37.透鏡用作光學(xué)窗口38.微孔電流39.真空圖5是光散射信號敏感區(qū)的示意圖。其中，51.直徑50微米的庫爾特微孔52.激光束53.敏感區(qū)54.敏感區(qū)后部55.敏感區(qū)中部56.敏感區(qū)前部57血細胞A、B、C、D58.激光束光軸與庫爾特微孔軸(同軸)59.前向光散射信號510.后向光散射信號511.100微米厚園片庫爾特微孔板圖6是表示血液的組成成分的示意圖。其中，61.血漿62.血液的有形成分63.血小板64.紅血球65.白血球0091]66中性粒細胞0092]67.嗜酸粒細胞0093]68.嗜堿粒細胞0094]69.淋巴細胞0095]610.單核細胞0096]圖'是分基于流式細胞儀的光散射血分析儀的基本原理圖，其中0097]71.流式細胞盒0098]72.庫爾特微孔0099]73.電極0100]74.微孔電流0101]75.鞘套流束0102]76.樣本(粒子)流束0103]77.激光光源0104]78.聚焦透鏡0105]79.90°光散射或熒光探測裝置0106]710.前向光散射及軸向光損失檢測裝置0107]圖6是流式細胞盒的示意圖，其中0108]81.激光束0109]82.鞘套流束0110]83.園錐0111]84.微通道(Orifice)0112]85.樣本(粒子)流束0113]圖9是共軸照明方式與正交照明方式的比較示意圖。其中0114]91.正交照明方式0115]92.血細胞0116]93.正交照明方式中庫爾特微孔中心處的橢園型高斯聚焦激光光斑0117]94.正交照明方式中激光與細胞(粒子)相互作用區(qū)域0118]4a.共軸照明方式中激光與細胞(粒子)相互作用區(qū)域0119]95.庫爾特微孔壁0120]96.庫爾特微孔0121]97.流式細胞盒中庫爾特微孔的長度0122]98.庫爾特微孔直徑0123]99.圓錐0124]910.共軸照明方式0125]911.共軸照明方式中庫爾特微孔的長度0126]912庫爾特微孔直徑0127]913.共軸照明方式中聚焦激光束光腰0128]圖10是使用本發(fā)明的共軸照明方式的檢測系統(tǒng)的具體實施例，其中0129]1.微孔電流2.電極3.庫爾特微孔4.血細胞5.血細胞懸浮液6.光學(xué)窗口7.聚焦激光束8.照明光學(xué)系統(tǒng)9.照明激光強度的實時監(jiān)測光學(xué)系統(tǒng)10.后向散射光接收光學(xué)系統(tǒng)11.分光板12.光纖13.激光器14.前向散射光接收光學(xué)系統(tǒng)圖11是使用本發(fā)明的共軸照明方式的檢測系統(tǒng)的另一具體實施例，其中1.微孔電流2.電極3.庫爾特微孔4.血細胞5.血細胞懸浮液6.光學(xué)窗口7.聚焦激光束8.照明光學(xué)系統(tǒng)9.照明激光強度的實時監(jiān)測光學(xué)系統(tǒng)10.后向散射光接收光學(xué)系統(tǒng)11.分光板12.光纖13.激光器14.前向散射光接收光學(xué)系統(tǒng)圖12是本發(fā)明的照明方法的標準粒子的前向散射光和直流脈沖信號的示波器記錄圖，其中，下軌跡為直流脈沖(DC)信號，上軌跡為前向散射光(FLS)信號。前向的直流背景920毫伏。圖13是本發(fā)明的照明方法的標準粒子的后向散射光和直流脈沖信號的示波器記錄圖，其中，下軌跡為直流脈沖(DC)信號，上軌跡為后向散射光(BLS)信號。后向的直流背景9.60毫伏。圖14是本發(fā)明的照明方法的質(zhì)控血樣的后向散射光和直流脈沖信號的示波器記錄圖，其中，下軌跡為直流脈沖(DC)信號，上軌跡為后向散射光(BLS)信號。中軌跡為后向散射光(BLS)經(jīng)濾波后的信號。后向的直流背景M毫伏。具體實施方法下面結(jié)合附圖及其實施例，對本發(fā)明的作詳細描述。11本發(fā)明的實施主要是把照明光學(xué)系統(tǒng)、安裝有通光窗口的微孔池、前向和后向散射光信號探測光學(xué)系統(tǒng)等直接涉及本發(fā)明的部分，按儀器設(shè)計要求與僅用基于庫爾特阻抗法的三分類儀器適當合理的整合起來，從而成為一臺僅用庫爾特阻抗法和光散射法的具有高鑒別力的高端全功能血液學(xué)分析儀器。本發(fā)明的區(qū)別特征在于所述照明光束傳播方向與庫爾特微孔的軸線一致。參見圖1，在本發(fā)明中，照明激光光束45的傳播方向的光軸與庫爾特微孔41的軸線同軸，它使光散射法可以直接應(yīng)用于經(jīng)典的庫爾特微孔。在一片幾毫米直徑、厚100微米的紅寶石圓片42的中心打一個50微米直徑的通孔41，就成了一個經(jīng)典的庫爾特微孔。把沿庫爾特微孔軸傳播的光束45聚焦到微孔41的中心(如圖1所示)。這種照明方式在庫爾特原理發(fā)明至今近60年的世界血液分析儀器歷史上尚屬首創(chuàng)。其優(yōu)越性在本說明書的其余部分將得到充分的闡述。血細胞44可以通過通孔41。當然，上述圓片42的材料和尺寸、微孔的直徑可根據(jù)具體要求設(shè)定。再參見圖1，由于照明光束45的傳播方向的光軸與庫爾特微孔41的軸線同軸，所以圖中軸線43既是照明光束45轉(zhuǎn)播方向的光軸，也是空心圓柱型的庫爾特微孔41的圓柱的中心軸。上述方法使用的照明光源，可以是激光器(氣體激光器，如He-Ne激光器，Ar離子激光器，半導(dǎo)體激光器，光纖藕合半導(dǎo)體激光器，固體激光器，光纖藕合固體激光器，半導(dǎo)體激光泵浦固體激光器，可調(diào)諧激光器，光纖激光器等)，也可以是發(fā)光二極管(LED)，氣體放電光源、自灼光源等。上述使用的光源的波長范圍，根據(jù)不同的應(yīng)用，可以從紫外、可見到紅外波段中的一種或幾種。當照明光束沿庫爾特微孔軸傳播時，應(yīng)使用適當?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)把光束聚焦到均勻地充滿整個庫爾特微孔。當使用的光源為激光器時，應(yīng)使聚焦激光束在焦點處的光腰大小略小于庫爾特微孔的直徑，而其瑞利范圍(RayleighRange)則大于幾個庫爾特微孔的長度。圖3是根據(jù)庫爾特原理(參見圖2、的微孔池能形成光束的通道以照明庫爾特微孔，將圖2的微孔管22改制成把微孔池31分隔為兩部分的微孔板32，并在微孔池31相對微孔35的前后開兩個光學(xué)窗口37，如圖3所示，窗口37上可以是如圖3所示的一對光學(xué)平板，也可以是如圖4所示一對透鏡或其它光學(xué)元件。該光學(xué)元件可將光源的光束聚光到微孔35中。由此可見，本發(fā)明的微孔池31可以在常用的庫爾特原理微孔池上稍加改進。在圖3、圖4中，33表示血細胞懸浮液，34代表血細胞，36.代表內(nèi)外電極，38是產(chǎn)生的微孔電流。微孔池31表示真空39(例如，真空度可為6”Hg)。由此可見，由于上述微孔池壁上的光學(xué)窗口37離庫爾特微孔35的中心(聚焦激光束的光腰)的距離較遠，光學(xué)窗口37上的激光強度遠小于光腰處的激光強度，使從光學(xué)窗口37上反射的光強度大為降低，從而大為降低了后向散射光探測時的噪音背景。這也是基于流式細胞儀原理的現(xiàn)有的血液分析儀器中探測后向散射光時不可克服的技術(shù)瓶頸(USPatent6646742,Gangsteadetal.，Nov.11,2003)。再如圖8所示，在現(xiàn)有技術(shù)的情況，在探測后向散射光時，聚焦激光束要先照到長方柱體的表面(距庫爾特微孔中心約2mm)，然后再照到庫爾特微孔的園柱形表面(距庫爾特微孔中心約25微米)，因為這里的聚焦激光束強度很大，反射的光強度相應(yīng)也較大，使原本強度就很弱的后向散射光(比前向散射光強度小約3個數(shù)量級)的探測因器壁反射產(chǎn)生的噪音背景太大而無法達到可接受的信噪比要求。而本發(fā)明的照明方法正可克服這一后向散射光探測的技術(shù)瓶頸和技術(shù)缺陷。大為降低了后向散射光探測時的噪音背景。如圖5所示，本發(fā)明的整個庫爾特微孔區(qū)可以定義為探測敏感區(qū)53，探測敏感區(qū)53可以包括整個庫爾特微孔，也可以是微孔的中部55、微孔的前部56、微孔的后部M，或微孔的幾個部分的組合。它的光源可采用激光束52。從而可產(chǎn)生的前向光散射信號59、后向光散射信號510。激光束52的光軸與圓片511的庫爾特微孔51的軸方向同軸，當然，本文中所謂的“共軸”或“同軸”實際上是表明方向上的一致，都是在一定的加工和調(diào)校的精度下所能實際達到的限度內(nèi)而言的，不可能是幾何上、理論上的100%的共軸或同軸。本實施例中，圓片511是采用100微米厚園片庫爾特微孔板。當然，上述圓片的材料和尺寸、微孔的直徑可根據(jù)具體要求設(shè)定。再參見圖5，由于激光光束52的傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸，所以圖中軸線58既是激光光束轉(zhuǎn)播方向的光軸，也是空心圓柱型的庫爾特微孔的圓柱的中心軸。本發(fā)明的信號探測系統(tǒng)具有只對某特定空間區(qū)域敏感的特點，即只對圖5中的探測敏感區(qū)中的粒子產(chǎn)生的光散射信號有響應(yīng)，對探測敏感區(qū)外的粒子，即使處于照明光束中，其所發(fā)出的光散射信號也不能到達光電探測器。本發(fā)明的只對某特定空間區(qū)域敏感的信號探測系統(tǒng)包括，但不限于，光學(xué)的、機械的、電子學(xué)的、光-電的、光-機的、及以上幾種結(jié)合的方法，或其它可以這到對某特定空間區(qū)域敏感的任何方法加以實現(xiàn)。本發(fā)明所用的光學(xué)探測接收系統(tǒng)，具有對空間特定區(qū)域選擇性接受散射光信號的特點，從而實現(xiàn)了后向光散射信號的成功探測。對前向、后向散射光信號信號的探測，可以是對不同角度區(qū)間，或幾個不同角度區(qū)間的組合的探測。前向的光信號包括前向散射光、軸向光損失(AxialLightLoss，簡稱ALL)等信號。對前向、后向散射光信號的探測，可以是單波長的探測，也可以是多波長光譜儀分光探測。也可以在前向、后向進行單色或多色的熒光信號探測，或非彈性光散射信號，如拉曼散射、反斯托克斯拉曼散射等的信號探測。參見圖9，與現(xiàn)有的正交照明方式91相比，本發(fā)明的共軸照明方式910在光束與粒子相互作用的區(qū)域和時間上具有絕對的優(yōu)勢。如圖9所示，在本發(fā)明的共軸照明方式中，光束與粒子相互作用的區(qū)域為整個庫爾特微孔(見圖9右，標號4a，約100微米長，直徑50微米的圓柱)。而在正交照明方式中，光束與粒子相互作用的區(qū)域僅為約20微米的聚焦光束尺寸(見圖9左，標號94)。另外，光束與粒子相互作用的時間，本發(fā)明的共軸照明方式約為正交照明方式的5倍，所探測到的散射光信號的時間寬度也相應(yīng)的增寬，這就對探測器的時間響應(yīng)的要求相應(yīng)的下降，從而可以使用較大面積的光電探測器，及增加接收角度范圍的選擇性。圖9中，92表示血細胞；93表示正交照明方式中庫爾特微孔中心處的橢園型高斯聚焦激光光斑；9表示庫爾特微孔壁；96表示庫爾特微孔；97表示流式細胞盒中庫爾特微孔的長度；98表示庫爾特微孔直徑；9表示圓錐；910表示共軸照明方式；911表示共軸照明方式中庫爾特微孔的長度；912表示庫爾特微孔直徑；913表示共軸照明方式中聚焦激光束光腰。圖10、圖11是本發(fā)明提供的兩個具體實施例的示意圖，它們是在圖3或圖4的微孔池的基礎(chǔ)上，采用本發(fā)明的共軸照明方式的檢測系統(tǒng)的實施例的示意圖。該實施例僅是舉例說明，但實際應(yīng)用可不限于這些實施例。具體如下實施例1)參見圖10，激光器13，例如光纖藕合激光器，的輸出經(jīng)光纖12輸出的光經(jīng)分光板11進入照明光學(xué)系統(tǒng)8，聚焦光束7經(jīng)微孔池光學(xué)窗口6(右邊的)聚焦到微孔中心的血細胞4上。照射光與血細胞相互作用產(chǎn)生的前向散射光(FLS)或軸向光損失(ALL)經(jīng)微孔池光學(xué)窗口6(左邊的)進入前向散射光接收光學(xué)系統(tǒng)14。照射光與血細胞4相互作用產(chǎn)生的后向散射光(BLS)經(jīng)微孔池窗口6返回進入后向散射光接收光學(xué)系統(tǒng)(包括照明光學(xué)系統(tǒng)8、分光板11和后向散射光接收光學(xué)系統(tǒng)10)，照明激光強度的實時監(jiān)測光學(xué)系統(tǒng)9用于實時監(jiān)測照明激光的強度變化。于是，每個血細胞通過微孔時，就可以同時得到至少3到4個有關(guān)血細胞信息的信號(DC、FLS、BLS、ALL)，這些信號即以其高鑒別力用于血細胞的五分類和其他多項參數(shù)的測量。圖中，5是血細胞懸浮液。1是微孔池產(chǎn)生的微孔電流。圖中，A、B為庫爾特微孔池被庫爾特微孔分隔成的兩個部分。實施例2):參見圖11，本實施方法與具體實施方法1)的不同在于照明光學(xué)系統(tǒng)和后向散射光接收光學(xué)系統(tǒng)沒有共用的部分，微孔池的設(shè)計也不同于上述實施方法1)。光纖藕合激光器13的輸出經(jīng)光纖12先進入照明光學(xué)系統(tǒng)8，然后經(jīng)分光板11后變成聚焦光束7經(jīng)微孔池的光學(xué)窗口6(右邊的)聚焦到微孔中心的血細胞4上。照射光與血細胞相互作用產(chǎn)生的前向散射光(FLQ或軸向光損失(ALL)經(jīng)微孔池光學(xué)窗口6(左邊的)進入前向散射光接收光學(xué)系統(tǒng)14。照射光與血細胞4相互作用產(chǎn)生的后向散射光(BLS)經(jīng)微孔池窗口6(右邊的)返回，由分光板11反射進入后向散射光接收光學(xué)系統(tǒng)10。照明激光強度的實時監(jiān)測光學(xué)系統(tǒng)9用于實時監(jiān)測照明激光的強度變化。于是，每個血細胞通過微孔時，就可以同時得到至少3到4個有關(guān)血細胞信息的信號(DC、FLS、BLS、ALL)，這些信號即以其高鑒別力用于血細胞的五分類和其他多項參數(shù)的測量。部分實驗結(jié)果示例1)直徑7微米的標準粒子的庫爾特直流脈沖信號(DC，下軌跡)與前向散射光信號(FLS，上軌跡)的示波器記錄顯示(實驗結(jié)果)，見圖12。注意前向光散射信號的直流背景為920毫伏。2)直徑7微米的標準粒子的庫爾特直流脈沖信號(DC，下軌跡)與后向散射光信號(BLS，上軌跡)的示波器記錄顯示(實驗結(jié)果)，參見圖13。3)質(zhì)控血樣的庫爾特直流脈沖信號(DC，下軌跡)與后向散射光信號(BLS，下軌跡，經(jīng)濾波后的BLS，中軌跡)的示波器記錄顯示(實驗結(jié)果)，參見圖14。注意后向光散射信號的直流背景僅為M毫伏。對比前向光散射信號的直流背景920毫伏，降低了34倍。后向光散射信號的信號噪音比(S/N)甚至比直流脈沖的(S/N)還高，這充分說明本發(fā)明的照明方式和后向光學(xué)探測系統(tǒng)的設(shè)計的無比優(yōu)越性。通過上述實施例，可以看出，本發(fā)明是對庫爾特微孔直接照明，因而徹底擯棄了現(xiàn)有的基于流式細胞儀原理的血細胞分析儀器中所必不可少的昂貴的流式細胞盒和復(fù)雜的流體聚焦系統(tǒng)，所以有“簡單的結(jié)構(gòu)、低故障、低成本、易操作”等一系列優(yōu)點。當然，利用本發(fā)明的庫爾特微孔的共軸照明方法，不僅可以用于上述血液分析儀器中，還可制成各種測量和檢測儀器來應(yīng)用于其他細胞、動物血細胞、其他微小粒子，及對材料有顆粒度及粒子內(nèi)部成分有要求的各個工業(yè)領(lǐng)域，諸如食晶、制藥、化工、石化工業(yè)等。航空航天工業(yè)中同樣也可用來檢測燃料的純度等。參考文獻DHaematologyTimetable(1995),JanePittaway,MedLabPrac1CXAlOl,UCDavis.2)KerkerΜ,etal.，“Lightscatteringandfluorescencebysmallparticleshavinginternalstructure.",JHistochenCytochem,1979Jan；27(1)250-63.3)KerkerΜ,"Elasticandinelasticlightscatteringinflowcytometry",Cytometry,1983.Tul；4(1):1_10。4)P.Μ.A.SlootandC.G.Figdor,"Elasticlightscatteringfromnucleatedbloodcells:rapidnumericalanalysis",AppliedOptics,Vol.25,Issue19,pp.3559-3565(1986).5)Dakotaetal.,"ElasticLightScatteringfromSingleCellsOrientationalDynamicsinOpticalTrap",BiophysicalJournal,Vol.87,August2004，ppl298-1306.權(quán)利要求1.全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，它使光散射法可以直接應(yīng)用于經(jīng)典的庫爾特微孔，其特征在于，將照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，所述照明光束的照明光源，可以是下列任一種或幾種激光器、發(fā)光二極管(LED)，氣體放電光源、自灼光源；所述激光器可以是下列任一種或幾種氣體激光器，如He-Ne激光器，Ar離子激光器，半導(dǎo)體激光器，光纖藕合半導(dǎo)體激光器，固體激光器，光纖藕合固體激光器，半導(dǎo)體激光泵浦固體激光器，可調(diào)諧激光器，光纖激光器。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，所述照明光束的照明光源的波長范圍，根據(jù)不同的應(yīng)用，可以從紫外、可見到紅外波段中的一種或幾種。4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，當照明光束沿庫爾特微孔軸傳播時，光束聚焦到均勻地充滿整個庫爾特微孔。5.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，當使用的光源為激光器時，聚焦激光束在焦點處的光腰大小略小于庫爾特微孔的直徑，而其瑞利范圍(RayleighRange)則大于幾個庫爾特微孔的長度。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，為使庫爾特原理的微孔池能形成光束的通道以照明庫爾特微孔，微孔管改造成把微孔池分隔為兩部分的微孔板，并在微孔池相對微孔的前后開兩個光學(xué)窗口。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，所述微孔池相對微孔的前后的兩個光學(xué)窗口，每一對所述光學(xué)窗口可以是一對光學(xué)平板或一對透鏡或其它光學(xué)元件。8.根據(jù)權(quán)利要求1、4和5所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，整個庫爾特微孔區(qū)為探測敏感區(qū)，探測敏感區(qū)可以包括整個庫爾特微孔，也可以是微孔的中部、微孔的前部、微孔的后部，或微孔的幾個部分的組合。9.根據(jù)權(quán)利要求1和8所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，信號探測系統(tǒng)具有只對某特定空間區(qū)域敏感，即只對探測敏感區(qū)中的粒子產(chǎn)生的光散射信號有響應(yīng)，對探測敏感區(qū)外的粒子，即使處于照明光束中，其所發(fā)出的光散射信號也不能到達光電探測器。10.根據(jù)權(quán)利要求9的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，只對某特定空間區(qū)域敏感的信號探測系統(tǒng)可以是光學(xué)的、機械的、電子學(xué)的、光-電的、光-機的、及以上幾種的結(jié)合的方法，或其它可以達到對某特定空間區(qū)域敏感的任何方法加以實現(xiàn)。11.根據(jù)權(quán)利要求9的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，具有對空間特定區(qū)域選擇性接受散射光信號的特點，從而實現(xiàn)了后向光散射信號的成功探測。12.根據(jù)權(quán)利要求9和11的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，對前向、后向散射光信號信號的探測，可以是對不同角度區(qū)間，或幾個不同角度區(qū)間的組合的探測。13.根據(jù)權(quán)利要求9、11、12的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，前向的光信號包括前向散射光、軸向光損失(AxialLightLoss，簡稱ALL)等信號。14.根據(jù)權(quán)利要求9、11、12、13的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，對前向、后向散射光信號的探測，可以是單波長的探測，也可以是多波長光譜儀分光探測。15.根據(jù)權(quán)利要求9、11、12、13的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特征在于，也可以在前向、后向進行單色或多色的熒光信號探測，或非彈性光散射信號，如拉曼散射、反斯托克斯拉曼散射等的信號探測。16.一種庫爾特微孔的共軸照明血液分析儀器，它包括照明光學(xué)系統(tǒng)、有通光窗口的微孔池、前向和后向散射光信號探測光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，在微孔池中所述照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線一致。17.—種庫爾特微孔的共軸照明的應(yīng)用，所述照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸，它不僅可以用于血液分析儀器中，還可用于其他細胞、動物血細胞、其他微小粒子，及對材料有顆粒度及粒子內(nèi)部成分有要求的各個工業(yè)領(lǐng)域，諸如食晶、制藥、化工、石化工業(yè)的檢測以及航空航天工業(yè)中可用來檢測燃料的純度等。全文摘要一種庫爾特微孔的共軸照明方法及其血液分析儀器，以與庫爾特微孔的軸線同軸的照明光束直接對庫爾特微孔進行共軸照明的特殊設(shè)計，使對粒子內(nèi)部組成成分和結(jié)構(gòu)特別敏感的后向光散射探測應(yīng)用到商業(yè)血液分析儀器中成為可能，從而極大的提高了儀器的鑒別能力；它不需昂貴的流式細胞盒和復(fù)雜的流體聚焦系統(tǒng)，它也不需附加的試劑處理和熒光染色等增加儀器操作復(fù)雜性的任何方法，僅用庫爾特阻抗法和光散射法，就不僅能完成血細胞的五分類分析計數(shù)，還能提供更多參數(shù)的綜合檢測和分析。與世界上現(xiàn)有的占市場主導(dǎo)地位的基于流式細胞儀原理的高端血液分析儀器相比，具有明顯的性價比和市場優(yōu)勢。文檔編號G01N15/12GK102087197SQ20101014250公開日2011年6月8日申請日期2010年3月9日優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日發(fā)明者龔維燕申請人:龔維燕