專利名稱：：高質(zhì)粒生產(chǎn)性e.coli克隆的遺傳選擇的方法高質(zhì)粒生產(chǎn)性EC(9ZJ克隆的遺傳選擇的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的Eco"菌抹的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包含比較相同菌林的克隆亞型之間的IS1轉(zhuǎn)座活性，其中顯示了相對低的轉(zhuǎn)座活性的那些克隆代表了潛在的高產(chǎn)性克隆亞型。公開了基于PCR的分析來測量轉(zhuǎn)化的克隆亞型的質(zhì)?；蚧蚪MDNA內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子插入突變的頻率。這些遺傳選擇分析可以經(jīng)受高通量分析，降低鑒定能夠在工業(yè)規(guī)模上培養(yǎng)大量質(zhì)粒DNA的高產(chǎn)性克隆亞型的時間的量。
背景技術(shù)：
：大量的藥物級別質(zhì)粒DNA的制造和純化對于治療用途的多核苷酸疫苗和基因治療方案的適用性是關(guān)鍵的。因而，高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA生產(chǎn)和純化過程是必需的，以完全地開發(fā)和采用DNA疫苗和基因治療處理選擇4是供的益處(Shamlou,2003,Ao&c/mo/.jp//.Aoc/ze肌77:207-218)?？寐兜腄NA疫苗作為質(zhì)粒分子在充分研究的革蘭氏陰性細菌大腸桿菌("￡.co//")中容易地增殖；然而，用DNA疫苗構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細菌可以產(chǎn)生相對于質(zhì)粒含量的克隆亞型的異質(zhì)的群體。早先開發(fā)了篩選過程來幫助從這種異質(zhì)群體中分離出能夠以高水平復制并維持質(zhì)粒DNA的那些轉(zhuǎn)化的Eco/Z克隆(參見2005年1月31日提交的共同待決國際申請NO.PCT/US2005/002911;于2005年8月25日作為國際公開No.WO2005/078115公開)。簡要地，轉(zhuǎn)化的五.co//克隆在化學合成的培養(yǎng)基上的生產(chǎn)力與ColumbiaBloodAgar上的形態(tài)學表型松散地相關(guān)。形成白色、平滑的和隆起的圓形菌落的克隆("白色"克隆)不能在進料-分批發(fā)酵(fed-batchfermentation)中擴增質(zhì)粒DNA;然而，形成灰色、不規(guī)則形狀、扁平和半透明菌落的那些("灰色"克隆)更可能以高水平復制質(zhì)粒DNA。隨后通過在固體和液體培養(yǎng)基中的多輪培養(yǎng)建立了篩選方案(在下文，"高生產(chǎn)者篩選")來鑒定適當?shù)卣宫F(xiàn)了期望的形態(tài)的灰色克隆。然后檢查形態(tài)穩(wěn)定的克隆來確定搖瓶中進料-分批培養(yǎng)之后的質(zhì)粒含量。雖然高生產(chǎn)者篩選已經(jīng)成功地實現(xiàn)了，以分離幾種DNA疫苗候選物的高產(chǎn)克隆，但該過程是十分費力和耗時的。在固體合成培養(yǎng)基上的生長需要每輪三到五天的孵育周期，使用BloodAgar作為分析平板的需要意味著這種培養(yǎng)是"死胡同，，，必需平行地培養(yǎng)使得從轉(zhuǎn)化體到發(fā)酵罐種子的克隆被維持在無血液培養(yǎng)基中。因而，如在此公開的，進行實驗以表征高生產(chǎn)者現(xiàn)象的性質(zhì)，最終目標是開發(fā)更強大和更快的篩選方案。通過了解高生產(chǎn)者現(xiàn)象的遺傳學基礎(chǔ)，本發(fā)明公開了改進的篩選方案以更快地鑒定高質(zhì)粒生產(chǎn)性Eco"克隆亞型。在低質(zhì)粒生產(chǎn)性Eco//DH5克隆中提高的IS1轉(zhuǎn)座的觀察結(jié)果導致了開發(fā)出多種基于PCR的分析來測量轉(zhuǎn)化的E.co//克隆中質(zhì)粒和基因組DNA中的IS1插入突變。如在此描述的，含有相同質(zhì)粒DNA的相同菌抹的具有較低頻率的IS1插入突變的克隆被鑒定為潛在的高質(zhì)粒生產(chǎn)性克隆亞型。然后測試所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的單位生產(chǎn)力(specificproductivity)來確定它們是否實際上展現(xiàn)每個細胞的高質(zhì)粒拷貝數(shù)，這樣它們被鑒定為高質(zhì)粒生產(chǎn)性克隆。發(fā)明概述本發(fā)明一般地涉及用于挑選攜帶質(zhì)粒DNA的Eco//菌林的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，其包括測量所述克隆亞型中質(zhì)粒或基因組DNA之中IS1轉(zhuǎn)座子插入突變的頻率，其中提高的IS1插入突變與可能展現(xiàn)每個細胞低質(zhì)粒拷貝數(shù)(即，低的單位生產(chǎn)力)的克隆亞型相關(guān)。重要地，在此描述的測量細菌克隆亞型的質(zhì)粒和/或基因組DNA中IS1轉(zhuǎn)座的分析可以經(jīng)受高通量分析，因而降低鑒定用于例如大規(guī)模藥物級別質(zhì)粒DNA生產(chǎn)的高產(chǎn)性克隆亞型的時間的量。本發(fā)明涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的菌林的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括(a)比較攜帶相同質(zhì)粒DNA的相同菌抹的至少兩種克隆亞型中IS1轉(zhuǎn)座活性，其中顯示了相對更低的轉(zhuǎn)座活性的克隆亞型代表潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；以及，(b)測試所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的生產(chǎn)力；其中高產(chǎn)性克隆亞型展現(xiàn)了每個細胞高的質(zhì)?？截悢?shù)。在本發(fā)明的一個實施方式中，克隆亞型的IS1轉(zhuǎn)座活性通過測量從所述克隆分離的質(zhì)粒DNA樣品中的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)來測定，其中具有相對更低的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的克隆代表顯示了相對更低的IS1轉(zhuǎn)座活性的克隆。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，克隆亞型的IS1轉(zhuǎn)座活性通過測量所述克隆的基因組DNA的預定IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子序列的存在或缺乏來測定，其中在所述預定的區(qū)域內(nèi)缺少一個或多個ISl插入序列的克隆亞型代表顯示了相對更低的ISl轉(zhuǎn)座活性的克隆。本發(fā)明進一步涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的菌林的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括(a)從攜帶相同質(zhì)粒DNA的相同菌林的至少兩種克隆亞型中分離質(zhì)粒DNA;(b)測量所述分離的質(zhì)粒DNA樣品中ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)，其中顯示了相對更低的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的克隆亞型代表潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；和，(c)測試所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的生產(chǎn)力，其中高產(chǎn)性克隆亞型展現(xiàn)了每個細胞高的質(zhì)?？截悢?shù)。根據(jù)本發(fā)明，攜帶質(zhì)粒DNA的Eco"菌林，包括但不限于DH5菌林，的高產(chǎn)性克隆亞型，與類似地測試的相同菌林的未挑選的、轉(zhuǎn)化的Eco/z亞型相比，展現(xiàn)更高的每細胞質(zhì)?？截悢?shù)。在本發(fā)明的一個實施方式中，使用定量PCR("Q-PCR")分析測量分離的質(zhì)粒DNA樣品中的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)，包括但不限于基于質(zhì)?？截悢?shù)測量IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的相對數(shù)量的Q-PCR分析。在這個實施方式中，基于質(zhì)?？截悢?shù)的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝的相對數(shù)量代表了作為所描述的Q-PCR分析的一部分而測量的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)。在本發(fā)明的一個實施方式中，Q-PCR分析被用于根據(jù)分離的質(zhì)粒DNA樣品中的質(zhì)?？截悢?shù)測量IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的相對數(shù)量，所述分析包括擴增位于ISl核普酸序列內(nèi)的質(zhì)粒DNA的第一核苷酸序列和預先確定為沒有ISl插入的質(zhì)粒DNA的第二核苷酸序列，產(chǎn)生代表特定克隆亞型的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的ISl/質(zhì)?？截惐壤?。這種Q-PCR分析可以以多重方式進行，同時在一個反應(yīng)試管中同時擴增第一和第二核苷酸序列，降低變異性。位于ISl核苷酸序列內(nèi)的質(zhì)粒DNA的第一核苷酸序列在存在核酸聚合酶和一組寡核普酸的情況下被擴增，所述一組寡核苷酸由以下組成(i)與ISl核苷酸序列的第一位置雜交的正向PCR引物；(ii)與所述第一位置下游的ISl核苷酸序列的第二位置雜交的反向PCR引物；和(iii)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值(uniqueemissionmaxima)下發(fā)射能量；所述探針與所述第一和第二位置之間的ISl核苷酸序列的位置雜交；其中所述核酸聚合酶在擴增期間消化所述焚光探針來將所述焚光團從所述9淬滅劑分子上解離，以及檢測在所述熒光團和所述淬滅劑分子解離時熒光的變化，所述熒光的變化相應(yīng)于IS1擴增的發(fā)生。確定沒有IS1插入的質(zhì)粒DNA的第二核苷酸在存在核酸聚合酶和一組寡核苷酸的情況下也被擴增，所述一組寡核苷酸由以下組成(i)與第二核苷酸序列的第一位置雜交的正向PCR引物；(ii)與所述第一位置下游的第二核苷酸序列的第二位置雜交的反向PCR引物；和(111)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量；所述探針與所述第一和第二位置之間的第二核苷酸序列的位置雜交；其中所述核酸聚合酶在擴增期間消化所述熒光探針來將所述焚光團從所述淬滅劑分子上解離，檢測所述熒光團和所述淬滅劑分子解離時熒光的變化，所述熒光的變化相應(yīng)于第二核普酸序列擴增的發(fā)生。在一個實施方式中，與IS1核苷酸序列一起被擴增的質(zhì)粒DNA的第二核苷酸序列位于質(zhì)粒DNA的啟動子序列內(nèi)，包括但不限于位于質(zhì)粒DNA的CMV啟動子內(nèi)的核苷酸序列，因而，產(chǎn)生IS1/CMV質(zhì)?？截惐壤Ｔ跍y量攜帶相同質(zhì)粒DNA的相同菌株的至少兩種細菌克隆亞型中的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)之后，如上定義的，被確定為具有相對更低的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的克隆類型被鑒定為"潛在的，，高產(chǎn)性克隆亞型。然后通過在發(fā)酵系統(tǒng)、優(yōu)選小規(guī)模發(fā)酵系統(tǒng)中培養(yǎng)所述克隆亞型來測定所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的單位生產(chǎn)力(即，每個細胞的質(zhì)?？截悢?shù))，來確定所述鑒定的克隆是否實際上是高產(chǎn)性的(即，展現(xiàn)每個細胞的高的質(zhì)粒拷貝數(shù))。在本發(fā)明的一個實施方式中，這種小規(guī)模發(fā)酵系統(tǒng)由具有營養(yǎng)物給料的搖瓶發(fā)酵系統(tǒng)組成(如在作為國際公開No.WO2005/078115公開的共同待決國際申請NO.PCT/US2005/002911中詳細描述的)。小規(guī)模發(fā)酵系統(tǒng)將理想地模擬用于產(chǎn)生期望的質(zhì)粒DNA的預期的大規(guī)模生產(chǎn)過程的發(fā)酵方式。在本發(fā)明的一個實施方式中，在所描述的Q-PCR分析中用于從分離的質(zhì)粒DNA樣品擴增IS1轉(zhuǎn)座子序列的正向和反向PCR引物分別由IS1-Q-F(SEQIDNO:6)和IS1-Q-R(SEQIDNO:7)組成，所述焚光探針由IS1-Q-P2(SEQIDN0:8)組成。在本發(fā)明的另一個實施方式中，在所描述的Q-PCR分析中用于從分離的質(zhì)粒DNA樣品擴增第二核苷酸序列的正向和反向PCR引物分別由CMV-Q-F(SEQIDNO:3)和CMV-Q-R(SEQIDNO:4)組成，所述熒光探針由CMV-Q-P2(SEQIDNO:5)組成。所述焚光探針用熒光團和淬滅劑分子標記。本發(fā)明進一步涉及IS1定量PCR分析，類似于如上所述的，包括間接地計算來自細菌克隆亞型的分離的質(zhì)粒DNA樣品中存在的剩余基因組DNA貢獻的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的預計數(shù)量，其中所述IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的預計數(shù)量從ISl/質(zhì)粒拷貝數(shù)中減去，產(chǎn)生校正的ISl/質(zhì)粒拷貝比例。在本發(fā)明的這個部分的一個實施方式中，來自質(zhì)粒DNA樣品中存在的剩余基因組DNA的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的預計貢獻利用笫二Q-PCR分析來間接地測量，其中所述分析根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)測量23srDNA的相對數(shù)量，產(chǎn)生23srDNA/質(zhì)?？截惐壤Ｋ?3srDNA/質(zhì)?？截惐壤龔腎Sl/質(zhì)粒拷貝比例中減去，來提供矯正的ISl/質(zhì)粒拷貝比例。這種Q-PCR分析可以以多重方式進行，同時地擴增23rDNA序列和確定沒有IS1插入的質(zhì)粒DNA的相同的核苷酸序列(參見上文)。在本發(fā)明的一個實施方式中，在此描述描述的Q-PCR分析中用于擴增23srDNA序列的正向和反向PCR引物分別由23s-FlD(SEQIDNO:11)和23s國RlD(SEQIDNO:12)組成，所述焚光探針由23s-Pfam(SEQIDNO:13)組成。在本發(fā)明的另一個實施方式中，預先確定為沒有IS1插入的序列被包含在質(zhì)粒DNA的CMV啟動子區(qū)域內(nèi)，產(chǎn)生23srDNA/CMV拷貝比例，其從本發(fā)明還涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的E.co//菌株的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括檢測預先確定為ISl插入?yún)^(qū)域的細菌基因組DNA的區(qū)域內(nèi)一個或多個ISl轉(zhuǎn)座子插入序列的存在或缺乏，其中在所述ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)缺乏IS1轉(zhuǎn)座子序列的克隆亞型代表潛在的高產(chǎn)性克隆亞型。公開了基于PCR的分析，其可以檢測預定的ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)插入的ISl轉(zhuǎn)座子序列的存在或缺乏。這些分析可以經(jīng)受高通量分析。因而，本發(fā)明進一步涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的co//菌林的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括(a)檢測所述克隆亞型的基因組DNA的預先確定的ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)ISl轉(zhuǎn)座子序列的存在或缺乏，其中在所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)缺乏ISl轉(zhuǎn)座子序列的克隆亞型代表潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；和(b)測試所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的生產(chǎn)力；其中高產(chǎn)性克隆亞型展現(xiàn)每個細胞的高的質(zhì)?？截悢?shù)。在進一步的實施方式中，基于TaqMan的Q-PCR分析:故用于檢測co/,克隆亞型的基因組DNA的區(qū)域內(nèi)ISl插入序列的存在或缺乏，其中基因組DNA的所述區(qū)域被預先確定為接受IS1插入并跨越所述基因組DNA的低于約20個連續(xù)核苷酸(即，代表"IS1插入位點")。檢測所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)特定IS1插入的存在或缺乏的Q-PCR分析在存在核酸聚合酶和一組寡核苷酸的情況下擴增含有所述區(qū)域的基因組DNA的一部分，所述一組寡核苷酸由以下構(gòu)成(i)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量，其中所述探針僅當所述基因組DNA缺乏所述區(qū)域內(nèi)的ISl轉(zhuǎn)座子序列時與跨越ISl插入?yún)^(qū)域的基因組DNA內(nèi)的位置雜交；(ii)與所述熒光探針下游的基因組DNA的位置雜交的反向PCR引物；和(iii)與所述熒光探針下游的基因組DNA的位置雜交的反向PCR引物；其中所述核酸聚合酶在擴增期間消化所述熒光探針來從所述淬滅劑分子上解離所述熒光團，檢測所述焚光團和淬滅劑分子解離時的焚光的變化，所述熒光的變化相應(yīng)于基因組DNA的擴增和所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)ISl轉(zhuǎn)座子序列的缺乏。這種分析不需要多重化，可以使用完整的細胞溶胞產(chǎn)物進行，消除了從所述克隆分離基因組DNA的需要。在ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)缺乏ISl轉(zhuǎn)座子序列的那些克隆亞型被鑒定為潛在的高產(chǎn)性克隆亞型，并且將被測試來確認它們的單位生產(chǎn)力。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，基于PCR的分析被用于檢測五.co"克隆亞型的基因組DNA的區(qū)域內(nèi)ISl插入序列的存在或缺乏，其中基因組DNA的所述區(qū)域被預先確定為接受ISl插入并跨越所述基因組DNA的大于約20個連續(xù)核苦酸(即，代表"IS1插入熱點")。所述PCR分析在存在核酸聚合酶和一組寡核香酸的情況下擴增基因組DNA的區(qū)域，所述一組寡核苷酸由以下構(gòu)成(i)與ISl插入?yún)^(qū)域外(即，ISl插入熱點外)的基因組DNA的位置雜交的第一PCR引物；和(ii)與ISl轉(zhuǎn)座子序列內(nèi)的基因組DNA的位置雜交的第二PCR引物；其中，由于來自兩個PCR引物的雜交和擴增，ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)的ISl轉(zhuǎn)座子序列的存在引起基因組DNA的所述部分的指數(shù)性擴增。由于僅第一PCR引物的雜交，ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)的ISl轉(zhuǎn)座子序列的缺乏引起基因組DNA的僅一條鏈的線性擴增。基因組DNA的指數(shù)性擴增可以通過鑒定近似目標大小的擴增核酸片段視覺上地檢測，或通過添加與雙鏈DNA結(jié)合的核酸染料(例如，SYBRGreen)焚光地實時檢測。在ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)缺乏ISl轉(zhuǎn)座子序列的那些克隆亞型被筌定為潛在的高產(chǎn)性克隆亞型，并且將被測試來確認它們的單位生產(chǎn)力。本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生攜帶質(zhì)粒DNA的￡.co//菌抹的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括在用所述質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化細菌菌抹之前使宿主菌林突變來從細菌基因組中除去IS1序列的所有拷貝。本發(fā)明進一步涉及突變的Eco"宿主菌株，包括但不限于DH5菌林，其中所有的IS1拷貝已經(jīng)被除去，以及所述菌林用于質(zhì)粒DNA的增殖的用途。如在此使用的，術(shù)語"寡核苷酸"是指天然的或修飾的單體或鍵、包括脫氧核糖核普、核糖核苷等等的線性寡聚物，通過單體對單體相互作用的規(guī)律模式，例如Watson-Crick型堿基配對的方式，可以與目標多核普酸特異性地結(jié)合。對于本發(fā)明來說，術(shù)語寡核苷酸包括寡核苷酸探針和寡核苷酸引物。如在此使用的，術(shù)語"引物"是指當置于一定條件下能夠沿著互補鏈作為合成的起始點的寡核香酸，在所述條件中與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的合成被催化。這些條件包括存在四種不同的脫氧核糖核普酸三磷酸和聚合化誘導試劑例如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，在適合的緩沖液中("緩沖液"包括作為輔助因子、或影響pH值、離子強度等等的成分)，以及在適合的溫度下。如在此采用的，寡核苷酸引物可以是天然發(fā)生的，如在純化的限制性消化中，或是合成地產(chǎn)生的。為了擴增中的最高效率，引物優(yōu)選的是單鏈的。如在此使用的，對于本發(fā)明的熒光團來說，"獨特的，，是指相對于在特定的分析中使用的所有其他熒光團，每個熒光團在不同的發(fā)射最大值下發(fā)射能量。具有獨特的發(fā)射最大值的熒光團的使用允許特定分析中使用的多種熒光團的每一個發(fā)射的熒光能量的同時檢測。如在此使用的，"擴增子"是指PCR反應(yīng)的特定產(chǎn)物，其是在存在核酸聚合酶和特定的引物對的情況下通過包含核酸的樣品的PCR擴增產(chǎn)生的。如在此使用的，"寡核苷酸組(oligonucleotideset)"或"寡核苷酸的組"是指與特定的目標核普酸序列雜交的寡核苷酸引物對和寡核苷酸探針的組合。所述寡核苷酸組包括(a)與目標DNA的第一位置雜交的正向引物；(b)與所述第一位置下游的相同目標DNA的第二位置雜交的反向引物；和(c)用熒光團和淬滅劑標記的熒光探針，其與引物之間的目標DNA的位置雜交。換句話說，寡核苷酸組由能夠啟動特異于13特定目標DNA序列，例如IS1轉(zhuǎn)座子序列的擴增子的合成的一組特定的PCR引物，和與擴增子雜交的熒光探針組成。如在此使用的，關(guān)于寡核苷酸組、寡核香酸引物或寡核苷酸探針的"特異性雜交"是指所述寡核苷酸組、引物或探針與單個目標DNA雜交。如在此使用的，"基因"是指涉及產(chǎn)生多肽鏈的核酸節(jié)段。它包括翻譯的序列(編碼區(qū))和5'和3'非翻譯序列(非編碼區(qū))，以及各編碼節(jié)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。如在此使用的，"熒光團"是指熒光報告分子，其在用激光、鵠、汞或氙燈、或發(fā)光二極管激發(fā)時，以具有指定光譜的光的形式釋放能量。通過熒光共振能量傳遞(FRET)的過程，焚光團發(fā)射的光可以激發(fā)第二分子，所述第二分子的激發(fā)光譜與所述熒光團的發(fā)射光譜重疊。熒光團的發(fā)射能量向另一個分子的轉(zhuǎn)移淬滅了熒光團的發(fā)射。第二分子被稱為淬滅劑分子。術(shù)語"熒光團"在此與術(shù)語"熒光報告物"可互換地使用。如在此使用的，"淬滅劑"或"淬滅劑分子"是指一種分子，當其與包含熒光團的熒光探針連接時，能夠接受熒光團發(fā)射的能量，從而淬滅熒光團的發(fā)射。淬滅劑可以是熒光的，其將接受的能量釋放為光，或是非熒光的，其將接受的能量釋放為熱量，可以附著到沿探針長度的任何位置。如在此使用的，"探針，，是指由于探針的至少一個序列與目標區(qū)域中的序列、或要檢測的區(qū)域的互補性，能夠與目標核酸中的序列形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。術(shù)語"探針"包括如上所述的寡核苦酸，有或者沒有連接的熒光團和淬滅劑分子。術(shù)語"熒光探針，，是指包含熒光團和淬滅劑分子的探針。如在此使用的，"FAM，，是指熒光團6-羧基熒光素；"JOE"是指熒光團6-羧基-4',5'二氯-2',7'-二曱氧基熒光素；"TET，，是指熒光團5-四氯熒光素；"VIC"是指AppliedBiosystems開發(fā)的專有的熒光團;"TAMRA"是指熒光團6-羧基-四曱基-羅丹明。如在此使用的，"RFLP"是指"限制性片斷長度多態(tài)性"。如在此使用的，"DCW"是指"干細胞重量"。如在此使用的，"OD2團粒"是指細胞的團，當懸浮在1ml溶液中時，其在600nm得到OD=2。14附圖的簡要說明附圖1A和B顯示了從LB-生長的(A)或DME-P5生長的(B)培養(yǎng)物分離的VlJns-"e/質(zhì)粒DNA，NLB-1到NLB-10(左到右)。在凝膠(A)中，每個樣品泳道含有來自培養(yǎng)物的1mlQIAGEN制備物的1pl質(zhì)粒DNA，10個培養(yǎng)物的平均OD6oo等于3.7。樣品NLB-10添加到泳道13中的分子量標記物。在凝膠(B)中，每個樣品泳道含有來自培養(yǎng)物的1mlQIAGEN制備物的2pl質(zhì)粒DNA,10個培養(yǎng)物的平均OD600等于12.5。(A)泳道1、5、9、13和(B)泳道1、7、13——NewEnglandBiolabs1KbDNA階梯(0.5|il)。scDNA——超巻曲DNA。星號的泳道含有可見的IS1陽性條帶。附圖1C顯示了選定的NLB樣品的M/wI消化。泳道2、4、7、9、12——NLB國1、NLB-3、NLB國5、NLB-7、NLB畫8;未消化的。泳道3、5、8、10、13——NLB-1、NLB-3、NLB-5、NLB國7、NLB國8;消化的。泳道l、6、11、14-NewEnglandBiolabs1KbDNA階梯(0.5^)。附圖2A顯示了從選定的樣品的IS1的PCR擴增。泳道2——LB-生長的NLB-1。泳道3-DME-P5-生長的NLB-1。泳道4-LB-生長的NLB-2。泳道5-DME-P5-生長的NLB-2。泳道6-LB-生長的pUC19。；永道7—DH5基因纟且DNA。；永道8—DH5a基因纟且DNA。；永道1、9——GibcoBRL1KbPlusDNA階梯(0.5pi)。附圖2B顯示了利用來自NLB-1和NLB-2的DME-P5生長的培養(yǎng)物的質(zhì)粒制備物的PCR反應(yīng)的M7wl消化。泳道2、3-NLB-1未消化的、消化的。泳道4、5-NLB-2未消化的、消化的。泳道1、6-GibcoBRL1KbPlusDNA階梯(0.5pi)。附圖2C和2D顯示了使用來自(C)DME-P5-生長的或(D)LB-生長的細胞的制備物從NLB-3到NLB-10(左到右)的IS1的PCR擴增。泳道1、6、1l^~GibcoBRL1KbPlusDNA階梯(0,5pi)。附圖3A顯示了VlJns-tpa-;o/克隆的IS1RFLP分布型(profiles),使用限制性內(nèi)切酶4/7II和^gel。泳道1——pISl陽性對照。泳道2——未轉(zhuǎn)化的DH5對照。泳道3-tpa-/o/-HP質(zhì)粒DNA。泳道4-tpa-po/-HP總DNA。泳道5-tpa-/o/-LP質(zhì)粒DNA。泳道6——tpa-po/-LP總DNA。DIG標記的分子量標記物在此沒有顯示，但是更長的曝光時間下是可見的。附圖3B顯示了VlJns-tpa-"e/克隆的IS1rflp分布型，使用限制性內(nèi)切酶」ym和^gel。泳道1-pISl陽性對照。泳道2——未轉(zhuǎn)化的DH5對照。泳道3——tpa-we/-HP質(zhì)粒DNA。泳道4-tpa-"e/-HP總DNA。泳道5-tpa-we/-LP質(zhì)粒DNA。泳道6——tpa-"e/-LP總DNA。DIG標記的分子量標記物在此沒有顯示，但是更長的暴露時間下是可見的。附圖3C顯示了未轉(zhuǎn)化的DH5和VlJns-tpa-g"g克隆的IS1RFLP分布型，使用限制性內(nèi)切酶^/711和^gel。泳道1-未適應(yīng)的(unadapted)、未轉(zhuǎn)化的DH5對照。泳道2-適應(yīng)合成培養(yǎng)基DME-P5的未轉(zhuǎn)化的DH5。泳道3-tpa-gag-HP工作種子質(zhì)粒DNA。泳道4、5-tpa-gag-HP工作種子總DNA。泳道6——tpa-gag-HP實驗室種子質(zhì)粒DNA。泳道7、8——tpa-gag-HP實驗室種子總DNA。泳道9-tpa-gag-LP質(zhì)粒DNA。泳道10、11——tpa-g"g-LP總DNA。DIG標記的分子量標記物在此沒有顯示，但是更長的暴露時間下是可見的。附圖4顯示了標準pnlQ3v2的質(zhì)粒圖。標明了引物和探針結(jié)合位點。附圖5顯示了23srDNA/CMV拷貝比例分析的定量極限的確定。()從使用一個引物-探針組的反應(yīng)測定的比例。()從使用兩個引物4果針組(多重)的反應(yīng)測定的比例。質(zhì)粒p23sTA和PCR擴增的CMV啟動子片段用作模板來制備標明的拷貝比例。到1:105拷貝比例的線性確定了定量的極限。附圖6顯示了fimBEA操縱子的示意圖(對于序列的細節(jié)，參見GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫登記號碼Y10902)。用于PCR擴增搡縱子的各個區(qū)域的引物的位置被標明為Pl'、Pl'-Rev、P3'、P3'-Rev、P4'、和P5，根據(jù)公開的報道選4奪引物位置(Stentebjerg-01esenetal.,2000,FEMSMc油W.182:319-325)。IS1插入在引物Pl'和P3'之間的區(qū)域中觀察到。附圖7A顯示了對于潛在的高產(chǎn)性細菌克隆的基于TaqMan的高通量篩選分析的示意圖，其中IS1插入?yún)^(qū)域跨越基因組DNA的少量的核苷酸("IS1插入位點")。附圖7B顯示了對于潛在的高產(chǎn)性細菌克隆的基于PCR的高通量篩選分析的示意圖，其中IS插入?yún)^(qū)域跨越基因組DNA的大量的連續(xù)的核苷酸("IS1熱點")。在7B中所示的分析中，必需利用IS1特異性引物在相反方向上進行第二次分析，以解釋兩個可能的方向上的插入。發(fā)明的詳細i兌明在此公開了選擇高產(chǎn)性五.co//克隆用于質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)的新的方法。本發(fā)明人/申請人將提高的IS1轉(zhuǎn)座與低產(chǎn)細菌克隆的群體相關(guān)聯(lián)，這一信息已經(jīng)被用于產(chǎn)生包括遺傳選擇分析的改進的篩選過程，來鑒定潛在的高質(zhì)粒生產(chǎn)性五.co"克隆亞型。所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型然后被評估來確認它們實際上是高產(chǎn)性的(即，展現(xiàn)每個細胞高的質(zhì)?？截悢?shù))。重要地，作為新的選擇過程的一部分的在此描述的分析可以經(jīng)受高通量分析，因而，將降低鑒定高產(chǎn)性克隆所需的時間的量。最終，含有質(zhì)粒DNA的E.co//菌抹、即轉(zhuǎn)化的E.co/z克隆的高產(chǎn)性克隆亞型被鑒定為與含有相同質(zhì)粒DNA的相同菌林的未選擇的、轉(zhuǎn)化的Eco//克隆亞型相比，具有展現(xiàn)每個細胞更高的質(zhì)粒拷貝數(shù)的能力。所述高產(chǎn)性克隆亞型可以被用于，例如，為治療性多核苷酸疫苗和/或基因治療方案進行的質(zhì)粒DNA的商業(yè)規(guī);溪生產(chǎn)。在此使用DH5^co/Z菌抹例證了本發(fā)明的選擇方法；然而，這種例舉不意圖將本發(fā)明的范圍限制到僅僅來自Eco/,DH5菌林的高質(zhì)粒生產(chǎn)性克隆的遺傳選擇。技術(shù)人員已知的是，替代性的五.co/z'菌抹可以供本發(fā)明的選擇過程中使用。本發(fā)明部分地來自于先前的觀察結(jié)果，用多個質(zhì)粒DNA疫苗候選物轉(zhuǎn)化的￡.co//DH5細胞顯示了培養(yǎng)異質(zhì)性，當在分化和/或化學合成的瓊脂培養(yǎng)基上平鋪時展現(xiàn)了具有不同的形態(tài)的至少兩種菌落表型。這種現(xiàn)象在已經(jīng)放棄的共同待決申請文件2004年2月4日提交的美國臨時申請No.60/541,894中詳細描述，相應(yīng)于2005年1月31日提交的國際申請No.PCT/US2005/002911(2005年8月25日作為國際公開No.WO2005/078115被公開)；通過引用合并在此。每種表型的菌落分離和隨后的測試導致了特定表型克隆分離物的發(fā)現(xiàn)，其能夠在發(fā)酵期間提高質(zhì)粒擴增，產(chǎn)生高產(chǎn)量的臨床級別質(zhì)粒DNA。這一發(fā)現(xiàn)導致了篩選過程的開發(fā)，在此稱為高生產(chǎn)者篩選，在PCT/US2005/002911(上文)中詳細地闡述了，其中鑒定了展現(xiàn)每個細胞的高質(zhì)?？截悢?shù)的高產(chǎn)性克隆亞型。高生產(chǎn)者篩選包括第一選擇步驟，其中分離Eco/Z的潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；隨后是第二選擇步驟，其中在步驟一中分離的所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型在發(fā)酵系統(tǒng)中、優(yōu)選小規(guī)模發(fā)酵系統(tǒng)中評估，來確定哪個克隆亞型實際上是高產(chǎn)性的。因而，第一選擇步驟縮小了可能的高產(chǎn)性Eco"克隆亞型的庫，來僅包括那些克隆變體，與在相似的發(fā)酵條件下17胞相比，所述克隆變體具有展現(xiàn)產(chǎn)生更大的每個細胞的質(zhì)?？截悢?shù)的能力的最大可能性。已經(jīng)在科學文獻中描述了細菌克隆亞型。在白色念珠菌(Candidaalbicans)中的表型變化作為差別基因表達的直接結(jié)果發(fā)生(Soil,D.etal.,1995,C，.J.組73:1049-1057)。兩種不透明-特異性基因，PEP1和OP4，以及一種白色-特異性基因WH11,對病原性Candida中白色向不透明表型變化負責。雖然這與Candida中的毒力相關(guān)，但類似的現(xiàn)象可能在選擇具有優(yōu)異的單位生產(chǎn)力的細菌克隆中存在。也已經(jīng)針對A^^ehame"/"g"/cfe的病原性菌林鑒定了菌落變體。在這種情況下，表型多樣性與脂多糖和5類外膜蛋白的菌抹內(nèi)異質(zhì)性相關(guān)(Poolman,J.T.etal.,1985,,/.A/edA//craZ),o/.19:203-209)。Mason,C.A.etal.(1989,J;//.A^cra^W.Szo&c/mo/,32:54-60)也已經(jīng)描述了質(zhì)粒存在對DH5的生長和酶活性的影響，表明質(zhì)粒拷貝數(shù)對涉及碳新陳代謝的宿主細胞酶的表達具有直接影響。因而，具有不同的生長特征的E.co//克隆亞型的產(chǎn)生可能從多種不同的事件產(chǎn)生，包括但不限于DNA轉(zhuǎn)化過程誘導的突變或在選擇性富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌施加的壓力。在轉(zhuǎn)化的Eco/z'DH5細胞中早先所見的細菌異質(zhì)性顯示了兩種主要的菌落類型(如在PCT/US2005/002911中描述的；上文)。確定的是，至少具有稍后被鑒定為高質(zhì)粒生產(chǎn)性克隆的潛力的那些克隆，當平鋪在ColumbiaBloodAgar上并在28-30。C培養(yǎng)時形成了表型為灰色的菌落("灰色"克隆)。所述灰色菌落看起來是不規(guī)則形狀的、扁平的和半透明的。比較起來，當在ColumbiaBloodAgar上平鋪并在28-30。C培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)化的E.co/z'DH5細胞的群體的主要部分形成的菌落顏色是白色的，圓形形狀，并產(chǎn)生光滑的紋理("白色"克隆)。這些"白色，，克隆被鑒定為低質(zhì)粒生產(chǎn)性Eco//克隆。代表潛在的高產(chǎn)性克隆分離物的灰色克隆形成的菌落，當平鋪在化學合成的瓊脂培養(yǎng)基上時，不能與低質(zhì)粒生產(chǎn)性白色菌落區(qū)分。雖然潛在的高產(chǎn)灰色克隆可以直接從ColumbiaBloodAgar平板上純化，通常希望的是避免用于人類治療產(chǎn)物的生產(chǎn)的工業(yè)發(fā)了純化潛在高產(chǎn)性的克隆亞型(灰色克隆)，開發(fā)了有些費力和費時的雙份鋪板技術(shù)來確保用于最后的發(fā)酵過程的最終的灰色克隆亞型不與任何血液制品接觸(如PCT/US2005/002911中描述的；上文)。在選擇18攜帶質(zhì)粒DNA的潛在的高產(chǎn)性E.co/Z克隆亞型(即，灰色克隆)之后，高生產(chǎn)者篩選需要評估所述克隆亞型來確定從第一選擇步驟鑒定的哪些克隆實際上具有更高的單位生產(chǎn)力(即，每個細胞的質(zhì)?？截悢?shù))，其高于在相同的發(fā)酵條件下生長的、用相同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的、相同菌抹的未選擇的￡".co//細胞的單位生產(chǎn)力。攜帶DNA質(zhì)粒的未選擇的E.co//細胞的單位生產(chǎn)力可以通過計算攜帶相同質(zhì)粒DNA的所述細菌菌抹的克隆分離物群體的平均生產(chǎn)力來確定。技術(shù)人員將認識到，許多不同的選擇策略是可獲得的，以分離潛在的高產(chǎn)性細菌克隆。如PCT/US2005/002911(上文)中描述的高生產(chǎn)者篩選被證明在選擇高產(chǎn)克隆中非常有用，所述高產(chǎn)克隆用于質(zhì)粒的生產(chǎn)，所述質(zhì)粒用于一些DNA疫苗程序。因而，形態(tài)學表型與富集的高產(chǎn)克隆群體的相關(guān)性提供了選擇這種克隆的一種機制。雖然高生產(chǎn)者篩選導致了幾種DNA疫苗候選物的高產(chǎn)性種子材料的遞送，本發(fā)明人/申請人試圖研究異質(zhì)轉(zhuǎn)化體群體出現(xiàn)背后的理由，以圖進一步表征和可能改善篩選過程。為此，本發(fā)明人/申請人的一項早期的觀察結(jié)果是，Eco//DH5細胞的轉(zhuǎn)化效力，即，回收的、含質(zhì)粒的細胞的總數(shù)，與復合肉湯中相比，在合成培養(yǎng)基中更低多達三個數(shù)量級。因此，進行了實驗，其中DH5宿主細胞變?yōu)殡姼惺軕B(tài)的，并用復合培養(yǎng)基中的DNA疫苗質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，然后移到合成培養(yǎng)基中，以圖以一定方式轉(zhuǎn)化和回收細胞，所述方式最大化成功的轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)量。然而，在合成培養(yǎng)基中重新適應(yīng)和擴大生長之后，來自幾個克隆的一小部分提取的質(zhì)粒DNA被發(fā)現(xiàn)含有Eco/Z轉(zhuǎn)座子序列IS1。當在小規(guī)模發(fā)酵系統(tǒng)(例如，具有營養(yǎng)物給料的搖瓶("SFF，)系統(tǒng)，在PCT/US2005/002911中詳細地描述；上文)中培養(yǎng)來檢查質(zhì)粒DNA含量時，具有提高的IS1轉(zhuǎn)座的克隆都被表征為低生產(chǎn)者(類似于如上所述的白色克隆)。因而，在提高的IS1轉(zhuǎn)座和低產(chǎn)克隆的群體之間似乎存在相關(guān)性。這種信息被用于創(chuàng)建本發(fā)明的備選性篩選方案，其包括潛在的高質(zhì)粒生產(chǎn)性co//克隆的遺傳選擇。本發(fā)明涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的E.co//菌林的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，其包括在攜帶相同質(zhì)粒DNA的相同菌林的克隆亞型之間比較IS1轉(zhuǎn)座活性，其中顯示相對更低的轉(zhuǎn)座活性的克隆亞型代表了潛在的高產(chǎn)性克隆亞型。相對更低的轉(zhuǎn)座活性可以通過計算攜帶相同質(zhì)粒DNA的所述細菌菌抹的克隆分離物的群體的平均轉(zhuǎn)座活性來容易地確定，其中19被確定具有低于所述平均值的轉(zhuǎn)座活性的那些克隆亞型被鑒定為展現(xiàn)相對更低的轉(zhuǎn)座活性。因而，本發(fā)明涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的E.co//菌抹的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括(a)在攜帶相同質(zhì)粒DNA的相同菌株的至少兩種克隆亞型中比較IS1轉(zhuǎn)座活性，其中顯示相對更低的轉(zhuǎn)座活性的克隆亞型代表了潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；和(b)測試所迷潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的生產(chǎn)力；其中高產(chǎn)性克隆亞型展現(xiàn)每個細胞的高的質(zhì)?？截悢?shù)。在本發(fā)明的這個部分的一個實施方式中，IS1轉(zhuǎn)座活性通過測量從克隆亞型分離的質(zhì)粒DNA樣品中的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)來測定，其中相對更低的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)表明相對更低的ISl轉(zhuǎn)座活性。具有相對更低的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的克隆可以通過計算攜帶相同質(zhì)粒DNA的所迷細菌菌株的克隆分離物的群體的平均ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)來容易地確定，其中被確定具有低于所述平均值的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的那些克隆亞型被鑒定為展現(xiàn)相對更低的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，通過測量所述克隆亞型的基因組DNA的預定ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)一個或多個ISl轉(zhuǎn)座子序列的存在或缺乏來確定ISl轉(zhuǎn)座活性，其中ISl插入序列的缺乏表明相對更低的ISl轉(zhuǎn)座活性。指出克隆亞型的基因組DNA內(nèi)接受ISl序列插入的具體位置的過程在下文的實施例5中詳細地描述。本發(fā)明的一個實施方式涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的Kco"菌株的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括測量所述克隆亞型的質(zhì)粒DNA中ISl轉(zhuǎn)座子插入突變的相對數(shù)量，其中ISl轉(zhuǎn)座子插入突變的低數(shù)量是潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的指示。因而，本發(fā)明的一個實施方式涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的￡.co/z'菌抹的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括(a)從相同菌林并攜帶相同質(zhì)粒DNA的至少兩種克隆亞型分離質(zhì)粒DNA;(b)測量所述分離的質(zhì)粒DNA樣品中的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)，其中顯示了相對更低的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的克隆亞型代表潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；和(c)測試所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的生產(chǎn)力；其中高產(chǎn)性克隆亞型展現(xiàn)了每個細胞高的質(zhì)粒拷貝數(shù)。相對更低的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)可以通過計算所檢查的克隆分離物的群體的平均ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)來容易地確定，其中被確定具有低于所述平均值的質(zhì)粒IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的那些克隆亞型被鑒定為展現(xiàn)相對更低的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)。做為選擇，如果檢查了來自僅兩種克隆亞型的質(zhì)粒DNA樣品的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)，具有最低的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的克隆代表了顯示相對更低的ISI轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的克隆亞型。ISI是768》咸基對的可轉(zhuǎn)座元件，已知是最小的細菌插入序列(OhtsuboandSekine,7Vtms/c^aZ)/e五/e膨她，Ed.H.SaedlerandA.Gierl:Berlin:Springer,1996,1-26)。ISI轉(zhuǎn)座子序列的實例可以在NCBIGenBank核苦酸數(shù)據(jù)庫中找到，登記號X52534、X52537和U49270(IS1A/IS1E);X17345和X52535(IS1B/IS1C);X52536(IS1D);X52538(IS1F);和V00609(沒有周圍序列的IS1的干凈拷貝)。isi在E.co/z基因組中以多達10的拷貝數(shù)天然地發(fā)現(xiàn)，在野生型K-12菌抹中鑒定為6到8個拷貝(Deonier,EscherichiacoliSalmonellatyphimurium:CW/w/araw<iM/ecw/"rAo/ogy,Ed.F.Neidhardt,WashingtonD.C.:AmericanSocietyforMicrobiology,1987,2:982-989)。在轉(zhuǎn)座時，在插入的位點處通常產(chǎn)生目標序列的9bp的加倍(OhtsuboandSekine,1996,。雖然在Eco//中發(fā)現(xiàn)的ISI可以分成四種類型，僅IS1A/IS1E型(參見Genbank登記號NO.X52534、X52537和U49270)顯示了從染色體轉(zhuǎn)座到質(zhì)粒DNA(ChenandYeh,1997,FEMSMzcra^o/.丄饑36:275-280)。ISI以比其他插入序列高得多的頻率引起自發(fā)的插入突變(OhtsuboandSekine,1996,supra),已經(jīng)^皮鑒定為質(zhì)粒和染色體DNA中突變的原因性因子。例如，這種突變已經(jīng)顯示了抑制(完全地或部分地)毒性或應(yīng)激誘導基因的表達(NakamuraandInouye,1981,Mol.Gen.Genet.183:107-114;Nakahamaetal.,1986,Appl.Microbiol.Biotechnol.25:262-266;and,Toba-Minowa,1992,Gene121:25-33);通過破壞調(diào)節(jié)物或末端轉(zhuǎn)錄通讀來活化基因表達(Hall，1998,Mol.Biol.Evol.15:l畫5;and,Kobayashietal.,2001,J.Bacteriol.183:2646-2653);提高宿主細月包對重金屬的抗性(Itohetal.,1994,J.Ferment.Bioeng.78:466-468);以及，增強質(zhì)粒分離穩(wěn)定性(Chewetal.，1986,FEMSMicrobiol.Lett36:275-280)。在DNA疫苗候選物的一個樣品中鑒定了十一個獨特的插入位點，所有這些發(fā)生在新霉素抗性基因"aii的編碼區(qū)的100個堿基對之中或之內(nèi)(參見實施例3)。因此，十分可能的是，ISI轉(zhuǎn)座可能是一種機制，通過它，遺傳突變引起高產(chǎn)者和低產(chǎn)者(即，灰色和白色克隆)分化的出現(xiàn)。質(zhì)粒DNA中轉(zhuǎn)座子的存在首先作為瓊脂糖凝膠上的更高分子量條帶被注意到(參見實施例1)。采用了終點PCR分析，其中所謂的"完美匹配的引物1皮用于IS1的標準擴增反應(yīng)中。從5'末端開始，這些引物由9bp的不匹配的核苷酸，隨后是7或9bp的完美匹配的核苷酸構(gòu)成。使用這些引物產(chǎn)生了濃度敏感的分析，其中僅在模板DNA濃度高于未確定的閾值水平時IS1被擴增。這些分析僅得到定性的結(jié)果。因而，以求更好地表征某些DNA疫苗克隆關(guān)于轉(zhuǎn)座子含量的行為，設(shè)計了定量PCR("Q-PCR")分析來測量DNA疫苗候選物中(即，質(zhì)粒DNA本身之內(nèi))根據(jù)質(zhì)粒拷貝數(shù)的IS1拷貝相對數(shù)量。這種IS1/質(zhì)粒Q-PCR分析產(chǎn)生了ISl/質(zhì)粒拷貝比例，其代表了來自轉(zhuǎn)化的co/,'克隆亞型的分離的質(zhì)粒DNA樣品中IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的度量。該分析利用了熒光TaqMan探針技術(shù)來允許;險測PCR期間積累的特定產(chǎn)物。由于TaqDNA聚合酶的核酸外切酶活性消化了熒光探針，分離了5'末端的報告染料和3'末端的淬滅劑染料，發(fā)射出熒光。在PCR運行的過程中，來自報告染料的熒光指數(shù)地積累，并被實時地監(jiān)測。對比循環(huán)數(shù)來繪制熒光幅度，通過幅度達到用戶定義的設(shè)置點、稱為閾值循環(huán)(CT)的點來確定數(shù)量。因而模板DNA拷貝數(shù)可以根據(jù)從樣品平板中一組已知的模板數(shù)量產(chǎn)生的外部標準曲線來內(nèi)推，或者相對拷貝數(shù)可以通過以多重模式操作并包括反應(yīng)孔中參考模板的定量來測定。類似地開發(fā)了第二多重Q-PCR分析來計算質(zhì)粒制品中剩余的基因組DNA貢獻的IS1的預計數(shù)量。這個產(chǎn)生23srDNA/質(zhì)?？截惐壤?。23srDNA/質(zhì)粒拷貝比例可以從ISl/質(zhì)?？截惐壤袦p去，來產(chǎn)生"校正的"ISl/質(zhì)?？截惐壤?，其考慮了由分離的質(zhì)粒DNA樣品中殘余的基因組DNA貢獻的可能的IS1擴增，提供了質(zhì)粒IS1含量的更精確的讀數(shù)。在103到108個質(zhì)粒DNA拷貝每]LiL的范圍內(nèi)，利用這些分析的所有目標的定量被發(fā)現(xiàn)是線性的，容許在100%(1:1)到0.001%(1:105)的范圍內(nèi)的ISl/質(zhì)粒拷貝比例的檢測。這種分析是高度敏感的，而結(jié)果表明大約5-10%的IS1級分是在瓊脂糖凝膠上可見所需的。不受任何特定理論的限制，不可能的是，質(zhì)粒DNA中的IS1插入，特別是如VlJns質(zhì)粒所見的(參見實施例3)主要發(fā)生在抗生素抗性基因內(nèi)的那些，將影響質(zhì)?？截悢?shù)或影響克隆的擴增性質(zhì)。然而，插入序22列向質(zhì)粒DNA中的轉(zhuǎn)座引起了IS1拷貝數(shù)的增加，以及可想象地，提高的回到基因組中的轉(zhuǎn)座的能力。在co//菌抹中的鎘抗性的獲得中觀察到了這種行為(Itohetal.,1994;同上)。為了從尸膽t/o膨謹pw腦克隆對鎘抗性負責的基因，獲得了攜帶具有0.8Kb插入物的pBR322的Eco//轉(zhuǎn)化體。一旦宿主獲得了質(zhì)粒，就保持了鎘抗性；然而，后來該插入物被鑒定為來自Eco/,'的IS1而不是來自尸./7她cfo的DNA。還鑒定了染色體重排，得到的結(jié)論是，從質(zhì)?；氐交蚪M的IS1轉(zhuǎn)座改變了表型。因而，如在此描述的，不受到任何特定理論的約束，從基因組到質(zhì)粒DNA以及再次返回的IS1轉(zhuǎn)座可以促進低質(zhì)粒生產(chǎn)性co//克隆亞型的形成。以上描述的Q-PCR分析通過定量測定所述克隆內(nèi)含有的質(zhì)粒DNA內(nèi)的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)，被用于間接地測量細菌克隆亞型中ISl插入突變的增加。具有顯著轉(zhuǎn)座活性的質(zhì)粒DNA樣品都分離自低質(zhì)粒生產(chǎn)性克隆，高質(zhì)粒生產(chǎn)性克隆含有低水平的基于質(zhì)粒的ISl的觀察結(jié)果，支持了低生產(chǎn)性克隆與ISl插入突變相關(guān)的所提出的理論。雖然早先描述的高生產(chǎn)者篩選的第一個選擇標準涉及形態(tài)學表型的分析，但這僅僅是質(zhì)粒擴增行為的代表。因而，如在此描述的，五.co/克隆亞型也可以根據(jù)它們關(guān)于ISl轉(zhuǎn)座的穩(wěn)定性和它們的高質(zhì)粒滴度的保持來被表征。測量質(zhì)粒DNA樣品中ISl的所描述的Q-PCR分析提供了相對瓊脂糖凝膠電泳和終點PCR分析的幾個重要的優(yōu)點。首先，該分析是高度特異性的。通過它對特別設(shè)計的寡核普酸引物和熒光探針的依賴，它可以容易地區(qū)分含有ISl轉(zhuǎn)座子的樣品、含有其他轉(zhuǎn)座子(例如，IS5)的樣品和轉(zhuǎn)座子陰性樣品。第二，Q-PCR技術(shù)提供的高水平的敏感性容許在六個log的模板DNA濃度上定量ISl轉(zhuǎn)座，而檢測濃度至少低至100個拷貝每的目標(例如，對于VlJnspg/ml)。因此，本發(fā)明涉及選擇方案來鑒定攜帶質(zhì)粒DNA的￡.co/!'菌抹、包括但不限于K-12￡.co"菌抹，例如DH5菌抹的高產(chǎn)的克隆亞型，包括測量來自攜帶相同質(zhì)粒DNA的相同菌株的至少兩種克隆亞型的分離的質(zhì)粒DNA樣品中ISl轉(zhuǎn)座子拷貝的相對數(shù)量(即，IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù))，并選擇顯示相對更低的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的克隆亞型；其中顯示相對更低的ISl轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的克隆被鑒定為潛在的高產(chǎn)性克隆亞型。然后評估所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的單位生產(chǎn)力(即，每個細胞的質(zhì)?？截悢?shù))來確定它是否實際上是高產(chǎn)性克隆亞型?？紤]的是，這種基于Q-PCR的遺傳選擇過程可以用于分析攜帶相同質(zhì)粒DNA的相同Eco//菌抹的超過兩種克隆亞型，從而產(chǎn)生IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的數(shù)值范圍。在這種情況下，人們可以選擇評估不僅顯示最低IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的克隆亞型的單位生產(chǎn)力，還有降至低于所分析的克隆的平均IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的可管理數(shù)量的克隆亞型的單位生產(chǎn)力。使用發(fā)酵系統(tǒng)、優(yōu)選小規(guī)模發(fā)酵系統(tǒng)來評估潛在的高產(chǎn)性克隆分離物，其大小將松散地取決于要使用的最終的發(fā)酵過程的大小。例如，為了幫助鑒定將用于"大規(guī)模"質(zhì)粒DNA生產(chǎn)過程(即，總發(fā)酵體積大于可以容納大于約1000L的發(fā)酵體積的標準實驗室生物反應(yīng)器，可以包括大到10,000到100,000L的發(fā)酵容器)，一般在這種小規(guī)模評估階段使用從約250ml到約1L的燒瓶。小規(guī)模發(fā)酵系統(tǒng)應(yīng)當也模擬最終的商業(yè)的、大規(guī)模的發(fā)酵過程。如在公開高生產(chǎn)者篩選的共同待決申請(PCT/US2005/002911;上文)中詳細描述的，潛在的高產(chǎn)性克隆分離物可以使用具有營養(yǎng)物給料的搖瓶("SFF")發(fā)酵系統(tǒng)來評估，從而每個燒瓶在發(fā)酵期間補充連續(xù)的營養(yǎng)物給料。搖瓶系統(tǒng)代表了小規(guī)模發(fā)酵系統(tǒng)，其中所述克隆分離物被培養(yǎng)在不超過約1000ml的擋板搖瓶、優(yōu)選的250ml的擋板搖瓶中。在一個實施方式中，展現(xiàn)了每個細胞的高質(zhì)?？截悢?shù)的高產(chǎn)性克隆亞型被測定具有大于或等于約20pgDNA/嗎DCW的單位生產(chǎn)力。用于評估單位生產(chǎn)力的可選擇的測量，一般用于小規(guī)模發(fā)酵，是基于OD2團粒，其代表當重懸浮在lml溶液中時得到600nm下OD=2的細胞團。因而，在另一個實施方式中，展現(xiàn)每個細胞的高質(zhì)?？截悢?shù)的高產(chǎn)性克隆亞型被測定具有大于或等于約15(agDNA/(igOD2團粒的單位生產(chǎn)力。如上所述，本發(fā)明涉及定量PCR("Q-PCR")分析，例如TaqManPCR分析，用于測量候選DNA疫苗的質(zhì)粒DNA樣品內(nèi)的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)。所述Q-PCR分析方法測量根據(jù)質(zhì)粒拷貝數(shù)的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的相對數(shù)量，通過擴增位于IS1核苷酸序列內(nèi)的質(zhì)粒DNA的第一核苷酸序列和預先確定沒有IS1插入的質(zhì)粒DNA的第二核苷酸序列，產(chǎn)生ISl/質(zhì)?？截惐壤?，其代表分離自E.co/z克隆亞型的質(zhì)粒DNA樣品中IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的數(shù)量(即，IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù))。技術(shù)人員可以容易地鑒定質(zhì)粒DNA內(nèi)具有接受IS1插入的低概率的位置(參見，例如，實施例3)。在一24個實施方式中，以多重方式進行分析，從而第一(即，IS1的序列)和第二(即，無IS1的序列)核苷酸序列在同一反應(yīng)試管中擴增，降低變異性?；?'核酸外切酶熒光PCR的分析(TaqManPCR)在本領(lǐng)域中描述了，其容許實時地檢測PCR產(chǎn)物并消除對放射性的需要。參見，例如，美國專利No.5,538,848;和Hollandetal.,1991,尸亂淑/.JcW.88:7276-7280。這種方法利用了標記的探針，包括熒光報告物(熒光團)和淬滅劑，其與PCR引物之間的目標DNA雜交。熒光團的激發(fā)引起熒光團的熒光信號的釋放，其被所述淬滅劑淬滅。通過TaqDNA聚合酶的5'到3'核酸外切酶活性，可以檢測擴增子，其降解在PCR引物的延伸期間遭遇的雙鏈DNA,因而從探針上釋放熒光團。此后，熒光信號不再被淬滅，與目標DNA的數(shù)量直接相關(guān)的熒光信號的積累可以用自動化的焚光計實時地檢測。用于進行TaqManPCR反應(yīng)的自動化的焚光計是本領(lǐng)域公知的，可以適用于這種特殊的分析，例如，來自Bio-RadLaboratories(Hercules,CA)的iCycler,和來自Stratagene(LaJolla,CA)的Mx4000。在本發(fā)明的一個實施方式中，作為本發(fā)明的一部分描述的Q-PCR分析可以用ABIPrism7900HT序列檢測儀器(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)進行。這種儀器使用光譜圖來將熒光發(fā)射分離(根據(jù)波長)成可預測的空間模式越過電荷耦合器件(CCD)照相機。ABIPrism7900HT的序列檢測系統(tǒng)應(yīng)用從CCD相機采集熒光信號并進行數(shù)據(jù)分析算法。在作為本發(fā)明的一部分描述的Q-PCR分析中使用的核酸聚合酶必需具有5'到3'核酸外切酶活性。幾種適合的聚合酶是本領(lǐng)域已知的，例如,Taq(TTzermiM1a《,/7cws)、Tbr(7Te，z^6rach'awz^)和Tth(77ze，z^//zermo//n7^)聚合酶。TaqDNA聚合酶是用于本發(fā)明的優(yōu)選的聚合酶。5'到3'核酸外切酶活性特征在于降解在PCR引物的延伸期間遭遇的雙鏈DNA。與擴增子退火的熒光探針將以類似方式被降解，從而從所述寡核苷酸上釋放熒光團。在熒光團和淬滅劑解離時，熒光團發(fā)射的焚光不再被淬滅，其引起熒光方面可檢測的變化。在PCR產(chǎn)物的指數(shù)增長期間，擴增子特異性熒光提高到一個點，在此，序列檢測應(yīng)用程序在對復合光譜應(yīng)用多組分算法之后，可以將它從未擴增的樣品的背景熒光中辨別出來。ABIPrisn^7900HT序列檢測儀器還包括軟件應(yīng)用，其測定樣品的閾但循壞(Ct)(這種熒光提高到預定的闊值之上時的循環(huán))。PCR陰性樣品具有等于所進行的循環(huán)總數(shù)的CT,PCR陽性樣品具有低于所進行的循環(huán)總數(shù)的CT。本發(fā)明的寡核苷酸探針和引物可以通過許多方法合成。參見，例如，Ozakietal.,1992,M/c/"'c^c油Ae廳n^20:5205-5214;Ag匿aletal.,1990,A^c/e/cJc^y/^wwc/z18:5419-5423。例如，寡核苷酸探針可以在自動化DNA合成儀，例如ABI3900DNA合成儀(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)上合成。例如，產(chǎn)生非天然的主干基團，例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等等的可選擇的化學作用也可以被采用，只要產(chǎn)生的寡核苷酸的雜交效率不受到不利的影響。本發(fā)明的PCR擴增步驟可以通過本領(lǐng)域公知的標準技術(shù)進行(參見,例如；Sambrook,E.F.etal.,C7om'wg..爿Z/a6orato^yA^mwa/,2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989);美國專利No.4,683,202;和尸C7/Vc^oco/rJGw油A/^ocfe(3wcM//7//ca〃'o/m,Eds.Innisetal.,SanDiego:AcademicPress,Inc.(1990);均通過引用合并在此)。PCR循環(huán)條件一般包括起始變性步驟，其可以通過加熱PCR反應(yīng)物到約8(TC到約105T的溫度范圍，約1到約10分鐘的時間范圍來進行。熱變性之后一般是多個循環(huán)，從約20個到約50個循環(huán)，每個循環(huán)通常包括起始變性步驟，隨后是引物退火步驟，以引物延伸步驟結(jié)束。做為選擇，每個循環(huán)可以包括溫度從約80。C到約105。C的變性步驟，隨后是在更低的溫度，從約60。C到約75。C的引物退火/延伸步驟。通過核酸聚合酶，例如Taq聚合酶的引物的酶延伸，產(chǎn)生了模板的拷貝，其可以用作隨后的循環(huán)的模板。"熱起始(hotstart)，，PCR反應(yīng)可以與本發(fā)明的方法一起使用，來消除錯誤啟動(priming)和非特異性擴增子的產(chǎn)生。為此，在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，核酸聚合酶是AmpliTaqGoldDNA聚合酶，PCR循環(huán)條件包括"熱起始，，PCR反應(yīng)。所述聚合酶在活化之前是無活性的，這可以通過在PCR循環(huán)之前在95°C孵育PCR反應(yīng)成分大約10分鐘來實現(xiàn)。包含相似的起始孵育步驟的PCR方法作為"熱起始"PCR分析是本領(lǐng)域已知的。在本發(fā)明的一個實施方式中，使用長度從約15個到約40個核苷酸的、用于在此描述的TaqManQ-PCR分析的寡核苷酸探針。在另一個實施方式中，所述寡核苷酸探針長度在約15個到約30個核苷酸的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的第三實施方式中，所述寡核苷酸探針長度在約18個到約28個核苷酸的范圍內(nèi)。本發(fā)明的寡核苷酸探針的確切序列和長度部分地取決于它結(jié)合的目標多核苷酸的性質(zhì)?？梢愿淖兘Y(jié)合位置和長度來實現(xiàn)對特定的實施方式適合的退火和熔化性質(zhì)。寡核普酸探針的3'末端核苷酸優(yōu)選地通過核酸聚合酶被封閉或使之不能延伸。由于DNA聚合酶僅可以添加核苷酸到3'羥基而不能添加到3'磷酸，因此這種封閉通過3'末端核苷酸的磷酸化來方便地進行。本發(fā)明的熒光團可以在探針的任何位置連接到所述探針，包括5'末端、3'末端或任一末端的內(nèi)部，即，所述熒光團可以連接到任何一個核苷酸，包括能夠與該探針被設(shè)計以進行檢測的目標DNA雜交的特定核苷酸序列。在本發(fā)明的一個實施方式中，熒光團連接到核苦酸的特定序列的5'末端核苷酸，淬滅劑連接到核苷酸的特定序列的3'末端核普酸。本發(fā)明中使用的熒光團優(yōu)選的是熒光有機染料，其被衍生化用于經(jīng)由連接部分附著到探針的3'碳或末端5'碳。淬滅劑分子優(yōu)選的也是有機染料，其可以是或可以不是熒光的。一般地，無論所述淬滅劑分子是焚光的還是僅通過非放射性衰變釋放從報告物轉(zhuǎn)移的能量，淬滅劑的吸收譜帶應(yīng)當基本上重疊報告分子的熒光發(fā)射譜帶。從激發(fā)的報告分子吸收能量的、但是不放射性地釋放能量的非熒光淬滅劑分子，被稱為"暗淬滅劑，，或"非熒光淬滅劑"。本領(lǐng)域描述了幾種焚光團-淬滅劑配對。參見，例如，Pesceetal.,editors,F/womscewceS/ec/rosco/7乂MarcelDekker,NewYork(1971);Whiteetal,F/worescewceJwa/戸's:j尸rac/v'ca/^woac/z,MarcelDekker,New20York(1970);等等。文獻還包括提供熒光和非熒光分子以及它們的相關(guān)光學性質(zhì)的詳細清單的參考文獻，例如Berlman,//朋WooA:F/wo潛ce"ceS/re"ra爿to腦"cM/ecw/es,2ndedition,NewYork:AcademicPress(1971)。進一步的，對于衍生化報告物和淬滅劑分子用于經(jīng)由可以添加到寡核苷酸的常見的反應(yīng)基團來共價附著，文獻中存在著廣泛的指導。參見，例如，美國專利NO.3,996,345和美國專利No.4,351,760。示范性的熒光團-淬滅劑配對可以選自卩占噸染料，包括熒光素和羅丹明染料。這些化合物的許多適合的形式是廣泛可用的，具有在它們的苯基部分上的取代基，其可以用作用于鍵合的位點，或作為用于附著到寡核苷酸的鍵合官能團。另一組熒光化合物是萘胺，具有在a或p位置中的氨基。在這種萘胺化合物中包括的是l-二曱基氨基萘基-5-磺酸，1-苯胺基8-萘磺酸和2-p-touidinyl-6-萘磺酸。其他染料包括3-苯基-7-異氰酸酯基香豆素、吖啶，例如9-異硫氰酸酯基吖啶和吖啶橙；N-(p-(2-苯并嗜唑基)苯基)馬來酰亞胺；苯并二唑，D二苯乙烯，嵌二萘，等等。在本發(fā)明的一個實施方式中，熒光團和淬滅劑分子選自熒光素和羅丹明染料。這些染料和用于連接到寡核苷酸的適當?shù)倪B接方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Marshall,1975,/^/oc/^m,c"/丄7:299-303;和美國專利No.5,188,934。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，熒光團選自由6-羧基-熒光素(FAM);AppliedBiosystems專有的熒光團，VIC;6-羧基_4',5'_二氯_2',7'二曱氧基熒光素(joe);和5-四氯-熒光素(tet)構(gòu)成的組。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，淬滅劑分子是熒光的，例如6-羧基-四甲基-羅丹明(TAMRA)。優(yōu)選的，采用商業(yè)上可獲得的連接部分，其可以在合成期間附著于寡核苷酸，例如，可從ClontechLaboratories(PaloAlto,Calif.)獲得。在本發(fā)明的一個實施方式中，通過擴增位于IS1核苷酸序列內(nèi)的質(zhì)粒DNA的第一核苷酸序列和確定沒有IS1插入的質(zhì)粒DNA的第二核普酸序列，來測定ISl/質(zhì)?？截惐壤渲兴鲑|(zhì)粒DNA的第一和第二核苷酸序列在存在核酸聚合酶和一組寡核苷酸的情況下分別地擴增。用于擴增第一核苷酸序列的寡核苷酸組由以下構(gòu)成(i)與IS1核苦酸序列的第一位置雜交的正向PCR引物；(ii)與所述第一位置下游的IS1核苷酸序列的第二位置雜交的反向PCR引物；和(iii)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量；所述探針與所述第一和第二位置之間的IS1核苷酸序列內(nèi)的位置雜交。用于擴增第二核苷酸序列的寡核苷酸組由以下構(gòu)成(i)與第二核普酸序列的第一位置雜交的正向PCR引物；(ii)與所述第一位置下游的第二核苷酸序列的第二位置雜交的反向PCR引物；和(iii)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量；所述探針與所述第一和第二位置之間的第二核普酸序列內(nèi)的位置雜交。核酸聚合酶在擴增期間消化所述熒光探針來將所述焚光團從所述淬滅劑分子上解離，檢測在熒光團和淬滅劑分子解離時熒光的改變，焚光的改變相應(yīng)于第一和/或第二核苷酸序列的擴增的發(fā)生。在進一步的實施方式中，所述第一和第二核苷酸序列以多重方式同時地擴增。在另一個實施方式中，能夠擴增IS1的核苷酸序列的正向和反向PCR引物分別由IS1國Q國F(5'-AGGCTCATAAGACGCCCCA-3';SEQIDNO:6)和IS1畫Q-R(5'-ACGGTTGTTGCGCACGTAT國3';SEQIDNO:7)組成，所述熒光探針由IS1-Q-P2(5'-CGTCGCCATAGTGCGTTCACCG-3';SEQIDNO:8)組成，其中所述探針用熒光團和淬滅劑分子標記，如上所述。在一個實施方式中，所述IS1-Q-F探針在3'末端用淬滅劑分子TAMRA標記，在5'末端用焚光團FAM標記。在本發(fā)明的這個部分的進一步的實施方式中，與IS1核苷酸序列一起被擴增的確定沒有IS1插入的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列是質(zhì)粒DNA的啟動子序列，包括但不限于CMV啟動子序列(例如，人類CMV啟動子)。在一個實施方式中，能夠擴增CMV啟動子的核普酸序列的正向和反向PCR引物可以分別由CMV-Q-F(5'畫GTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCA畫3';SEQIDNO:3)和CMV-Q-R(5'-GGAGGTCAAAACAGCGTGGAT誦3';SEQIDNO:4)組成，熒光探針可以由CMV-Q-P2(5'-TCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTG誦3';SEQIDNO:5)組成，其中所述探針用熒光團和淬滅劑分子標記，如上所述。在一個實施方式中，所述CMV-Q-P2探針在3'末端用淬滅劑分子TAMRA標記，在5'末端用熒光團VIC標記。因而，本發(fā)明進一步涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的E.co//菌林的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括(a)從攜帶相同質(zhì)粒DNA的相同菌抹的至少兩種克隆亞型分離質(zhì)粒DNA;(b)使用定量PCR分析測量來自第一克隆亞型的所述分離的質(zhì)粒DNA樣品中基于質(zhì)?？截悢?shù)的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的相對數(shù)量；其中所述分析擴增位于IS1核苷酸序列內(nèi)的質(zhì)粒DNA的第一核苷酸序列，和確定沒有IS1插入的質(zhì)粒DNA的第二核苦酸序列，產(chǎn)生ISl/質(zhì)?？截惐壤?c)比較來自第一克隆亞型的ISl/質(zhì)?？截惐壤蛠碜詳y帶相同質(zhì)粒DNA的相同菌林的至少第二克隆亞型的ISl/質(zhì)粒拷貝比例；(d)選擇顯示了相對更低的ISl/質(zhì)?？截惐壤目寺?，其中顯示相對更低的ISl/質(zhì)粒拷貝比例的克隆被鑒定為潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；和(e)測試所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的生產(chǎn)力；其中高產(chǎn)性克隆亞型展現(xiàn)每個細胞高的質(zhì)?？截悢?shù)。如早先描述的，開發(fā)第二多重Q-PCR分析來計算測試的￡.co//克隆亞型的質(zhì)粒DNA樣品中剩余的基因組DNA貢獻的IS1預計數(shù)量，通過允許IS1轉(zhuǎn)座活性增加的更精確的定量來進一步提高所公開的遺傳選擇過程的特異性。在標準的質(zhì)粒DNA制備中，基因組DNA與變性的蛋白質(zhì)共同沉淀，從質(zhì)粒DNA中分離，并^皮丟棄。因而，雖然從細菌細胞發(fā)酵物分離的質(zhì)粒DNA樣品主要含有質(zhì)粒DNA,可能存在少量的基因組DNA污染。例如，用QIAGEN柱純化的質(zhì)粒DNA可以含有按重量計高達3.3%的基因組DNA(Vilaltaetal.,2002,顛/,ca/腸c/z縫301:151-153)。雖然基因組DNA污染可能是微小的，但本發(fā)明的Q-PCR分析的高敏感性將允許檢測位于所述剩余的基因組DNA內(nèi)的IS1轉(zhuǎn)座子。因為在此描述的ISl/質(zhì)?？截惐壤治霾荒軈^(qū)分位于質(zhì)粒DNA內(nèi)的IS1和位于基因組/染色體DNA內(nèi)的IS1,開發(fā)這種第二多重Q-PCR來計算基線剩余基因組DNA貢獻的IS1數(shù)量。因而，在本發(fā)明的一個實施方式中，如上所述的ISl/質(zhì)粒拷貝比例，代表根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)的IS1拷貝的相對數(shù)量(即，IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù))，是通過減去質(zhì)粒DNA樣品中存在的剩余基因組DNA貢獻的IS1拷貝的預計數(shù)量來校正的，其中來自質(zhì)粒DNA樣品中存在的剩余基因組DNA的IS1拷貝的預計數(shù)量使用定量PCR分析來測量。因為，如上所述，ISl/質(zhì)?？截惐壤治霾荒軈^(qū)分基于質(zhì)粒和基于染色體的IS1，為了校正剩余基因組DNA可能的IS1貢獻，Q-PCR分析測量了染色體DNA的組分，其^L認為以與所述染色體DNA中基線IS1相似的數(shù)量存在。例如，6到8個拷貝之間的IS1存在于E.co"K-12基因組中(OhtsuboandSekine,1996;上文),發(fā)明人/申請人:的Southern印跡實^^顯示了在DH5細胞中的IS1拷貝數(shù)是6或7(參見實施例2)。類似地，23srDNA基因以每個細胞7個拷貝存在于五.co/z'基因組中(Jinks-RobertsonandNomura,EscherichiacoliSalmonellatyphimurium:CW/w/arM/ecw/<arA'o/ogy,Ed.F.Neidhardt:WashingtonD.C.:AmericanSocietyforMicrobiology,1987,2:1358-1385)。因而，在分離的質(zhì)粒DNA樣品中23srDNA拷貝的定量測定提供了來自剩余基因組DNA的、所公開的Q-PCR分析中測量的IS1拷貝數(shù)的良好的近似值。因而，在本發(fā)明的一個實施方式中，如上所述的ISl/質(zhì)?？截惐壤?，是通過減去來自質(zhì)粒DNA樣品中存在的剩余基因組DNA的IS1拷貝的30預計貢獻來校正的，其中來自質(zhì)粒DNA樣品中存在的剩余基因組DNA的IS1拷貝的預計貢獻使用Q-PCR分析來測量。在進一步的實施方式中，所述Q-PCR分析測量根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)的23srDNA的相對數(shù)量，通過擴增23srDNA序列內(nèi)基因組DNA的核普酸序列和確定沒有IS1插入的、用來產(chǎn)生ISl/質(zhì)?？截惐壤馁|(zhì)粒DNA的相同核苷酸序列，產(chǎn)生23srDNA/質(zhì)粒拷貝比例，其從ISl/質(zhì)?？截惐壤袦p去來提供"校正的"IS1/質(zhì)?？截惐壤?。在本發(fā)明的另一個實施方式中，通過擴增23srDNA序列內(nèi)的基因組DNA的核苷酸序列和確定沒有IS1插入的質(zhì)粒DNA的相同核苷酸序列(即，當產(chǎn)生ISl/質(zhì)?？截惐壤龝r擴增的第二核苷酸序列)，來確定23srDNA/質(zhì)粒拷貝比例，其中位于23srDNA序列內(nèi)的核苷酸序列和第二核苷酸序列分別在存在核酸聚合酶和一組寡核苷酸的情況下擴增。用于擴增23srDNA核普酸序列的寡核苷酸組由以下構(gòu)成(i)與23srDNA序列的第一位置雜交的正向PCR引物；(ii)與所述第一位置下游的23srDNA序列的第二位置雜交的反向PCR引物；和(iii)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量；所述探針與所述第一和第二位置之間的23srDNA序列內(nèi)的位置雜交。用于擴增第二核苷酸序列的寡核苷酸組由以下構(gòu)成(i)與第二核普酸序列的第一位置雜交的正向PCR引物；(ii)與所述第一位置下游的第二核苷酸序列的第二位置雜交的反向PCR引物；和(iii)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量；所述探針與所述第一和第二位置之間的第二核苷酸序列內(nèi)的位置雜交。核酸聚合酶在擴增期間消化所述熒光探針來將所述熒光團從所述淬滅劑分子上解離，檢測熒光團和淬滅劑分子解離時熒光的改變，焚光的改變相應(yīng)于23srDNA序列和/或第二核苷酸序列的擴增。在進一步的實施方式中，所述23srDNA和第二核苷酸序列以多重方式同時地擴增。在進一步的實施方式中，能夠擴增基因組DNA內(nèi)的23srDNA的核苷酸序列的正向和反向PCR引物分別由23s-FlD(5'-GAAAGGCGCGCGATACAG-3';SEQIDNO:11)和23s國RlD(5'-GTCCCGCCCTACTCATCGA-3';SEQIDNO:12)組成，所述熒光〗罙針由23s-Pfam(5'-CCCCGTACACAAAAATGCACATGCTG-3';SEQIDNO:13)組成，其中所述探針用熒光團和淬滅劑分子標記，如上所述。在一個實施方式中，所述23s-Pfam探針在3'末端用淬滅劑分子TAMRA標記，在5'末端用焚光團FAM標記。在本發(fā)明的這個部分的另一個實施方式中，與來自剩余基因組DNA的23srDNA核苦酸序列一起-故擴增的確定沒有IS1插入的質(zhì)粒DNA的核普酸序列是質(zhì)粒DNA的啟動子序列，包括但不限于CMV啟動子序列(例如，人類CMV啟動子)，產(chǎn)生23srDNA/CMV拷貝比例。因而，本發(fā)明進一步涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的Eco/z菌抹的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括(a)從攜帶相同質(zhì)粒DNA的相同菌林的至少兩種克隆亞型分離質(zhì)粒DNA;(b)使用定量PCR分析測量第一質(zhì)粒DNA樣品中根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的相對數(shù)量，其中所述分析擴增位于IS1核苷酸序列內(nèi)的質(zhì)粒DNA的第一核苷酸序列，和預先確定沒有IS1插入的質(zhì)粒DNA的第二核苷酸序列，產(chǎn)生ISl/質(zhì)?？截惐壤?；(c)使用測量根據(jù)質(zhì)?？截惖?3srDNA的相對數(shù)量的定量PCR分析，計算所述第一質(zhì)粒DNA樣品中存在的剩余基因組DNA貢獻的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的預計數(shù)量，其中所述分析擴增位于23srDNA序列內(nèi)的基因組DNA的核苦酸序列和步驟(b)的第二核苷酸序列，產(chǎn)生23srDNA/質(zhì)粒拷貝比例；(d)從ISl/質(zhì)粒拷貝比例中減去該23srDNA/質(zhì)?？截惐壤齺懋a(chǎn)生校正的ISl/質(zhì)粒拷貝比例；(e)比較來自所述第一質(zhì)粒DNA樣品的校正的ISl/質(zhì)?？截惐壤蛠碜灾辽俚诙|(zhì)粒DNA樣品的校正的ISl/質(zhì)?？截惐壤?；(f)選擇顯示了相對更低的校正的ISl/質(zhì)?？截惐壤目寺。渲酗@示相對更低的校正的ISl/質(zhì)?？截惐壤目寺”昏b定為潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；和，(g)測試所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的生產(chǎn)力；其中高產(chǎn)性克隆亞型展現(xiàn)每個細胞高質(zhì)粒拷貝數(shù)。在本發(fā)明的這個部分的一個實施方式中，確定沒有IS1轉(zhuǎn)座子插入的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列是質(zhì)粒DNA的啟動子區(qū)域，包括但不限于所述質(zhì)粒的CMV啟動子區(qū)域，因而，例如，產(chǎn)生IS1/CMV和/或校正的IS1/CMV拷貝比例。雖然以上詳細描述的遺傳選擇過程包括通過測量質(zhì)粒DNA本身中IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)來評估攜帶質(zhì)粒DNA的五.co"亞型中IS1插入突變的程度，但本發(fā)明進一步涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的Eco"菌抹的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，其包括檢測所述克隆亞型的基因組DNA中提高的IS1插入突變?？山?jīng)受高通量分析的基于PCR的分析是考慮到的，其將檢測預計接受IS1插入的基因組DNA的區(qū)域(即，"預計的IS1插入?yún)^(qū)域")內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子序列的存在或缺乏。在這個預計的區(qū)域內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子插入的存在或缺乏不應(yīng)當與未轉(zhuǎn)化的細菌菌抹的基因組DNA中存在的基線ISl轉(zhuǎn)座子混淆。相反，這個預計的ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)的ISl插入在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到細菌細胞中之后發(fā)生。參見下文的實施例2，RFLP分布型顯示了低產(chǎn)性DNA疫苗克隆和細菌基因組DNA內(nèi)ISl拷貝的提高的數(shù)量之間的相關(guān)性。因而，本發(fā)明進一步涉及4兆選攜帶質(zhì)粒DNA的￡.co/z菌抹的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括檢測預先確定為ISl插入的區(qū)域(即，"預計的ISl插入?yún)^(qū)域")的所述克隆亞型的基因組DNA的區(qū)域內(nèi)一個或多個IS1轉(zhuǎn)座子插入序列的存在或缺乏，其中在所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)缺乏IS1轉(zhuǎn)座子序列的克隆亞型代表潛在的高產(chǎn)性克隆亞型。為此，本發(fā)明涉及挑選攜帶質(zhì)粒DNA的E.co//菌抹的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括(a)檢測所述克隆亞型的基因組DNA的預定的ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)ISl轉(zhuǎn)座子序列的存在或缺乏，其中在所述插入?yún)^(qū)域內(nèi)缺乏ISl轉(zhuǎn)座子序列的克隆亞型代表潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；和(b)測試所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的生產(chǎn)力；其中高產(chǎn)性克隆亞型展現(xiàn)每個細胞的高的質(zhì)粒拷貝數(shù)?；赑CR的分析，包括但不限于定量PCR分析("Q-PCR")，可以用于^r測所述基因組DNA的預定的ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)ISl轉(zhuǎn)座子序列的存在或缺乏。確定細菌克隆亞型的基因組DNA內(nèi)ISl插入?yún)^(qū)域的位置的過程在下文的實施例5中詳細地描述。在本發(fā)明的一個實施方式中，Q-PCR分析被用于檢測在所述Eco/Z的轉(zhuǎn)化之后預先確定為接受IS1插入的Eco//克隆亞型的基因組DNA的一部分內(nèi)ISl插入突變的提高，其中所述預計的ISl插入?yún)^(qū)域跨越所述基因組DNA的低于約20個連續(xù)核苷酸。如果所述ISl插入?yún)^(qū)域跨越所述基因組DNA的低于約20個連續(xù)核苷酸，在此所述區(qū)域?qū)⒈环Q為特異性"IS1插入位點"。TaqManQ-PCR分析是考慮的，其通過試圖擴增含有這個預定的ISl插入?yún)^(qū)域(即，ISl插入位點)的基因組DNA的一部分來檢測這個ISl插入位點內(nèi)ISl插入序列的存在或缺乏；參見附圖7A中考慮的分析的示意圖。當使用被設(shè)計以跨越IS1插入位點的熒光探針時，僅當沒有ISl序列^f皮插入預定的ISl插入位點時發(fā)生正常的擴增和信號產(chǎn)生。因而，在本發(fā)明的一個實施方式中，Q-PCR分析是被考慮的，其包33括在存在核酸聚合酶和一組寡核苷酸的情況下擴增預計接受IS1轉(zhuǎn)座子序列的基因組DNA的區(qū)域，所述一組寡核苷酸由以下構(gòu)成(i)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量，其中僅當所述基因組DNA缺乏所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)的ISl轉(zhuǎn)座子序列時，所述探針與跨越ISl插入?yún)^(qū)域的基因組DNA內(nèi)的位置雜交；(ii)與所述熒光探針上游的基因組DNA的位置雜交的正向PCR引物；和(iii)與所述焚光探針下游的基因組DNA的位置雜交的反向PCR引物。當所述焚光探針與基因組DNA雜交時，核酸聚合酶將在擴增期間消化所述探針來從所述淬滅劑分子上解離所述熒光團，檢測在熒光團和淬滅劑分子解離時熒光的變化。這種熒光的變化相應(yīng)于基因組DNA的擴增，隨后，確認了ISl插入位點不含有ISl轉(zhuǎn)座子序列。因而，熒光方面的改變表明潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的鑒定，其單位生產(chǎn)力可以隨后在小規(guī)模發(fā)酵系統(tǒng)中評估來確認它是否實際上是高產(chǎn)性克隆。做為選擇，僅僅正向和反向PCR引物與推定的低產(chǎn)性克隆(即，在預定的ISl插入位點內(nèi)含有ISl轉(zhuǎn)座子的克隆)的基因組DNA的雜交將可能擴增基因組模板，但是由于熒光探針不能與ISl插入位點雜交，將不能檢測到熒光信號(參見附圖7A)。重要地，這種分析不需要多重化，可以用完整的細胞溶胞產(chǎn)物進行，消除了分離基因組DNA的需要。由于TaqMan探針一般長度在約15個到約40個核普酸之間變動，為了使用這種分析，鑒定的ISl插入位點必需被定位到基因組DNA序列的相對狹窄的區(qū)域，優(yōu)選的在低于約20個連續(xù)核苷酸之內(nèi)，以確?；蚪M-特異性探針的充分結(jié)合。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，基于PCR的分析被用于檢測在轉(zhuǎn)化之后預定接受IS1插入的co"克隆亞型的基因組DNA的一部分內(nèi)的ISl插入突變的提高，其中所述預定的ISl插入?yún)^(qū)域跨越所述基因組DNA的大于約20個連續(xù)核苷酸；參見附圖7B中考慮的分析的示意圖。如果所述IS1插入?yún)^(qū)域跨越所述基因組DNA的大于約20個連續(xù)核苦酸，在此所述區(qū)域?qū)⒈环Q為"IS1插入熱點"。所述考慮的PCR分析利用一種PCR引物，其將與ISl插入?yún)^(qū)域之外(即，ISl插入熱點之外)的基因組DNA的位置雜交，和第二PCR引物，其將與位于ISl插入熱點之內(nèi)的基因組DNA的ISl轉(zhuǎn)座子序列雜交。兩個引物的雜交將產(chǎn)生近似已知目標長度的引物模板的片段的指數(shù)性擴增，隨后，引起推定的低產(chǎn)性克隆的鑒定。做為選擇，在IS1插入熱點內(nèi)缺乏IS1轉(zhuǎn)座子序列時，僅一個引物將與基因組DNA雜交，引起模板DNA的一條鏈的線性擴增，隨后，鑒定潛在的高產(chǎn)性克隆亞型。雖然可能的是第二PCR引物，其理想地預計與IS1插入熱點內(nèi)的IS1轉(zhuǎn)座子序列雜交，可以與所述插入熱點之外的IS1轉(zhuǎn)座子序列雜交(即，未轉(zhuǎn)化的細胞的基因組內(nèi)存在的基線IS1轉(zhuǎn)座子)，通過了解兩種PCR引物將會雜交的基因組DNA內(nèi)的特定位置，以及IS1熱點的位置，當所述分析使用完整細胞溶胞產(chǎn)物或純化的基因組DNA進行時，來自推定的低產(chǎn)性克隆的擴增DNA的目標長度可以容易地近似。因而，在本發(fā)明的一個實施方式中，PCR分析是被考慮的，其將使用一組寡核苷酸檢測預定的IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子序列的存在或缺乏，所述一組寡核苷酸由以下構(gòu)成(i)與所述IS1插入?yún)^(qū)域之外(即，IS1插入熱點之外)的基因組DNA的位置雜交的第一PCR引物；和(ii)與預計的IS1插入?yún)^(qū)域中IS1轉(zhuǎn)座子序列內(nèi)的位置雜交的第二PCR引物；其中由于來自兩個PCR引物的雜交和擴增，IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子序列的存在引起所述基因組DNA的指數(shù)性擴增，由于來自僅第一PCR引物的雜交和擴增，IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子序列的缺乏引起基因組DNA的一條鏈的線性擴增。基因組DNA的指數(shù)性擴增可以通過鑒定近似目標大小的擴增核酸片段視覺上地檢測，或通過添加與雙鏈擴增的DNA結(jié)合的核酸染料(例如，SYBRGreen)熒光地實時檢測。做為選擇，熒光引物(例如，LUXtm引物(Invitrogen))可以用于測量熒光方面的指數(shù)性增加，記住的是，甚至在IS1插入熱點內(nèi)缺乏IS1轉(zhuǎn)座子序列的克隆中熒光信號將是預期的；然而，在這種情況下信號將線性地提高，而不是如來自兩個PCR引物的雜交的指數(shù)性地提高。所述分析還必需考慮在兩個方向上IS1插入熱點內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子序列插入的可能性。因而，為了計算這種可能性，可以使用兩個方向上的內(nèi)部IS1引物，使用各引物或使用兩種引物對每個樣品運行兩個獨立的分析來篩選克隆的群體。由于低生產(chǎn)者現(xiàn)象與提高的IS1插入突變相關(guān)，缺少所有的IS1拷貝的E./,宿主菌林將可能產(chǎn)生高產(chǎn)性克隆的更為均一的群體。為此，本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生攜帶質(zhì)粒DNA的Eco//菌抹的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括在用所述質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化細菌菌抹之前4吏￡.co/z宿主菌林突變來從細菌基因組中除去IS1序列的所有拷貝。本發(fā)明進一步涉及突變的E.co"宿主菌抹，包括但不限于突變的DH5菌林，其中所有的IS1拷貝已經(jīng)被除去，以及所述菌抹用于質(zhì)粒DNA的增殖的用途。存在幾種方法用于構(gòu)建Eco//的刪除或破壞突變，包括Pl噬菌體轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)座子介導的隨機誘變、和一般的(RecA介導的)同源重i且。由于對每個突變的可選擇標記，例如抗生素抗性的需要，這些方法一般僅適合于單一突變。備選的方法涉及使用在引物上具有36-nt到50-nt延長的PCR產(chǎn)物，其與期望的破壞位點周圍的側(cè)翼序列同源，以及X-Red重組酶(DatsenkoandWanner,2000,尸A^5"97:6640-6645)。在這種情況中仍然使用可選擇標記；然而，標記隨后可以被除去，解放了它用于突變的其他輪次。消除殘余的"疤痕"的修改的方法利用了內(nèi)源雙鏈中斷修復過程來除去可選擇標記(Kolisnychenko"a/.,2002,Ge"omeA仏12:640-647)。這種方法被用于產(chǎn)生基因組大小降低8.1%的K-12E.co/z菌林，包括44個可轉(zhuǎn)座元件的24個的消除。在這個菌抹中七個IS1拷貝的三個被除去。高度可能的是，其余4個拷貝的消除將對菌抹的生存力、或在進料-分批發(fā)酵過程中它的用途的適用性沒有有害影響。然而，注意的是，由于在雙鏈中斷修復過程(double-strandbreakrepairprocess)中需要RecA,Kolisnychenko等人的修改的方法不適合于Eco//菌抹DH5。另一種方法利用了II組內(nèi)含子，所謂的"targetrons",根據(jù)互補序歹寸的14-nt到16-nt區(qū)i或來產(chǎn)生突變(Zhong"a/.,2003,A^c/e/cJc/A31:1656-1664)。這種方法還利用了可選擇標記，其隨后可以被移去以允許多個插入。然而，它不像早先的兩種方法一樣產(chǎn)生目標位點的刪除，而是產(chǎn)生破壞。使用這種方法將產(chǎn)生攜帶7個無功能的IS1拷貝的菌林，在轉(zhuǎn)座子編碼的主要轉(zhuǎn)座酶基因(insAB)中被破壞。在此描述的轉(zhuǎn)化的Eco//克隆內(nèi)含有的質(zhì)粒DNA載體可以是任何染色體外DNA分子，其含有編碼感興趣的生物化合物的基因，即，轉(zhuǎn)基因。所述質(zhì)粒將含有用于它在微生物細胞(例如Eco")中的維持和增殖以及用于隨后在動物宿主中表達轉(zhuǎn)基因所需的元件。對于細菌增殖，除了復制所需的任何質(zhì)粒編碼的功能之外，例如用于選擇成功的轉(zhuǎn)化體的可選擇標記，復制起點是需要的。對于基因表達，質(zhì)粒應(yīng)當被設(shè)計以最大化進入動物寄主時轉(zhuǎn)基因的短暫產(chǎn)生。促進基因表達的質(zhì)粒的元件可以包括，但不限于，真核啟動子、轉(zhuǎn)錄終止和多腺香酸化信號，以及增強子元件。對于在動物細胞中的重組基因表達選擇的啟動子可以是同源的或異源的，可以是組成型的或可誘導的，包括但不限于來自人類巨細胞病毒/即時早期(CMVIE)、猿猴病毒/早期(SV40)、人類延伸因子-la(EF-la)和人類遍在蛋白C(UbC)的啟動子。質(zhì)粒DNA可以利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)重組地工程化。參見，例如，Sambrook,etal.,sw/ra;andCwrew/尸r由co/sMo/ecwAar歷o/ogy,GreenePublishingAssoc.&Wiley(1987);這兩者都通過引用合并在此。為了描述和公開可以與本發(fā)明相聯(lián)系使用的方法和材料，在此提及的所有出版物通過引用合并。在此的任何內(nèi)容都不能解釋為承認本發(fā)明沒有資格根據(jù)在先發(fā)明在日期上早于這種公開。參考附圖描述了本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，要理解的是本發(fā)明不限于這些精確的實施方式，由本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以實行各種改變和修改而不背離如附隨的權(quán)利要求中所定義的本發(fā)明的范圍或精神。提供以下的實施例來說明本發(fā)明，然而，不將本發(fā)明限制到實施例上。實施例1DNA疫苗質(zhì)粒中IS1轉(zhuǎn)座子的鑒定奢#、DM4建麥者在和^長培券差-所有DNA疫苗構(gòu)建體的宿主菌林是Eco/,DH5[FWeoR度A1eWAlZwt/R17(r"mk+)，E44r由陽lgyrA96re/A1]。該菌4木最初購自Invitrogen(Carlsbad,CA;以前的GibcoBRL),在合成培養(yǎng)基DME-P5中適應(yīng)，變?yōu)殡姼惺軕B(tài)用于隨后的轉(zhuǎn)化。co/zDH5a[F())80/acZAM15△(/acZYA賓gF)U169cfeoR匿A1e"c/Al/wt/R17(rk-,mk+)ga/》/zoAs1gyrA96m/A1]作為電感受態(tài)細胞購自Invitrogen(Carlsbad,CA)。HIVDNA疫苗質(zhì)粒VlJns-"e/的構(gòu)建在2000年12月15日提交的國際PCT申請?zhí)朠CT/US00/34162中詳細描述(于2001年6月21日作為國際公開號WO01/43693公開)。簡要地，所述DNA疫苗質(zhì)粒由pUC19衍生的細菌復制起點和用于五.co//中的維持和選擇的新霉素/卡那霉素抗性基因;CMV-IE啟動子、內(nèi)含子A和用于HIV衍生的轉(zhuǎn)基因的真核表達的牛生長激素終止子/多腺苷酸化信號組成。根據(jù)標準實踐通過電穿孔進行轉(zhuǎn)化。脫水的LB肉湯(DehydratedLBbroth)和LB瓊脂購自Becton國Dickinson(FranklinLakes,NJ),根據(jù)廠家的說明書來制備。無菌的SOC培養(yǎng)基(用于轉(zhuǎn)化后回收)購自Invitrogen。合成培養(yǎng)基DME-P5含有以下的7g/1KH2P04、7g/1K2HP04、6g/1(NH4)2S04、5g/1L國谷氨酸、10g/1甘油、和0.5g/lNaCl，用NaOH調(diào)節(jié)到pH7.2。在滅菌后每升添加8.3ml新霉素/硫胺/MgS04溶液和1ml微量元素溶液。120X新霉素/硫胺/MgS〇4溶液含有24g/L硫胺-HCl、240g/1MgS04.7H20和9.6g/1硫酸新霉素。IOOOX微量元素溶液溶于1.2NHC1中，并含有27g/1FeCl3.6H20、2g/lZnCl2、2g/1CoCl2'6H20、2g/1Na2Mo04.2H20、lg/1CaCl2.2H20、1.3g/1CuCl2.2H20和0.5g/1H3B03。潛^-在LB培養(yǎng)基中制備的co//DH5用1|ul的VlJns-"e/轉(zhuǎn)化，并在SOC培養(yǎng)基中回收。轉(zhuǎn)化體平鋪在LB/新霉素瓊脂上。隨機選擇的十個菌落(NLB-1到NLB-10)被用于接種10mlLB/neo液體培養(yǎng)基并生長過夜。取出1毫升等分量用于質(zhì)粒DNA的分離，還制備冷凍甘油儲備物。使用甘油儲備物作為接種物制備新鮮的LB培養(yǎng)物，生長的LB培養(yǎng)物用于接種搖瓶中的25mlDME-P5培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在DME-P5中進行三輪傳代用于適應(yīng)培養(yǎng)基變換。在第三輪之后，取出lml等分量，用QIAGEN質(zhì)粒mini-prep試劑盒分離質(zhì)粒DNA。來自LB-生長的培養(yǎng)物和DME-P5生長的培養(yǎng)物的DNA樣品在0.7%瓊脂糖凝膠上跑動來證實質(zhì)粒含量(分別為附圖1A和IB)。兩個凝膠的比較顯示了幾個DME-P5樣品含有相對于優(yōu)勢種類較少的、更高分子量的種類，其在LB樣品中是不明顯的(參見NLB-l、-3、-5、-7和-8;附圖1B中的星號泳道)。一個樣品，NLB-8,還含有主要的、更低分子量的種類，其很可能形成自原始分子的DNA的重排和排除。樣品NLB-10是獨特的，因為它看起來主要作為二聚分子存在，表現(xiàn)了共價鍵或僅僅是強的物理締合。在包含HIVgag的DNA疫苗質(zhì)粒的類似培養(yǎng)物中早先觀察到了兩種不同分子量的種類的存在，所述培養(yǎng)物在延長的慢生長期的進料-分批培養(yǎng)之后未能擴增質(zhì)粒DNA(標記為"低生產(chǎn)者"或"LP")(數(shù)據(jù)未示出)。在這種觀察之后，在相似的DNA疫苗質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)了可轉(zhuǎn)座元件IS1。為了檢查VlJns-we/的DME-P5生長的培養(yǎng)制備物中IS1插入的可能性，含有較少的、更高分子量種類的五個NLBDNA樣品進行用iW/wI的限制性內(nèi)切酶消化。限制消化如下設(shè)置lpl質(zhì)粒DNA、7plH20、1(il10x反應(yīng)緩沖液、liiil酶。消化物在37。C孵育~1小時，然后向每一個中添加2ml加載緩沖液用于在凝膠上加載。根據(jù)核普酸序列的比較，這種酶應(yīng)當在IS1片段內(nèi)切割而不是VlJns-"e/序列內(nèi)。因而，如果更高分子量條帶含有IS1，A^i/I限制性內(nèi)切酶消化應(yīng)當引起線性化和這些條帶在瓊脂糖凝膠上的遷移。不含有IS1的種類應(yīng)當不相對于未消化的樣品遷移。實際上，在A//wI消化之后，所檢查的所有五種樣品顯示了與線性化相符的更高分子量條帶的特征性遷移，而更低條帶不移動(附圖1C)。寡核苷酸引物被設(shè)計用于含IS1的片段的擴增來提供它存在的其他證據(jù)。設(shè)計的引物是所謂的"不完美匹配"引物，由9bp的非互補核苷酸、隨后是與IS1序列的末端互補的7或9bp的核香酸組成。照這樣設(shè)計的引物具有對模板濃度敏感的實際效果。因而，僅具有大于未指定數(shù)量(unspecifiedamount)的IS1含量的樣品將被擴增。選擇來自LB-和DME-P5生長的細胞的樣品NLB-1和NLB-2作為PCR反應(yīng)的才莫板。在從LB-生長的細胞分離的NLB-1或NLB-2中在瓊脂糖凝膠上更高分子量條帶不是明顯的；然而，來自DME-P5生長的細胞在NLB-1中、而不是在NLB-2中是明顯的。在pUC19樣品中沒有更高MW條帶的證據(jù)(數(shù)據(jù)未顯示)；因此，這作為陰性對照被包括。推測起來，IS1從基因組轉(zhuǎn)座到質(zhì)粒中；因此，從Eco/zDH5和DH5a得到基因組DNA制備物。在分離基因組DNA之前，兩個菌抹都在LB上生長。使用來自QIAGEN的HotStarTaqMasterMix試劑根據(jù)廠家的說明書在50(xl的總體積中建立PCR反應(yīng)。5(il的每個反應(yīng)在0.7%瓊脂糖凝膠上運行(附圖2A)。與瓊脂糖凝膠分析一致，從任一NLB樣品的LB生長的制備物中，沒有與IS1長度上相應(yīng)的片段的顯著擴增(泳道2和4)。然而，從DME-P5生長的培養(yǎng)物的NLB-1和NLB-2制備物兩者中擴增了在650和850bp之間遷移的片段(泳道3和5)。沒有來自pUC19或任一基因組DNA制備物的擴增，確認了引物不能擴增所測試的這些質(zhì)粒DNA的制品中污染性剩余基因組DNA中存在的IS1。為了確認擴增的片段的身份，兩個陽性樣品進行M/wI限制性內(nèi)切酶消化(3(xlPCR反應(yīng)，5|li1H20、1jalIOX反應(yīng)緩沖液、1itil酶，在37。C孵育2小時)。這種酶應(yīng)當切割I(lǐng)Sl一次，產(chǎn)生~0.44和~0.34Kb的兩條鏈，實際上，對于擴增的樣品觀察到了這一點(附圖2B)。39在NLB-2樣品的DME-P5生長的制備物中IS1的存在提高了在所有DME-P5生長的細胞的群體中插入序列以顯著的、然而仍然非常微小的百分比存在的可能性。為了測試這種可能性，使用來自LB和DME-P5生長的細胞的NLB-3到NLB-10樣品作為模板進行PCR反應(yīng)。結(jié)果表明，IS1片段實際上在NLB制備物的所有十個DME-P5生長的樣品中存在(附圖2C)。LB生長的制備物的結(jié)果是不那么清楚的(附圖2D)。在所有這些樣品中存在著650和850bp之間的才莫糊條帶；然而，擴增的程度表明IS1以極少量存在，可能甚至來自于質(zhì)粒制備物的染色體污染。這些模糊的條帶也可能代表產(chǎn)自引物的非特異性結(jié)合的延伸。然而，明顯的是IS1序列存在于DME-P5制備物中。還高度可能的是，從LB到DME-P5培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移誘導了質(zhì)粒群體中IS1的增加。在DME-P5培養(yǎng)基中傳代的NLB樣品然后在SFF(參見國際申請NO.PCT/US2005/002911;上文)中組合地培養(yǎng)，來檢查質(zhì)粒DNA含量。所有10個樣品被表征為"低生產(chǎn)者"，質(zhì)粒DNA含量從0.8到2.4|tigDNA/OD2團粒。在這些樣品的每一個中IS1轉(zhuǎn)座因子的鑒定提出了問題，即IS1的存在是否對低生產(chǎn)者現(xiàn)象負責。實施例2使用限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)分析的高生產(chǎn)者和低生產(chǎn)者基因組中的IS1含量比較霹#、DM4^^#在和##潛#差-參見，上文，實施例1。另外，未適應(yīng)的、未轉(zhuǎn)化的細胞購自Invitrogen并在LB培養(yǎng)基中維持。HIVDNA疫苗質(zhì)粒VlJns-tpa-"e/(5540bp)的構(gòu)建在國際PCT申請?zhí)朠CT/US00/34162(上文)中詳細描述了。HIVDNA疫苗質(zhì)粒VlJns-tpa-戶o/(7516bp)的構(gòu)建在2000年12月21日提交的國際PCT申請?zhí)朠CT/USOO/34724中詳細描述(于2001年6月28日作為國際公開號WO01/45748公開)。HIVDNA疫苗質(zhì)粒VIJns畫tpa-g"g(6375bp)的構(gòu)建在1998年2月3日提交的國際PCT申請?zhí)朠CT/US98/02293中詳細描述(于1998年8月13日作為國際公開號WO98/34640公開)。///FZ)A^4^麥#參^搖瘋培#和A哞^Z)A^4為、庠-VlJns-tpa-gag的HIVDNA疫苗高生產(chǎn)者(-HP)和低生產(chǎn)者(-LP)克隆早先使用如國際申請NO.PCT/US2005/002911(上文)中描述的標準高生產(chǎn)者篩選來分離。冷凍甘油儲備物的25^等分量被用于接種250ml搖瓶中的25mlDME-P5。細胞在37。C、在Kuehner柜式搖動器中220RPM生長過夜，在中到晚指數(shù)期收獲用于DNA的分離。VlJns-tpa-po/和VlJns-tpa-"e/低生產(chǎn)者(-LP)克隆通過首先用純化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化適應(yīng)的(adapted)Eco//DH5細胞來制備。在DME-P5中回收轉(zhuǎn)化體并平鋪在DME-P5上，選擇5-10個單獨的菌落用于在搖瓶中生長。在中到晚指數(shù)期收獲細胞，用于接種新的一輪。培養(yǎng)物照這樣傳代總共三輪。如國際申請NO.PCT/US2005/002911(上文)中描述的，通過在搖瓶中進料-分批培養(yǎng)，確認了候選低生產(chǎn)者中不能擴增質(zhì)粒DNA,每個構(gòu)建體的單獨一個克隆被保存為代表性的低生產(chǎn)者。這些冷凍甘油儲備物的25)il等分量被用于接種燒瓶和收獲培養(yǎng)物用于如上所述的DNA分離。使用PromegaWizard⑧基因組DNA純化試劑盒(Madison,WI)分離總DNA。DNA團粒在10mMTris'HCl、pH8.5中再水化。來自高生產(chǎn)者和低生產(chǎn)者樣品的質(zhì)粒DNA使用QiagenMiniprepSpin試劑盒(Valencia,CA)分離。很賴#^錄長^,在#M凡尸J為Vf-使用PCRDIG探針合成試劑盒(RocheMolecularBiosystems,Mannheim,Germany)創(chuàng)建IS1凈爭異'I"生探針(0.7Kb)來通過PCR將非放射性的、修飾的核苷酸DIG-ll-dUTP摻入DNA中。引物訂購自SigmaGenosys(TheWoodlands,TX),質(zhì)粒pISl用作模板DNA。引物序歹'J如下IS1-F2,5'國GGTAATGACTCCAACTTATTG畫3'(SEQIDNO:1);IS1-R2,5'-GGTGATGCTGCCAACTTA國3'(SEQIDNO:2)。使用的PCR條件是根據(jù)廠家的建議。用于DNA消化的限制性內(nèi)切酶購自NewEnglandBiolabs(Beverly,MA)。來自每個樣品的消化的總DNA和僅質(zhì)粒DNA在0.7%瓊脂糖凝膠上跑動過夜(~16小時)34V,4°C。根據(jù)廠家的方案，使用Schleicher和SchullTurboblotterRapidDownwardTransferSystem(Keene,NH)將DNA轉(zhuǎn)移到NytranSuPerCharge尼龍膜上1小時。使用BioRadGSGeneLinker(Hercules,CA)通過在150mJoule的紫外線照射將DNA交聯(lián)到膜上。根據(jù)FilterHybridizationProtocol使用過夜卵孚育(RocheMolecularBiosystems,Mannheim,Germany),在Southern印跡上，DIG標記的IS1探針與目標DNA雜交。通過利用抗41DIG堿性磷酸酶抗體和堿性磷酸酶底物CSPD(FilterHybridizationProtocol,RocheMolecularBiosystems,Mannheim,Germany)的酶聯(lián)4匕學發(fā)光分析，顯現(xiàn)探針-目標雜交物。潛^-F7J朋-^^-;o/^謦^/S/^F丄尸為、有寬一酶配對」y/H和被用于產(chǎn)生片段，用于DNA疫苗構(gòu)建體VlJns-tpa-po/的高和低生產(chǎn)者克隆的IS1特異性RFLP分析。高生產(chǎn)者克隆(tpa-po/-HP)早先通過國際申請NO.PCT/US2005/002911(上文)中詳細描述的標準篩選過程分離，被獲得作為冷凍工作種子小瓶。來自DME-P5中生長的高生產(chǎn)者(tpa-^o/-HP)和低生產(chǎn)者(tpa-/w/-LP)培養(yǎng)物的總DNA制備物用限制性內(nèi)切酶和』gel消化，而從每個培養(yǎng)物分離的質(zhì)粒DNA用消化。作為對照，還從沒有對DME-P5進行在先適應(yīng)的、在LB培養(yǎng)基上生長的DH5細胞分離基因組DNA。制備Southern印跡，與DIG標記的ISl探針雜交(附圖3A)。在DH5(泳道2)和tpa-/o/-HP(泳道4)樣品中都出現(xiàn)了六個含有ISl的片段。最低分子量的條帶與其他條帶相比更強烈大約兩倍，表明這個條帶可能含有超過一個IS1插入序列。然而，這個片段是小于2Kb,可能不足夠大以容納兩個768-bpISl插入物。最低分子量條帶的更高的強度可以表明重疊的含IS1片段，或反映了相對于更高分子量條帶、更小的片段在Nytran膜上更好的轉(zhuǎn)換效率。因此，未轉(zhuǎn)化的DH5的ISl拷貝數(shù)可以4氐至6和7之間。tpa-po/-LP(泳道6)的ISl分布型含有在DH5對照或tpa-/o/-HP樣品中未發(fā)現(xiàn)的兩個其他的ISl陽性條帶。根據(jù)與對照僅1口&-/0/-1^質(zhì)粒(泳道5)的比較，這兩個中的更高分子量的條帶(7-8kb)與質(zhì)粒DNA—致。然而，更低的3-4kb條帶不在任何其他樣品中存在，因而是tpa-po/-LP基因組中存在其他IS1插入位點的強烈的指示。J^/似-^-we/^謦^AF丄尸》有f-利用酶4/II和檢查VlJns-tpa-nef克隆的IS1插入分布(附圖3B)，結(jié)果類似于用VlJns-tpa-zw/克隆所獲得的結(jié)果。六個含有IS1的條帶在DH5對照(泳道2)和tpa-"e/HP(泳道4)樣品中都是明顯的，最小的條帶以比其他的更高的強度存在。在tpa-we/-LP樣品中，7個條帶是可見的，第三大的條帶比其他的明顯更強烈(泳道6)。這個克隆(泳道5)與僅質(zhì)粒樣品的比較顯示了，含有IS1的質(zhì)粒跑動非?？拷鼣y帶IS1的基因組DNA片段。因此，最高強度的條帶實際上是質(zhì)粒和基因組DNA片段的重疊條帶的結(jié)果。然而，還有在0}^對照或1口3-^/-1^樣品中都沒有發(fā)現(xiàn)的3-4kb條帶，是與上述1口&-/70/-1^樣品中觀察到的未鑒別的條帶大約相同的大小。這是低生產(chǎn)者基因組中IS1插入突變的另一個指示。KA/"^0a-gag^i^W/5/i^X尸為、有剪-由于VlJns-tpa-/w/和VlJns-tpa-nef低生產(chǎn)者克隆的4/II-ISl分布型表明了低生產(chǎn)者的基因組內(nèi)的其他的IS1插入位點，還檢查了VlJns-tpa-gag克隆來確定突變是否存在于所有三種VlJns-tpa構(gòu)建體中。然而，在這種情況下，高和低生產(chǎn)者克隆的來源不同于VlJns-tpa-po/和VlJns-tpa-"e/的來源。兩個克隆是許多年前分離的，自那時起已經(jīng)作為實驗室種子來增殖，來充當供料搖瓶發(fā)酵(SFF)階段的高生產(chǎn)者篩選中的對照(實驗室種子樣品)(參見國際申請NO.PCT/US2005/002911;上文)。因而，這些克隆對DME-P5的曝露時間大大高于tpa卞o/和tpa-;e/克隆的。也獲得了在產(chǎn)生時間上與早先評估的高生產(chǎn)者可比較的冷凍工作種子小瓶用于分析(工作種子樣品)。RFLP結(jié)果顯示來自兩個高生產(chǎn)者克隆的總DNA的IS1分布型是相似的(附圖3C),然而在實驗室種子樣品中存在模糊的條帶(泳道7和8),其運行比工作種子樣品中笫三大的片段(泳道4和5)稍微更高。這個條帶還在高生產(chǎn)者實驗室種子的僅質(zhì)粒樣品中存在(泳道6),所以它可以歸于質(zhì)粒DNA。在工作種子的僅質(zhì)粒樣品中，輕得多的條帶是剛剛可見的(泳道3)。這種RFLP分析與Q-PCR結(jié)果一致(參見，下文，實施例4),表明含有IS1的質(zhì)粒的級分可以隨著高生產(chǎn)者在合成培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間增加而提高。兩個高生產(chǎn)者樣品的基因組分布型也類似于未適應(yīng)的DH5對照(泳道1)。與早先描述的tpa-;o/和tpa-"e/樣品相當?shù)膖pa-gag低生產(chǎn)者是不可用的，在這種情況下僅評估了實驗室種子(附圖3C)。RFLP結(jié)果顯示了，如同tpa-/w/-LP和tpa-"e/-LP—樣，另外的條帶存在于tpa-gag-LPISl分布型中，其不與質(zhì)粒DNA相應(yīng)(泳道10和11)。然而，這個條帶是2-3kb,小于在其他克隆中觀察到的。不同于tpa-po/和tpa-we/,IS1探針不與從tpa-gag-LP樣品分離的質(zhì)粒DNA結(jié)合(泳道9)。在它作為高生產(chǎn)者篩選的SFF階段的低生產(chǎn)者對照的角色中，tpa-gag-LP實驗室種子一致地產(chǎn)生《1mcg質(zhì)粒DNA/mg干細胞重量(DCW),而tpa-;w/和tpa-"e/低生產(chǎn)者含有~2mcg質(zhì)粒DNA/mgDCW。后一數(shù)值是隨枳^選擇的低生產(chǎn)者中更典型的。因此，有可能的是，雖然在tpa-g"g-LP中發(fā)現(xiàn)的插入突變不同于在tpa-/w/-LP和tpa-"e/-LP中發(fā)現(xiàn)的，它產(chǎn)生了拷貝數(shù)抑制的表型，其對克隆擴增質(zhì)粒DNA的能力具有甚至更大的影響。D^ffi-尸5^co/,的/5/WF丄尸為、布至三種不同DNA疫苗構(gòu)建體的高和低生產(chǎn)者的ISl分布型表明，所有的低生產(chǎn)者克隆含有IS1插入突變，而高生產(chǎn)者類似于未適應(yīng)的DH5。有可能的是，適應(yīng)引起基因組中ISl的拷貝數(shù)的提高。為了測試這一點，在用J/ZII和爿gel消化基因組DNA之后，分析了未適應(yīng)的DH5和適應(yīng)DME-P5的DH5的ISl分布型(附圖3C)。RFLP結(jié)果表明，在兩種E.co/Z基因組中ISl的位置之間沒有差異(泳道1和2)。因此，看起來低生產(chǎn)者與基因組的IS1插入突變相關(guān)，這種插入在轉(zhuǎn)化步驟之后發(fā)生。實施例3VlJns質(zhì)粒中的ISl轉(zhuǎn)座子整合位點/#辨弄才法-如實施例1描述的獲得在DME-P5培養(yǎng)基中增殖的來自VUns-"e/克隆NLB-5的質(zhì)粒DNA。設(shè)計與完整的、無插入質(zhì)?；パa的總共十六個寡核苷酸引物以在正向(8)和反向(8)方向上在700bp的增加中退火。第二組引物特異于IS1插入序列的正向和反向末端。進行一系列32個PCR反應(yīng)，由以下構(gòu)成(i)16個VUns-"e/特異性引物之一和2個IS1特異性引物之一，(ii)克隆NLB-5質(zhì)粒DNA作為才莫板，(iii)和HotStarTaqPCRMasterMix試劑(Qiagen)。使用標準方案進行PCR反應(yīng)。每個樣品在0.7%瓊脂糖凝膠上分析來鑒定擴增的片段。擴增的片段的存在是載體-ISl接點的初步的指示，但是不能排除錯誤起始事件(假陽性)的可能性。因為使用的引物覆蓋了質(zhì)粒DNA的兩條鏈和轉(zhuǎn)座子插入的兩種可能的取向，與互補鏈上相同的插入物的擴增子一致的第二擴增片段的存在被用于降低假陽性的可能性。確認的擴增片段的大小提供了初步的插入圖。然后選擇幾個擴增的片段，用于克隆到pCR2.1—TOPO⑧載體(Invitrogen)中，隨后使用AppliedBiosystems310GeneticAnalyzer測序來鑒定IS1插入的4青確位置和取向。潛^-運用一種IS1特異性引物和一種VlJns特異性的一系列PCR反應(yīng)，隨后測序擴增的產(chǎn)物，使用NLB-5克隆鑒定了IS1插入的位置(參見實施例1)。分辨了部分的和完整的接點，測序確認了轉(zhuǎn)座子在插入的位點產(chǎn)生9bp的目標加倍。鑒定了十一個獨特的整合位點，具有在兩個取向上轉(zhuǎn)座子的插入；在兩個方向上》見察到一個插入位點。所有位點處于新霉素抗性基因"/m的編碼區(qū)的85個石咸基對之中或之內(nèi)。由于在用來自pUC4K(AmershamPharmacia;Piscataway,NJ)的ne。R基因(w/^II)替換pUC19(NewEnglandBiolabs)的ampR基因()構(gòu)建的pUC誦neo克隆中沒有發(fā)現(xiàn)IS1插入，單獨的新霉素抗性基因的存在不足以誘導向質(zhì)粒分子的轉(zhuǎn)座。實施例4利用實時Q-PCR的根據(jù)質(zhì)粒拷貝數(shù)的IS1的相對數(shù)量##、DiVJ^麥,在和J7^潛養(yǎng)差-參見，上文，實施例1和2。l在標雀參^^建-所有的分子生物學操作根據(jù)標準方案進行(Sambrooketal.,1989,上文)。酶購自NewEnglandBiolabs(Beverly,MA)。通過用來自pUC4K(AmershamPharmacia;Piscataway,NJ)的ne。R基因(，m)替換pUC19(NewEnglandBiolabs)的ampR基因()來構(gòu)建pUC-neo。IS1的768bp序列從含有轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒VlJnswe/的樣品PCR擴增。片段克隆到pCR⑧2.1-TOPO⑧載體(Invitrogen)中，來產(chǎn)生IS1質(zhì)粒標準pISl，然后使用限制性內(nèi)切酶EcoRI切除，并使用T4DNA連接酶連接到pUC-neo的EcoRI限制性位點中來獲得質(zhì)粒標準pnIQl。作為0.7Kb片段從VlJns-"e/提取部分CMV啟動子，連接到用Z6al和S//zI雙重消化的pnIQl，來獲得質(zhì)粒標準pnlQ2。23srDNA的片段使用如下為GenBank中co//K-12序列設(shè)計的引物從DH5基因組DNA中PCR擴增23s-Fl(5'-GGATCCAACCCAGTGTGTTTCGACAC-3'二SEQIDNO:9)and23s-Rl(5'-GGATCCAGACAGGATACCACGTGTCC-3':SEQIDNO:10)。S"mHI限制性位點(下劃線)的被包括在23srDNA片段的任一末端以便于連接。0.3KbPCR片段克隆到pCR2.1-TOPO⑧載體中(質(zhì)粒p23sTA)，然后用SamHI切除并連接到pnlQ2的Sa附HI位點中，來獲得最終的質(zhì)粒標準pnlQ3v2(附圖4)。這個質(zhì)粒含有完全的IS1序列和部分的CMV啟動子和23srDNA序列，所有這些都是Q-PCR分析的目標。質(zhì)粒標準的DNA濃度通過在260nm的UV吸光度測定(A26o=l三50昭/ml),制備稀釋物來獲得具有103到108個拷貝/^的標準溶液。("r/J似-we/VW蕃/^^參-參見，上文，實施例2。豸矽定量尸CA—使用來自AppliedBiosystems(FosterCity,CA)的PrimerExpress軟件v.2.0設(shè)計檢測引物和探針。未標記的引物購自Sigma-Genosys(TheWoodlands,TX),焚光標記的探針購自AppliedBiosystems。TaqMan探針被設(shè)計與在模板DNA上的引物之間退火，在5'末端包括報告染料6-羧基熒光素(FAM)或AppliedBiosystems專有的染料"VIC",在3'末端包括6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)。引物CMV-Q-F(5'國GTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCA3';SEQIDNO:3)CMV-Q國R(5'-GGAGGTCAAAACAGCGTGGAT畫3';SEQIDNO:4)和VIC標記的TaqMan探針CMV國Q-P2(5'-VIC-TCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTG-3'國TAMRA;SEQIDNO:5)被設(shè)計以利用CMV啟動子作為標記物定量質(zhì)粒DNA。引物IS1-Q-F(5'-AGGCTCATAAGACGCCCCA國3';SEQIDNO:6)和IS1-Q-R(5'-ACGGTTGTTGCGCACGTAT-3';SEQIDNO:7),,以及FAM標記的TaqMan探針I(yè)S1-Q-P2(5'畫FAM隱CGTCGCCATAGTGCGTTCACCG陽3'國TAMRA;SEQIDNO:8)被i殳計以定量ISl。CMV和IS1引物"笨針集以多重方式運行來測定總質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子拷貝。為了開發(fā)用于測定剩余基因組IS1的第二分析，設(shè)計引物和探針以定量23srDNA,如下23s-FlD(5，GAAAGGCGCGCGATACAG;SEQIDNO:11),23s-RlD(5'-GTCCCGCCCTACTCATCGA;SEQIDNO:12)和FAM標記的TaqMan探針23s-Pfam(5'-FAM國CCCCGTACACAAAAATGCACATGCTG畫TAMRA;SEQIDNO:13)。對于剩佘基因組DNA分析，23srDNA和CMV引物-探針集(參見上文)以多重方式運行。4吏用恒定體積的10的2xUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems)和2|iL樣品DNA以及各種體積的引物和探針在20|iL反應(yīng)體積中進行PCR。使用384孔平板形式，六個pnlQ3v2標準的十倍稀釋物，每個樣品四到六個副本。樣品的擴增和熒光檢測在以下熱循環(huán)條件下在ABI7900HT序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems)中進行50°C2分鐘，95°C10分鐘，之后是95°C15秒和60°C1分鐘的40個循環(huán)。^^定量尸C7W為Vf-使用ABIPrism7900HT序列檢測系統(tǒng)(SDS)v.2.0軟件完成數(shù)據(jù)分析。PCR閾值循環(huán)數(shù)(CT)從擴增標繪圖上的點來計算，在所述點上樣品的熒光與用戶定義的閾值極限交叉。對于決定定量實驗，使用拷貝數(shù)對比CT的標準曲線標繪圖計算模板拷貝數(shù)。樣品的相對定量使用2-^^方法進行(LivakandSchmittgen,2001,A&//zoA25:402-408)。簡要地，對于樣品q的定量，標準化到內(nèi)源參考物，并相對于定標物樣品cb,==(1+=2-對于￡i,其中△CT=CT,X-Ct,r,目標和參考分子的閾值循環(huán)的差值，△△CT=ACT,q-AGr,cb,XN=相對于內(nèi)源參考物(R。)標準化的目標數(shù)量(X。/R。)，和E二反應(yīng)的擴增效率。在這些拷貝比例分析中，ISl(或23srDNA)是目標序列；CMV啟動子是內(nèi)源參考物；所有未知樣品與作為定標物的質(zhì)粒標準pnlQ2或pnlQ3v2(所有目標的1:1拷貝比例)比較。為了使這種方法精確，必需進行兩個假定。首先，所有反應(yīng)的擴增效力必需是大約100%。利用Primer軟件的引物和探針產(chǎn)生了具有高效率的試劑以滿足這一需求。第二，目標和內(nèi)源參考物的效力必需是相當接近的，差異低于O.l。CMK啟動f^試#為,在定#的《標^#/{/^"放#-在早先的完整VlJns-we/質(zhì)粒的掃描中，鑒定了IS1的11個獨特的插入位點，所有這些在新霉素抗性基因的編碼區(qū)的100個堿基對之中或之內(nèi)，從CMV啟動子中除去>550個堿基對(參見實施例3)。為了確認這個啟動子作為Q-PCR目標(即，作為沒有IS1插入的模板)的適用性，測試了VlJns-"e/的這個區(qū)域的IS1插入。如果在預定的擴增序列中發(fā)生插入，CMV引物和探針不會結(jié)合，在拷貝數(shù)比例計算中將出現(xiàn)顯著誤差。使用已知含有轉(zhuǎn)座子的VlJns-"e/的樣品作為模板DNA,用與CMV啟動子互補的三種引物之一和針對IS1的末端的兩種特異性引物之一進行PCR反應(yīng)。大于插入序列(768bp)的任何產(chǎn)生的擴增子可能含有IS1質(zhì)粒接點；然而，引物的非特異性結(jié)合可能產(chǎn)生假陽性。通過在沿CMV啟動子序列上的多個點上的引物，如果互補的引物對不產(chǎn)生類似的結(jié)果，來自非特異性結(jié)合的擴增片段被淘汰。獲得了大于0.7Kb的五個擴增子，使用以上指標，除了兩個以外所有的都作為非特異性結(jié)合的結(jié)果被淘汰。后兩個被測序，發(fā)現(xiàn)IS1插入發(fā)生在CMV啟動子上游新霉素抗性基因的編碼區(qū)中或附近的位點，具有兩個早先記錄的位點之一。因而，CMV啟動子區(qū)域可以用作Q-PCR分析期間熒光探針的目標，而不受轉(zhuǎn)座子的干擾。^7^#遞道^/#及^^//參-豕#^,說'必-兩組目標序列的引物和探針濃度被優(yōu)化來以最少量試劑實現(xiàn)最低的閾值循環(huán)(Ct)。在兩種分析中，對于單通道和多重反應(yīng)，IS1、23srDNA和CMV啟動子探針的濃度被優(yōu)化為200nM。發(fā)現(xiàn)CMV-Q引物的100nM的最佳濃度降低了ISl/CMV和23srDNA/CMV分析中多重化期間的光"i普干擾。然后使用CMV引物-探針組、針對制備的pISl或p23sTA和VlJns-tpa-gag(CMV啟動子目標)的比例混合物，在多重反應(yīng)中測試了兩種分析中IS1和23srDNA的目標引物濃度100到700nM。當與僅IS1和僅CMV的反應(yīng)測定的拷貝比例相比時，提供最大精確度的500nM的IS1-Q引物引起了與CMV-Q引物的多重化，而200nM的23srDNA引物在23srDNA/CMV多重反應(yīng)中提供了相當?shù)木_性(數(shù)據(jù)未顯示)。0-尸CA^^f敏^Vi-對IS1/CMV和23srDNA/CMV多重Q-PCR分析進行敏感性研究。為了確定光語干擾顯著地抑制相對于質(zhì)粒DNA的23srDNA定量的點，必需使用廣闊的范圍上23srDNA對CMV片段的比例，用于使用23srDNA/CMVQ-PCR分析來分析。如果質(zhì)粒是CMV啟動子模板的來源，質(zhì)粒制品中剩余基因組DNA限制了可以測試比例的范圍。因而，質(zhì)粒VlJns-tpa-gag的CMV啟動子區(qū)域被擴增(引物5'-CACTGTTAGGAGCAAGGAGC曙3'(SEQIDNO:14)和5'-TGACGACTGAATCCGGTGAG國3'(SEQIDNO:15))，降低23srDNA/CMV比例到^1.7xl(T5。擴增的CMV啟動子片段然后用作CMV才莫板來制備1:1到I:IO523srDNA/CMV比例的樣品。單通道和多重(CMV引物有限的)反應(yīng)結(jié)果對于所有測試的樣品是相當?shù)模磻?yīng)在5個數(shù)量級上是線性的(附圖5)。以類似的方式測試了IS1/CMV分析的敏感性，使用與108拷貝CMV啟動子片段/pL組合的103-108拷貝pISl/^iL的混合物，對于所有比例的樣品，產(chǎn)生了對單通道和多重反應(yīng)結(jié)果相當48的結(jié)果。因此，該分析適于1:105(0.001%)拷貝IS1或23srDNA每拷貝CMV的定量極限。g-尸CA為Vf敏^^乂,^銀腐潛凝麼右豕-ISl轉(zhuǎn)座子最初在分離自培養(yǎng)物的質(zhì)粒VlJns-"e/的實驗樣品中觀察到，所述培養(yǎng)物已經(jīng)從復合培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到合成培養(yǎng)基并培養(yǎng)~30個世代(參見實施例1)。通過瓊脂糖凝月交電泳分析來自這10個克隆(樣品NLB-1到NLB-10)的質(zhì)粒DNA表明，根據(jù)至少五個克隆中高分子量條帶的存在，存在著轉(zhuǎn)座子(附圖1B中的星號泳道；還參見實施例1)。使用IS1/CMV拷貝比例分析來分析了所有10個NLB樣品(參見表1)。樣品的七個含有^1°/。的IS1陽性質(zhì)粒DNA。具有可見的轉(zhuǎn)座子的五個樣品含有〉5Q/。的IS1陽性分子。這些結(jié)果表明，必需改變5-10。/o級別的質(zhì)粒DNA,以使用瓊脂糖凝膠的溴化乙錠染色顯現(xiàn)異常。表1:根據(jù)IS1/CMV拷貝比例分析測定的IS1陽性質(zhì)粒DNA級分。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>一魔迷-ISl/CMVQ-PCR拷貝比例分析是DNA疫苗克隆的表征中有價值的工具。該分析是高度特異性的。通過它對特別設(shè)計的寡核普酸引物和熒光探針的依賴，它可以容易地區(qū)分含有IS1轉(zhuǎn)座子的樣品、含有其他轉(zhuǎn)座子例如IS5的樣品、轉(zhuǎn)座子陰性樣品。包括23srDNA/CMV拷貝比例分析進一步提高了特異性，容許IS1轉(zhuǎn)座活性方面的提高的精確定量。Q-PCR技術(shù)所提供的高水平的敏感性容許在超過六個log的模板DNA濃度下定量IS1轉(zhuǎn)座，同時檢測濃度至少低至100拷貝每jiL(對于VlJns誦"e/,0.6pg/ml)的目才示。實施例5基因組DNA中IS1插入突變的鑒定用于分離潛在高產(chǎn)性克隆的在先的篩選方法是基于"灰色"和"白色"克隆之間菌落形態(tài)學的差異，因為它們在ColumbiaBloodAgar平板上在28-30°C孵育大約48小時之后出現(xiàn)(參見共同待決國際申請NO.PCT/US2005/002911,上文)。與菌毛形成有關(guān)的基因中的插入序列突變已知影響菌落形態(tài)(LaRagioneetal.,1999,F￡MSM,cra6/o/.iLe".175:247-253;Stentebjerg國Olsonetal.,2000,F五MS"A^cra6zo/.Z^".182:319-325)。另外，由于fimA基因的調(diào)節(jié)序列的區(qū)域的倒置引起的階l殳切換也引起菌毛表達中的差異(Stentebjerg-Olesenetal.,2000,同上)。使用PCR,在天然的和DME-P5適應(yīng)的DH5細胞中、在28-30°C和37。C研究了fimBEA操縱子和csgB基因中插入因子的存在。適應(yīng)的細胞顯示了在血瓊脂平板上28-30。C和37。C之間的形態(tài)變換。因而菌毛基因中的差異可能與這種變換相關(guān)。使用從37。C下兩種細胞的搖瓶培養(yǎng)物以及兩種溫度下的靜態(tài)(血瓊脂生長的)培養(yǎng)物分離的基因組DNA,在樣品中沒有觀察到fimA階段變換或插入元件的差異。代表性的高生產(chǎn)者和低生產(chǎn)者tpa-gag-灰色和tpa-gag-白色，也分別進行描繪，沒有觀察到差異。有趣地，在包括大部分fimE基因和上游序列的擴增區(qū)域中(附圖6，區(qū)域P1'-P3')根據(jù)限制消化鑒定了IS1插入物。這個位點沒有在GenBank上可獲得的非致病K-12菌抹MG1655或W3110的公開的E.co/z序列中報道。根據(jù)周圍的J/7II和爿gd限制性位點，含有這個IS1插入物的片段長度將是-2.3Kb或1.7Kb。后一片段大小與轉(zhuǎn)化的和無質(zhì)粒菌林的RFLP分布型中最小的條帶一致(參見實施例2)。由于插入物在所有樣品中發(fā)現(xiàn)，在用IS1特異性酶消化時受影響的片段產(chǎn)生了相當?shù)臈l帶，不太可能的是，插入物序列貢獻了菌落形態(tài)方面觀察到的差異。/MGS2^發(fā)戎謬^^^^-構(gòu)建了基于pUC19的載體，其賦予了對新霉素的抗性(pUC-neo)。pUC19(NewEnglandBiolabs)的ampR基因()#皮取自pUC-4K質(zhì)粒(AmershamPharmaciaBiotech)的kanR/neoR基因("/rtl)替代。通過用限制性內(nèi)切酶(Eaml1051)和消化除去pUC19中的ampK基因，通過用限制性內(nèi)切酶尸M消化從pUC-4K質(zhì)粒移除neoR基因。使用DNA聚合酶的克列諾片段使兩個片段鈍端化。含有復制機制的1.8kbpUC19片段和含有來自pUC-4K的"prtl基因的1.2kb片段通過瓊脂糖凝膠電泳純化，然后用T4DNA連接酶連接。篩選產(chǎn)生的質(zhì)粒來鑒定在與原始Wa基因相同的方向上具有w//II插入的那些，來完成pUC-neo的構(gòu)建。為了構(gòu)建pMCS2，EcoRI、4/ZII和6amHI(5'—3')的限制性位點被插入正向引物的5'末端來從五.co//擴增hisC基因(MCS2-hisC-For:SEQIDNO:16)。任意地挑選/n、C基因用于這個目的。Xbal、Jgd和SamHI(5'—3')的類似地插入反向引物中(MCS2-hisC-Rev:5'-TCTAGACCGGTATGGATCCCGCGATCGATAAAAAGATAC國3';SEQIDNO:17)。使用PCR擴增來產(chǎn)生1.1Kb片段，其包括含有4/7II和的新的多克隆位點，具有在SamHI位點之間插入的hisC基因。包括這種hisC基因來提供大的片段用于連接，S"mHI位點被用于除去這個基因，并恢復lacZaORF用于藍色/白色選擇。產(chǎn)生的片段連接到pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)。切下1.1KbEcoRI-XbaI片段，成功地連接到pUC-neo。產(chǎn)生的質(zhì)粒pMCS2-hisC，用SawHI消化來除去hisC基因，最大的(3.1Kb)片段進行凝膠提取，重新連接來形成質(zhì)粒pMCS2。如提及的，pMCS2多克隆位點被設(shè)計以保持/acZa基因的開放閱讀框(ORF)和保持藍-白選擇。pMCS2連接的轉(zhuǎn)化體在補充有IPTG和X-gal的LB/neo瓊脂上回收，產(chǎn)生的菌落是藍色的，表明保留了/acZORF。載體pMCS2然后部分地測序來確認多克隆位點的結(jié)構(gòu)。/S/插入在,《W謬遞-RFLP分析表明，當基因組DNA用限制性內(nèi)切酶和Jgd消化時，感興趣的插入突變依賴~3到4Kb之間的限制性片斷(參見實施例2)。鑒定基因組DNA中的插入突變的位點的策略包括組裝并篩選來自受影響克隆的基因組DNA片段的庫，根據(jù)以下步驟1.從展現(xiàn)IS1插入突變的鑒定的低生產(chǎn)者克隆提取基因組DNA。取決于選擇的方法，基因組DNA的提取可以產(chǎn)生包括質(zhì)粒DNA的混合物。2.用J/m和爿gd消化來產(chǎn)生含有早先鑒定的大小~3-4Kb的IS1的生產(chǎn)。3.從所述限制性片斷的庫提取期望的片段大小。例如，通過用于根據(jù)大小分離片段的凝膠電泳、隨后通過切除含有期望范圍的片段的凝52膠部分，并從所述切除的凝膠分離片段，可以實現(xiàn)這一點。如果質(zhì)粒DNA保持在原始的基因組DNA制品中，期望的基因組DNA片段應(yīng)當從混合物中分離，來除去與線性化質(zhì)粒DNA的重連接和轉(zhuǎn)化相關(guān)的高背'4.期望片段的庫連接到在多克隆位點中用限制性內(nèi)切酶和jgd線性化的載體中。為此目的創(chuàng)建了這種載體pMCS2(參見上文)。連接的庫可以用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)的E.co//細胞，轉(zhuǎn)化體可以在固體LB或其他適合于快速生長和維持的復合培養(yǎng)基上增殖。5.產(chǎn)生的庫的篩選可以以幾種方式實現(xiàn)，包括但不限于(a)使用對IS1特異性的Q-PCR分析；和(b)對ISl:質(zhì)粒接點特異性的菌落或質(zhì)粒PCR。這些潛在的篩選方法以下更詳細地描述?；蚪M^NA^庫創(chuàng)建的載體pMCS2含有新霉素抗性的基因(neoR)^在包括與pMCS2載體連接的IS1陽性基因組DNA片段的庫中的質(zhì)粒將含有1:1比例的IS1和neoR。IS1陰性質(zhì)粒將僅含有來自剩余基因組DNA的背景數(shù)量的IS1。與質(zhì)粒DNA貢獻的數(shù)量相比，由基因組DNA貢獻的IS1的部分應(yīng)當是小的，因為pMCS2是高拷貝數(shù)質(zhì)粒。因此，類似于實施例4中所描述的Q-PCR分析可以用純化的質(zhì)粒DNA或完整細胞來進行。Q-PCR分析是期待，以使用以下引物/探針序列以多重方式測定lSl:nec^拷貝比例ISl國Q畫For:5'-AGGCTCATAAGACGCCCCA國3'(SEQIDNO:18);IS1陽Q-Rev:5'畫ACGGTTGTTGCGCACGTAT-3'(SEQIDNO:19);和,IS1-Q-Probe:5'-VIC-CGTCGCCATAGTGCGTTCACCG-TAMRA-3'(SEQIDNO:20)。膽"，/豕#襲neo畫Q-For二5'-CAACCTATTAATTTCCCCTCGTCA-3'(SE(^IDNO:21);neo-Q-Rev:5'-CTGGCCTGTTGAACAAGTCTG畫3'(SEQIDNO:22);和,neo-Q-Probe:5'-FAM-CCATGAGTGACGACTGAATCCGGTG-TAMRA誦3'(SEQIDNO:23)。進行起始多重優(yōu)化實驗來鑒定出對于IS1-Q引物的最佳引物濃度100nM和對于neo-Q引物的300nM,對于IS1和neo4果針都是200nM。通過將IS1-Q引物濃度限制到100nM同時測試100nM-400nM之間的范圍內(nèi)的neo-Q引物濃度，確定了這些條件。通過多重引物優(yōu)化實驗，特別是限制neo-Q引物濃度，ISl-Q已經(jīng)顯示了消極地影響neo-Q。使用新近優(yōu)化的值，ISl-Q光譜干擾仍然改變neo-Q閾值循環(huán)(CT)值達到0.1。/。ISl/neo拷貝比例下的70%,但是結(jié)果都^艮好地處于篩選所需的耐受度之內(nèi)。AS7;^^",和,在尸CT-由于完整細胞和純化的質(zhì)粒DNA都預計含有基因組DNA，對IS1特異性的PCR預計引起來自所有樣品的擴增，無論IS1陽性基因組DNA片段是否存在于質(zhì)粒庫中。然而，如果重組質(zhì)粒含有IS1片段，使用對質(zhì)粒特異性的一個引物和對IS1特異性的一個引物的PCR應(yīng)當僅產(chǎn)生信號。質(zhì)粒特異性引物可以按多種方式來設(shè)計。如果轉(zhuǎn)座子靠近片段的相反末端，它可以與靠近插入位點的質(zhì)粒區(qū)域退火(即，4/m-』gel識別位點)，以避免高達~4Kb的不利地大的擴增子大小。在這種情況下，被有利地配置以擴增長目標的聚合酶可以用于確保滿意的擴增。做為選擇，引物可以與從插入位點兩側(cè)移除的區(qū)域退火，以避免不尋常地小的片段的擴增。在兩種情況下，重要的是，利用PCR來鑒定IS1:質(zhì)粒接點的分析在設(shè)計引物時考慮了不同的IS1取向的可能性。為了解決這個問題，可以采用與轉(zhuǎn)座子的中心區(qū)域互補的、但在兩個方向上延伸的IS1特異性引物，來確保轉(zhuǎn)座子插入物的兩個方向都被檢測。使用內(nèi)部引物也確保了至少~380bp的目標的擴增。由于這種篩選分析特異于IS1:質(zhì)粒接點；它可以使用完整細胞("克隆PCR")或純化的質(zhì)粒DNA來進行。不預期的是，基因組DNA中存在的IS1將返回信號。實施例6用于高產(chǎn)性克隆的基于基因組的高通量篩選實施例2中公開的RFLP分布型顯示了低產(chǎn)性DNA疫苗克隆和基因組DNA中的IS1插入突變之間的相關(guān)性。因此高產(chǎn)性克隆的高通量篩隆的鑒定和選擇。這種篩選將需要鑒定突變/插入位點，例如，如實施例5中描述的。對于這種篩選過程，隨后可以開發(fā)幾種分析。差fra《A^"Q-尸CA-TaqManQ-PCR高通量分析來鑒定不攜帶IS1插入突變的細菌克隆的一個實例需要使用兩種引物和內(nèi)部探針用于熒光信號的擴增(附圖7A中圖示)。如果IS1插入突變被定位到基因組DNA內(nèi)的單個鑒定的位點，TaqMan探針可以凈皮設(shè)計以識別基因組的這個部分。由于如早先描述的探針的降解(參見實施例4),利用互補引物的擴增將引起熒光信號的積累。在所討論位點的IS1插入的存在將破壞結(jié)合位點并阻止熒光的積累。因而，潛在的高生產(chǎn)者克隆將得到擴增信號，而低生產(chǎn)者將僅展現(xiàn)由于系統(tǒng)的固有噪聲的背景熒光。所述分析不需要多重，可以使用完整細胞溶胞產(chǎn)物進行，消除了分離基因組DNA的需要。TagMan探針一般在長度上從約15個到約40個核苷酸變動。因而，對IS1突變鑒定的熱點必需被定位到狹窄的序列范圍，優(yōu)選的在10個核苦酸內(nèi)，以確保基因組特異性探針的充分結(jié)合。/S/:差^逸凝,W尸CA為Vf-如果插入位點沒有被定位到基因組DNA的非常狹窄的區(qū)域，可以采用不使用內(nèi)部探針的PCR分析來鑒定IS1:基因組DNA接點(在附圖7B中圖示)。一個引物可以祐:設(shè)計以在從IS1插入熱點移開的短距離上與基因組DNA退火。第二引物應(yīng)當與轉(zhuǎn)座子退火。如果存在插入物(即，推定的"低生產(chǎn)者")，應(yīng)當產(chǎn)生與IS1:基因組DNA接點相應(yīng)的擴增的片段。產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物可以被視覺地分析來鑒定目標大小的片段。做為選擇，染料例如SYBRGreen可以被添加到分析中，實時PCR儀器被用于根據(jù)相應(yīng)的熒光提高來鑒定潛在的高產(chǎn)性克隆(例如，缺乏熒光表明缺少IS1插入——推定的"高產(chǎn)者")。類似地，熒光LUXTM引物(Invitrogen)可以被采用來測量熒光的指數(shù)性提高。注意到在這種情況下，甚至在沒有基因組:IS1接點的克隆中預計有熒光信號，因為來自LUX引物的信號從單個引物的延伸產(chǎn)生。然而，由于互補引物的缺乏產(chǎn)生單個擴增的片段，信號將線性地提高，而不是指數(shù)地。為了避免視覺地分析擴增的片段的需要，鑒定的插入突變必需從基因組中7個靜態(tài)的IS1拷貝中良好地除去以防止假陽性。根據(jù)實施例2中公開的RFLP分布型，如果靜態(tài)拷貝足夠靠近突變來引起干擾，它不會出現(xiàn)。這些分析必需也考慮突變的插入的兩個方向的可能性。通過使用任一方向上的內(nèi)部IS1引物，可以進行這一點。在這種情況下，可以每個樣品運行兩個獨立的分析，可以同時利用兩種引物來完全地篩選克隆的群體。實施例7用于DNA疫苗生產(chǎn)的優(yōu)化的菌抹的構(gòu)建由于低生產(chǎn)者群體與IS1插入突變相關(guān)，設(shè)想的是，缺少任何IS1拷貝的Ec0/,宿主菌林將可能產(chǎn)生高產(chǎn)性克隆的更為均一的群體。因此，改善高產(chǎn)性克隆的產(chǎn)量的一種策略包括構(gòu)建五.co/,菌抹，其中所有的IS1拷貝被除去，并利用所述菌抹用于DNA疫苗載體的增殖。存在幾種方法用于構(gòu)建E.co//的刪除或破壞突變，包括Pl噬菌體轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)座子介導的隨機誘變、和一般的(RecA介導的)同源重組。由于對每個突變的可選擇標記，例如抗生素抗性的需要，這些方法一般僅適合于單一突變，而不適合于多個突變?？蛇x擇的方法涉及使用在引物上具有36-nt到50-nt延長的PCR產(chǎn)物，其與期望的破壞位點周圍的側(cè)翼序列同源，以及X-Red重組酶(DatsenkoandWanner,2000,尸A^4S97:6640-6645)。在這種情況中仍然使用可選擇標記；然而，標記隨后可以被除去，解放了它用于突變的其他輪次的用途。消除殘余的"痣痕，，的修改的方法利用了內(nèi)源雙鏈中斷修復過程來除去可選擇標記(KolisnychenkoWa/.,2002,12:640-647)。這種方法被用于產(chǎn)生基因組大小降低8.1%的K-12E.co//菌抹，包括44個可轉(zhuǎn)座元件的24個的消除。在這個菌林中七個IS1拷貝的三個被除去。高度可能的是，其余4個拷貝的消除將對菌林的生存力、或在進料-分批發(fā)酵過程中它的用途的適用性沒有有害影響。然而，注意的是，由于值雙鏈中斷修復過程中需要RecA,Kolisnychenko等人的修改的方法不適合于￡.co//菌林DH5。另一種方法利用了II組內(nèi)含子，所謂的"targetrons",根據(jù)互補序列的14-nt到16-nt區(qū)域來產(chǎn)生突變(ZhongW"/.,2003,M/c/"'cJ"AAe&31:1656-1664)。這種方法還利用了可選擇標記，其隨后可以;故移動以允許多個插入。然而，它不像早先的兩種方法一樣產(chǎn)生目標位點的刪除，而是產(chǎn)生破壞。使用這種方法將產(chǎn)生攜帶7個無功能的IS1拷貝的菌抹，在轉(zhuǎn)座子編碼的主要轉(zhuǎn)座酶基因(insAB)中被破壞。5權(quán)利要求1.一種選擇攜帶質(zhì)粒DNA的E.coli菌株的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括(a)比較攜帶相同質(zhì)粒DNA的相同菌株的至少兩種克隆亞型中的IS1轉(zhuǎn)座活性，其中顯示了相對更低的轉(zhuǎn)座活性的克隆亞型代表潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；和(b)測試所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的生產(chǎn)力；其中高產(chǎn)性克隆亞型展現(xiàn)每個細胞高的質(zhì)?？截悢?shù)。2.權(quán)利要求1的方法，其中通過測量來自所述克隆亞型的分離的質(zhì)粒DNA樣品中的ISI轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)來確定IS1轉(zhuǎn)座活性，其中相對更低的ISI轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)表明相對更低的ISI轉(zhuǎn)座活性。3.權(quán)利要求1的方法，其中通過測定所述克隆亞型的基因組DNA內(nèi)預定IS1插入?yún)^(qū)域中ISI轉(zhuǎn)座子序列存在或缺乏來確定IS1轉(zhuǎn)座活性，其中ISI插入序列的缺乏表明相對更低的ISI轉(zhuǎn)座活性。4.一種選擇攜帶質(zhì)粒DNA的五.co/,菌抹的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括(a)從攜帶相同質(zhì)粒DNA的相同菌抹的至少兩種克隆亞型分離質(zhì)粒DNA;(b)測量所述分離的質(zhì)粒DNA樣品中的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)，其中顯示了相對更低的ISI轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的克隆亞型代表潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；和(c)測試所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的生產(chǎn)力；其中高產(chǎn)性克隆亞型展現(xiàn)每個細胞高的質(zhì)?？截悢?shù)。5.權(quán)利要求4的方法，其中使用定量PCR分析來測定ISI轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述定量PCR分析通過擴增位于ISI核苷酸序列內(nèi)的質(zhì)粒DNA的第一核苷酸序列和確定沒有ISI插入的質(zhì)粒DNA的第二核苷酸序列，產(chǎn)生代表ISI轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的ISl/質(zhì)粒拷貝比例，來測量基于質(zhì)粒拷貝數(shù)的ISI的相對數(shù)量。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述ISl/質(zhì)?？截惐壤ㄟ^減去所述質(zhì)粒DNA樣品中存在的剩余基因組DNA貢獻的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的預計數(shù)量來校正。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述質(zhì)粒DNA樣品中存在的剩余基因組DNA貢獻的IS1轉(zhuǎn)座子拷貝的預計數(shù)量使用第二定量PCR分析來測量。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述第二定量PCR分析通過擴增位于23srDNA核苷酸序列內(nèi)的剩余基因組DNA的核苷酸序列和用于產(chǎn)生ISl/質(zhì)?？截惐壤?、確定沒有IS1插入的質(zhì)粒DNA的第二核普酸序列，產(chǎn)生23srDNA/質(zhì)?？截惐壤?，其從ISl/質(zhì)?？截惐壤袦p去來提供校正的ISl/質(zhì)?？截惐壤?，來基于質(zhì)?？截悢?shù)的23srDNA的相對數(shù)量。10.權(quán)利要求6的方法，其中質(zhì)粒DNA的第一和第二核苷酸序列在存在核酸聚合酶和一組寡核苷酸的情況下分別地擴增，其中所述用于擴增第一核苦酸序列的寡核苦酸組由以下組成(i)與IS1核苷酸序列的第一位置雜交的正向PCR引物；(ii)與所述第一位置下游的IS1核苷酸序列的第二位置雜交的反向PCR引物；和，(iii)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量，所述探針與所述第一和第二位置之間的IS1核普酸序列內(nèi)的位置雜交；以及用于擴增所述第二核苷酸序列的寡核苷酸組由以下組成(i)與所述第二核苷酸序列的第一位置雜交的正向PCR引物；(ii)與所述第一位置下游的的第二核苷酸序列的第二位置雜交的反向PCR引物；和(iii)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量，所述探針與所述第一和第二位置之間的第二核苷酸序列內(nèi)的位置雜交；其中所述核酸聚合酶在擴增期間消化所述熒光探針來將所述熒光團從所述淬滅劑分子上解離，檢測所述焚光團和所述淬滅劑分子解離時熒光的變化，所述熒光的變化相應(yīng)于所述第一和/或第二核苷酸序列的擴增的發(fā)生。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述第一和第二核苷酸序列以多重方式擴增。12.權(quán)利要求10的方法，其中用于擴增第一核苷酸序列的寡核苷酸組分別由正向和反向PCR引物IS1-Q-F(SEQIDNO:6)和IS1-Q-R(SEQIDNO:7),和焚光探針I(yè)S1-Q-P2(SEQIDNO:8)組成。13.權(quán)利要求10的方法，其中用于擴增第二核苷酸序列的寡核苷酸組分別由正向和反向PCR引物CMV-Q-F(SEQIDNO:3)和CMV-Q畫R(SEQIDNO:4),和焚光探針CMV畫Q畫P2(SEQIDNO:5)組成。14.4又利要求9的方法，其中位于所述23srDNA序列內(nèi)的核苷酸序列和第二核苷酸序列在存在核酸聚合酶和一組寡核苷酸的情況下分別地擴增，其中所述用于擴增第一核苷酸序列的寡核普酸組由以下組成(i)與所述23srDNA序列的第一位置雜交的正向PCR引物；(ii)與所述第一位置下游的23srDNA序列的第二位置雜交的反向PCR引物；和，(ill)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量；所述探針與所述第一和第二位置之間的23srDNA序列內(nèi)的位置雜交；以及用于擴增所述第二核普酸序列的寡核苷酸組由以下組成(iv)與所述第二核苷酸序列的第一位置雜交的正向PCR引物；(v)與所述第一位置下游的的第二核苷酸序列的第二位置雜交的反向PCR引物；和(vi)用淬滅劑分子和熒光團標記的熒光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量，所述探針與所述第一和第二位置之間的第二核苦酸序列內(nèi)的位置雜交；其中所述核酸聚合酶在擴增期間消化所述熒光探針來將所述焚光團從所述淬滅劑分子上解離，檢測所述熒光團和所述淬滅劑分子解離時熒光的變化，所述熒光的變化相應(yīng)于所述23srDNA序列和/或第二核苷酸序列的擴增的發(fā)生。15.^l利要求14的方法，其中所述23srDNA序列和第二核苷酸序列以多重方式擴增。16.權(quán)利要求14的方法，其中用于擴增23srDNA核苷酸序列的寡核苷酸組分別由正向和反向PCR引物23s-FlD(SEQIDNO:11)和23s-RlD(SEQIDNO:12),和熒光探針23s-Pfam(SEQIDNO:13)組成。17.權(quán)利要求14的方法，其中用于擴增第二核苷酸序列的寡核苷酸組分別由正向和反向PCR引物CMV-Q-F(SEQIDNO:3)和CMV-Q-R(SEQIDNO:4)，和熒光探針CMV-Q-P2(SEQIDNO:5)組成。18.—種選擇攜帶質(zhì)粒DNA的￡.co/,菌株的高產(chǎn)性克隆亞型的方法，包括(a)檢測所述克隆亞型的基因組DNA的預定IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子序列的存在或缺乏，其中在所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)缺乏IS1轉(zhuǎn)座子序列的克隆亞型代表潛在的高產(chǎn)性克隆亞型；和(b)測試所述潛在的高產(chǎn)性克隆亞型的生產(chǎn)力；其中高產(chǎn)性克隆亞型展現(xiàn)每個細胞高的質(zhì)?？截悢?shù)。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述IS1插入?yún)^(qū)域3爭越所述基因組DNA的低于約20個連續(xù)核苷酸。20.權(quán)利要求19的方法，其中定量PCR分析被用于檢測基因組DNA的所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子序列的存在或缺乏。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述定量PCR分析在存在核酸聚合酶和一組寡核苷酸的情況下擴增含有IS1插入?yún)^(qū)域的基因組DNA的一部分，所述寡核香酸組由以下構(gòu)成(i)用淬滅劑分子和熒光團標記的焚光探針，所述熒光團在獨特的發(fā)射最大值下發(fā)射能量，其中僅當所述基因組DNA缺乏所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)的IS1轉(zhuǎn)座子序列時，所述探針與位于跨越所述IS1插入?yún)^(qū)域的基因組DNA內(nèi)的位置雜交；(ii)與所述熒光探針上游的基因組DNA的位置雜交的正向PCR引物；和(iii)與所述熒光探針下游的基因組DNA的位置雜交的反向PCR引物；其中所述核酸聚合酶在擴增期間消化所述熒光探針來將所述熒光團從所述淬滅劑分子上解離，檢測所述熒光團和所述淬滅劑分子解離時熒光的變化，所述熒光的變化相應(yīng)于所述基因組DNA的擴增和所述ISl插入?yún)^(qū)域內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子序列的缺乏。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述定量PCR分析針對完整細胞溶胞產(chǎn)物進行。23.權(quán)利要求18的方法，其中所述IS1插入?yún)^(qū)域跨越所述基因組DNA的大于約20個連續(xù)核苦酸。24.權(quán)利要求23的方法，其中定量PCR分析凈皮用于檢測基因組DNA的所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子序列的存在或缺乏。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述PCR分析在存在核酸聚合酶和一組寡核苷酸的情況下擴增所述基因組DNA的一部分，所述寡核普酸纟且由以下構(gòu)成(i)與所述ISl插入?yún)^(qū)域之外的基因組DNA的位置雜交的第一PCR引物；和，(ii)與所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)插入的ISl轉(zhuǎn)座子序列內(nèi)的位置雜交的第二PCR引物；其中由于兩個PCR引物的雜交，所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)ISl轉(zhuǎn)座子序列的存在引起所述基因組DNA的所述部分的指數(shù)性擴增，以及由于僅第一PCR引物的雜交，所述IS1插入?yún)^(qū)域內(nèi)ISl轉(zhuǎn)座子序列的缺乏引起所述基因組DNA的所述部分的僅單鏈的線性擴增。26.4又利要求25的方法，其中所述基因組DNA的所述部分的擴增通過鑒定近似目標大小的擴增的核酸片段來視覺上地檢測。27.權(quán)利要求25的方法，其中所述基因組DNA的所述部分的擴增通過添加結(jié)合雙鏈DNA的核酸染津牛實時地熒光地;險測。全文摘要本發(fā)明涉及挑選用于生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的高產(chǎn)性E.coli克隆的方法，包括測量轉(zhuǎn)化的克隆亞型的質(zhì)粒或基因組DNA內(nèi)IS1轉(zhuǎn)座子插入突變的頻率。IS1插入突變的增加與可能展現(xiàn)低單位生產(chǎn)力的克隆亞型相關(guān)。在此公開的基于PCR的遺傳選擇分析可以經(jīng)受高通量分析，降低鑒定能夠在工業(yè)規(guī)模上培養(yǎng)大量質(zhì)粒DNA的高產(chǎn)性克隆的時間。文檔編號G01N33/569GK101454672SQ200780009583公開日2009年6月10日申請日期2007年3月13日優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日發(fā)明者J·赫羅德,K·J·普拉瑟爾,M·C·埃德蒙茲申請人:默克公司