專利名稱：同時檢測ToRCH感染的免疫層析試紙及制備方法
同時檢測torch感染的免疫層析試紙及制備方法背景技術(shù)本發(fā)明涉及一種層析試紙及其制備方法，尤其涉及一種同時檢測torch感染的免疫層析 試紙及制備方法。
技術(shù)背景ToRCH是弓形體(Toxoplasma gondii, Tox)、風(fēng)疹病毒(Rubella Virus, RubV)、巨細胞病毒 (Cytomegalovirus, CMV)、單純皰疹病毒(Herpes simplex Virus, HSV)的英文名稱殺頭組合，是可 導(dǎo)致先天性宮內(nèi)感染及圍產(chǎn)期感染而引起圍產(chǎn)兒畸形的病原體。孕婦torch感染多無臨床癥狀，為隱型感染，診斷胎兒有無宮內(nèi)感染應(yīng)首先確定孕婦是 否感染，孕婦torch感染對優(yōu)生優(yōu)育與人口素質(zhì)構(gòu)成很大的威脅，因此對孕期進行ToRCH篩 查是十分必要的。目前醫(yī)院及計劃生育服務(wù)部門確定孕早期或孕前婦女是否有torch感染， 需要同時檢測這四項指標(biāo)。臨床上檢測ToRCH感染常用的是elisa法，其操作程序比較復(fù)雜， 檢測時間較長，不適應(yīng)孕婦感染的快速診斷和懷孕人群的篩査。層析試紙作為一種快速的檢測工具，在早孕檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。受其啟發(fā)，在一 些其他的疾病檢測中人們也采用了層析試紙，而且為了能同時進行多種疾病的檢測，人們在 一張層析試紙上依次設(shè)置了檢測線，通過其變色反應(yīng)檢測疾病。但這種層析試紙它的膠體金 結(jié)合物墊上涂的膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合物濃度是一定的。若結(jié)合物墊涂的過高，用其所裝配的 試紙條檢測標(biāo)本，層析膜上的本底顏色會深，并且易發(fā)生非特異性反應(yīng)即檢測標(biāo)本會出現(xiàn)假 陽性結(jié)果情況；若涂的過低，用其所裝配的試紙條檢測靈敏度會達不到要求，標(biāo)本可能會出 現(xiàn)漏檢情況。當(dāng)在層析膜上同時包被固定兩種以上檢測項目抗原，包被線長度相同，并間隔 一定距離平行向后排列，固化的層析膜裝配成試紙條。當(dāng)用此試紙條檢測含有兩種以上病原 體抗體血標(biāo)本時，膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合物與第一條檢測線形成復(fù)合物后，剩余的膠體金標(biāo)記 抗體結(jié)合物再與下一個檢測線反應(yīng)時，由于濃度下降檢測靈敏度會降低，當(dāng)它"流到"第三 條檢測線反應(yīng)時，由于濃度更低，反應(yīng)檢測靈敏度會更低，標(biāo)本會出現(xiàn)假陰性情況。尤其當(dāng)血標(biāo)本與第一條檢測線呈強陽性反應(yīng)時，在第一條檢測線處形成復(fù)合物會多，肉 眼觀察表現(xiàn)為檢測線紅色帶更加明顯，剩余的膠體金標(biāo)記抗體濃度就會更少，那么在第二個 檢測線反應(yīng)靈敏度就會更低，標(biāo)本出現(xiàn)漏檢情況就會更嚴重。還有人提出將多張層析試紙集成到一個盒體進行檢測，但其也存在一定問題，比如當(dāng)加樣量太少流不到檢測區(qū)時，它需要在緩沖液加入?yún)^(qū)(b)處滴2滴緩沖液，該緩沖液在溶解固 相膠體金標(biāo)記抗人IgG/lgM抗體的同時"沖向"硝酸纖維素膜過程中同時稀釋血清，并一起 帶入固化層析膜，進行抗原抗體反應(yīng)。逆向膠體金檢測torch免疫層析試紙條沒有表現(xiàn)出想 要得到的結(jié)果，且操作繁瑣，需要兩步加樣。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服目前在一條試紙上進行多種病原體檢測時其靈敏度不高等問題，提供一種具有結(jié)構(gòu)簡單，使用方便，靈敏度髙等優(yōu)點的同時檢測torch感染的免疫層析試紙及制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種同時檢測torch感染的免疫層析試紙，它包括基板，基板上粘接層析膜，在層析膜 上包被固定至少兩種特定檢測線，在層析膜下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊、樣品墊，在層析 膜上端為吸收墊，所述檢測線以交錯排布在層析膜上，吸收墊上有與層析膜上的具體檢測線相對應(yīng)的標(biāo)識區(qū)，本試紙條用來同時檢測人是否有特異性IgG或IgM感染。所述檢測線排布時按照階梯式交錯排布。 所述檢測線排布時以波浪式交錯排布。一種同時檢測TORCH感染的免疫層析試紙的制備方法，它的步驟為， 1)在層析膜上以交錯排布方式包被固定至少兩種特定檢測線；
2) 制作膠體金結(jié)合物墊；3) 將固相化的層析膜與膠體金結(jié)合物墊、樣品墊、吸收墊按比例重疊在一起，裝配成試 紙條。所述步驟l)中，層析膜上包被抗原的制備方法為用pH-7.6、 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液 分別將多種檢測抗原、膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體稀釋到l-2mg/ml作為包被應(yīng)用液；在硝酸纖 維素膜上端用膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體包被應(yīng)用液劃線，做為質(zhì)控線即C線，然后在質(zhì)控線 下方包被與給抗原相對應(yīng)的檢測線Tn,各檢測線Tn交錯分布，將己包被好的NC膜放置室溫干燥,供裝配試紙用o所^步驟2)中，膠體金結(jié)合物墊的制備方法為a、 將氯金酸配制成0.01%水溶液，取100ml加熱煮沸，攪拌下加入1.5-2.0ml的1%檸檬 酸鈉溶液，直到溶液顏色穩(wěn)定成酒紅色，即得到膠體金溶液；b、 用0.2mol/L K2C03溶液將膠體金溶液調(diào)pH值至7.6,攪拌下將抗人IgM或抗人IgG 抗體5ug/ml用量加入膠體金溶液中混合，然后加入10%BSA溶液lOrnl，將標(biāo)記好的膠體金結(jié) 合物10000- 14000r/min離心30-60分鐘，棄上清，將沉淀用含1%BSA的磷酸鹽(PBS)緩沖 液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心，如此洗滌2 4次。最后將沉淀懸浮于3A0體積含1%BSA的 PBS緩沖液中，然后將此膠體金結(jié)合物溶液均勻涂在玻璃纖維上，冷凍干燥,密封備用。本發(fā)明的試紙條具有一次檢測，即可知是否有torch四種病原體感染，在圍產(chǎn)期檢査中 具有很大的應(yīng)用價值。本試紙條提供的這種同時檢測torch感染的免疫層析試紙，其方法是 將弓形蟲抗原、風(fēng)疹病毒抗原、巨細胞病毒抗原、單純皰疹病毒抗原分別在硝酸纖維素膜上的不同位置交錯包被成線，通過膠體金標(biāo)記抗人IgM或抗人IgG顯色，來同時檢測人血清中 針對抗原的特異性IgM或IgG抗體。本試紙條既克服了單測試紙條一次只能檢測一種病原體 的缺點，又避免了在一個層析條上同時做幾個項目的檢測時前面檢測線形成的復(fù)合物會影響 后面的檢測,在靈敏度上受到很大限制的缺陷。本發(fā)明的有益效果是它在層析膜上對同時包被至少兩種特定檢測線，是以交錯排布形式來完成的，避免了上述的缺陷，又^:服了單測試紙條一次只能檢測一種病原體抗體的缺點，本試紙條具有操作方法簡便、快速、靈敏、不需要特殊儀器設(shè)備、觀察結(jié)果直觀等顯著優(yōu)點。


圖l為本發(fā)明第一實施例結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為本發(fā)明第二實施例結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為本發(fā)明第三實施例結(jié)構(gòu)示意圖。其中，1、樣品墊，2、膠體金結(jié)合物墊，3、固相化層析墊，4、吸收墊。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步說明。 實施例l:層析試紙條整體外觀形式在一個12*80mm的PVC板上粘著一張12*25mm的層析膜， 層析膜上包被固定有弓形蟲抗原、風(fēng)疹病毒抗原、巨細胞病毒抗原、單純皰疹病毒ll型抗原、 膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體，形成固相化的層析膜3，其上的檢測線呈階梯狀交錯分布，層析 膜的下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊2、樣品墊l (玻璃纖維)，層析膜的上端粘有吸收墊4 (棉 漿板)，吸收墊4上有與層析膜上包被的具體抗原相對應(yīng)的標(biāo)識區(qū)，如圖1所示。實施例2:層析試紙條整體外觀形式在一個12*80mm的PVC板上粘著一張12*25mm的層析膜， 層析膜上包被固定有弓形蟲抗原、風(fēng)疹病毒抗原、巨細胞病毒抗原、單純皰疹病毒ll型抗原、 膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體，形成固相化的層析膜3，其上的檢測線呈波浪形交錯分布，層析 膜的下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊2、樣品墊l (玻璃纖維)，層析膜的上端粘有吸收墊4 (棉 漿板)，吸收墊4對應(yīng)的抗原區(qū)域標(biāo)明具體的檢測抗體名稱，如圖2所示。實施例3:
層析試紙條整體外觀形式在一個15*80mm的PVC板上粘著一張15*25mm的層析膜， 層析膜上包被固定有弓形蟲抗原、風(fēng)疹病毒抗原、巨細胞病毒抗原、單純皰疹病毒l型抗原、 單純皰疹病毒II型抗原、膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體，形成固相化的層析膜3，其上的檢測線 呈階梯狀交錯分布，層析膜的下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊2、樣品墊l (玻璃纖維)，層析 膜的J:端粘有吸收墊4 (棉漿板)，吸收墊4對應(yīng)的抗原區(qū)域標(biāo)明具體的檢測抗體名稱，如圖 3所示。
本發(fā)明試紙的制備方法為
(一) 層析膜包被抗原的制備用pH-7.6 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液分別將弓形蟲抗原、風(fēng)疹病毒抗原、巨細胞病毒抗原、 單純皰疹病毒l型抗原、單純皰疹病毒ll型抗原、膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體稀釋到l-2mg/ml 作為包被應(yīng)用液。
在距離硝酸纖維素膜(NC膜)上端6nm處將膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體包被應(yīng)用液劃一條 15mm長的線，做為質(zhì)控線(C線)，然后在質(zhì)控線向下4mm處包被一條3mm長的檢測線l(Tl)為弓形蟲抗原，在Tl橫線終止處垂直向下間距2mm處再包被一條3mm長的檢測線 2(T2)為風(fēng)疹病毒抗原,在T2橫線終止處垂直向下間距2mm處包被一條3mm長的檢測線3(T3) 為巨細胞病毒抗原，T3橫線終止處垂直向下間距2mm處包被一條3mm長的檢測線4 (T4) 為單純皰疹病毒I型抗原，T4橫線終止處垂直向下間距2mm處包被一條3mm長的檢測線5(T5)為單純皰疹病毒II型抗原。將己包被好的NC膜室溫放置干燥，供裝配試紙用。
(二) 膠體金結(jié)合物墊的制備
1、 將氯金酸(HAuCI4)配制成0.01%水溶液，取100ml加熱煮沸，攪拌下加入1.5-2.0ml 的1%檸檬酸鈉溶液，直到溶液顏色穩(wěn)定成酒紅色，即得到膠體金溶液。2、 用0.2mol/L K2C03溶液將膠體金溶液調(diào)pH值至7.6，攪拌下將抗人IgM抗體或抗人 IgG抗體5ug/ml用量加入膠體金溶液中混合，然后加入10%BSA溶液lOml。將標(biāo)記好的膠體 金結(jié)合物10000-14000r/min離心30-60分鐘，棄上清，將沉淀用含1%BSA的磷酸鹽(PBS) 緩沖液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心。如此洗滌2~4次。最后將沉淀懸浮于1/10體積含1%BSA 的PBS緩沖液中，然后將此膠體金結(jié)合物溶液均勻涂在玻璃纖維上，冷凍干燥,密封備用。
(三) 免疫層析檢測條的制備
按第一步驟(試紙條整體外觀形式)方法將固相化的層析膜與膠體金結(jié)合物墊、樣品墊、 吸收墊等按一定比例重疊在一起，裝配成試紙條。 二、免疫層析檢測條的結(jié)果判斷1、 取人血清標(biāo)本200ul加在層析檢測條的樣品墊上，靜置10-20分鐘觀察結(jié)果，若只有 一條紅色質(zhì)控線(C線)出現(xiàn)，則判為陰性；若有一條紅色質(zhì)控線(C線)出現(xiàn)，同時在包被 有Tox、 RubV、 CMV、 HSV-I、 HSV-II抗原特定位置出現(xiàn)紅色帶，則判為陽性，哪個特定位置出 現(xiàn)紅色帶則判定是什么病原體抗體陽性；若無任何紅色帶出現(xiàn)則判定本試紙條失效。2、 若膠體金結(jié)合物墊中涂的是膠體金標(biāo)記抗人IgG，那么裝配的試紙條是用于檢測人血 清中的ToRCH-lgG抗體。若膠體金結(jié)合物墊中涂的是膠體金標(biāo)記抗人IgM,那么裝配的試紙條是用于檢測人血 清中的ToRCH-lgM抗體。
權(quán)利要求
1、一種同時檢測ToRCH感染的免疫層析試紙，它包括基板，基板上粘接層析膜，在層析膜上包被固定至少兩種特定抗原檢測線，在層析膜下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊、樣品墊，在層析膜上端為吸收墊，其特征是所述檢測線以交錯排布在層析膜上，吸收墊上有與層析膜上的具體檢測線相對應(yīng)的標(biāo)識區(qū)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的同時檢測TORCH感染的免疫層析試紙，其特征是所述檢測線 排布時按照階梯式交錯排布。
3、 根據(jù)權(quán)利要求i所述的同時檢測torch感染的免疫層析試紙，其特征是所述檢測線排布時以波浪式交錯排布。
4、 一種權(quán)利要求i所述同時檢測torch感染的免疫層析試紙的制備方法，其特征是它的步驟為，1) 在層析膜上以交錯排布方式包被固定至少兩種特定檢測線；2) 制作膠體金結(jié)合物墊；3) 將固相化的層析膜與膠體金結(jié)合物墊、樣品墊、吸收墊按比例重疊在一起，裝配成試 紙條。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的同時檢測ToRCH感染的免疫層析試紙的制備方法，其特征是 所述步驟l)中，層析膜上包被抗原的制備方法為用pH-7.6、 O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液分別 將多種檢測抗原、膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體稀釋到l-2mg/ml作為包被應(yīng)用液；在硝酸纖維素 膜上端用膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體包被應(yīng)用液劃線，做為質(zhì)控線即C線，然后在質(zhì)控線下方 包被與給抗原相對應(yīng)的檢測線Tn，各檢測線Tn交錯分布，將己包被好的NC膜室溫放置干燥， 供裝配試紙用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的同時檢測ToRCH感染的免疫層析試紙的制備方法，其特征是-所述步驟2)中，膠體金結(jié)合物墊的制備方法為-a、 將氯金酸配制成0.01%水溶液，取100ml加熱煮沸，攪拌下加入1.5-2.0ml的1%擰檬 酸鈉溶液，直到溶液顏色穩(wěn)定成酒紅色，即得到膠體金溶液；b、 用0.2mol/L K2C03溶液將膠體金溶液調(diào)pH值至7.6，攪拌下將抗人IgM或抗人IgG 抗體5ug/ml用量加入膠體金溶液中混合，然后加入10%牛血清白蛋白(BSA)溶液10ml，將 此標(biāo)記好的膠體金結(jié)合物10000-14000r/min離心30-60分鐘，棄上清，將沉淀用含1%bsa的 磷酸鹽(pbs)緩沖液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心，如此洗滌2 4次，最后將沉淀懸浮于1A0 體積含1%BSA的PBS緩沖液中，然后將此膠體金結(jié)合物溶液均勻涂在玻璃纖維上，冷凍干燥， 密封備用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種同時檢測ToRCH感染的免疫層析試紙及制備方法。它包括基板，基板上粘接層析膜，在層析膜上包被固定至少兩種特定抗原檢測線，在層析膜下端依次粘有膠體金結(jié)合物墊、樣品墊，在層析膜上端為吸收墊，所述檢測線以交錯排布在層析膜上，吸收墊上有與層析膜上的具體檢測線相對應(yīng)的標(biāo)識區(qū)，本試紙條用來同時檢測人是否有ToRCH特異性IgM或IgG感染。本試紙條既克服了單測試紙條一次只能檢測一種病原體的缺點，又避免了在一個層析條上同時做幾個項目的檢測時前面檢測線形成的復(fù)合物會影響后面的檢測，在靈敏度上受到很大限制的缺陷，本試紙條具有操作簡便、快速、靈敏、不需要特殊儀器設(shè)備、觀察結(jié)果直觀等顯著優(yōu)點，大大方便了臨床檢測和篩查工作。
文檔編號G01N33/558GK101158684SQ20071011307
公開日2008年4月9日 申請日期2007年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月6日
發(fā)明者吳堅美, 崔亞洲, 波 朱, 韓金祥 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心