專利名稱：一種植物根表生防細菌的快速、高效篩選方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農業(yè)生產技術領域。是一種為拮抗植物病原真菌的植物根表生防 細菌快速、高效篩選方法。
背景技術：
全國各地每年都會因植物病害引起植株矮小、瘦弱、黃化等不同癥狀，嚴重 時全株死亡，造成巨大的經濟損失，其中有80%病害屬于真菌病害。在防治方面， 化學防治雖然見效快，但易造成農藥殘留、環(huán)境污染，對人們身體健康產生潛在 的威脅；同時化學農藥的長期使用，病原菌也易對其產生抗藥性因而導致防治效 果下降。細菌存在范圍廣，種類多，數量大，繁殖快，它們中有的能產生拮抗性 物質，抑制病原菌，并且促進植物的生長，所以利用細菌防治植物病害，尤其是 土傳病害，具有很大的潛力。隨著人們生活水平的提高，對食品安全性要求也在 不斷地提高，篩選出可替代化學藥劑防治植物病害的生防制劑成為迫切需要。國內外很多學者研究證明，有許多種拮抗性細菌具有防治植物病害尤其是土 傳病害的能力，常見的有以下一些屬芽孢桿菌屬CBa"7/M)、腸桿菌屬 (五"fera》"efer)、歐文氏菌屬(￡>147'"/")、黃桿菌屬(F/ozoto"OT'謂)、哈夫尼菌屬 (i/a/"/a)、小單孢菌屬(M/'crcw ompora)、假單胞菌屬(尸sew. fifew/o"as)、固氮菌屬 (v4加to6acfer)、根瘤菌屬(朋/zo6z力w)、沙雷氏菌屬(&rraft.a)、鏈霉菌屬(5Vre/ to附y(tǒng)ces)和黃單胞菌屬(ZaW/;omowaO。有的生防細菌不僅具有防病作用，同時還可以提高種子的發(fā)芽率，還有明顯的增產效應。目前，生防細菌的篩選普遍采用的步驟是，首先將植物組織研磨采用稀 釋涂布平板法分離組織內能培養(yǎng)的絕大多數細菌，取單個菌落在平板上不斷 劃線純化后，與病原真菌平板對峙培養(yǎng)進行篩選。如果從土壤中分離，則先 稀釋土壤懸浮液采用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法分離土壤中適合該 培養(yǎng)基的所有細菌，純化后進行平板一一對峙培養(yǎng)或點接法培養(yǎng)進行篩選。 工作量較大，重復工作較多，試驗過程中需要的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿量大，篩選
到有生防效果的細菌概率較小，即耗時耗材。 發(fā)明內容本發(fā)明的目的是高效篩選防治植物真菌病害尤其是土傳病害的植物根表生 防細菌，以達到縮短生防細菌的篩選階段，加快生防細菌的開發(fā)和應用，使農業(yè) 生產實踐中植物病害得到很好的控制。本發(fā)明的關鍵技術是對已有的傳統(tǒng)分離、 篩選方法，進行了改進，采用改進的TY培養(yǎng)基，稀釋平板法分離細菌，在另一 Ch+TY平板上均勻地涂上病原真菌懸浮液，然后接種菌落形狀、大小和顏色不 同的IO個細菌菌落進行培養(yǎng)，觀察真菌周圍是否有抑菌帶出現，有抑菌帶出現 的即為目標細菌。改目前的先稀釋平板法分離然后多次重復一一對峙培養(yǎng)篩選為 病原真菌與植物根表細菌直接對峙培養(yǎng)法篩選，使生防細菌對病原真菌的拮抗能 力明顯增強，并且時間短，根表生防細菌的篩選可縮短30d左右。該方法耗材少， 工作量小，僅用傳統(tǒng)方法的四分之一的材料，五分之一的工作量，篩選到的細菌 田間應用防治效果明顯提高。具體方法如下1.細菌分離和初篩Ch+TY培養(yǎng)基的配制(適合多數真菌和細菌生長)Nutrient agar 4gYeast Extract 0.2gBacto-Agar 2g Lactalbumin hydrolysate0.1 gDistilled H20 200ml高壓滅菌 15min 步驟1) 用酒精將剪子和鑷子表面消毒；2) 剪3cm左右的不同植物干根；3) 在無菌室將剪下的不同植物干根置于Ch+TY平板上;4) 然后挑取病原真菌，在植物根平行的位置劃線；5) 于25"C真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天左右觀察抑菌情況。2. 純化發(fā)現植物根周圍有大量細菌，細菌周圍出現抑菌帶(不長真菌)或菌絲長得 較短、產生較少孢子或沒有孢子產生，即為目標細菌。但此時細菌為混合菌，需 小心挑出，劃線純化，于28'C細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 一天即可觀察，如果發(fā)現仍 有形狀、大小和顏色不同的細菌菌落，則需分別挑取進一步純化，直至每皿呈現 形狀、大小和顏色均相同菌落。3. 復篩方法將己純化的細菌與病原真菌于Ch+TY平板上劃平行線對峙培養(yǎng)，或于 Ch+TY平板中心點接入病原真菌，真菌周圍約等距離四點接入細菌。于25"C真 菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天可測定抑菌帶寬，計算抑菌率。4. 保存將已純化的細菌接到試管斜面中，蛇形劃線28'C培養(yǎng)一天后，儲存4"C冰箱 中，或將生防菌接入直徑為4cm的Ch+TY培養(yǎng)皿中心，28。C培養(yǎng)一天后，儲存 4"C冰箱中。所用儀器設備DHP-9162A恒溫培養(yǎng)相(天津泰斯特)、DL-CJ-IN超級潔凈工作臺(北京東聯)、Y60368微量移液器(上海雷勃)。
具體實施方式
本發(fā)明是中國科學院重大創(chuàng)新工程項目"東北地區(qū)農業(yè)水土資源優(yōu)化調控 機制與技術體系研究"專題作物病、蟲、草害生物生態(tài)控制關鍵技術研究(編 號KZCX1-SW-19-4-03)和黑龍江省"十五"重點科技攻關項目"主要農作物病 蟲害可持續(xù)控制技術研究"專題大豆根腐病生物防治(編號GB01B201)中的 主要內容。我們于2002年1月至2006年12月在中國科學院東北地理與農業(yè)生 態(tài)研究所按以上步驟進行了生防細菌的篩選和中式生產，田間防治大豆根腐病效 果非常好，解決了生產實踐中大豆根腐病生物防治的難題。既獲得了經濟效益， 又獲得了生態(tài)效益。本發(fā)明的使用材料較普遍，價格便宜，成本低，所需時間短，篩選的細菌生 防效果好，達到了高效的目的。廣泛應用防治由鐮孢菌屬F"WA^m引起的多種 植物根部腐爛病害。本發(fā)明將縮短生防細菌的分離和篩選所需時間，進一步保證 細菌的生防效果，加快生防細菌的開發(fā)和應用，促進我國生物防治的發(fā)展。
權利要求
1.一種植物根表生防細菌的快速、高效篩選方法，其特征在于采用改進的TY培養(yǎng)基，稀釋平板法分離細菌，在另一Ch+TY平板上均勻地涂上病原真菌懸浮液，然后接種菌落形狀、大小和顏色不同的10個細菌菌落進行培養(yǎng)，觀察真菌周圍是否有抑菌帶出現，有抑菌帶出現的即為目標細菌；其方法及具體步驟如下a.細菌分離和初篩用酒精將剪子和鑷子表面消毒后，剪3cm左右的不同植物干根，在無菌室將剪下的不同植物干根置于Ch+TY平板上，然后用接種針挑取病原真菌，在植物根平行的位置劃線，于25℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天左右觀察抑菌情況，發(fā)現植物根周圍有大量細菌，細菌周圍出現抑菌帶(不長真菌)或菌絲長得較短、產生較少孢子或沒有孢子產生，即為目標細菌；b.純化此時細菌為混合菌，需小心用接菌環(huán)挑出細菌，劃線純化，于28℃細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一天后即可觀察，如果發(fā)現仍有形狀、大小和顏色不同的細菌菌落，則需分別挑取進一步純化，直至每皿呈現形狀、大小和顏色均相同菌落；c.復篩方法將已純化的細菌與病原真菌于Ch+TY平板上劃平行線對峙培養(yǎng)，或于Ch+TY平板中心點接入病原真菌，真菌周圍約等距離四點接入細菌，于25℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天可測定抑菌帶寬，計算抑菌率；d.保存將已純化的細菌接到試管斜面中，蛇形劃線28℃培養(yǎng)一天后，儲存4℃冰箱中，或將生防菌接入直徑為4cm的Ch+TY培養(yǎng)皿中心，28℃培養(yǎng)一天后，儲存4℃冰箱中。
全文摘要
本發(fā)明屬于農業(yè)生產技術領域，是一種快速篩選植物真菌病害尤其是土傳病害生防細菌的方法。改目前的先稀釋平板法分離然后多次重復一一對峙培養(yǎng)篩選為病原真菌與植物根表細菌直接對峙培養(yǎng)法篩選，明顯提高了生防細菌篩選的效率，并且生防效果增強。本發(fā)明的使用材料與傳統(tǒng)方法基本相同，價格便宜，方法快捷。廣泛應用于多種植物真菌病害生防細菌篩選，適用于從不同植物組織及其器官表面分離篩選生防細菌。本發(fā)明將縮短生防細菌的分離和篩選所需時間，加快生防細菌的開發(fā)和應用，促進我國生物防治的發(fā)展。
文檔編號C12N1/20GK101148648SQ200710056059
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月11日 優(yōu)先權日2007年9月11日
發(fā)明者于澤波, 李春杰, 許艷麗 申請人:中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所