專利名稱：：在微陣列上的靶的實時pcr的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用以監(jiān)測微陣列上固定的俘獲分子上的多重熱循環(huán)核酸擴增的聚合酶鏈式反應(PCR)的方法、裝置和診斷試劑盒。更具體講，本發(fā)明提供了使用微陣列在實時PCR擴增中的核苷酸分子的檢測和定量。本發(fā)明還包括實施該方法的手段和裝置。
背景技術(shù)：
：已公開的核苷酸分子檢測方法相比之前的用以檢測擴增的核酸的方法具有快速、簡易和多路化的優(yōu)點。核酸檢測技術(shù)通常在醫(yī)療診斷試驗中非常有用。聚合酶鏈式反應(PCR)的發(fā)明大大地提高了核酸檢測方法的敏感性和特異性。PCR是一種擴增核酸的工藝，它涉及到兩種寡核苷酸引物、聚合劑、靶核酸模板的使用，以及核酸的變性、引物的退火和延伸的連續(xù)循環(huán)，從而制造特定核酸片斷的大量拷貝。用這種方法，單拷貝基因組DNA的片斷能夠保持高特異性和高保真度地擴增超過1千萬倍。用以檢測PCR產(chǎn)物的方法在美國專利No.4,683,195中有描述。那些方法要求寡核苷酸探針能夠與擴增的靶核酸雜交。這些方法要求分離的擴增、俘獲和檢測的步驟，而且通常需要好幾個小時才能完成。由于PCR工藝巨大的擴增可能，來自高DNA含量樣品、正控制模板、或來自先前的擴增的小水平DNA結(jié)轉(zhuǎn)物甚至在不刻意添加模板DNA的情況下得到PCR產(chǎn)物。因為引入污染DNA的可能性會隨著樣品制備、處理和分析所需操作步驟的增加而增加，所以應盡量減少樣品的檢測和定量分析的操作，尤其是在擴增反應完成之后。已經(jīng)描述了同時放大和靶核酸檢測的方法以使樣品污染減到最小。美國專利No.4,683,195和No.6,171,785涉及將可檢測的DNA結(jié)合劑(如溴化乙錠)引入到擴增反應中，該試劑產(chǎn)生就結(jié)合雙鏈DNA上增強的可檢測信號。PCR混合物的熒光增加表明發(fā)生了擴增。美國專利No.6,395,518和No.5,952,202公開了一種寡核苷酸探針，包括附著于該寡核苷酸第一端的熒光劑分子和附著于該寡核苷酸相對端的淬滅劑分子，使得只要該寡核苷酸探針處于雙鏈態(tài)時，該熒光劑就基本上是未熄滅的。具有5′到3′核酸酶活性的DNA聚合酶在擴增期間溶解所述探針以將指示染料從該淬滅劑中分離出來。PCR混合物的熒光增加表明發(fā)生了擴增。美國專利No.5,716,784基于使用兩個輔助探針提供了一種替代方法，第一分析探針在其5′端用能量傳遞給體熒光團標識，而第二檢測探針在其3′端用能量傳遞受體熒光團標識。使用能量傳遞法測量溶解狀態(tài)的雜交寡核苷酸分析探針到溶液狀態(tài)下分光光度計測得的寡核苷酸檢測探針，提供了對在靶核酸序列的擴增中消耗掉的寡核苷酸分析探針的量的測量，從而提供了對在PCR復制步驟中擴增出的靶核酸序列的量的測量。美國專利No.5,928,907描述了一種用以實時監(jiān)測核酸擴增反應產(chǎn)物形成的裝置，其中使用了光學對焦于樣品體的纖維。盡管那些方法能夠?qū)崟r監(jiān)測均質(zhì)PCR雜交系統(tǒng)中核酸的定量，但它們限于每個熒光染料僅一種靶核酸。鑒于對于用以測量同一裝置中多個靶核酸擴增的信號增量的不相交熒光染料的要求，實施多路化并不容易。本發(fā)明的一個問題在于提供一種用以實時監(jiān)測非均勻體系中的PCR的改進方法，其消除了先有技術(shù)方法的缺點。具體說，本方法應當易于實施且經(jīng)濟合算。本發(fā)明為在微陣列上多個靶分子的同時放大提出了一種簡易和有效的的方法和裝置，從而克服上述局限性。
發(fā)明內(nèi)容為實現(xiàn)上述目標，用以監(jiān)測微陣列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR擴增的方法包括如下步驟-設(shè)置一個表面上固定有微陣列和反應室(14)的支架(15)，該微陣列包括至少一個固定于所述支架的特異性限定區(qū)域(21)上的俘獲分子(20)，-將含有所述核苷酸分子的溶液引入到所述反應室(14)和用于核苷酸分子擴增和標識的試劑中，-對該溶液執(zhí)行兩次具有至少2個、優(yōu)選3個不同溫階的熱循環(huán)，用以通過PCR擴增獲得標識的靶核苷酸分子(13)，-通過下列方式在至少一次熱循環(huán)中對標識的靶核苷酸分子進行至少一次測量，о在允許所述靶核苷酸分子(13)和其相應俘獲分子(20)之間進行特異結(jié)合的情況下培養(yǎng)所述標識的靶核苷酸分子(13)，о對盒中含有標識的靶核苷酸分子(13)的溶液施以激發(fā)光(2)，測量被結(jié)合的標識的靶核苷酸分子應激發(fā)光(2)而發(fā)出的光發(fā)射(7)，其中限定區(qū)域的發(fā)射面在約0.1μm2到約75mm2之間，以及-對在至少一次熱循環(huán)中獲得的數(shù)據(jù)進行處理以檢測和/或定量溶液中的核苷酸分子在擴增前的數(shù)量。根據(jù)本發(fā)明的用以監(jiān)測微陣列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR擴增的裝置包括-表面上固定有微陣列的支架(15)，包括至少一個固定于所述支架的特異性限定區(qū)域(21)內(nèi)的俘獲分子(20)，其在盒中與所述核苷酸分子和用以核苷酸分子擴增和標識的試劑是流態(tài)連通的，-用以進行自動PCR工藝的熱循環(huán)器，所述熱循環(huán)器能夠交替地加熱和冷卻所述支架以制造標識的靶核苷酸分子，-激發(fā)光源(1)，-用以測量電磁光發(fā)射(7)的檢測裝置(10)，該光發(fā)射(7)是對盒中含有標識的靶核苷酸分子的溶液施以激發(fā)光而從被結(jié)合的標識的靶核苷酸分子上發(fā)出的，其中限定區(qū)域的發(fā)射面在約0.1μm2到約75mm2之間，-其中不同部分被歸并到同一裝置中以在PCR擴增期間讀取被結(jié)合的標識的靶核苷酸分子的光發(fā)射。該裝置進一步包括-存儲系統(tǒng)，用以存儲在規(guī)定的熱循環(huán)次數(shù)下支架的至少5個限定區(qū)域內(nèi)的不同的測量數(shù)據(jù)，-控制器(11)，用以重復為微陣列的每個限定區(qū)域在至少一次熱循環(huán)中進行至少一次激發(fā)、檢測和存儲的步驟，-程序，用以對在至少一次熱循環(huán)中獲得的數(shù)據(jù)進行處理以檢測和/或定量樣品中的核苷酸分子在擴增前的數(shù)量。本發(fā)明還包括一個用以監(jiān)測微陣列上以溶液存在的核苷酸分子的PCR擴增的診斷試劑盒-表面上固定有微陣列的支架(15)，包括至少一個固定于所述支架的特異性限定區(qū)域(21)內(nèi)的俘獲分子(20)，其中所述支架的表面在高于85℃的溫度下保持平坦，且所述支架具有弱自熒光性。-反應室，包括2個、優(yōu)選3個彼此流態(tài)連通的部分，其具有用以承載微陣列的平面。圖1整體裝置的總示意圖，該裝置包含支架(15)、載體(12)、調(diào)溫裝置(16)和控溫裝置(17)、以及檢測器(10)。圖2使用標識的引物聯(lián)機檢測在微陣列上的PCR產(chǎn)物的示意圖。PCR是在有包含不同俘獲分子的微陣列的存在下進行的。在一個反應循環(huán)內(nèi)進行退火、延伸和變性的交替步驟，導致標識產(chǎn)物的積聚，這些產(chǎn)物在位于微陣列上的他們的俘獲分子上雜交，但在每次變性循環(huán)后從他們的特異的俘獲分子脫雜交。圖3使用標識的dNTPs聯(lián)機檢測在微陣列上的PCR產(chǎn)物的示意圖。PCR是在有包含不同俘獲分子的微陣列的存在下進行的。在一個反應循環(huán)內(nèi)進行退火、延伸和變性的交替步驟，導致標識產(chǎn)物的積聚，這些產(chǎn)物在每次變性循環(huán)之后部分整合入它的特異俘獲分子中并被檢出。圖4如圖2所示的使用標識的引物聯(lián)機檢測在微陣列上的PCR擴增的結(jié)果。在有包含不同結(jié)合的俘獲分子的存在條件下，在GMO插入序列上進行PCR，結(jié)合的俘獲分子中一個對擴增產(chǎn)物(P35S)是特異的，另一個(PAT1)則不是。在不同熱循環(huán)的退火步驟期間對P35S和PAT1俘獲分子進行測量。具體實施例方式定義在本申請和發(fā)明的上下文中，下列定義適用如這里所使用的，“俘獲分子”是指一個分子或其復合體或組合，其能夠特異性地結(jié)合于靶分子、或結(jié)合于靶分子族、或結(jié)合于多個靶分子中的一個或多個成員或其部分。該俘獲分子優(yōu)選為核酸，或者是在支架表面上原位化學合成的或者是被放置在支架上的。核酸結(jié)合是通過兩個多核苷酸之間堿基配對完成的，一個固定在俘獲分子上，另一個作為待檢測靶。俘獲分子還包括核酸如PNA或LNA的衍生物，只要他們能夠特異性地結(jié)合靶多核苷酸分子。術(shù)語“單俘獲探針種”是一個用以通過堿基配對雜交或通過多肽或蛋白質(zhì)之間的分子識別來檢測給定序列的相關(guān)多核苷酸的組合物。多核苷酸是化學或非系統(tǒng)合成的、或是樣品提純而得到的，但是合成或提純并不總是理想的，俘獲分子會被其它相關(guān)分子如更短的多核苷酸所污染。本發(fā)明的俘獲種的根本特征是整個種可被用于給定靶核苷酸分子的俘獲。術(shù)語“直接在支架表面上”是指光束的主要部分對準支架的表面上并激發(fā)表面上的熒光分子。術(shù)語“核酸，微陣列，探針，靶核酸，基本上結(jié)合，特異性地雜交于，背景，定量”如國際專利申請WO97/27317中所描述，在此引用他們。術(shù)語“核苷三磷酸”亦稱做dNTP，是指存在于DNA或RNA的核苷酸，因此包括核苷酸，其以腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶為堿基，糖部分則是脫氧核糖或者核糖。也可使用其它能夠與傳統(tǒng)的堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的一個堿基配對的修飾堿基。這樣的修飾堿基包括例如8-氮鳥嘌呤和次黃嘌呤。這里使用的術(shù)語“核苷酸”是指與所述核酸的堿基相比，存在于核酸(DNA或RNA)中的核苷，其包括含有上述一般的或修飾的堿基的核苷酸涉及核苷酸、多核苷酸等包括類似種，其中糖-磷酸酯主鏈經(jīng)改性和/或被替換，只要其雜交性能沒被破壞。舉例來說，主鏈可被等同的合成肽所替代，稱做肽核酸(PNA)。術(shù)語“多核苷酸”序列，其與這里描述的一個或多個基因或基因組序列所互補，是指能夠在嚴格的條件下與所述基因或基因組或其拷貝的至少一部分核苷酸序列雜交的多核苷酸。多核苷酸還包括具有大于2個但低于100個堿基長度的能在特定條件下使用的寡核苷酸。這樣的可雜交多核苷酸在核苷酸水平典型地顯示對所述基因或基因組至少約75％的序列一致性，優(yōu)選約80％或95％的序列一致性，或優(yōu)選對所述基因或基因組大于95％的核苷酸序列一致性。根據(jù)試驗的特異性和敏感性要求，它們由典型為15～30個堿基長的小序列、或由30～100個較長的甚至100～800個更長堿基長度的序列組成。術(shù)語“同源”用以表示一個多核苷酸序列對另一個多核苷酸序列的一致程度。兩個或多個多核苷酸之間可能完全同源(即100％一致)。同源度是在序列校直后計算的，可通過所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員所熟知的任何方法確定?！拔㈥嚵小笔侵钙渖瞎潭ㄓ卸鄠€俘獲分子的支架，用以能夠結(jié)合于給定的特異靶分子。該微陣列優(yōu)選由存在于在支架表面或內(nèi)部、或覆蓋該支架的底物上的特異性限定區(qū)域中的俘獲分子組成。特異性限定區(qū)域是指表面包含有對確定靶分子具有特異性的結(jié)合俘獲分子的區(qū)域。該特異限定區(qū)域或者通過建造該微陣列的方法識別，或者在檢測期間或者之后確認。斑點是指特異靶分子被固定在它們的俘獲分子上的地方，可通過檢測器看到。斑點是指特異靶分子被固定在它們的俘獲分子上的地方，可通過檢測器看到。在本發(fā)明的一個特殊應用中，俘獲分子的微陣列還可設(shè)置在不同的支架上，只要這些不同支架包含特異俘獲分子且可以彼此區(qū)分開來以能夠?qū)μ禺惏蟹肿佣?。這可以通過使用具有特殊特征且能夠彼此區(qū)別以定量結(jié)合分子的微珠混合物來實現(xiàn)。然后一個微珠或一群微珠被認為是具有對靶分子特異的俘獲分子的斑點。術(shù)語“背景”或“背景信號強度”是指由標識靶核酸和多核苷酸微陣列的組件(如多核苷酸探針、控溫探針、微陣列底物等)之間的非特異結(jié)合或其他非特異交互作用引起的雜化信號。背景信號也可能由微陣列組件自身的固有熒光所產(chǎn)生。可為整個微陣列計算單個背景信號，或可為每個靶核酸計算不同的背景信號。在優(yōu)選的實施方式中，分別為每個斑點計算背景，作為在斑點周圍表面上的信號水平強度，但不包括特異俘獲分子。本發(fā)明的核苷酸分子典型地通過檢測一個或更多個附著于該核苷酸分子的“標識”來檢測。該標識可以采用領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的任何方法引入，這里參考如WO99/32660所描述的方法。該標識優(yōu)選直接在熒光中檢測。核苷酸分子是指存在于所感興趣且待檢測的生物材料中的多核苷酸。它們是從存在于優(yōu)選為生物材料的樣品中的所感興趣的分子中提取或提純而得到的。術(shù)語“生物材料”包括，在其內(nèi)在意義中，有機體、器官、組織、細胞或通過細胞培養(yǎng)制造的生物材料。有利地，靶核苷酸分子的測量是在有處于溶液中的標識擴增靶分子存在的固相中進行的。該方法避免了溶液從承載微陣列的支架的表面上被移除，以及避免了測量前沖洗。該沖洗包括含有擴增靶的溶液的液態(tài)操作和對實驗室中進一步試驗的可能的污染。有利地，本發(fā)明的方法不要求使用不同的熒光染料來定量不同的核苷酸分子。一種熒光染料足以定量多個不同核苷酸分子，因為它們通過雜交在俘獲分子上的特異性結(jié)合對每個靶核苷酸序列都具有特異性，而且定位于微陣列的不同的區(qū)域內(nèi)。例如，一個核苷酸分子與使用相同或不同引物的另一個核苷酸分子一起擴增，而兩種擴增子用同一熒光染料標識。不同的擴增子在分離的俘獲分子上被檢測和/或定量，而不像實時溶液PCR所要求的那樣需要幾種熒光染料。該方法的另一個優(yōu)點是它高特異性。第一特異性水平通過引物的退火獲得，第二特異性水平通過俘獲分子上的雜交獲得。這種雙特異性極大的增加了最終檢測的特異性，這通常是在復合體生物標本的分析中所需要的。另一個優(yōu)點是在PCR擴增期間行程的引物二聚物或非特異擴增產(chǎn)物不會在微陣列上產(chǎn)生信號，因為不存在引物或非特異性產(chǎn)物的互補性俘獲分子。對同一靶核苷酸分子使用不同的俘獲分子仍能夠增加特異性。兩個或更多個俘獲分子能夠設(shè)計成結(jié)合同一鏈，或一個俘獲探針結(jié)合擴增產(chǎn)物的有義鏈、而另一個俘獲分子結(jié)合反義鏈。有利地，待擴增的核苷酸分子是同源核苷酸序列，其在PCR期間使用與WO0177372所描述的相同引物在微陣列上被定量。同一引物被用來擴增所有可能存在于樣品中的同源序列。用同一熒光染料標識的擴增子在不同的俘獲分子上被區(qū)別，每個都對應不同的同源序列。這對僅一個引物對和一個熒光染料也適用，通過使用微陣列上的多重俘獲探針以實現(xiàn)試驗的多路化。在一個實施方式中，被同一引物擴增的序列的數(shù)目大于2，甚至大于5，更甚至大于20。然后在陣列上檢測擴增靶。在另一個實施方式中，標準物核苷酸序列被引入到經(jīng)檢測的溶液中，標準物使用與靶核苷酸序列相同的引物擴增。在又一個實施方式中，在主體實施方式中，靶和/或俘獲分子是多核苷酸。俘獲分子優(yōu)選通過共價鍵附接在支架上或支架上的底物上。在另一個實施方式中，俘獲分子可以吸附在支架上，只要他們在PCR循環(huán)期間不會明顯釋放到溶液中。俘獲探針的沉積優(yōu)選通過物理方式實現(xiàn)，如插腳或“插腳和環(huán)”接觸表面，或通過采用如壓力或納米分配器的方法使溶液的微液滴的釋放來實現(xiàn)?；蛘?，俘獲分子的原位合成是本發(fā)明實施方式的一種，其在如5,744,305和6,346,413所提供的場所中那樣具有寡核苷酸或多核苷酸合成的高空間分辨率。在另一個實施方式中，核苷酸分子是存在于生物試樣的DNA中。該DNA是從樣品中提取并通過PCR擴增，擴增子通過它們在其特異俘獲分子上的固定而聯(lián)機檢測。在一特別實施方式中，該核苷酸分子是同源核苷酸序列，其在使用與WO0177372相同的引物對基因組DNA擴增之后在微陣列上接受聯(lián)機檢測和/或定量。根據(jù)本發(fā)明，微陣列的固體載體優(yōu)選為選自于玻璃、金屬支架、聚合物支架(優(yōu)選耐熱的弱自熒光性)或任何其他用于微晶片(或微陣列)技術(shù)的其它支架(優(yōu)選載有醛或環(huán)氧樹脂或丙烯酸酯基團的活化玻璃)，所述支架還包含特異性涂層、標識器或裝置(條形碼、電子器件等)用以改進試驗。在一個優(yōu)選實施方式中，支架(15)包含其上固定有俘獲分子的底物。如果玻璃帶來諸多優(yōu)點(如惰性且弱自熒光性)，其他的支架如聚合物，其表面上具有不同的具有明確化學定義的基團，能夠用于核苷酸序列的結(jié)合，也有其用處。在另一個優(yōu)選實施方式中，承載該俘獲分子的支架具有三維多孔結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的載玻片在其表面具有少于60％的二氧化硅。這固有地限制了可在表面上化學鍵合的量。多孔材料顯示出較高的俘獲分子的荷載能力。典型的多孔支架是凝膠墊、熔融纖維基質(zhì)、纖維狀聚合物基質(zhì)。陣列可整個由多孔材料構(gòu)造，或可包含安裝在如玻璃、塑料或金屬平面上的多孔材料層。在另一個實施方式中，俘獲分子位于不同的支架上，這些支架優(yōu)選為具有能為特異俘獲分子識別的化學或物理性質(zhì)的微珠。在又一個實施方式中，支架承載有多個以物理或化學界面分離的微陣列。物理障礙的例子是阱，例如支架是96，384，1536多阱板，因此創(chuàng)建出分離的限定區(qū)域，其上俘獲分子可被分別定點。384阱和1536阱板可從細胞基試驗的BDFalcon獲得(MerckEurolab公司，Leuven，比利時)，或從NuncA/S(Roskilde，丹麥)獲得。6144格式微量滴定板可從ParallelSynthesis技術(shù)公司(PSTI，MenloPark，加州，美國)獲得。多阱可以板或條形式存在。其它物理障礙是管，如96、384、1536或甚至6144管沉積在支架表面上。管與阱形式相似，但不具有平底，因此當沉積在支架表面上時，它們創(chuàng)建出彼此隔離的限定區(qū)域?；瘜W障礙的例子如DE0019949735A1所描述，其中在疏水表面內(nèi)的限定區(qū)域具備親水錨，允許俘獲分子在載體上的精確定位和限制。在一個優(yōu)選實施方式中，支架載有多個被物理界面(優(yōu)選以多阱板或條的形式)分離的微陣列。在另一實施方式中，在測量光發(fā)射(7)期間對多阱板執(zhí)行溫度梯度。在一個優(yōu)選實施方式中，反應室包括2個、或更好為3個彼此流態(tài)連通的部分，其具有用以承載微陣列的平面。支架優(yōu)選由塑料滑片制成，滑片被穿過觀測通道的氣流所覆蓋，在那里微陣列得以建立。該觀測通道終止于優(yōu)選位于兩端的一個或兩個儲液器。一個儲液器優(yōu)選用于引入溶液，而另一個則用來排出溶液。儲液器被特殊的蓋所密封，以防治溶液在熱循環(huán)期間蒸發(fā)。在一特別實施方式中，溶液從微陣列處移開以提高標識靶核苷酸分子在其俘獲分子上的結(jié)合反應速度。這是通過至少在熱循環(huán)的退火步驟期間旋轉(zhuǎn)、變換或上下移動反應室來實現(xiàn)的。在又一個實施方式中，液體在具有固定微陣列的表面上的高度低于1mm，優(yōu)選低于0.1mm，更優(yōu)選低于0.02mm。在優(yōu)選實施方式中，用作俘獲分子的多核苷酸為10～1000核苷酸長，優(yōu)選為100～400核苷酸長。為在同一樣品中可能的同源序列特異性結(jié)合，多核苷酸俘獲分子包含如專利WO0177372描述的隔離物。可能在同一樣品中的同源序列或SNP的特異性結(jié)合可使用具有10～30個核苷酸的特異性部分的俘獲分子實現(xiàn)。在優(yōu)選實施方式中，用作俘獲分子的多核苷酸處于密度大于10fmoles、優(yōu)選100fmoles每載體cm2表面的微陣列限定區(qū)域上。根據(jù)本發(fā)明的微陣列包含4～100000斑點/cm2，優(yōu)選20～1000斑點/cm2，每個斑點是一個俘獲分子的限定區(qū)域。微型化允許在表面上執(zhí)行試驗(通常約0.1～約1mm直徑的圓形斑點)。包含20到400個斑點的低密度陣列能以具有0.25mm的插腳且以低成本獲得。1,600斑點/cm2的更高密度的斑點能夠通過將斑點尺寸降低至例如0.15mm獲得。獲得高密度俘獲分子的方法早在US5,445,934中有描述。斑點尺寸的微型化可以獲得高數(shù)量的數(shù)據(jù)，能夠同時獲得和分析這些數(shù)據(jù)，并使得執(zhí)行重復成為可能，以及使得試驗所需生物試樣量盡可能少。在微陣列上檢測的微型化優(yōu)選與用以將核苷酸分子從細胞抽提物中分離和提取的微流態(tài)底物相關(guān)聯(lián)。在一個優(yōu)選實施方式中，微陣列包含大于5個、優(yōu)選大于20個甚至大于50個不同俘獲分子(20)。在一個優(yōu)選實施方式中，限定區(qū)域為約10μm2～約1mm2，優(yōu)選約1μm2～100μm2。在一個優(yōu)選實施方式中，微陣列上的俘獲分子與溶液中的擴增靶核苷酸的至少一部分序列是互補的。俘獲分子包含能夠與擴增靶核苷酸序列特異性結(jié)合的核苷酸序列，所述特異的核苷酸序列還優(yōu)選被具有至少約6.8mm長或?qū)U增靶分子不具結(jié)合親合力的20個雙鏈形式核苷酸的隔離臂從載體的表面上分離。在一個優(yōu)選實施方式中，俘獲分子是單鏈多核苷酸，其包含能夠特異性結(jié)合于標識靶核苷酸分子的序列和具有至少20個、優(yōu)選90個核苷酸的隔離物。該隔離物部分可以是單鏈或雙鏈DNA。在一個優(yōu)選實施方式中，對靶結(jié)合具有特異性的探針序列包含15～100個核苷酸，優(yōu)選15～35個核苷酸。適用于本發(fā)明的可檢測標識包括任何可用電磁光發(fā)射檢測的組合物。在一個實施方式中，靶分子被熒光染料標識。熒光標識可通過酶或化學反應引入到靶中。典型的酶反應包括核苷酸類似物引入到靶中?；蛘?，可將5′端被熒光染料標識的引物引入到靶中。熒光染料還通過化學反應而被引入到靶中，如載有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)基團的熒光染料與靶的胺基的反應?？捎糜诒景l(fā)明的熒光染料包括花青染料(Cy3、Cy5、Cy7)、熒光素、texas紅、羅丹明、綠色熒光蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，花青3的激發(fā)波長為540～558nm，峰值在550nm，發(fā)射波長為562～580nm，峰值在570nm。優(yōu)選的，花青5的激發(fā)波長為639～659nm，峰值在649nm，發(fā)射波長為665～685nm，峰值在670nm。優(yōu)選的，花青7的激發(fā)波長為733～753nm，峰值在743nm，發(fā)射波長為757～777nm，峰值在767nm。教導使用這些標識的專利包括美國專利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。在一個優(yōu)選實施方式中，熒光染料是花青3，花青5或花青7。有些熒光標識可能引起特別的興趣，如具有熒光性能的納米晶體粒子。最常見的是Quantum點(Hanetal.，NatureBiotechnology19，631-635，2001)。它們具有熒光性且不因時間或照明而褪去。它們的穩(wěn)定性使得它們適合于連續(xù)使用，在本發(fā)明中建議使用。還有，它們含有金屬，這些金屬給予這些粒子以特異性能，使得除熒光外的方法可用于跟隨它們在俘獲探針上的附著。對這些粒子的熱加熱是隨時間的參數(shù)之一。金屬吸收光束、尤其是激光的能量以及誘導粒子的加熱的事實已經(jīng)成為在支架上檢測密度低的金粒子甚至單粒子檢測的基礎(chǔ)(BoyeretalScience，297，1160-2002)。該方法被稱作光熱干涉相襯。另一個直接測量納米粒子的技術(shù)是瑞利散射。該方法是基于使用經(jīng)調(diào)整的光束以獲得金屬粒子中電子的振蕩，以從可檢測粒子中獲得電磁輻射。(Stimpsonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(2003)，11350-11353)(使用光波引導實時檢測DNA雜交和寡核苷酸陣列上的熔融；)該方法在生物試樣上應用上缺乏靈敏度。或者，拉曼散射和表面等離子共振也可用于本發(fā)明中，這些技術(shù)已廣泛應用于抗體/抗原結(jié)合檢測，但同時也適用于陣列的多參數(shù)測量并滿足生物試樣所要求的靈敏度。(Thieletal.，AnalyticalChemistry，69(1997)，4948-4956)在另一個實施方式中，可使用石英微量天秤，其已足夠靈敏，可以測量低于納克的質(zhì)量變化(參看CarusoetaL，AnalyticalChemistry69(1997)，2043-2049)。這是實時微陣列檢測的一個建議。懸臂是在微陣列上DNA檢測的又一選擇。(McKendryetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99(2002)，9783-9788)此外，另一個技術(shù)是考慮了金屬特性的納米粒子的電檢測。電化學檢測被最先采用但是靈敏度低。更為先進和靈敏的方式是使用差動脈沖伏特計檢測(Ozsozetal.，AnalyticalChemistry75(2003)，2181-2197)。金屬的電阻和電容也是在電子芯片上檢測的最佳性能。金屬在二個電極間的存在將誘導電阻和電容的變化。當俘獲分子出現(xiàn)在一個電極上時觀察DNA或蛋白質(zhì)的檢測(Moreno-HagelsiebetalSensorsandActuatorsB-Chemical，98，269-274，2004)。金標識的DNA的電容試驗由Guiduccietal.ESSDERC2002所描述。由于電子芯片可由幾個小區(qū)構(gòu)成，不同的靶可以在不同的繪圖上檢測，可以記錄在電阻或電容上的變化。如果該方法不足以制造生物試樣所要求的可靠和靈敏的檢測，但能預測它們中的一些能夠滿足實時檢測的要求。另一個具前景的在微陣列的俘獲分子上測量靶分子結(jié)合的技術(shù)是基于非線性變頻光譜學(GFS)的光學工藝的化學繪圖法(L.Dreesenetal.ChemPhysChem，5，1719-172，2004)。這些技術(shù)允許表面和界面的振動特性以亞微?？臻g分辨率實時成像。該測量是通過在底物表面上混合兩個激光束而獲得，其中一個具有可見光區(qū)的固定頻率(綠色)，另一個在紅外區(qū)具有可變頻率。界面上的振動特征波形是作為紅外激光束的頻率的函數(shù)，通過測量由樣品發(fā)出的光而得到的。這些方法允許避免對待檢測靶的標識。初始核苷酸分子在擴增之前沒必要標識，但會在擴增步驟期間導致被標識的靶分子。擴增的核苷酸分子在變性步驟之后能夠在俘獲分子上雜交。由于擴增的核苷酸分子是雙鏈的，理論上它們必須在溶解狀態(tài)中再聚集，而且比在固體支架上固定的俘獲分子上雜交更快，那里擴散小且特異性結(jié)合序列短，從而更加降低反應速率。因此，在一個培養(yǎng)時間的短周期之后觀察到俘獲分子經(jīng)多重熱循環(huán)的信號顯著升高并不奇怪(圖4)。在一特別的實施方式中，在熱循環(huán)的退火和/或延伸期間當結(jié)合的靶標記分子再聚集成雙鏈形式時進行測量。在一個優(yōu)選實施方式中，核苷酸分子擴增用的試劑包括引物對，dNTPs，熱穩(wěn)定DNA聚合酶和緩沖劑。在一特別的實施方式中，試驗的退火和/或延伸和/或變性步驟是以連續(xù)或半連續(xù)的方式進行的。在一個優(yōu)選實施方式中，核苷酸分子擴增用試劑包括引物和/或用熒光染料標識的dNTP，優(yōu)選花青3、花青5或花青7。在一特殊的實施方式中，在同一溶液中使用兩個或更多個熒光染料。在一備選實施方式中，調(diào)整溶液組成以進行核苷酸分子上的引物的退火和在同一溫階上對俘獲分子上的標識靶分子的特異性結(jié)合。在一個優(yōu)選實施方式中，微陣列上的PCR所使用的熱穩(wěn)定DNA聚合酶是在62℃下工作的熱Master(Eppendorf，德國漢堡)。在一個優(yōu)選實施方式中，陣列上的退火、延伸和雜交步驟是在同一溫度(60～80℃)下進行的。有利地，本發(fā)明的方法與大多數(shù)市售的熱穩(wěn)定DNA聚合酶相兼容。它不像美國專利No.5,952,202那樣要求5′～3′核酸酶具有活性。在一個實施方式中，溶液包含5′端標識的寡核苷酸或引物，其作為聚合酶在微陣列上復制待檢測靶序列的錨。圖2顯示了使用標識的引物檢測在微陣列上的PCR產(chǎn)物。出乎意料的是，在熱循環(huán)的退火的溫階期間，引物與核苷酸分子在溶解狀態(tài)中雜交，同時在上述熱循環(huán)中獲得的擴增靶分子在同一時間、同一條件下與固定于支架的特異性限定區(qū)域內(nèi)的俘獲分子雜交。在熱循環(huán)的延伸的溫階期間，與核苷酸分子雜交的引物在溶解狀態(tài)中延伸。與標識靶核苷酸分子結(jié)合的俘獲分子(20)可能延伸但不被標識。在一個反應循環(huán)內(nèi)進行退火、延伸和變性的交替步驟，導致標識產(chǎn)物的積聚，這些產(chǎn)物在位于微陣列上的他們的俘獲分子上雜交，但在每次變性循環(huán)后從他們的特異的俘獲分子脫雜交。在一個優(yōu)選實施方式中，優(yōu)選在退火和/或延伸的溫階期間，標識的靶核苷酸分子特異性地結(jié)合在相應的俘獲分子(20)上。在另一實施方式中，溶液含有標識的dNTP，該dNTP通過聚合酶引入到微陣列上待檢測的目標脈沖順序中。圖3顯示了使用標識的dNTPs檢測在微陣列上的PCR產(chǎn)物。在熱循環(huán)的退火的溫階期間，引物與核苷酸分子在溶解狀態(tài)中雜交，同時在上述熱循環(huán)中獲得的擴增靶分子在同一時間、同一條件下與固定于支架的特異性限定區(qū)域內(nèi)的俘獲分子雜交。在熱循環(huán)的延伸的溫階期間，與核苷酸分子雜交的引物在溶解狀態(tài)中被延伸，結(jié)合于靶核苷酸分子的固定俘獲分子(20)被延伸并被標識。在反應循環(huán)期間進行退火、延伸和變性的交替步驟，導致標識產(chǎn)物的積聚，這些產(chǎn)物部分整合入它的特異俘獲分子中，并能夠在每個變性步驟的期間或者末尾被檢測出。在一個實施方式中，一些俘獲分子被聚合酶延伸，同時一些則與在熱循環(huán)期間在溶解狀態(tài)中積累的擴增產(chǎn)物雜交。在一個實施方式中，延伸的俘獲分子在變性的溫階期間被檢測。在另一個實施方式中，延伸的俘獲分子和與其俘獲分子結(jié)合的標識核苷酸分子都在退火和/或延伸的溫階期間被檢測。在一個優(yōu)選實施方式中，雜交優(yōu)選使用不能被延伸的俘獲探針在延伸期間進行。在這種情況下，俘獲分子優(yōu)選包括堿基終止劑或同一堿基在其3′端的長拉伸如polyA?；蛘撸@分子通過它們不能被聚合酶延伸的3′端、自由5′端被固定在支架上。在另一個實施方式中，優(yōu)選雜交期間的延伸，是通過在一個引物過量、另一引物量有所減少的情況下進行PCR。在另一個實施方式中，在熱循環(huán)的末尾，進行至少10分鐘、優(yōu)選至少30分鐘、最好60分鐘的退火步驟，以提高擴增前甚低濃度的核苷酸分子的雜交信號。在一個優(yōu)選實施方式中，熱循環(huán)進行10分鐘以內(nèi)、優(yōu)選6分鐘以內(nèi)、甚至3分鐘以內(nèi)。在一可選實施方式中，在5小時內(nèi)、優(yōu)選3小時內(nèi)、甚至1.5小時內(nèi)進行30次熱循環(huán)。有利地，經(jīng)擴增的靶核苷酸分子的長度選擇為100～800個堿基的有限長度，優(yōu)選為100～400個堿基，更優(yōu)選為100～200個堿基。這一優(yōu)選要求取決于發(fā)現(xiàn)引物的可能性，該引物用以擴增樣品中可能存在的所要求的序列。太長的靶會更快再分配并采用能夠抑制在俘獲核苷酸序列上固定的二次結(jié)構(gòu)。熱循環(huán)器優(yōu)選由如下相關(guān)組件以最簡單形式組成熱電偶、傳送器、轉(zhuǎn)換器和加熱器。熱電偶盡可能靠近微陣列待加熱的限定區(qū)域并測量溫度給傳送器。溫度信息經(jīng)轉(zhuǎn)換器傳給計算機。每0.1秒鐘，軟件比較測得的真實溫度與終端用戶要求的設(shè)定溫度。如果實測溫度高于所要求的溫度，就只是停止加熱器(而不啟動冷卻)。如果實測溫度低于設(shè)定點，系統(tǒng)繼續(xù)加熱進程。熱循環(huán)器優(yōu)選調(diào)整至與支架形式相符合，而支架形式優(yōu)選為約一個2.5×7.5cm的載玻片或一個96阱的微滴定板。可選的加熱和冷卻優(yōu)選使用Peltier或脈沖空氣來實現(xiàn)。在一個優(yōu)選實施方式中，熱循環(huán)器能夠以5℃/min、優(yōu)選10℃/min、更優(yōu)選30℃/min、甚至優(yōu)選40℃/min的斜率交替地加熱和冷卻支架。該方法尤其適于控制光激發(fā)，因為光是直接射在支架的表面上，在每個限定區(qū)域上的激發(fā)的均勻性能被確定和更正(如有必要)。在一個優(yōu)選實施方式中，光束是激光束，其聚焦在微陣列的表面上以直接激發(fā)熒光分子。激光束優(yōu)選垂直聚焦于陣列的表面或經(jīng)由溶液或支架。發(fā)射光在激發(fā)激光束的反向方向被檢測。發(fā)射光優(yōu)選作為共焦光被檢測，并在擴增用光電倍增管測量。在優(yōu)選實施方式中，微陣列的表面通過激光束掃描以獲得被結(jié)合靶的最大光激發(fā)。在一個優(yōu)選實施方式中，來自光源(1)的激發(fā)光(2)對準到支架的表面上。在一個優(yōu)選實施方式中，與微陣列上的俘獲分子相關(guān)聯(lián)的信號被定量。優(yōu)選的方法是用優(yōu)選為激光共焦掃描器的掃描器掃描陣列以檢測熒光標識的靶。圖像的分辨率為1～500μm、優(yōu)選為5～50μm。在一個優(yōu)選實施方式中，對經(jīng)標識的靶核苷酸分子的測量在至少5次熱循環(huán)，優(yōu)選至少10次、甚至20次熱循環(huán)中執(zhí)行。在一個優(yōu)選實施方式中，光發(fā)射(7)是從溫階開始起的規(guī)定時刻測量的，例如退火后1分鐘。在另一優(yōu)選實施方式中，光發(fā)射(7)是在退火溫階開始后5分鐘內(nèi)、甚至2分鐘內(nèi)、更甚至1分鐘內(nèi)測量的。在一可選的實施方式中，光發(fā)射(7)是在PCR擴增中的3個溫階中的至少一個的末尾測量的。在又一實施方式中，光發(fā)射(7)是PCR擴增的末尾測量的。優(yōu)選掃描微陣列，隨后測量每個限定區(qū)域。陣列的掃描優(yōu)選在1分鐘內(nèi)、較好在30秒鐘內(nèi)、甚至在10秒鐘內(nèi)進行。優(yōu)選對每個限定區(qū)域的掃描是在溫階的同一精確時刻測量的，此時在多重熱循環(huán)過程中重復讀取。每個限定區(qū)域隨后被測量的事實能夠有利地用于監(jiān)測被標識的靶核苷酸分子對固定在支架不同限定區(qū)域的同一俘獲探針的雜交動力學，其中俘獲探針是以依賴于時間的方式掃描的。由于溫度在測量過程中保持恒定，靶核苷酸分子在掃描期間繼續(xù)雜交在它們的俘獲探針上。在一特別的實施方式中，在不同PCR循環(huán)進行的擴增靶分子的定量數(shù)據(jù)經(jīng)過處理以定量擴增之前核苷酸分子在原始溶液中的數(shù)量。當擴增效率是最大時，擴增循環(huán)導致每個循環(huán)中靶序列翻倍。初始核苷酸濃度的定量是使用外推法由第一循環(huán)給出的可檢測值或經(jīng)過固定閾值的值計算而來的。然后由參考曲線或由在標準物分子上獲得的數(shù)據(jù)來計算濃度。在一個優(yōu)選實施方式中，數(shù)據(jù)經(jīng)處理以獲得每個限定區(qū)域的信號值。在另一實施方式中，數(shù)據(jù)經(jīng)處理以獲得每個限定區(qū)域和局部背景的信號值。對數(shù)據(jù)進行進一步處理，對每個限定區(qū)域?qū)⒈尘皬男盘栔抵袦p去。在一個優(yōu)選實施方式中，核苷酸分子的定量通過將限定區(qū)域的信號值與一定值進行比較來進行。在一備選實施方式中，核苷酸分子的定量通過將達到一定值所需的熱循環(huán)數(shù)目(循環(huán)閾值或CT)與基準核苷酸分子的CT值加以比較來進行。該基準核苷酸分子優(yōu)選是在同一溶液中被擴增并作為靶核苷酸分子在同一微陣列上被檢測。在另一實施方式中，核苷酸分子的定量通過將達到一定值(CT)所需的熱循環(huán)數(shù)目與CT值對標準濃度作圖得到的標準曲線加以比較來進行。在一個實施方式中，微陣列與試劑接觸以進行一個或多個核苷酸序列的擴增。在一個優(yōu)選實施方式中，在同一試驗中對1～4個核苷酸分子、優(yōu)選1～20個核苷酸分子在溶液中進行擴增、檢測和/或定量。在另一實施方式中，在同另一個試驗中對20～1000個核苷酸分子在溶液中進行擴增、檢測和/或定量。用以根據(jù)本發(fā)明事實該方法的裝置包含兩個不同的部分。第一部分包含培養(yǎng)系統(tǒng)，其為靶在它們的俘獲分子上的結(jié)合反應提供必要的條件。第一部分優(yōu)選包含溫度控制系統(tǒng)，用以調(diào)節(jié)并控制結(jié)合反應期間的溫度。在一個優(yōu)選實施方式中，溫度調(diào)節(jié)裝置選自于受控Peltier、夾在透明聚酯片之間微細發(fā)熱絲元件(如Minco公司的Thermal-ClearTM透明加熱器)、或流體系統(tǒng)(外循環(huán)溫度調(diào)節(jié)流體)。在一個優(yōu)選實施方式中，溫度調(diào)節(jié)裝置安裝在支持支架的載體上。溫度調(diào)節(jié)裝置優(yōu)選位于載體和支架之間。在另一實施方式中，溫度調(diào)節(jié)裝置安裝在支架上但不接觸載體。在一個優(yōu)選實施方式中，培養(yǎng)系統(tǒng)提供條件以使與微陣列相接觸的溶液的厚度在所有陣列斑點或限定區(qū)域上都是一致的。陣列表面上兩個斑點或限定區(qū)域間的厚度差異優(yōu)選低于100微米，甚至低于10微米，更甚至低于1微米。在另一實施方式中，培養(yǎng)系統(tǒng)為與微陣列接觸的溶液的厚度在兩側(cè)測量之間的變化提供條件。裝置的第一部分還優(yōu)選包含混合或攪拌系統(tǒng)，用于即將移入到反應室的液體并提高反應速率。在一個優(yōu)選實施方式中，通過物理方式如泵、開口閥和節(jié)制閥、靜電波或壓電振蕩來移動液體以進行混合。第二部分包含檢測系統(tǒng)，用以檢測從靶結(jié)合到它們的相應俘獲分子的光發(fā)射。光源產(chǎn)生一束光以激發(fā)支架上被標識的靶。在該優(yōu)選實施方式中，檢測部分必須設(shè)置成用以在整個被待分析微陣列覆蓋的表面上獲取相同的檢測效率。在一個優(yōu)選實施方式中，激發(fā)光是激光束，其優(yōu)選以約15mW的功率傳送，散度低于1.2mrad，波長約532nm。在另一個實施方式中，檢測系統(tǒng)包含2乃至4個激光。在一個優(yōu)選實施方式中，由光源(1)產(chǎn)生的激光束(2)幾乎成平行且?guī)缀醺咚剐??？山粨Q的激發(fā)過濾器(4)用于只收集所關(guān)心的波長。優(yōu)選放置附加濾色鏡輪(3)作為減光器以精確調(diào)節(jié)激光功率。該濾光輪以可變的已知吸收水平被不同地遮蔽。具有防反射涂膜的透鏡(5)用于是激光束聚焦于支架(15)上。光源、透鏡和支架間的距離是可變的以方便聚焦。其后，光通過分色鏡或光束分離器(6)。該鏡能通過波長低于約530nm的光但波長大于560nm的光被反射。因此，來自激光的532nm波長的光穿過分色鏡到支架。光然后穿過反應室(14)和經(jīng)熒光標志的樣品(13)并到達支架(15)，在那里被結(jié)合的標識靶被激發(fā)并發(fā)出約560nm的熒光。發(fā)射光(7)然后通過聚焦透鏡(9)聚焦到光電倍增管(10)以檢測那里的光子數(shù)目。在一特殊實施方式中，增加一個傳送波長大于約550nm的光的附加發(fā)射過濾器(8)。因此，光電倍增管(10)基本上僅檢測熒光。光電倍增管產(chǎn)生為每個被檢光子產(chǎn)生一個脈沖。每個脈沖通過光電效應經(jīng)過放大并轉(zhuǎn)換成電子信號。數(shù)據(jù)獲取板或控制器(11)然后收集結(jié)果信號。該控制器包括控制溫度裝置，用以控制PCR擴增所需要的溫階。在從底物的區(qū)域手機數(shù)據(jù)之后，載體(12)移動支架以使激發(fā)光對準支架(15)上的不同區(qū)域。重復該過程直到所有在底物上的區(qū)域都被掃描。在另一個實施方式中，支架被固定，激發(fā)光束從支架表面上的一個部分移向另一個部分。在又一個實施方式中，整個微陣列被照亮，檢測來自每個限定區(qū)域的光發(fā)射。在一個實施方式中，支架本身就是載體。在一個優(yōu)選實施方式中，存儲和處理數(shù)據(jù)用以計算不同靶分子在溶解中和在原始生物試樣中的量或濃度。存儲數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)處理優(yōu)選使用可編程計算機執(zhí)行，它被整合入本發(fā)明的裝置中。數(shù)據(jù)處理可以在存儲數(shù)據(jù)以后任何時候進行。在一個實施方式中，支架在讀取期間相對于檢測系統(tǒng)移動。支架相對于激發(fā)光移動以讀取支架的不同區(qū)域。激發(fā)光可以固定或在一個方向上移動以掃描支架。在一備選實施方式中，支架同時相對于培養(yǎng)系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)移動。在培養(yǎng)期間，支架與溫度控制系統(tǒng)(培養(yǎng)位置)接觸。當需要啟動讀取時，支架從培養(yǎng)系統(tǒng)移動到檢測系統(tǒng)(讀取位置)。在讀取期間，支架或者相對于激發(fā)光移動或者被固定。讀取之后，支架回到到它的初始位置。使支架在讀取期間相對于培養(yǎng)部分移動的一個優(yōu)點是可以避免加熱器對檢測系統(tǒng)部分產(chǎn)生有害效應。在另一個實施方式中，該裝置的兩個部分被固定且一同運作而沒有固體支架相對于培養(yǎng)部分和檢測部分的移動。一個上下文使用的典型的檢測器是CCD相機，其能夠拾取整個微陣列的圖像。在一個特殊的實施方式中，裝置通過可編程計算機控制，它控制該系統(tǒng)兩個部分的參數(shù)。掃描器如Axon的Genepix4200A型掃描器，其配備有Axon的可編寫Genepix5.1軟件。在步驟1，用戶被要求填寫所需參數(shù)，如分辨率，PMT電壓，激光功率，掃描數(shù)，掃描間隔，掃描面積。底物的溫度獨立設(shè)置在加熱裝置上，加熱裝置可以是安裝在底物上的Peltier裝置。系統(tǒng)參數(shù)分辨率決定像素大小。通常，像素大小的選擇要使每個限定區(qū)域內(nèi)具有1個像素、優(yōu)選10～100個像素。分辨率設(shè)定過高導致數(shù)據(jù)過載，而像素大小設(shè)置過低則導致低質(zhì)量結(jié)果。PMT電壓乘以已檢信號。增加激光功率將增加每個像素內(nèi)的光子計數(shù)。參數(shù)“掃描數(shù)”對應于用戶希望掃描底物的次數(shù)，而參數(shù)“掃描間隔”控制開始下一輪掃描所需等待的時間。用這樣的方式，用戶可以執(zhí)行一系列的掃描以跟蹤反應動力學。掃描面積參數(shù)對應于待測底物的尺寸。溫度參數(shù)控制進行檢測時的溫度。溫度可根據(jù)被測聚合物的類型而變化。優(yōu)選測試是在能夠產(chǎn)生最大結(jié)合親合力而使錯配達到最小的溫度下進行。然后初始化系統(tǒng)載體移到原始位置，同時檢查激光功率。在步驟2，執(zhí)行第一次掃描，收集從包含底物微陣列的被選區(qū)域上發(fā)出的熒光。當掃描完成時啟動JavaScript復查(步驟3)。如果未達到需要做的掃描數(shù)，那么程序等待用戶提出延遲。然后圖像在步驟4被保存，如果需要則進行一次新掃描(步驟5)。JavaScript復查允許該回路繼續(xù)。在步驟6，從數(shù)據(jù)中提取數(shù)值；在步驟7，執(zhí)行計算和分析。為此目的，在微陣列上放置一個包含該數(shù)目個行和列的待測微陣列的柵板。該柵板由圓圈組成，其直徑與待定量斑點的直徑的像素對應。該直徑取決于為掃描選擇的分辨率。在圓圈內(nèi)的像素強度的平均值給出了斑點信號。然后每次都計算該信號并對培養(yǎng)時間作圖。步驟6優(yōu)選通過將掃描的16位圖像輸入到軟件中進行，該軟件為“Imagene4.0”(BioDiscovery，美國加州洛杉磯)，其用于定量信號強度。算法<prelisting-type="program-listing">＜html＞ ＜head＞ ?。約tyletype="text/css"＞ @importurl(GenePix_Style_Base.css); ?。?style＞ ?。紅itle＞ExampleAutomation＜/title＞</pre><prelisting-type="program-listing"> ＜/head＞ ?。糱odymarginheight="0"marginwidth="0"topmargin="0"leftmargin="0"＞ ?。?-HTMLLayoutportion--＞ ?。紁＞ ?。紅ablewidth=600border=0cellspacing=0cellpadding=5＞ ?。紅rclass="title"＞ ?。紅d＞ ?。紁class="heavy"＞實時掃描允許在沒有任何用戶干預的情況下對同一樣品以一定的間隔進行多重掃描 ?。?td＞ ?。?tr＞//步驟1用戶參數(shù) ?。紅r＞ ?。紅dclass-′underlineinstructions′＞ ?。紁＞PMT:＜inputtype=textsize=2name=setpmtvalue="700"＞ ＜p＞Resolution:＜inputtype=textsize=2name=setresvalue="40"＞μm ?。紁＞Scaninterval:＜inputtype=textsize=2name=intervalvalue="120"＞(s) ?。紁＞Scannumbers:＜inputtype=textsize=2name=snumbervalue="10"＞ ?。紁> ?。糹nputtype=checkboxsize=5name=savedvalue="10"＞Saveimages ?。紁＞Imagesdirectory:C:\DocumentsandSettings\user\desktop\＜inputtype=textsize=20name=ipathvalue=""＞ ?。?td＞ ?。?tr＞ ?。紅r＞ ?。紅dclass="underlineinstructions′^ ?。糹nputtype="button"value="Prescan"onclick="GenePix.PreviewScan()"＞ ?。糹nputtype="button"value="Startscanning"onclick="startscan()"＞ ＜/td＞ ?。?tr＞ ?。?tr＞ ＜/table＞ ＜!--Scriptingportion--＞ ?。約criptlanguage=vbscript> // +++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ OptionExplicit DimGenePix DimScanner dimi//PMT值 dimj//分辨率(μm) dimk//掃描間隔(s) dimn//掃描數(shù) dime//計數(shù)器 dims//圖像通道 dimtl//計時器 //這些步驟通過按開始掃描按鈕啟動 +++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ substartscan()//步驟2 c=0 SetGenePix=window.external//表明掃描器對象 SetScanner=GenePix.Scanner GenePix.DiscardImages()//清除顯示 callInitializeCallbacks()//定義Javascript復查</pre><prelisting-type="program-listing"> i=cint(setpmt.value)//設(shè)定PMT值 j=cint(setres.value)//設(shè)定分辨率值 k=cint(interval.value)//設(shè)定掃描間隔 n=cint(snumber.value)//設(shè)定掃描數(shù) s=cstr(ipath.value)//設(shè)定圖像通道 Scanner.PixelSize=j Scanner.PMT(0)=i tl=timer()//setsthetime0 GenePix.DataScan//開始第一次掃描 endsub //保存圖像并啟動新掃描 +++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ FunctionScanDone()//步驟4 ifsaved.checked=truethen//保存圖像 GenePix.Savelmages"C:\"&amp;s&amp;"\RT-"&amp;cstr(formatnumber(timer()-tl-k,0))&amp;"s.tif,"",&amp;h008000 endif GenePix.Discardlmages()//重初始化顯示 c=c+1//計數(shù)掃描數(shù) ifc＜nthen//步驟5如有必要 GenePix.DataScan//啟動新掃描 endif EndFunction ＜/script＞ ?。約criptlanguage="JavaScript"＞ 該功能在掃描完成后調(diào)入 +++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ functionwaitjs()//步驟3 { Ifc＜nthen//如果需要更多掃描 setTimeout("ScanDone()",k*1000)；//間隔期間暫停程序 else//并調(diào)入ScanDone功能 Endif } //Javascript復查確定每次事件后應運行何種功能 +++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++ functionInitializeCallbacks() { GenePix.OnScanDone=function(){waitjs();} } ?。?script＞ ?。?body＞ ?。?html＞</pre>圖1表示本發(fā)明的一個實施方式，其中兩個過程的部分存在于同一室中。這兩個過程在整體系統(tǒng)中執(zhí)行，只要各職能部分(具有技術(shù)條件多必要的)彼此兼容。光源(1)對準到支架(15)的表面上，該表面與接觸于熱穩(wěn)定載體(12)的表面相對。控制器(11)包括控制溫度裝置。在優(yōu)選實施方式中，激發(fā)光(2)以45°～135°、優(yōu)選60°～120°、更優(yōu)選80°～100°的角度到達微陣列表面。光激發(fā)標識靶的直接激發(fā)，不使用如由損耗波提供的光的內(nèi)反射。在一個優(yōu)選實施方式中，裝置包含其上固定有俘獲分子的底物。在一個優(yōu)選實施方式中，裝置的支架是熱穩(wěn)定的，其表面在高于85℃甚至高于94℃的溫度下保持平坦。該支架還表現(xiàn)出弱自熒光性，為的是配合熒光測量。優(yōu)選的是，裝置所包含的微陣列包含大于5個不同俘獲分子(20)，優(yōu)選大于20個甚至大于50個。在一個優(yōu)選實施方式中，熱循環(huán)的加熱和冷卻以5℃/min、優(yōu)選30℃/min的斜率進行。在一個優(yōu)選實施方式中，包含俘獲分子的限定區(qū)域為約10μm2～約1mm2，優(yōu)選約1μm2～100μm2。本裝置進一步包含光學系統(tǒng)，用以將從激發(fā)光源(1)發(fā)出的激發(fā)光(2)對準并直接聚焦到所述支架上，其中激發(fā)光以45～135°的角度到達微陣列表面。在一特殊的實施方式中，提供了一個診斷試劑盒，用以監(jiān)測在微陣列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR擴增。該試劑盒包括一個盒，該盒包含表面上固定有微陣列的支架(15)，包括至少一個固定于所述支架的特異性限定區(qū)域(21)內(nèi)的俘獲分子(20)，其中所述支架的表面在高于85℃的溫度下保持平坦，且所述支架具有弱熒光性。以及反應室，包括2個、優(yōu)選3個彼此流態(tài)連通的部分，其具有用以承載微陣列的平面。根據(jù)本發(fā)明的診斷試劑盒還優(yōu)選包含dNTPs，熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，緩沖劑和可選的作為內(nèi)標的引物和/或核苷酸分子。下面給出本發(fā)明適用于從初始核苷酸分子確定擴增靶測量的一個例子。實施例1監(jiān)測微陣列上的PCR擴增俘獲核苷酸序列固定根據(jù)專利申請WO02/18288描述的方法，對Diaglass滑片(Eppendorf，德國漢堡)進行官能團化以有醛的存在。按照該專利申請中描述的方案將胺化DNA接枝到醛激活玻璃上。該胺化俘獲核苷酸序列從濃度為3μM的溶液中點樣。使用自制機械臂、以250μm直徑的插腳將該俘獲核苷酸序列印到顯微載玻片上。該點樣直徑為400μm，配給的體積為0.5nL?；谑覝叵赂稍?，使用前在4℃下保存。本實驗使用的俘獲探針具有下面的序列TP35S(SEQIDNO23)5′Amine-GTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATAT-3′TGUT(PCRcontrol)(SEQIDNO24)5′Amine-GGGACTGGCTGCTATTGGGCGAA-3′TPAT1(SEQIDNO25)5′Amine-CTGTGTATCCCAAAGCCTCATGCAA-3′每個俘獲探針在其5′端包含95個堿基長的隔離物，其具有以下序列ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTA.PCR和雜交為DNA樣品的35個促進劑因子的擴增設(shè)計PCR，該DNA樣品是參照面粉ERM-BF412f的基因改性有機體(GMO)。本實驗使用的引物具有下面的序列OP35SF(SEQIDNO26)5′-Cy3-CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG-3′OP35SR(SEQIDNO27)5′-TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT-3′經(jīng)擴增的產(chǎn)物具有其鏈序列特異俘獲分子P35S中之一的部分(SEQIDNO23)。PCR反應的混合制備如下對于終體積為100μL，混合10μL的PCREppendorf緩沖劑，10μL的dNTP混合(每個dNTP的終濃度為200μM)，1μL的20μM標識在5′端的引物OP35SF-Cy3和1μL的20μM引物OP35SR，2μL的EppendorfTaqDNA聚合酶，10μL的NaCl600mM，55μL的水和10μL基于面粉ERM-BF412f提取的20ng/μL的DNA樣品。將25μL這種PCR混合溶液加載到由雜交室構(gòu)造的微陣列上，尺寸為9×9mm，并具有平滑塑料蓋玻片(GraceBiolabs)。在滑片后部，固定了一個專門的溫控熱電偶。完整的加熱過程試驗臺由一下相關(guān)組件構(gòu)成*熱電偶RS-COMPONENTndeg.219-4321，自粘熱電偶K型-鎳鉻/鎳鋁，*傳送器RS-COMPONENTndeg.363-0222，傳送器測溫熱電偶4-20mA，*轉(zhuǎn)換器NATIONALINSTRUMENTS779026-01USB-600948K樣品/秒DAQ多功能，USB14位*加熱器MINCOHeating熱箔柔性加熱器Kapton0，75″×0，75″HK5578R18，3L12F。熱電偶盡可能靠近待加熱的斑點并測量溫度給傳送器。溫度信息經(jīng)轉(zhuǎn)換器傳給計算機。每0.1秒鐘，軟件比較測得的真實溫度與終端用戶要求的設(shè)定值，控制器調(diào)整加熱以提供所要求的穩(wěn)定。然后滑片倒置進入Axon掃描器(4100個人型)，并在整個實驗保持在那里。掃描以500的增益、10微米的分辨率在通道Cy3進行。然后將加溫罩加熱到95℃(變性)保持1分鐘，然后到56℃(退火)2分鐘，再然后到72℃(延伸)保持1分鐘。同一循環(huán)重復39次。熒光發(fā)射是在循環(huán)6、10、14、18、22、24、26、28、30、32、33、34、35、37、38和40的退火步驟(56℃下)開始1分鐘后對微陣列表面進行掃描而確定的。掃描器使用激光作為激發(fā)光，其聚焦在支架的表面上。發(fā)射光被檢測并通過光電倍增管放大。在圖像拾取之后，掃描的16位圖像被輸入給軟件Genepix5(Axon，Union市，美國加州)，其用于定量信號強度。對陣列上六次重復的兩個俘獲探針P35S(SEQIDNO23)和PAT1(SEQIDNO25)進行信號定量。減去局部背景，將背景減去的信號對循環(huán)數(shù)作圖。陣列還包含用作負雜交控制和正檢測控制的俘獲探針，用Cy3標志，在陣列上以四重存在。微陣列上的實時PCR的結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示特異的俘獲探針P35S在循環(huán)22處出現(xiàn)信號。該信號持續(xù)規(guī)則地升高直到循環(huán)40。對俘獲探針PAT1未觀察到信號。權(quán)利要求1.一種用以監(jiān)測微陣列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR擴增的方法，包括步驟-設(shè)置一個表面上固定有微陣列和反應室(14)的支架(15)，該微陣列包括至少一個固定于所述支架的特異性限定區(qū)域(21)上的俘獲分子(20)，-將含有所述核苷酸分子的溶液引入到所述反應室(14)和用于核苷酸分子擴增和標識的試劑中。-對該溶液執(zhí)行兩次具有至少2個、優(yōu)選3個不同溫階的熱循環(huán)，用以通過PCR擴增獲得標識的靶核苷酸分子(13)，-通過下列方式在至少一次熱循環(huán)中對標識的靶核苷酸分子進行至少一次測量，o在允許所述靶核苷酸分子(13)和其相應俘獲分子(20)之間進行特異結(jié)合的情況下培養(yǎng)所述標識的靶核苷酸分子(13)，o對盒中含有標識的靶核苷酸分子(13)的溶液施以激發(fā)光(2)，測量被結(jié)合的標識的靶核苷酸分子應激發(fā)光(2)而發(fā)出的光發(fā)射(7)，其中限定區(qū)域的發(fā)射面在約0.1μm2到約75mm2之間，以及-對在至少一次熱循環(huán)中獲得的數(shù)據(jù)進行處理以檢測和/或定量溶液中的核苷酸分子在擴增前的數(shù)量。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對經(jīng)標識的靶核苷酸分子的測量在至少5次熱循環(huán)，優(yōu)選至少10次、甚至20次熱循環(huán)中進行。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述光發(fā)射(7)是從溫階開始起的規(guī)定時刻測量的。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述光發(fā)射(7)是在退火溫階開始后5分鐘內(nèi)、甚至2分鐘內(nèi)、更甚至1分鐘內(nèi)測量的。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述光發(fā)射(7)是在PCR擴增中的3個溫階中的至少一個的末尾測量的。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述光發(fā)射(7)是在PCR擴增的末尾測量的。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述數(shù)據(jù)經(jīng)處理以獲得每個限定區(qū)域的信號值。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述數(shù)據(jù)經(jīng)處理以獲得每個限定區(qū)域和局部背景的信號值。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，通過從每個限定區(qū)域的信號值中減去背景來進一步處理所述數(shù)據(jù)。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸分子的定量通過將限定區(qū)域的信號值與一個定值進行比較來進行。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸分子的定量通過將達到一定值所需的熱循環(huán)數(shù)目(CT)與基準核苷酸分子的CT值加以比較來進行。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述基準核苷酸分子在同一溶液中被擴增并作為靶核苷酸分子在同一微陣列上被檢測。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸分子的定量通過將達到一定值(CT)所需的熱循環(huán)數(shù)目與CT值對標準濃度作圖得到的標準曲線加以比較來進行。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸分子擴增用的試劑包括引物對，dNTPs，熱穩(wěn)定DNA聚合酶和緩沖劑。15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸分子擴增用試劑包括引物和/或用熒光染料標識的dNTP，優(yōu)選花青3、花青5或花青7。16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在同一溶液中使用兩種熒光染料。17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，調(diào)整所述溶液組成以進行核苷酸分子上的引物的退火和在同一溫階期間對俘獲分子上的標識的靶分子的進行特異性結(jié)合。18.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，與所述標識的靶核苷酸分子結(jié)合的所述俘獲分子(20)在延伸的溫階期間被延伸。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述延伸的俘獲分子在變性的溫階期間被檢測。20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述限定區(qū)域為約10μm2～約1mm2，優(yōu)選約1μm2～100μm2。21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微陣列包含大于5個不同俘獲分子(20)，優(yōu)選大于20甚至大于50。22.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在同一試驗中對在溶液中的1～4個核苷酸分子、優(yōu)選1～20個核苷酸分子進行擴增、檢測和/或定量。23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在同一試驗中對在溶液中的20～1000個核苷酸分子進行擴增、檢測和/或定量。24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述支架(15)包含其上固定有俘獲分子的底物。25.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述支架(15)載有多個用物理界面分離的微陣列。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述支架(15)具有多阱板形或條形。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，在測量光發(fā)射(7)期間對所述多阱板執(zhí)行溫度梯度。28.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，來自光源(1)的激發(fā)光(2)對準到所述支架的表面上。29.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在10分鐘以內(nèi)、優(yōu)選6分鐘以內(nèi)、甚至3分鐘以內(nèi)進行一次熱循環(huán)。30.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在5小時內(nèi)、優(yōu)選3小時內(nèi)、甚至1.5小時內(nèi)進行30次熱循環(huán)。31.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述俘獲分子是單鏈多核苷酸，其包含能夠特異性結(jié)合于標識靶核苷酸分子的序列和具有至少20個核苷酸的隔離物。32.一種用以監(jiān)測微陣列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR擴增的裝置，包括-表面上固定有微陣列的支架(15)，包括至少一個固定于所述支架的特異性限定區(qū)域(21)內(nèi)的俘獲分子(20)，其在盒中與所述核苷酸分子和用以核苷酸分子擴增和標識的試劑是流態(tài)連通的，-用以進行自動PCR工藝的熱循環(huán)器，所述熱循環(huán)器能夠交替地加熱和冷卻所述支架以制造標識的靶核苷酸分子，-激發(fā)光源(1)，-用以測量電磁光發(fā)射(7)的檢測裝置(10)，該光發(fā)射(7)是對盒中含有標識的靶核苷酸分子的溶液施以激發(fā)光而從被結(jié)合的標識的靶核苷酸分子上發(fā)出的，其中限定區(qū)域的發(fā)射面在約0.1μm2到約75mm2之間，-其中不同部分被歸并到同一裝置中以在PCR擴增期間讀取被結(jié)合的標識的靶核苷酸分子的光發(fā)射。33.如權(quán)利要求32所述的裝置，其特征在于，進一步包含-存儲系統(tǒng)，用以存儲在規(guī)定的熱循環(huán)次數(shù)下支架的至少5個限定區(qū)域內(nèi)的不同的測量數(shù)據(jù)，-控制器(11)，用以重復為微陣列的每個限定區(qū)域在至少一次熱循環(huán)中進行至少一次激發(fā)、檢測和存儲的步驟，-程序，用以對在至少一次熱循環(huán)中獲得的數(shù)據(jù)進行處理以檢測和/或定量樣品中的核苷酸分子在擴增前的數(shù)量。34.如權(quán)利要求32所述的裝置，其特征在于，所述支架(15)包含其上固定有俘獲分子的底物。35.如權(quán)利要求32所述的裝置，其特征在于，所述微陣列包含大于5個、優(yōu)選大于20個、甚至大于50個不同俘獲分子(20)。36.如權(quán)利要求32所述的裝置，其特征在于，所述加熱和冷卻是以5℃/min、優(yōu)選30℃/min的斜率進行。37.如權(quán)利要求32所述的裝置，其特征在于，所述限定區(qū)域為約10μm2～約1mm2，優(yōu)選約1μm2～約100μm2。38.如權(quán)利要求32所述的裝置，其特征在于，進一步包含光學系統(tǒng)，用以將從所述激發(fā)光源(1)發(fā)出的激發(fā)光(2)對準并直接聚焦到所述支架上，其中激發(fā)光以45～135°的角度到達所述微陣列表面。39.一種用以監(jiān)測微陣列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR擴增的診斷試劑盒，包括-表面上固定有微陣列的支架(15)，包括至少一個固定于所述支架的特異性限定區(qū)域(21)內(nèi)的俘獲分子(20)，其中所述支架的表面在高于85℃的溫度下保持平坦，且所述支架具有弱自熒光性；-反應室，包括2個、優(yōu)選3個彼此流態(tài)連通的部分，其具有用以承載微陣列的平面。40.如權(quán)利要求39所述的診斷試劑盒，其特征在于，進一步包含dNTPs、熱穩(wěn)定DNA聚合酶和緩沖液。41.如權(quán)利要求39所述的診斷試劑盒，其特征在于，進一步包含dNTPs、熱穩(wěn)定DNA聚合酶，緩沖液和引物。42.如權(quán)利要求39所述的診斷試劑盒，其特征在于，進一步包含作為內(nèi)標的核苷酸分子。43.如權(quán)利要求39所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述支架和反應室是盒的一部分。全文摘要本發(fā)明涉及一種用以監(jiān)測微陣列上存在于溶液中的核苷酸分子的PCR擴增的方法和裝置。該方法包括步驟設(shè)置一個表面上固定有微陣列和反應室(14)的支架(15)，該微陣列包括至少一個固定于所述支架的特異性限定區(qū)域(21)上的俘獲分子(20)，將含有所述核苷酸分子的溶液引入到所述反應室(14)和用于核苷酸分子擴增和標識的試劑中；對該溶液執(zhí)行兩次具有至少2個、優(yōu)選3個不同溫階的熱循環(huán)；用以通過PCR擴增獲得標識的靶核苷酸分子(13)；通過下列方式在至少一次熱循環(huán)中對標識的靶核苷酸分子進行至少一次測量在允許所述靶核苷酸分子(13)和其相應俘獲分子(20)之間進行特異結(jié)合的情況下培養(yǎng)所述標識的靶核苷酸分子(13)，對盒中含有標識的靶核苷酸分子(13)的溶液施以激發(fā)光(2)，測量被結(jié)合的標識的靶核苷酸分子應激發(fā)光(2)而發(fā)出的光發(fā)射(7)，其中限定區(qū)域的發(fā)射面在約0.1μm文檔編號B01L3/00GK101065498SQ200580039325公開日2007年10月31日申請日期2005年11月18日優(yōu)先權(quán)日2004年11月18日發(fā)明者若澤·勒馬克勒,伊莎貝爾·亞歷山大,西爾萬·馬爾蓋納,迪特爾·胡薩爾申請人:埃彭多爾夫陣列技術(shù)公司