一株二氯喹啉酸高效降解菌及其用途和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境保護【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株二氯喹啉酸高效降解菌及其用途。本發(fā)明二氯喹啉酸高效降解菌代號為MC-08，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas?sp.)，于2013年11月19日在中國菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為：CGMCC?No.8488；該菌可用于二氯喹啉酸污染土壤及水域的治理，有良好的降解效果。該菌在二氯喹啉酸污染的土壤和水域中有良好的定植能力，能充分的降解土壤和水中殘留的二氯喹啉酸，而且不會產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點，對原有生態(tài)環(huán)境中的微生物無不良影響。
【專利說明】一株二氯喹啉酸高效降解菌及其用途和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MC_08,及其在微生物降解二氯喹啉酸農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]二氯喹啉酸是德國巴斯夫公司1984年開始推廣的一種激素型喹啉酸類除草劑，ISO通用名稱=Quincloracjv^s =CltlH5C12NO2，化學(xué)名稱:3，7-二氯喹琳-8-羧酸，其常見的商品名有:神鋤(I代、2代)、快殺稗、殺稗靈、稗草凈、克稗星和稗草王等。二氯喹琳酸對光、溫等外界條件穩(wěn)定，土壤中二氯喹啉酸的消失與土壤濕度呈線性關(guān)系。在田間自然狀態(tài)下二氯喹啉降解緩慢，主要依靠土壤中的微生物和有關(guān)的降解酶類，李晶新等人的研究表明稻田按推薦施用量下，偏酸性土壤，經(jīng)過269d后才對煙草葉寬的生長沒有顯著影響，經(jīng)過342d后，才消除到對煙草根生長沒有顯著影響的范圍。由于南方很多都是稻-煙輪作田塊，許多稻田施用二氯喹啉酸防治稗草等多種雜草，下茬又緊接著種植煙草，由于其半衰期較長，其在土壤中的殘留給煙草的生長帶來嚴重影響。但目前對于二氯喹啉酸土壤污染問題，并沒有很有效的治理和解決措施，只能通過活性炭等具有吸附活性的物質(zhì)來吸附土壤中殘留的二氯喹啉酸；或者在出現(xiàn)藥害后使用蕓苔素內(nèi)酯等一些生物調(diào)節(jié)劑來緩解煙株的受害癥狀；這些方法都不能從根本上解決二氯喹啉酸的污染為題，而且還容易造成二次污染。所以探尋二氯喹啉酸污染新的高效治理方法顯得十分迫切和重要。
[0003]微生物降解技術(shù)具有去除效率高、處理費用低、能從根本上解決二氯喹啉酸污染問題，且不會產(chǎn)生 二次污染問題。但采用微生物降解技術(shù)的關(guān)鍵之一便是獲得二氯喹啉酸的高效降解菌株。目前，國內(nèi)外學(xué)者已對二氯喹啉酸微生物降解進行了大量的研究，但是由于二氯喹啉酸含有喹啉環(huán)，較穩(wěn)定不易降解，且在土壤中含量較低，迄今為止分離到的降解菌還比較有限，主要包括蒼白桿菌屬(認AroAacir應(yīng)sp.)、Burkholderia cepecia.、Alcaligenes sp., Bordetella sp., Pantoea sp., Bordetella sp.等，這些分離到的菌株對低濃度下的二氯喹啉酸降解效果還有待于進一步提高。大量的研究表明從環(huán)境中分離篩選高效二氯喹啉酸降解菌，是從根本上解決二氯喹啉酸污染的重要舉措。且目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)煙草節(jié)桿菌屬降解二氯喹啉酸的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一株高效、定植能力強的具有二氯喹啉酸降解能力的高效降解菌及其用途。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一株二氯喹啉酸降解菌假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MC_08,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰路I號院3號，保藏編號=CGMCCN0.8488，保藏日期:2013年11月19日。
[0006]所述二氯喹啉酸降解菌MC-08菌落特征如下:菌落呈淡黃色，圓形，凸起，半透明，邊緣不整齊，表面光滑；透射電鏡下觀察該菌體的形態(tài)為桿狀，一端生有數(shù)根極鞭毛；革蘭氏染色陰性，氧化酶呈陰性，淀粉水解酶、甲基紅試驗和吲哚試驗呈陽性，能利用葡萄糖和乳糖。
[0007]本發(fā)明的一個方面,二氯喹啉酸降解菌假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MC_08在降
解二氯喹啉酸中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的一個方面,二氯喹啉酸降解菌假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MC_08在治
理二氯喹啉酸污染土壤中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的一個方面,一種包含二氯喹啉酸降解菌假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MC-08的菌劑，所述菌劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知任何技術(shù)手段制備任何形式的菌劑，例如通過發(fā)酵培養(yǎng)后進行凍干獲得的干菌劑，也可以是液體形式的濃縮液態(tài)菌劑。
[0010]本發(fā)明的一個方面,所述包含二氯喹啉酸降解菌假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MC-08菌劑在降解二氯喹啉酸中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的一個方面,所述包含二氯喹啉酸降解菌假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MC-08菌劑在治理二氯喹啉酸污染土壤中的應(yīng)用。 [0012][0008]所述降解在 25_35°C、pH 6-8 下進行。
[0013][0009]優(yōu)選的，所述降解在35°C、pH=7.5下進行。
[0014][0010]本發(fā)明中的二氯喹啉酸降解菌假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MC_08是一種常見的假單胞菌，經(jīng)檢索專利和其他相關(guān)文獻，尚未發(fā)現(xiàn)能夠降解二氯喹啉酸的假單胞菌屬菌種，且該菌種能夠在低濃度下對二氯喹啉酸進行降解，并在土壤中有良好的定植能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明中假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MC_08的透射電鏡照片。
[0016]圖2為CK測定結(jié)果圖。
[0017]圖3為本發(fā)明中假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MC-08的二氯喹啉酸降解效果圖?！揪唧w實施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0019]實施例1:假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)MC_08的分離、純化及保存。
[0020]所述降解菌經(jīng)馴化培養(yǎng)和篩選純化分離得來，具體步驟如下:
馴化培養(yǎng):將常年施用二氯喹啉酸的稻田土樣5g加入到100mg/L的二氯喹啉酸無機鹽培養(yǎng)基中，于28°C、150r/min搖床上振蕩培養(yǎng)7d ;然后以5%的接種量，轉(zhuǎn)接到新的二氯喹啉酸無機鹽培養(yǎng)基中，二氯喹啉酸的濃度按100mg/L的梯度增加，轉(zhuǎn)接4次至二氯喹啉酸濃度達到500mg/L。
[0021]所述無機鹽培養(yǎng)基為:每升無機鹽培養(yǎng)基含硝酸銨4g，磷酸二氫鉀1.5g，磷酸氫二鉀0.5g，三氯化鐵0.01g,氯化鈣0.01g,微量元素母液(EDTA- 二鈉0.01g/L,氯化錳39mg/L,硫酸鋅 43mg/L,鑰酸鈉 36mg/L) IOmL。
[0022]將最后一次的馴化培養(yǎng)液按濃度梯度稀釋至10_9，分別于100mg/L的二氯喹啉酸無機鹽培養(yǎng)基上涂板，于34°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3d，挑取長勢旺盛的菌落于LB液體培養(yǎng)基中擴大、純化培養(yǎng)。
[0023]將純化得到的菌體一份接種于LB斜面培養(yǎng)基中，4°C保存；同時于甘油中保存于-20°C下。
[0024]實施例2:假單胞菌屬(Pseudomonas sp.) MC-08的鑒定。
[0025]通過16S rDNA序列分析和生理生化實驗鑒定，確定菌株MC-08為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)菌種。具體步驟如下:
采用DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司)提取和純化菌株的DNA，4°C保存。選用細菌的16s通用引物由華大基因公司合成:
上游引物為 5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ ；
下游引物為 5’ -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
[0026]擴增反應(yīng)體系:IOXBuffer(Mg2+) 2 μ L, dNTPs2 μ L,引物各 I μ L，菌體 DNA I μ L,Taq DNA聚合酶0.5 μ L，加去離子水至20 μ L。
[0027]PCR反應(yīng)程序設(shè)定為:94° C預(yù)變性4min ;然后94° C變性lmin，55° C退火Imin, 72° C延伸1.5min，循環(huán)35個周期；然后72° C延伸IOmin ;最后4° C保持lOmin。將PCR產(chǎn)物進行測序(華大基因公司)。
[0028]測序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫進行比對,發(fā)現(xiàn)其屬于Pseudomonas sp.。圖1為MC-08菌的電鏡照片。
[0029]基于測序結(jié)果和生理生化試驗結(jié)果，確定MC-08屬于Pseudomonas sp.。因此,將該菌命名為Pseudomonas sp strain MC-08,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101)，保藏日期為2013年11月19日，保藏編號為CGMCCN0.8488。
[0030]實施例3:降解菌MC-08的降解效果鑒定。
[0031]將MC-08菌接種于液體LB中于35°C、180r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期。將5ml培養(yǎng)液于10000r/min離心2min,棄去上清液后用等體積的0.01PBS緩沖液重懸菌體后接種于50mg/L 二氯喹啉酸無機鹽培養(yǎng)基中，于30°C、150r/min，培養(yǎng)7d后用液相色譜儀進行檢測菌體的降解率。降解試驗設(shè)對照，三個重復(fù)。
[0032]液相色譜檢測條件:色譜柱:WatersSun FireTM_C18, 5.0 μ m, 4.6 mm X 250 mm。流動相:甲醇/0.01%磷酸水溶液(3:1，V/V)，流速0.6 mL/min進樣量10 yL，柱溫30 °C，檢測波長為240 nm。
[0033]相對降解率=(CK含量-降解菌降解后含量)/CK含量*100%
由上述公式計算出二氯喹啉酸降解菌MC-08的降解率為91.44%。
[0034]實施例4:外界環(huán)境因素對降解菌降解效果的影響。
[0035]二氯喹啉酸初始濃度對降解菌MC-08降解率的影響:分別配制10ppm、20ppm、40ppm、50ppm的二氯喹啉酸無機鹽培養(yǎng)基各100ml于三角瓶中滅菌待用。分別向上述二氯喹啉酸無機鹽中接種5%的活化好的MC-08菌懸液，于30°C、150r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)7d后，測定各處理的降解效率。
[0036]培養(yǎng)溫度對降解菌MC-08降解率的影響:向滅好菌的50ppm 二氯喹啉酸無機鹽培養(yǎng)基中接種5%活化好的MC-08PBS菌懸液，分別于20°C、25°C、30°C、35°C、4(rC下培養(yǎng)7d，測定各處理的降解率。
[0037]培養(yǎng)基pH對降解菌MC-08降解率的影響:分別配置ρΗ=6、6.5、7、7.5、8的50ppm二氯喹啉酸無機鹽培養(yǎng)基，接種5%的MC-08的PBS菌懸液，于30°C、150r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)7d，測定各處理的降解效果。
[0038]培養(yǎng)時間對降解菌MC-08降解效果的影響:向50ppm、pH=7的二氯喹啉酸無機鹽培養(yǎng)基中接種5%的MC-08PBS菌懸液，于30°C、150r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)7d，每個24小時
取一次樣，測定二氯喹啉酸含量。
[0039]結(jié)果顯示，二氯喹啉酸降解菌MC-08的最佳降解條件為:35° C、pH值7.5。二氯喹啉酸初始質(zhì)量濃度在10ppm-50ppm都有較好的降解效果，降解率可達90%。培養(yǎng)到第6天時，降解菌對二氯喹啉磷酸的降解已較充分。
[0040]實施例5:二氯喹啉酸降解菌MC-08在土壤中的定植效果及對二氯喹啉酸污染土壤的修復(fù)能力評估。
[0041]以噴霧的方式配置25mg/kg的二氯喹啉酸毒土，將降解菌MC-08培養(yǎng)至對數(shù)期，取5ml菌液離心后去掉LB，以20mlPBS緩沖液重懸菌體，接種到配置好的二氯喹啉酸毒土中，于35°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，測定土壤中二氯喹啉酸的含量。試驗設(shè)置3個重復(fù)和對照。
[0042]土壤樣品中二氯喹啉酸含量測定方法:準確稱取20.0 g 土壤樣品，置于磨口三角瓶中，加60 mL甲醇/0.01%磷酸水溶液(3:1，V/V)，回旋式振蕩器提取I h后，將提取液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4000 r/min離心5 min,濾紙過濾,取上清液30 mL,過0.22μπι濾膜，用于測定。測定條件同實施例3。
[0043]降解菌MC-08在30°C下7d的降解效果可達80.3%。 [0044]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【權(quán)利要求】
1.二氯喹啉酸高效降解菌MC-08,其特征在于:分類命名為假單胞菌(Pseudomonassp.)，能夠高效的降解土壤和水中殘留的二氯喹啉酸，菌種保藏編號為=CGMCC N0.8488,2013年11月19日在中國菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。
2.如權(quán)利要求1所述的二氯喹啉酸高效降解菌MC-08，其特征在于:所述二氯喹啉酸高效降解菌MC-08菌落特征如下:菌落呈淡黃色，圓形，凸起，半透明，邊緣不整齊，表面光滑；透射電鏡下觀察該菌體的形態(tài)為桿狀，一端生有數(shù)根極鞭毛；革蘭氏染色陰性，氧化酶呈陰性，淀粉水解酶、甲基紅試驗和吲哚試驗呈陽性，能利用葡萄糖和乳糖。
3.如權(quán)利要求1所述的降解菌在降解二氯喹啉酸中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的降解菌在治理二氯喹啉酸污染土壤中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求3或4所述降解菌MC-08，其特征在于在低濃度下也能充分降解土壤或水體中殘留的二氯喹啉酸，降解菌的降解作用在25-35°C、pH 6-8下進行。
6.一種包含權(quán)利要求1所述降解菌的菌劑。
7.如權(quán)利要求5所述降解菌劑在降解二氯喹啉酸中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求5所述降解菌劑在治理二氯喹啉酸污染土壤中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求7或8所述降解菌劑，其特征在于易于保存和運輸，能夠有效地降解土壤和水體中殘留的二氯喹啉酸，降解菌劑的降解作用在25-35°C、pH 6-8下進行。
【文檔編號】C02F3/34GK103834599SQ201410095790
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】陳德鑫, 張順, 黃國聯(lián), 曹君正, 閆寧, 郭先鋒 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所