專利名稱：食品中對位紅的測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種食品檢測技術(shù)領(lǐng)域的測試方法，特別涉及一種食品中對位紅的測試方法。
背景技術(shù)：
“對位紅”是一種常用的紅色顏料，亦稱對硝基苯胺紅，屬于偶氮系列人工合成的染色劑。目前已知對位紅不但對眼睛、皮膚和呼吸系統(tǒng)等有刺激性，而且還具有潛在的致癌性。由于對位紅的違法使用于食品生產(chǎn)中而引發(fā)了一系列食品安全事件，因此被禁止在食品染色劑中使用。目前檢測禁用偶氮染料主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和薄層層析法等，其檢測下限一般為0.2mg-0.5mg/kg。這些檢測技術(shù)和方法檢測精度高、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，但所需設(shè)備及檢測費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜、分析時間長，不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測，限制了其推廣和應(yīng)用。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，文君等在《食品研究與開發(fā)》(2001年22卷3期63-64頁)發(fā)表了題為“示波極譜法測定食品中人工合成色素赤蘚紅”的論文，提出一種用示波極譜法測定食品中人工合成色素的快速檢測方法，該方法利用人工合成色素赤蘚紅在-570mV處產(chǎn)生顯著二階導(dǎo)數(shù)波的特點(diǎn)在極譜儀上進(jìn)行測試，其操作簡便、重復(fù)性好，但該方法不適用于人工合成的偶氮類染料的檢測，另外該方法的檢測靈敏度較低，檢測下限為18.62mg/L。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種食品中對位紅的測試方法，利用偶氮反應(yīng)形成對位紅的偶聯(lián)物，檢測該對位紅的偶聯(lián)物，從而間接得到對位紅的含量，本方法能夠在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大批量樣本的測試，同時提高對位紅檢測靈敏度。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明具體包括如下步驟
(1)首先稱取待檢樣品，用待檢樣品質(zhì)量20～60倍的正丁醇-鹽酸(體積比為3∶2)萃取液進(jìn)行液-液萃取，萃取產(chǎn)物用乙腈溶解；(2)分別使標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品中對位紅衍生化利用還原劑還原生成對硝基苯胺，然后利用偶氮化反應(yīng)將α-萘乙二胺偶聯(lián)到對硝基苯胺上，形成對位紅的偶聯(lián)物，從而實(shí)現(xiàn)對位紅的衍生化。
第一步，還原反應(yīng)稱取對位紅標(biāo)準(zhǔn)品，加入該對位紅標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量2-4倍的氯化亞錫或連二亞硫酸鈉為還原劑及稀鹽酸，加熱、攪拌，至溶液中對位紅全部溶解且顏色變?yōu)樽攸S色，此時對位紅被還原成對硝基苯胺，再將溶液繼續(xù)加熱5分鐘～10分鐘后，冷卻到室溫，溶液中對位紅衍生物的濃度達(dá)0.01g/L～0.8g/L，然后加入體積為上述溶液0.5～2倍的乙醚，劇烈振蕩2分鐘～4分鐘后靜置，待溶液分層后，收集有機(jī)相，將無機(jī)相再用同體積的乙醚提取兩次，合并有機(jī)相，在30℃～35℃水浴中蒸干，得到純化的對硝基苯胺；第二步，偶氮化反應(yīng)用10ml～30ml 0.1mol/L稀鹽酸溶解上述對硝基苯胺，并在冰浴中靜置3分鐘～6分鐘，再加入與上述對硝基苯胺相同質(zhì)量的亞硝酸鈉，攪拌，使之充分溶解，反應(yīng)15分鐘～20分鐘后，加入質(zhì)量為上述對硝基苯胺的氨基磺酸銨以除去過多的亞硝酸鹽；第三步，偶聯(lián)化在冰浴條件下，向上述反應(yīng)液中加入質(zhì)量為上述對硝基苯胺2-6倍的α-萘乙二胺或乙酸副玫瑰苯胺或N-乙基-1-萘胺，攪拌反應(yīng)15分鐘～20分鐘，得到對位紅的偶聯(lián)物，然后將該偶聯(lián)物用液-液萃取法純化；(3)對標(biāo)準(zhǔn)品所得對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行電化學(xué)測試，在相同的測試條件下，記錄每一個濃度梯度所對應(yīng)的電流值；所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計后，用峰電流平均值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品偶聯(lián)產(chǎn)物的濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
設(shè)置伏安議的掃描速度可設(shè)為50～150mV.s-1、靈敏度可設(shè)為1～μA/mV，以導(dǎo)數(shù)循環(huán)伏安法(或微分脈沖伏安法)記錄，測試還原電流時，掃描電壓范圍為0.20V到～0.7V，測試氧化電流時，掃描電壓范圍為-0.2V到0.7V。以0.02～0.2 mol/L的高氯酸溶液作為電解質(zhì)支持液，因?yàn)楦呗人崛芤鹤鳛橹С忠嚎梢允箤ξ患t的偶聯(lián)產(chǎn)物表現(xiàn)出較好的掃描峰形及線性范圍；取由上述標(biāo)準(zhǔn)品所得對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物，進(jìn)行電化學(xué)測試，測試氧化電流時，在某一負(fù)電位處(-0.4V～-0.6V)攪拌富積90～200秒，靜置15～30秒后用導(dǎo)數(shù)循環(huán)伏安法掃描，測試還原電流時，在某一正電位處(0.4V～0.6V)處攪拌富積90～300秒，其它條件同測氧化電流，由于對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物的氧化峰顯著靈敏于還原峰，且峰形良好，因而在標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品的測試中均采用氧化峰電流進(jìn)行定量，在每個標(biāo)準(zhǔn)樣品測試前將電極均置于支持液中進(jìn)行2～3次掃描，以確證電極上無上次殘留待檢物干擾，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，每一個濃度梯度設(shè)3～7個重復(fù)，在相同的測試條件下，記錄每一個濃度梯度所對應(yīng)的氧化峰電流值，所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計后，用峰電流平均值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，而后獲得相應(yīng)得回歸方程式。在掃描電壓0.73V處出現(xiàn)了明顯氧化峰，氧化峰電流與對位紅衍生物濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性回歸方程為ip＝4.569+190.8C，其中C為所檢測樣品中對位紅的濃度，ip為峰電流。
(4)取由待檢樣品所得對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物，按與上述相同的方法進(jìn)行電化學(xué)測試，根據(jù)掃描所得的電流值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線所對應(yīng)的回歸方程式，計算出所測樣品中對位紅濃度。
本發(fā)明原理如下本發(fā)明首先將待檢樣品中的對位紅進(jìn)行萃取后再利用還原劑還原成對硝基苯胺，然后利用偶氮反應(yīng)將α-萘乙二胺偶聯(lián)到對硝基苯胺上，形成對位紅的偶聯(lián)物，從而實(shí)現(xiàn)對位紅的衍生化，最后以電化學(xué)方法定量檢測該對位紅的偶聯(lián)物，間接得到對位紅的含量。
本發(fā)明首先以氯化亞錫或連二亞硫酸鈉為還原劑，將對位紅標(biāo)準(zhǔn)品還原，使之形成苯胺類物質(zhì)，而后用乙醚提取有機(jī)相，得到還原型的對位紅，然后用亞硝酸鈉使其重新偶氮化，最后用α-萘乙二胺完成偶聯(lián)而實(shí)現(xiàn)對位紅的衍生化，從而構(gòu)建對位紅良好的氧化還原特性，提高對位紅電化學(xué)活性；其后用導(dǎo)數(shù)循環(huán)伏安法或微分脈沖伏安法對樣品中的對位紅的殘留進(jìn)行測試，運(yùn)用導(dǎo)數(shù)循環(huán)伏安法測定對位紅時，在掃描電壓0.73V處出現(xiàn)了明顯氧化峰，氧化峰電流與對位紅衍生物濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性回歸方程為ip＝4.569+190.8C，其中C為所檢測樣品中對位紅的濃度，ip為峰電流。變異系數(shù)RSD為4.5％，準(zhǔn)確度為96％，平均回收率為95.63％，檢測每個樣品所需時間不多于3分鐘。本發(fā)明無需復(fù)雜設(shè)備，檢測費(fèi)用低、操作簡單、分析快速、靈敏度高，可廣泛的應(yīng)用于食品檢測領(lǐng)域。


圖1為實(shí)施例1中對位紅衍生物在玻碳電極上的導(dǎo)數(shù)循環(huán)伏安曲線圖(氧化峰)。
圖2為實(shí)施例1中玻碳電極上對位紅衍生物的氧化峰電流與其濃度的線性回歸曲線。
具體實(shí)施例方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1本實(shí)施例1是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的首先稱取待檢樣品，用待檢樣品質(zhì)量20倍的正丁醇-鹽酸(體積比為3∶2)萃取液進(jìn)行液-液萃取，萃取產(chǎn)物用乙腈溶解；樣品來源100份辣椒粉樣品。其中，抽檢樣品50份，加標(biāo)樣品50份。抽檢樣品從上海市某超市購買，直接進(jìn)行前處理；加標(biāo)樣品從上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)研究院獲取辣椒粉樣品后，在其中加入不同濃度梯度的對位紅標(biāo)準(zhǔn)品(0.05mg/kg到0.2mg/kg)，共分成50份，即構(gòu)成了50份加標(biāo)樣品。
(2)分別使標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品中對位紅衍生化稱取0.100g對位紅，并用乙腈定容至100毫升作為儲備液，加入該對位紅標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量2倍的氯化亞錫為還原劑及稀鹽酸，加熱、攪拌，至溶液中對位紅全部溶解且顏色變?yōu)樽攸S色，此時對位紅被還原成對硝基苯胺，再將溶液繼續(xù)加熱6分鐘后，冷卻到室溫，溶液中對位紅衍生物的濃度達(dá)0.01g/L～0.8g/L，然后加入體積為上述溶液0.5～2倍的乙醚，劇烈振蕩2分鐘靜置，待溶液分層后，收集有機(jī)相，將無機(jī)相再用同體積的乙醚提取兩次，合并有機(jī)相，在31℃水浴中蒸干，得到純化的對硝基苯胺；而后進(jìn)行偶氮化反應(yīng)用10ml～30ml 0.1mol/L稀鹽酸溶解上述對硝基苯胺，并在冰浴中靜置4分鐘，再加入與上述對硝基苯胺相同質(zhì)量的亞硝酸鈉，攪拌，使之充分溶解，反應(yīng)16分鐘后，加入質(zhì)量為上述對硝基苯胺6倍的氨基磺酸銨以除去過多的亞硝酸鹽；最后進(jìn)行偶聯(lián)化在冰浴條件下，向上述反應(yīng)液中加入質(zhì)量為上述對硝基苯胺2倍的α-萘乙二胺，攪拌反應(yīng)15分鐘，得到對位紅的偶聯(lián)物，并用20ml 0.1mol/L鹽酸和20ml乙醚進(jìn)行分配萃取，將有機(jī)相35℃水溶蒸干后轉(zhuǎn)溶到5.0ml二甲基甲酰胺中。
(3)對標(biāo)準(zhǔn)品所得對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行電化學(xué)測試，在相同的測試條件下，記錄每一個濃度梯度所對應(yīng)的電流值；所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計后，用峰電流平均值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品偶聯(lián)產(chǎn)物的濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線電化學(xué)測試在便攜式伏安儀上進(jìn)行，該儀器由上海辰華儀器有限公司生產(chǎn)，型號為CHI1230，靈敏度可達(dá)到0.5pA，體積為28cm×16cm×3cm。儀器測試條件如下描速度設(shè)為50mV.s-1，靈敏度設(shè)為1μA/mV，掃描電壓范圍為-0.2V到0.7V，電解質(zhì)支持液為0.02M高氯酸溶液。分別取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)對位紅對應(yīng)的偶聯(lián)產(chǎn)物5.0ml，加入到電解反應(yīng)池中，插入三電極測試系統(tǒng)，連接好伏安儀。在-0.4V處攪拌富積120秒，靜置20秒后用導(dǎo)數(shù)循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描，記錄每一個濃度梯度所對應(yīng)的氧化峰電流值。在每個標(biāo)準(zhǔn)樣品測試前將電極均置于支持液中進(jìn)行3次掃描。參見圖1本實(shí)施例中對位紅衍生物在玻碳電極上的導(dǎo)數(shù)循環(huán)伏安曲線圖(氧化峰)，電解支持液為0.02M的高氯酸，掃描范圍為0.40V到1.20V；曲線從上到下依次為對位紅濃度0.00mg/L、0.03mg/L、0.04mg/L、0.05mg/L、0.06mg/L、0.70mg/L的循環(huán)伏安掃描曲線(富積時間為120s；掃速為50mVs-1，記錄方式為導(dǎo)數(shù)循環(huán)伏安法)，橫坐標(biāo)為電位(mV)，縱坐標(biāo)為氧化峰電流(μA)。所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計后，用峰電流平均值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。參見圖2本實(shí)施例中玻碳電極上對位紅衍生物的氧化峰電流與其濃度的線性回歸曲線，橫坐標(biāo)為對位紅濃度(mg/kg)，縱坐標(biāo)為氧化峰電流(μA)。
(4)取由待檢樣品所得對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物，按與上述相同的方法進(jìn)行電化學(xué)測試，根據(jù)掃描所得的電流值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線所對應(yīng)的回歸方程式，計算出所測樣品中對位紅濃度。
樣品前處理稱取5.00g辣椒粉樣品，混勻置于50ml三角瓶中，加入5g無水硫酸鈉(含水量較少樣品可適當(dāng)減少)，混合均勻，加入15mL乙腈，旋渦振蕩1min，再超聲提取10min，然后4000rpm離心10min，將上清液過0.45μm有機(jī)濾膜。收集濾液，定容到50ml。取濾液10ml，按照上述“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法及步驟對樣品進(jìn)行衍生化及偶聯(lián)處理，然后在相同的測試條件及儀器條件下進(jìn)行測試，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，得到所測樣品中對位紅濃度。
測試結(jié)果表明，50份抽檢樣品中對位紅均未檢出對位紅；標(biāo)加樣品中有48份樣品中檢出了對位紅，平均含量為0.13mg/kg，有2份樣品未檢出。用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對上述樣品進(jìn)行平行測定，結(jié)果表明，標(biāo)加樣品中有49份樣品中檢出了對位紅，平均含量為0.15mg/kg，有1份樣品未檢出。
本實(shí)施例檢測對位紅的準(zhǔn)確率及檢測限基本上與色譜法相當(dāng)，假陽性率及假陰性率均小于0.23％，但檢測時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于色譜方法，且不需要大型儀器，能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測，是篩選食品中有無對位紅存在的非常有效的工具。
實(shí)施例2本實(shí)施例2是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的(1)首先稱取待檢樣品，用待檢樣品質(zhì)量40倍的正丁醇-鹽酸(體積比為3∶2)萃取液進(jìn)行液-液萃取，萃取產(chǎn)物用乙腈溶解；樣品來源100份辣椒粉樣品。其中，抽檢樣品50份，加標(biāo)樣品50份。抽檢樣品從上海市某超市購買，直接進(jìn)行前處理；加標(biāo)樣品從上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)研究院獲取辣椒粉樣品后，在其中加入不同濃度梯度的對位紅標(biāo)準(zhǔn)品(0.05mg/kg到0.2mg/kg)，共分成50份，即構(gòu)成了50份加標(biāo)樣品。
(2)分別使標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品中對位紅衍生化稱取0.100g對位紅，并用乙腈定容至100毫升作為儲備液，加入該對位紅標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量3倍的氯化亞錫為還原劑及稀鹽酸，加熱、攪拌，至溶液中對位紅全部溶解且顏色變?yōu)樽攸S色，此時對位紅被還原成對硝基苯胺，再將溶液繼續(xù)加熱8分鐘后，冷卻到室溫，溶液中對位紅衍生物的濃度達(dá)0.01g/L～0.8g/L，然后加入體積為上述溶液0.5～2倍的乙醚，劇烈振蕩3分鐘靜置，待溶液分層后，收集有機(jī)相，將無機(jī)相再用同體積的乙醚提取兩次，合并有機(jī)相，在32℃水浴中蒸干，得到純化的對硝基苯胺；而后進(jìn)行偶氮化反應(yīng)用10ml～30ml 0.1mol/L稀鹽酸溶解上述對硝基苯胺，并在冰浴中靜置5分鐘，再加入與上述對硝基苯胺相同質(zhì)量的亞硝酸鈉，攪拌，使之充分溶解，反應(yīng)18分鐘后，加入質(zhì)量為上述對硝基苯胺6倍的氨基磺酸銨以除去過多的亞硝酸鹽；最后進(jìn)行偶聯(lián)化在冰浴條件下，向上述反應(yīng)液中加入質(zhì)量為上述對硝基苯胺4倍的乙酸副玫瑰苯胺攪拌反應(yīng)18分鐘，得到對位紅的偶聯(lián)物，并用20ml 0.1mol/L鹽酸和20ml乙醚進(jìn)行分配萃取，將有機(jī)相35℃水溶蒸干后轉(zhuǎn)溶到5.0ml二甲基甲酰胺中。
(3)對標(biāo)準(zhǔn)品所得對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行電化學(xué)測試，在相同的測試條件下，記錄每一個濃度梯度所對應(yīng)的電流值；所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計后，用峰電流平均值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品偶聯(lián)產(chǎn)物的濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線電化學(xué)測試在便攜式伏安儀上進(jìn)行，該儀器由上海辰華儀器有限公司生產(chǎn)，型號為CHI1230，靈敏度可達(dá)到0.5pA，體積為28cm×16cm×3cm。儀器測試條件如下描速度設(shè)為50mV.s-1，靈敏度設(shè)為1μA/mV，掃描電壓范圍為0.0V到-0.8V，電解質(zhì)支持液為0.02M高氯酸溶液。分別取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)對位紅對應(yīng)的偶聯(lián)產(chǎn)物5.0ml，加入到電解反應(yīng)池中，插入三電極測試系統(tǒng)，連接好伏安儀。在-0.4V處攪拌富積120秒，靜置20秒后用導(dǎo)數(shù)循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描，記錄每一個濃度梯度所對應(yīng)的還原峰電流值。在每個標(biāo)準(zhǔn)樣品測試前將電極均置于支持液中進(jìn)行3次掃描。所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計后，用峰電流平均值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(4)取由待檢樣品所得對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物，按與上述相同的方法進(jìn)行電化學(xué)測試，根據(jù)掃描所得的電流值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線所對應(yīng)的回歸方程式，計算出所測樣品中對位紅濃度樣品前處理稱取5.00g辣椒粉樣品，混勻置于50ml三角瓶中，加入5g無水硫酸鈉(含水量較少樣品可適當(dāng)減少)，混合均勻，加入15mL乙腈，旋渦振蕩1min，再超聲提取10min，然后4000rpm離心10min，將上清液過0.45μm有機(jī)濾膜。收集濾液，定容到50ml。取濾液10ml，按照上述“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法及步驟對樣品進(jìn)行衍生化及偶聯(lián)處理，然后在相同的測試條件及儀器條件下進(jìn)行測試，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，得到所測樣品中對位紅濃度。
本實(shí)施例測試結(jié)果表明，50份抽檢樣品中對位紅均未檢出對位紅；標(biāo)加樣品中有42份樣品中檢出了對位紅，平均含量為0.14mg/kg，有8份樣品未檢出。用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對上述樣品進(jìn)行平行測定，結(jié)果表明，標(biāo)加樣品中有48份樣品中檢出了對位紅，平均含量為0.11mg/kg，有2份樣品未檢出。
本實(shí)施例檢測對位紅的準(zhǔn)確率低于色譜法，但檢測時間短于色譜方法。
實(shí)施例3本實(shí)施例3是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的(1)首先稱取待檢樣品，用待檢樣品質(zhì)量60倍的正丁醇-鹽酸(體積比為3∶2)萃取液進(jìn)行液-液萃取，萃取產(chǎn)物用乙腈溶解；樣品來源100份胡椒粉樣品。其中，抽檢樣品50份，加標(biāo)樣品50份。抽檢樣品從上海市某超市購買，直接進(jìn)行前處理；加標(biāo)樣品從上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)研究院獲取辣椒粉樣品后，在其中加入不同濃度梯度的對位紅標(biāo)準(zhǔn)品(0.05mg/kg到0.2mg/kg)，共分成50份，即構(gòu)成了50份加標(biāo)樣品。
(2)分別使標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品中對位紅衍生化稱取0.100g對位紅，并用乙腈定容至100毫升作為儲備液，加入該對位紅標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量4倍的連二亞硫酸鈉為還原劑及稀鹽酸，加熱、攪拌，至溶液中對位紅全部溶解且顏色變?yōu)樽攸S色，此時對位紅被還原成對硝基苯胺，再將溶液繼續(xù)加熱10分鐘后，冷卻到室溫，溶液中對位紅衍生物的濃度達(dá)0.01g/L～0.8g/L，然后加入體積為上述溶液0.5～2倍的乙醚，劇烈振蕩4分鐘靜置，待溶液分層后，收集有機(jī)相，將無機(jī)相再用同體積的乙醚提取兩次，合并有機(jī)相，在33℃水浴中蒸干，得到純化的對硝基苯胺；而后進(jìn)行偶氮化反應(yīng)用10ml～30ml0.1mol/L稀鹽酸溶解對硝基苯胺，并在冰浴中靜置6分鐘，再加入與對硝基苯胺相同質(zhì)量的亞硝酸鈉，攪拌，使之充分溶解，反應(yīng)20分鐘后，加入質(zhì)量為上述對硝基苯胺6倍的氨基磺酸銨以除去過多的亞硝酸鹽；最后進(jìn)行偶聯(lián)化在冰浴條件下，向上述反應(yīng)液中加入質(zhì)量為上述對硝基苯胺6倍的N-乙基-1-萘胺，攪拌反應(yīng)20分鐘，得到對位紅的偶聯(lián)物，并用20ml 0.1mol/L鹽酸和20ml乙醚進(jìn)行分配萃取，將有機(jī)相35℃水溶蒸干后轉(zhuǎn)溶到5.0ml二甲基甲酰胺中。
(3)對標(biāo)準(zhǔn)品所得對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行電化學(xué)測試，在相同的測試條件下，記錄每一個濃度梯度所對應(yīng)的電流值；所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計后，用峰電流平均值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品偶聯(lián)產(chǎn)物的濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線電化學(xué)測試在便攜式伏安儀上進(jìn)行，該儀器由上海辰華儀器有限公司生產(chǎn)，型號為CHI1230，靈敏度可達(dá)到0.5pA，體積為28cm×16cm×3cm。儀器測試條件如下描速度設(shè)為50mV.s-1，靈敏度設(shè)為1μA/mV，掃描電壓范圍為-0.2V到0.7V，電解質(zhì)支持液為0.02M高氯酸溶液。分別取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)對位紅對應(yīng)的偶聯(lián)產(chǎn)物5.0ml，加入到電解反應(yīng)池中，插入三電極測試系統(tǒng)，連接好伏安儀。在-0.4V處攪拌富積120秒，靜置20秒后用導(dǎo)數(shù)循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描，記錄每一個濃度梯度所對應(yīng)的氧化峰電流值。在每個標(biāo)準(zhǔn)樣品測試前將電極均置于支持液中進(jìn)行3次掃描。所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計后，用峰電流平均值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(4)取由待檢樣品所得對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物，按與上述相同的方法進(jìn)行電化學(xué)測試，根據(jù)掃描所得的電流值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線所對應(yīng)的回歸方程式，計算出所測樣品中對位紅濃度樣品前處理稱取5.00g胡椒粉樣品，混勻置于50ml三角瓶中，加入5g無水硫酸鈉(含水量較少樣品可適當(dāng)減少)，混合均勻，加入15mL乙腈，旋渦振蕩1min，再超聲提取10min，然后4000rpm離心10min，將上清液過0.45μm有機(jī)濾膜。收集濾液，定容到50ml。取濾液10ml，按照上述“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法及步驟對樣品進(jìn)行衍生化及偶聯(lián)處理，然后在相同的測試條件及儀器條件下進(jìn)行測試，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，得到所測樣品中對位紅濃度。
本實(shí)施例測試結(jié)果表明，測試結(jié)果表明，50份抽檢樣品中對位紅均未檢出對位紅；標(biāo)加樣品中有49份樣品中檢出了對位紅，平均含量為0.14mg/kg，有1份樣品未檢出。用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對上述樣品進(jìn)行平行測定，結(jié)果表明，標(biāo)加樣品中有50份樣品中檢出了對位紅，平均含量為0.13mg/kg。
本實(shí)施例檢測對位紅的準(zhǔn)確率及檢測限基本上與色譜法相當(dāng)，但檢測時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于色譜方法。與檢測辣椒粉樣品相比，各項(xiàng)結(jié)果基本相當(dāng)，說明本發(fā)明建立的檢測方法能適用于檢測不同種實(shí)物樣品。
權(quán)利要求
1.一種食品中對位紅的測試方法，其特征在于，包括如下步驟(1)首先稱取待檢樣品，用待檢樣品質(zhì)量20～60倍的正丁醇-鹽酸萃取液進(jìn)行萃取，萃取產(chǎn)物用乙腈溶解；(2)分別使標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品中的對位紅經(jīng)過還原反應(yīng)，偶氮化反應(yīng)，偶聯(lián)化實(shí)現(xiàn)對位紅的衍生化，得到對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物；(3)對標(biāo)準(zhǔn)品所得對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行電化學(xué)測試，在相同的測試條件下，記錄每一個濃度梯度所對應(yīng)的電流值；所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計后，用峰電流平均值與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品偶聯(lián)產(chǎn)物的濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)將步驟(2)中待檢食品樣品所得對位紅的偶聯(lián)產(chǎn)物，按與步驟(3)相同的電化學(xué)測試方法掃描獲得電流值，由所得電流值用步驟(3)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的回歸方程計算出所待檢食品樣品中對位紅濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的食品中對位紅的測試方法，其特征是，所述的還原反應(yīng)是稱取對位紅樣品，加入該對位紅樣品質(zhì)量2-4倍的氯化亞錫或連二亞硫酸鈉為還原劑及稀鹽酸，加熱、攪拌，至溶液中對位紅全部溶解且顏色變?yōu)樽攸S色，再將溶液繼續(xù)加熱5分鐘～10分鐘后，冷卻到室溫，溶液中對位紅衍生物的濃度達(dá)0.01g/L～0.8g/L，然后加入體積為上述溶液0.5～2倍的乙醚，劇烈振蕩2分鐘～4分鐘后靜置，待溶液分層后，收集有機(jī)相，將無機(jī)相再用同體積的乙醚提取兩次，合并有機(jī)相，在30℃～35℃水浴中蒸干，得到純化的對硝基苯胺。
3.如權(quán)利要求1所述的食品中對位紅的測試方法，其特征是，所述的偶氮化反應(yīng)是用10ml～30ml 0.1mol/L稀鹽酸溶解還原反應(yīng)中得到的對硝基苯胺，并在冰浴中靜置3分鐘～6分鐘，再加入與上述對硝基苯胺相同質(zhì)量的亞硝酸鈉，攪拌，使之充分溶解，反應(yīng)15分鐘～20分鐘后，加入氨基磺酸銨以除去過多的亞硝酸鹽。
4.如權(quán)利要求1所述的食品中對位紅的測試方法，其特征是，所述的偶聯(lián)化是在冰浴條件下，向偶氮化反應(yīng)液中加入α-萘乙二胺或乙酸副玫瑰苯胺或N-乙基-1-萘胺，攪拌反應(yīng)15分鐘～20分鐘，得到對位紅的偶聯(lián)物。
5.如權(quán)利要求1所述的食品中對位紅的測試方法，其特征是，步驟(3)中所述的電化學(xué)測試的測試條件為設(shè)置伏安議的掃描速度設(shè)為50mV.s-1～150mV.s-1、靈敏度設(shè)為1～μA/mV，以導(dǎo)數(shù)循環(huán)伏安法記錄，測試還原電流時，掃描電壓范圍為0.20V～0.7V，測試峰電流時，掃描電壓范圍為-0.2V～0.7V，以0.02mol/L～0.2mol/L的高氯酸溶液作為電解質(zhì)支持液。
6.如權(quán)利要求1或5所述的食品中對位紅的測試方法，其特征是，所述峰電流是氧化峰電流。
7.如權(quán)利要求6所述的食品中對位紅的測試方法，其特征是，所述的氧化峰電流，其與相應(yīng)對位紅偶聯(lián)產(chǎn)物濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性回歸方程為ip＝4.569+190.8C，其中C為所檢測樣品中對位紅的濃度，ip為氧化峰電流。
全文摘要
一種食品檢測技術(shù)領(lǐng)域的“對位紅”的測試方法。本發(fā)明首先將待檢樣品中的對位紅進(jìn)行萃取后再利用還原劑還原成對硝基苯胺，然后利用偶氮反應(yīng)將α－萘乙二胺偶聯(lián)到對硝基苯胺上，形成對位紅的偶聯(lián)物，從而實(shí)現(xiàn)對位紅的衍生化，最后以電化學(xué)方法定量檢測該對位紅的偶聯(lián)物，間接得到對位紅的含量。本方法能夠在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大批量樣本的測試，同時提高對位紅檢測靈敏度。
文檔編號G01N1/28GK101042364SQ20071003963
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月19日
發(fā)明者劉國艷, 柴春彥, 劉海峰 申請人:上海交通大學(xué)