土壤溶磷真菌接種劑、制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種土壤溶磷真菌接種劑及其制備方法。取斜面菌種一支，在25℃條件下培養(yǎng)1-2天；用15mL無(wú)菌水洗脫孢子，制備孢子懸濁液，吸取10mL孢子懸濁液接種到100mLPD培養(yǎng)液的三角瓶中，在26℃條件下，震蕩培養(yǎng)3-5天，獲得液體菌種；將液體菌種按15-20％接種到一級(jí)種子PD培養(yǎng)液中，在27℃條件下℃，培養(yǎng)1-2天；將一級(jí)種子PD培養(yǎng)液按15-20％接種到二級(jí)種子PD培養(yǎng)液獲得二級(jí)液體菌種；將二級(jí)液體菌種與滅菌草碳1∶4吸附然后粉碎得到孢子粉。
【專(zhuān)利說(shuō)明】土壤溶磷真菌接種劑、制備方法及應(yīng)用(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種土壤溶磷真菌接種劑、制備方法及其應(yīng)用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]磷素是一切生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ),它不僅是生物遺傳信息載體DNA的組成元素，更重要的它是生物能量載體ATP的組成元素。磷素供應(yīng)不足，一切生命都將失去其原有的光輝。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，有效磷供應(yīng)不足仍是全球作物產(chǎn)量的主要限制因子之一。而從我國(guó)情況來(lái)看，全國(guó)有74%耕地土壤由于土壤磷素固定而缺磷。據(jù)報(bào)道:自20世紀(jì)50年代我國(guó)開(kāi)始施用化學(xué)磷肥以來(lái)，累積儲(chǔ)存在土壤中的難溶性磷已高達(dá)6000萬(wàn)噸，因此，破解開(kāi)發(fā)利用土壤難溶性磷技術(shù)難題，對(duì)提高土壤磷素的利用率，科學(xué)地減施磷肥，保障國(guó)家糧食生產(chǎn)安全、減少農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)周邊生態(tài)環(huán)境的污染、從源頭上預(yù)防和防治土壤重金屬污染和農(nóng)業(yè)面源污染都具有重要意義。
[0003]由于土壤難溶磷的轉(zhuǎn)化是在一定的條件下，以生物活動(dòng)為中心的生物驅(qū)動(dòng)過(guò)程，因此，開(kāi)發(fā)利用土壤中難溶磷不外乎兩條途徑:
[0004]一、發(fā)揮植物自身的溶磷潛力，通過(guò)基因工程育種技術(shù)，選育磷高效利用植物品種來(lái)開(kāi)發(fā)利用土壤難溶性磷素資源。這方面研究近年來(lái)已成為農(nóng)作物育種領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。到目前為止，已經(jīng)獲得植物的溶磷基因，可以說(shuō)該技術(shù)源于理論、技術(shù)層面的難題已經(jīng)破解，其應(yīng)用、推廣的阻力主要源于公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品安全性的置疑。
[0005]二、通過(guò)解磷菌將土壤中難溶性磷活化出來(lái)。這方面的研究幾十年來(lái)從未間斷過(guò)，并且取得了豐碩的成果。自前蘇聯(lián)學(xué)者孟金娜(1935)從土壤中分離一株能分解核酸和卵憐脂的解憐巨大芽抱桿菌(Bucillus.megaterium var.phosphaticum)后，于1947年大量生產(chǎn)使用，接種土壤中來(lái)提高土壤有效磷含量。我國(guó)對(duì)解磷菌的研究始于1950年，前東北農(nóng)科所于1950年從東北黑土和灰化土中分離出能分解有機(jī)磷的巨大芽孢桿菌。同年，中國(guó)科學(xué)院(前林業(yè)土壤研究所)從東北黑`土中分離出一種假單胞菌(Pseudomonas spp.)也具有分解核酸和卵磷脂的能力。東北農(nóng)科所將巨大芽孢桿菌制成菌劑在黑鈣土和非黑鈣土上施用，不同的作物增產(chǎn)幅度不同，平均增產(chǎn)黑鈣土為13.5%，非黑鈣土為11.7%。
[0006]20世紀(jì)80年代以后，國(guó)內(nèi)許多單位相繼開(kāi)發(fā)出了有多種芽孢桿菌組成的復(fù)合解磷菌制劑，但這些菌劑在生產(chǎn)上使用的效果并不理想，主要表現(xiàn)在田間應(yīng)用效果不穩(wěn)定。導(dǎo)致其田間應(yīng)用效果不穩(wěn)定的主要原因除了這些解磷菌的土壤適應(yīng)性差外，更主要的是這些解磷制劑使用的菌種都是解磷細(xì)菌，而該類(lèi)菌種的致命缺點(diǎn)在于:在深層液體發(fā)酵工廠(chǎng)化生產(chǎn)過(guò)程中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的種類(lèi)和比例、溫度、PH值、供氧量、發(fā)酵時(shí)間等發(fā)酵條件的微小變化，都會(huì)導(dǎo)致該類(lèi)菌種不可逆地丟失解磷基因，喪失解磷能力，從而導(dǎo)致其田間應(yīng)用效果不穩(wěn)定。
[0007] 申請(qǐng)人:利用解磷真菌平陽(yáng)正青霉篩選出兩株平陽(yáng)正青霉的無(wú)性系菌株JB201015(Eupenicillium euglaucum anamorph JB201015)、JB201016 (Eupenicilliumeuglaucum anamorph JB201016),其中關(guān)于JB201015菌株的接種劑已申請(qǐng)專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)為201210085390.8,201210085415.4。本發(fā)明“土壤溶磷真菌接種劑”使用的菌種是平陽(yáng)正青霉無(wú)性系菌株 JB201016 (Eupenicillium euglaucum anamorph JB201016),克服了工廠(chǎng)化生產(chǎn)過(guò)程中，菌種會(huì)不可逆地喪失解磷基因的缺點(diǎn)，其溶磷效果優(yōu)于JB201015;在田間應(yīng)用上，通過(guò)拌種的方法，使菌種定植在作物的根際，以作物根際分泌物為碳源、氮源生長(zhǎng)、繁殖，通過(guò)溶磷真菌的代謝活動(dòng)，將作物根際土壤中難溶的磷酸鹽(PO/—)，轉(zhuǎn)化成可溶性磷酸鹽(H2PO4'HPO42O供作物吸收利用?？朔艘酝饬拙寥肋m應(yīng)性差的缺點(diǎn)。
[0008]因此在此提出一種方法，能夠有效破解開(kāi)發(fā)利用累積儲(chǔ)存在中國(guó)土壤中的6000萬(wàn)噸難溶性磷的技術(shù)難題，為提高中國(guó)土壤磷肥的利用率，科學(xué)地減施磷肥，保障國(guó)家糧食生產(chǎn)安全、減少農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)周邊生態(tài)環(huán)境的污染、從源頭上預(yù)防和防治土壤重金屬污染和農(nóng)業(yè)面源污染提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]【要解決的問(wèn)題】
[0010]本發(fā)明的目的是提供一種土壤溶磷真菌菌株；
[0011]本發(fā)明的另一目的是提供一種土壤溶磷真菌接種劑；
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供一種土壤溶磷真菌接種劑的制備方法；
[0013]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種土壤溶磷真菌接種劑的應(yīng)用。
[0014]【技術(shù)方案】
[0015]一種土壤溶磷真菌菌株，該菌株為平陽(yáng)正青霉無(wú)性系菌株JB201016(Eupenicillium euglaucu·m anamorph JB201016),保藏號(hào)為 CGMCC N07919o
[0016]一種土壤溶磷真菌接種劑，包括將平陽(yáng)正青霉無(wú)性系菌株JB201016的二級(jí)液體菌種與滅菌草碳1: 4 (重量)吸附，在27°C的條件下，空氣相對(duì)濕度大于85%條件下，保濕培養(yǎng)2-5天，干燥粉碎得到孢子粉即為接種劑。
[0017]所述的土壤溶磷真菌接種劑的制備方法，具體包括以下步驟:
[0018]A.取保藏號(hào)為CGMCC N07919的平陽(yáng)正青霉無(wú)性系菌株JB201016的分生孢子在25°C條件下培養(yǎng)1-2天；再用15mL無(wú)菌水洗脫孢子，制備成孢子懸濁液，吸取IOmL孢子懸濁液接種到IOOmLPD培養(yǎng)液的三角瓶中，在26°C條件下，震蕩培養(yǎng)3_5天，獲得液體菌種；
[0019]B.將液體菌種與一級(jí)種子ro培養(yǎng)液按15-20 % (體積)接種到一級(jí)種子ro培養(yǎng)液中，在27°C條件下，培養(yǎng)1-2天；
[0020]c.再將培養(yǎng)后的一級(jí)種子ro培養(yǎng)液與二級(jí)種子ro培養(yǎng)液按15-20 % (體積)接種到二級(jí)種子H)培養(yǎng)液中，在26-27°C條件下發(fā)酵3天，獲得二級(jí)液體菌種；
[0021]D.將二級(jí)液體菌種與滅菌草碳1: 4(重量)吸附，在27°C的條件下，空氣相對(duì)濕度大于85%條件下，保濕培養(yǎng)2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。
[0022]所述的土壤溶磷真菌接種劑，平陽(yáng)正青霉無(wú)性系菌株JB201016 二級(jí)液體菌種的菌絲體達(dá)到3X108cfu/ml以上；滅菌草碳的分生孢子量達(dá)到3X109cfu/g。
[0023]進(jìn)一步的，所述的土壤溶磷真菌接種劑作為拌種劑的應(yīng)用。
[0024]進(jìn)一步的，所述的土壤溶磷真菌接種劑作為土壤處理劑的應(yīng)用。
[0025]平陽(yáng)正青霉無(wú)性系菌株JB201016 (Eupenicillium euglaucum anamorphJB201016)的篩選方法:[0026]A.取保藏號(hào)為CGMCC3.4396的平陽(yáng)正青霉Eupenicillium euglaucum的子囊孢子一接種環(huán)，放入無(wú)菌水中，利用漩渦混合器震蕩I分鐘，使子囊孢子均勻地分散在無(wú)菌水中，制備成子囊孢子懸液；
[0027]B.取0.1ml上述的子囊孢子懸液，均勻涂布在水瓊脂平板上；
[0028]C.將水瓊脂平板置于顯微鏡下挑取單孢子，以多個(gè)點(diǎn)的方式接種于第一選擇性培養(yǎng)基平板上，在25-27°C中培養(yǎng)10-15天；
[0029]D.挑取在選擇性培養(yǎng)基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接種到第二選擇性培養(yǎng)基平板上，同樣在在25-27°C中培養(yǎng)10-15天，然后篩選獲得一株具有最大溶磷圈的菌落的分生孢子，經(jīng)鑒定為新的菌株，命名為JB201016，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0030]所述第一選擇性培養(yǎng)基是由10g/L的葡萄糖、0.5g/L的硫酸銨、0.lg/L的硫酸鎂、
0.2g/L的氯化鉀、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亞鐵、0.2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用0.lmol/L的鹽酸溶液和0.lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0。
[0031]所述第二選擇性培養(yǎng)基是由10g/L的麥芽糖、0.5g/L的硫酸銨、0.lg/L的硫酸鎂、
0.2g/L的氯化鉀、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亞鐵、0.2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用0.lmol/L的鹽酸溶液和0.lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0。
[0032]在步驟A中所述震蕩條件為120轉(zhuǎn)/分鐘。所獲得的液體菌種的菌絲體3X107cfu/ml以上；二級(jí)液體菌種的菌絲體3X108cfu/ml以上；滅菌草碳的分生孢子量達(dá)到 3X109cfu/go
[0033]【有益效果】
[0034]具體地說(shuō)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:
[0035]所述真菌接種劑的土壤適應(yīng)性強(qiáng)、溶磷增產(chǎn)效果明顯；在工廠(chǎng)生產(chǎn)過(guò)程中不會(huì)喪失解磷基因；該真菌接種劑的生產(chǎn)成本低、不需深層發(fā)酵、生產(chǎn)周期短。在作用于植物的根際后，能夠活化作物根際土壤中難溶的磷酸鹽，供作物吸收利用。
(四)【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1為接種劑發(fā)酵工藝的流程圖。
(五)【具體實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明的土壤溶磷真菌接種劑及其制備方法，使用的菌種是解磷真菌平陽(yáng)正青霉的無(wú)性系菌株 JB201016 (Eupenicillium euglaucum anamorph JB201016),該菌株克服了工廠(chǎng)化生產(chǎn)過(guò)程中，菌種會(huì)不可逆地喪失解磷基因的缺點(diǎn)；在田間應(yīng)用上，通過(guò)拌種的方法，使菌種定植在作物的根際，以作物根際分泌物為碳源、氮源生長(zhǎng)、繁殖，通過(guò)溶磷真菌的代謝活動(dòng)，將作物根際土壤中難溶的磷酸鹽(P043_)，轉(zhuǎn)化成可溶性磷酸鹽(h2po4_、hpo42_)供作物吸收利用?？朔艘酝饬拙寥肋m應(yīng)性差的缺點(diǎn)。
[0038]技術(shù)原理:
[0039]土壤中的磷主要以有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷兩種形態(tài)存在。在石灰性土壤中，磷主要是以磷酸鈣鹽形式存在，占無(wú)機(jī)磷酸鹽的60-70%。這些磷酸鈣鹽主要以Ca(H2P04)2、CaHPO4.2H20、CaHPO4, Ca3 (PO4)2, Ca4H (PO4) 3.2.5H20、Ca5 (PO4) 3.0H 形式存在。依據(jù)其化學(xué)性質(zhì)，土壤鈣磷的水溶性依次為=Ca(H2PO4)2 > CaHPO4.2H20 > CaHPO4 > Ca3(PO4)2> Ca4H(PO4)3.2.5H20 > Ca5(PO4)3.0H。石灰性土壤中的鈣磷存在形式取決于土壤的pH值和CaCO3的含量。在堿性條件下，施入土壤中的磷肥主要轉(zhuǎn)化成CaHPO4.2H20和CaHPO4,很少一部分轉(zhuǎn)化成Ca3(PO4)2和Ca4H(PO4)3.2.5H20,且在連年施用磷肥的條件下，Ca4H(PO4)3.2.5H20 不會(huì)形成 Ca5(PO4)3.0H，而以 Ca4H(PO4)3.2.5H20 的形態(tài)存在數(shù)年。在pH < 7.3條件下，CaHPO4.2H20和CaHPO4可以轉(zhuǎn)化成Ca (H2PO4) 2被植物利用，降低石灰性土壤的PH值有助于鈣磷的活化。
[0040]該發(fā)明以購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)的平陽(yáng)正青霉(編號(hào):3.4396) (Eupenicillium euglaucum)為母本,篩選出一株利用作物根際分泌物生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力強(qiáng)的無(wú)性系菌株 JB201016 (Eupenicillium euglaucum anamorph JB201016),該菌株接種到作物根際土壤中后，可顯著降根際土壤的PH值，促進(jìn)作物根際土壤中難溶的磷酸鹽CaHPO4.2H20和CaHPO4向Ca (H2PO4) 2轉(zhuǎn)化，供作物吸收利用。
[0041]技術(shù)路線(xiàn):
[0042]通過(guò)工廠(chǎng)化生產(chǎn)，擴(kuò)繁平陽(yáng)正青霉無(wú)性系菌株JB201016 (Eupenicilliumeuglaucum anamorph JB201016)的菌絲體并獲得其分生孢子,將分生孢子吸附于滅菌載體，制備成孢子粉劑或草碳型粉劑成品(商品)；通過(guò)拌種或與營(yíng)養(yǎng)土混合，將孢子接種在作物的根際，待溶磷孢子萌發(fā)后(土溫4°C以上)，通過(guò)溶磷真菌的代謝活動(dòng)，活化作物根際土壤中難溶的磷酸鹽，供作物吸收利用。
[0043]生產(chǎn)制備流程:
[0044]取保藏號(hào)為CGMCC3.4396的平陽(yáng)正青霉Eupenicillium euglaucum的子囊孢子一接種環(huán)，放入無(wú)菌水中，利用漩渦混合器震蕩(120轉(zhuǎn)/分鐘)I分鐘，使子囊孢子均勻地分散在無(wú)菌水中，制備成子囊孢子懸液；取0.1ml上述的子囊孢子懸液，均勻涂布在水瓊脂平板上；將水瓊脂平板置于顯微鏡下挑取單孢子，以多個(gè)點(diǎn)的方式接種于第一選擇性培養(yǎng)基平板上，在25-27°C中培養(yǎng)10-15天；挑取在選擇性培養(yǎng)基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接種到第二選擇性培養(yǎng)基平板上，同樣在在25-27°C中培養(yǎng)10-15天，然后篩選獲得一株具有最大溶磷圈的菌落的分生孢子，命名為JB201016。
[0045]所述第一選擇性培養(yǎng)基是由10g/L的葡萄糖、0.5g/L的硫酸銨、0.lg/L的硫酸鎂、
0.2g/L的氯化鉀、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亞鐵、0.2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用0.lmol/L的鹽酸溶液和0.lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0。
[0046]所述第二選擇性培養(yǎng)基是由10g/L的麥芽糖、0.5g/L的硫酸銨、0.lg/L的硫酸鎂、
0.2g/L的氯化鉀、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亞鐵、0.2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用0.lmol/L的鹽酸溶液和0.lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為
7.0。
[0047]接著，將選出的分生孢子在22_27°C (優(yōu)選為25°C )條件下培養(yǎng)1_2天；再用15mL無(wú)菌水洗脫孢子，制備成孢子懸濁液，吸取IOmL上述孢子懸濁液接種到IOOmL PD培養(yǎng)液的三角瓶中，在22-27°C (優(yōu)選為26°C)條件下，震蕩培養(yǎng)3_5天，獲得液體菌種；將液體菌與一級(jí)種子ro培養(yǎng)液種按15-20% (體積)接種到一級(jí)種子ro培養(yǎng)液中，在22-30°C (優(yōu)選為27°C)條件下，培養(yǎng)1-2天。
[0048]再將培養(yǎng)后的一級(jí)種子ro培養(yǎng)液與二級(jí)種子ro培養(yǎng)液按15-20% (體積)接種到二級(jí)種子ro培養(yǎng)液中，在26-27°C條件下發(fā)酵3天，獲得二級(jí)液體菌種；將二級(jí)液體菌種與滅菌草碳1: 4(重量)吸附，在22-30°C (優(yōu)選為27°C)的條件下，空氣相對(duì)濕度大于85%條件下，保濕培養(yǎng)2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。
[0049]其中上述所獲得的液體菌種的菌絲體3X 107cfu/ml以上；二級(jí)液體菌種的菌絲體3X108cfu/ml以上；滅菌草碳的分生孢子量達(dá)到3X109cfu/g以上為優(yōu)選狀態(tài)。
[0050]溶磷試驗(yàn):
[0051]分別挑取溶磷圈清晰的JB201015、JB201016，有溶磷圈的JB201001，無(wú)溶磷圈的JB201009菌株的分生孢子進(jìn)行了定量試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1.[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種土壤溶磷真菌菌株，其特征在于:該菌株為平陽(yáng)正青霉無(wú)性系菌株JB201016(Eupenicillium euglaucum anamorph JB201016),保藏號(hào)為 CGMCC N07919o
2.一種土壤溶磷真菌接種劑，其特征在于:將平陽(yáng)正青霉無(wú)性系菌株JB201016的二級(jí)液體菌種與滅菌草碳1: 4(重量)吸附，在27°C的條件下，空氣相對(duì)濕度大于85%條件下，保濕培養(yǎng)2-5天，干燥粉碎得到孢子粉即為接種劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的土壤溶磷真菌接種劑的制備方法，具體包括以下步驟: A.取保藏號(hào)為CGMCCNQ7919的平陽(yáng)正青霉無(wú)性系菌株JB201016的分生孢子在25°C條件下培養(yǎng)1-2天；再用15mL無(wú)菌水洗脫孢子，制備成孢子懸濁液，吸取IOmL孢子懸濁液接種到IOOmLPD培養(yǎng)液的三角瓶中，在26°C條件下，震蕩培養(yǎng)3_5天，獲得液體菌種； B.將液體菌種與一級(jí)種子ro培養(yǎng)液按15-20%(體積)接種到一級(jí)種子ro培養(yǎng)液中，在27°C條件下，培養(yǎng)1-2天； c.再將培養(yǎng)后的一級(jí)種子ro培養(yǎng)液與二級(jí)種子ro培養(yǎng)液按15-20% (體積)接種到二級(jí)種子H)培養(yǎng)液中，在26-27°C條件下發(fā)酵3天，獲得二級(jí)液體菌種； D.將二級(jí)液體菌種與滅菌草碳1: 4 (重量)吸附，在27°C的條件下，空氣相對(duì)濕度大于85%條件下，保濕培養(yǎng)2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的土壤溶磷真菌接種劑，其特征在于:二級(jí)液體菌種的菌絲體達(dá)到3X108cfu/ml以上；滅菌草碳的分生孢子量達(dá)到3X109cfu/g。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的土壤溶磷真菌接種劑作為拌種劑的應(yīng)用。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的土壤溶磷真菌接種劑作為土壤處理劑的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】B09C1/10GK103571758SQ201310472690
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】宋丹丹, 崔俊濤 申請(qǐng)人:宋丹丹