專利名稱：制備特異性位點(diǎn)生理活性多肽結(jié)合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備一種特異性位點(diǎn)生理活性多肽結(jié)合物的方法，更特別地涉及一種通過將生理活性多肽和非肽基聚合物連接從而以高產(chǎn)率制備所述結(jié)合物的方法。
背景技術(shù)：
由于其低穩(wěn)定性，肽類很容易變性，被蛋白酶體內(nèi)降解，并由于其相對(duì)小的尺寸而從腎臟中排泄出去。因此，為了以其活性形式維持肽藥物在血液中的具體濃度，需要頻繁給予患者肽藥物。然而，肽藥物通常是以注射制劑形式給藥的，這種頻繁給藥引起患者的嚴(yán)重不適。為了解決此問題，已經(jīng)開發(fā)了很多方法，例如通過增加肽藥物通過生物膜的滲透，經(jīng)咽或經(jīng)鼻吸入將肽藥物轉(zhuǎn)移的方法，通過抑制酶促降解從而穩(wěn)定肽，修飾對(duì)蛋白酶敏感的特定氨基酸序列(例如阻止由二肽基肽酶引起的效價(jià)損失的GLP-I氨基酸序列)的方法， 以及在肽的表面化學(xué)添加一個(gè)高溶解度的非肽基聚合物，例如聚乙二醇(PEG)的方法。PEG，已經(jīng)被用作非肽基聚合物中的一種，它和靶向肽的一個(gè)特異性位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)非特異性地結(jié)合，從而達(dá)到增加肽的分子量的效果，所得的PEG-肽復(fù)合物耐受腎臟損失和酶水解，而無任何副作用。例如，國(guó)際專利公開文本W(wǎng)O 2006/076471描述了通過將用作充血性心力衰竭治療劑的B-型利尿鈉肽(BNP)和PEG結(jié)合從而維持生理活性，美國(guó)專利 US6, 924，264描述了通過將PEG和其上的賴氨酸殘基結(jié)合而增加藥物exendin-4的體內(nèi)滯留時(shí)間。這些方法通過增加PEG的分子量延長(zhǎng)了肽的體內(nèi)滯留時(shí)間，但是由于分子量增加，肽藥物的效價(jià)顯著降低。此外，PEG的非特異性結(jié)合可能遮蔽生理活性多肽的活性域從而顯著降低多肽活性。從而，需要開發(fā)一種改善的用于制備生理活性多肽和非肽基聚合物的結(jié)合物的方法，其中聚合物以在不影響多肽活性的特異位點(diǎn)的方式和肽連接。本發(fā)明人通過證實(shí)通過調(diào)節(jié)反應(yīng)媒介的pH和醇含量以高產(chǎn)率制備出在特異性位點(diǎn)連接有非肽基聚合物的生理活性多肽的結(jié)合物完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種高產(chǎn)率制備生理活性多肽結(jié)合物的方法，在所述生理活性多肽結(jié)合物中非肽基聚合物在特異性位點(diǎn)和生理活性多肽相連接。與本發(fā)明的一個(gè)方面相一致，提供了一種制備特異性位點(diǎn)生理活性多肽結(jié)合物的方法，包括步驟i)將生理活性多肽和非肽基聚合物置于包含特定量的醇和特定PH以使非肽基聚合物和生理活性多肽的靶向位點(diǎn)結(jié)合的反應(yīng)媒介中進(jìn)行反應(yīng)；ii)從步驟i)的反應(yīng)混合物中使用醇并通過離子交換色譜分離和純化生理活性多肽結(jié)合物。


當(dāng)考慮到下文附帶的附圖時(shí)，下文對(duì)本發(fā)明的描述將使本發(fā)明的上述和其他目的和特征變得明顯，其各自如下圖1 使用SOURCE S柱純化DA-exendin_4-PEG的位置異構(gòu)體的圖譜；圖2 使用SOURCE S柱純化CA-exendin-4-PEG的位置異構(gòu)體的圖譜；圖3 顯示當(dāng)在不同pH值下對(duì)CA-exendin-4聚乙二醇化時(shí)獲得的第27位賴氨酸聚乙二醇化的異構(gòu)體的曲線圖；圖4 顯示當(dāng)在45%乙醇中于不同pH值下對(duì)CA-exendin-4進(jìn)行聚乙二醇化時(shí)獲得的第27位賴氨酸聚乙二醇化的異構(gòu)體的曲線圖；圖5 顯示當(dāng)在不同量(％ )乙醇中于7. 5的pH值下對(duì)CA-exendin-4進(jìn)行聚乙二醇化時(shí)獲得的第27位賴氨酸聚乙二醇化的異構(gòu)體的曲線圖；圖6 顯示當(dāng)在不同量異丙醇(％ )中于7.5的pH值下對(duì)CA-exendin-4進(jìn)行聚乙二醇化時(shí)獲得的第27位賴氨酸聚乙二醇化的異構(gòu)體的曲線圖；圖 7 :CA-exendin-PEG-免疫球蛋白 Fc 的 SDS-PAGE 分析；圖8 :CA-exendin-PEG-第12位和第27位賴氨酸的SDS-PAGE分析；圖9 通過肽圖分析的CA-exendin-4第12位賴氨酸聚乙二醇化的異構(gòu)體的分析圖譜；圖10 通過肽圖分析的CA-exendin-4第27位賴氨酸聚乙二醇化的異構(gòu)體的分析圖譜；圖11 使用SOURCE S柱純化胃泌酸調(diào)節(jié)素-PEG的位置異構(gòu)體的圖譜；圖12 使用SOURCE S柱純化咪唑并-乙酰基胃泌酸調(diào)節(jié)素-PEG的位置異構(gòu)體的圖譜；圖13 通過肽圖分析的胃泌酸調(diào)節(jié)素的第30位賴氨酸聚乙二醇化的異構(gòu)體的分析圖譜；圖14 使用SOURCE Q柱純化咪唑并-乙?；该谒嵴{(diào)節(jié)素-PEG和免疫球蛋白Fc 的結(jié)合物的圖譜；圖15 咪唑并-乙?；该谒嵴{(diào)節(jié)素-PEG和免疫球蛋白Fc結(jié)合物的SDS-PAGE分析；圖16 使用SOURCE S柱純化胃泌酸調(diào)節(jié)素類似物-PEG的位置異構(gòu)體的圖譜；圖17 通過肽圖分析的胃泌酸調(diào)節(jié)素類似物的第27位賴氨酸聚乙二醇化的異構(gòu)體的分析圖譜；圖18 使用SOURCE S柱純化咪唑并-乙?；该谒嵴{(diào)節(jié)素類似物-PEG的位置異構(gòu)體的圖譜；圖19 通過肽圖分析的咪唑并-乙?；该谒嵴{(diào)節(jié)素類似物的第27位賴氨酸聚乙二醇化的異構(gòu)體的分析圖譜；圖20 使用SOURCE Q柱純化咪唑并-乙?；该谒嵴{(diào)節(jié)素類似物-PEG和免疫球蛋白Fc的結(jié)合物的圖譜；圖21 咪唑并-乙酰基胃泌酸調(diào)節(jié)素類似物-PEG和免疫球蛋白Fc的結(jié)合物的 SDS-PAGE 分析； 圖22 使用SOURCE S柱純化GLP-l-PEG的位置異構(gòu)體的圖譜； 圖23 通過肽圖分析的GLP-I的第34位賴氨酸-聚乙二醇化異構(gòu)體的分析圖譜；
圖M 使用SOURCE S柱純化咪唑并-乙?；?GLP_1_PEG的位置異構(gòu)體的圖譜；圖25 通過肽圖分析的咪唑并-乙?；?GLP-I的第34位賴氨酸聚乙二醇化的異構(gòu)體的分析圖譜圖沈使用SOURCE Phe柱純化咪唑并-乙酰基_GLP_1_PEG和免疫球蛋白Fc的結(jié)合物的圖譜；圖27 咪唑并-乙?；?GLP-I-PEG和免疫球蛋白Fc的結(jié)合物的SDS-PAGE分析；圖28 使用SOURCE S柱純化GLP_2_PEG的位置異構(gòu)體的圖譜；圖四通過肽圖分析的GLP-2的第30位賴氨酸聚乙二醇化的異構(gòu)體的分析圖譜；圖30 使用SOURCE S柱純化咪唑并-乙酰基-GLP_2_PEG的位置異構(gòu)體的圖譜；圖31 使用SOURCE Phe柱純化咪唑并-乙酰基-GLP_2_PEG和免疫球蛋白Fc的結(jié)合物的圖譜；圖32 咪唑并-乙?；?GLP-2-PEG和免疫球蛋白Fc的結(jié)合物的SDS-PAGE分析；圖33 使用SOURCE S柱純化人類胰島素-PEG(BlF)的位置異構(gòu)體的圖譜；圖34 使用SOURCE S柱純化人類胰島素-PEG(AlG)的位置異構(gòu)體的圖譜；圖35 使用SOURCE S柱純化人類胰島素-PEG (B29K)的位置異構(gòu)體的圖譜；以及圖36 通過肽圖分析的人類胰島素的A1G-、B1F_或B29K-聚乙二醇化異構(gòu)體的分析圖譜。
具體實(shí)施例方式下文中，將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明提供了一種制備特異性位點(diǎn)生理活性多肽結(jié)合物的方法，包括步驟i)在包含特定量的醇和具有特定pH以使非肽基聚合物和生理活性多肽的靶向位點(diǎn)結(jié)合的反應(yīng)媒介中用非肽基聚合物處理生理活性多肽；并ii)從步驟(i)的反應(yīng)混合物中使用醇并通過離子交換色譜分離和純化生理活性多肽結(jié)合物?；诒景l(fā)明的生理活性多肽結(jié)合物指的是其中生理活性多肽和非肽基聚合物的一個(gè)末端被共價(jià)地彼此連接的物質(zhì)，且本發(fā)明的特征即在于將多肽和聚合物在特定條件下連接，并將所得的具有在其靶向位點(diǎn)上連接的聚合物的多肽結(jié)合物分離出來。此處使用的術(shù)語(yǔ)“生理活性多肽或肽”指的是能夠在體內(nèi)顯示生理活性的肽，例如可以選自促胰島素釋放肽、血液因子、消化激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、甲狀腺激素、腸激素、細(xì)胞因子、酶、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)肽、促垂體激素(hypophyseotropic hormone)、促垂體素 (hypophysiotropic hormone)、抗肥胖肽、抗病毒肽，以及保持生理活性性質(zhì)的非天然肽衍生物，但不僅僅限于這些。更特別地，生理活性多肽或肽選自促紅細(xì)胞生成素、GM-CSF (粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、淀粉素、胰高血糖素、胰島素、生長(zhǎng)激素抑制素、PPY(肽YY)、 NPY(神經(jīng)肽Y)、GLP-U GLP-2、exendin-4,胃泌酸調(diào)節(jié)素、饑餓激素(ghrelin)、血管緊張肽、血管舒緩激肽、降鈣素、促腎上腺皮質(zhì)激素、唾液腺十一肽、胃泌素、瘦素、催產(chǎn)素、加壓素、LH(促黃體激素)、催乳激素、FSH(卵泡刺激素)、PTH(甲狀旁腺激素)、腸促胰液素、舍莫瑞林、hGH(人類生長(zhǎng)激素)、生長(zhǎng)激素釋放肽、G-CSFs (粒細(xì)胞集落刺激因子)、干擾素、 白介素、催乳素釋放肽、促食素、甲狀腺釋放肽、縮膽囊素、胃泌素抑制肽、鈣調(diào)蛋白、胃泌素釋放肽、促胃動(dòng)素、血管活性腸肽、ANP(心房利鈉肽)、BNP(腦鈉肽)、CNP(C型利鈉肽)、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)介肽、腎素、內(nèi)皮素、角蝰毒素肽、酪啡肽、皮啡肽、強(qiáng)啡肽、內(nèi)啡肽、蛋腦啡肽 (enkepalin)、T細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子受體、尿激酶受體、腫瘤抑制因子、 膠原酶抑制劑、促胸腺生成素、胸腺九肽(thymulin)、胸腺五肽、胸腺肽(tymosin)、胸腺體液因子、腎上腺髓質(zhì)素、咽側(cè)體抑制素、淀粉樣β蛋白片段、抗菌肽、抗氧化肽、鈴蟾肽、骨鈣素、CART肽、E-選擇素、ICAM-1、VCAM-1、白細(xì)胞激肽、kringle-5、層粘連蛋白、抑制素、甘丙肽、纖連蛋白、胰抑制素和恩夫韋地。此外，生理活性多肽包括其前體、衍生物、片段或其變體。本發(fā)明中使用的優(yōu)選的生理活性多肽為exendin、胰島素、GLP-l、GLP-2、胃泌酸調(diào)節(jié)素、饑餓激素、血管緊張肽、緩激肽、降鈣素或其衍生物。其衍生物可以例如通過對(duì)氨基酸殘基上的任何基團(tuán)的化學(xué)取代(例如α-甲基化或α-羥基化)、缺失(例如脫氨基或碳缺失)或修飾(例如N-甲基化)而制備，尤其是如韓國(guó)專利申請(qǐng)No. 2008-69234中詳細(xì)描述的exendin衍生物的制備。同時(shí)，此處使用的術(shù)語(yǔ)“非肽基聚合物”指的是包括由除肽鍵之外的共價(jià)鍵連接彼此的兩種或更多重復(fù)單元的生物可相容性聚合物?？梢杂糜诒景l(fā)明的非肽基聚合物可以選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基多醇(polyoxyethylated polyols)、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物如PLA(聚(乳酸))和PLGA(聚乳乙醇酸)、脂類聚合物、幾丁質(zhì)、透明質(zhì)酸及其組合，且優(yōu)選是聚乙二醇。本領(lǐng)域公知的或基于本領(lǐng)域的技術(shù)可以容易制備出的衍生物也被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。可用于本發(fā)明的非肽基聚合物功能是增加生理活性多肽的分子量從而阻止結(jié)合物通過腎的流失?？梢圆皇苋魏蜗拗频厥褂萌魏畏请幕酆衔铮灰茉隗w內(nèi)耐受蛋白酶。非肽基聚合物的分子量可以在0.5到IOOkDa的范圍內(nèi)，優(yōu)選0.5到20kDa，生理活性多肽和非肽基聚合物的適宜的摩爾比率可以選自1 1到1 50 的范圍。本發(fā)明中使用的非肽基聚合物在一個(gè)末端或在兩個(gè)末端具有反應(yīng)基團(tuán)。對(duì)于在兩個(gè)末端均具有反應(yīng)基團(tuán)的非肽基聚合物，它可以和生理活性載體以及幫助作為長(zhǎng)效制劑功能的蛋白藥物結(jié)合。非肽基聚合物的一個(gè)末端或兩個(gè)末端的反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選選自活性醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺基。琥珀酰亞胺基的實(shí)例包括琥珀酰亞胺基丙酸酯、琥珀酰亞胺基丁酸酯、羥基琥珀酰亞胺、羧甲基琥珀酰亞胺或琥珀酰亞胺碳酸酯。尤其是，當(dāng)非肽基聚合物在一個(gè)末端具有一個(gè)活性醛基或活性琥珀酰亞胺基團(tuán)時(shí)，它可有效地以最低的非特異性反應(yīng)在兩端和生理活性多肽和免疫球蛋白連接。在低PH值下，醛基活性基團(tuán)選擇性地和N-末端結(jié)合，并能在高pH值例如9. 0的pH值下和賴氨酸殘基結(jié)合從而形成胺鍵。 此外，琥珀酰亞胺反應(yīng)基團(tuán)能夠在pH 7. 0 9. 0下和氨基末端或賴氨酸殘基形成穩(wěn)定的酰胺鍵。進(jìn)而，在非肽基聚合物兩端的活性基團(tuán)可以是相同的或不同的。當(dāng)在其兩端均具有活性羥基的聚乙二醇用作非肽基聚合物時(shí)，可以使用已知的化學(xué)反應(yīng)將羥基活化成各種活性基團(tuán)，或可使用可以商購(gòu)的具有修飾的活性基團(tuán)的聚乙二醇。本發(fā)明的步驟(i)是為了在適宜反應(yīng)媒介中通過使非肽基聚合物和生理活性多肽通過特異性位點(diǎn)連接從而制備出生理活性多肽結(jié)合物。此處使用的術(shù)語(yǔ)“位點(diǎn)特異的”或“位點(diǎn)特異地”指的是使非肽基聚合物連接到生理活性多肽的特異的靶向氨基酸位點(diǎn)，優(yōu)選賴氨酸殘基或N-末端的胺基上。特異性位點(diǎn)連接或結(jié)合可以阻止形成非肽基聚合物連接到生理重要的氨基酸殘基上的隨機(jī)結(jié)合。例如， 當(dāng)非肽基聚合物和exendin-4的N-末端結(jié)合時(shí)，exendin-4的體外活性變低，但當(dāng)非肽基聚合物和賴氨酸殘基結(jié)合時(shí)，體外活性得以保持。尤其是，當(dāng)非肽基聚合物和第27位賴氨酸殘基而非第12位賴氨酸殘基結(jié)合時(shí)，觀測(cè)到更高的體外活性(參見實(shí)施例10和表2)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在步驟i)中反應(yīng)媒介中醇的存在和反應(yīng)媒介的PH值是非肽基聚合物和生理活性多肽的特異性位點(diǎn)結(jié)合的關(guān)鍵因素。因此，在本發(fā)明的步驟i)中，通過使用含有特定含量的醇和特定PH值的反應(yīng)媒介使非肽基聚合物和生理活性多肽的特異性位點(diǎn)連接。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，多肽結(jié)合物的特異性位置異構(gòu)體的比率基于反應(yīng)媒介的PH值，或基于在相同pH值下的醇濃度(％)而變化。因此使非肽基聚合物以特異性位點(diǎn)方式連接到生理活性多肽的期望的氨基酸上成為可能。即，本發(fā)明的步驟i)在特定PH值下進(jìn)行，從而使非肽基聚合物能夠和期望的(或靶向)位點(diǎn)也就是不影響多肽活性的位點(diǎn)結(jié)合。PH值范圍可能依賴于生理活性多肽的類型。例如，對(duì)于促胰島素釋放肽(例如exendin-4)，在反應(yīng)媒介處于低pH值下，觀測(cè)到主要是聚合物和第12位賴氨酸連接的異構(gòu)體，然而在反應(yīng)媒介處于高pH值下，觀測(cè)到主要是不影響促胰島素釋放活性的聚合物和第27位賴氨酸連接的異構(gòu)體(參見實(shí)施例3和圖3)。 從而，步驟i)優(yōu)選于pH值7. 5到9. 0之間進(jìn)行，從而使非肽基聚合物選擇性地和第27位賴氨酸連接。進(jìn)而，本發(fā)明的步驟i)在包含醇的反應(yīng)媒介中進(jìn)行，從而使非肽基聚合物能夠結(jié)合到不影響多肽活性的位點(diǎn)。醇的實(shí)例包括伯醇、仲醇和叔醇，優(yōu)選具有1到10個(gè)碳原子的醇，更優(yōu)選乙醇或異丙醇。對(duì)于促胰島素釋放肽(例如exendin-4)，為了使非肽基聚合物能結(jié)合到不影響促胰島素釋放活性的第27位賴氨酸上，反應(yīng)媒介中的醇含量范圍可以是基于反應(yīng)媒介的總體積，從體積份為0. 1 %到100%，優(yōu)選從25%到90%，更優(yōu)選從35%到 60%。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，當(dāng)生理活性多肽是exendin-4或其衍生物時(shí)， 步驟i)中使用的PH值可以是7. 0到10. 0，以增加非肽基聚合物結(jié)合到第27位賴氨酸的比例。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，當(dāng)生理活性多肽是降鈣素時(shí)，步驟i)中使用的 PH值可以是4. 0到6. 0，以增加非肽基聚合物結(jié)合到N-末端的比例。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，當(dāng)生理活性多肽是胃泌酸調(diào)節(jié)素或其衍生物時(shí)，步驟i)中使用的PH值可以是7. 0到10. 0，以增加非肽基聚合物結(jié)合到第27位賴氨酸或第30位賴氨酸的比例。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，當(dāng)生理活性多肽是人胰島素或其衍生物時(shí)，步驟i)中使用的PH值可以是4. 0到6. 0，以增加非肽基聚合物結(jié)合到B鏈中Wrel (1位苯丙氨酸)N-末端的比例。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，當(dāng)生理活性多肽是人胰島素或其衍生物時(shí)，步驟i)中使用的PH值可以是7. 0到10. 0，以增加非肽基聚合物結(jié)合到A鏈中Glyl (1位甘氨酸)N-末端，或B鏈中1^829(第四位賴氨酸)的比例。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，當(dāng)生理活性多肽是GLP-I或其衍生物時(shí)，步驟i)中使用的pH值可以是7. 0到10. 0，以增加非肽基聚合物結(jié)合到第34位賴氨酸的比例。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，當(dāng)生理活性多肽是GLP-2或其衍生物時(shí)，步驟i)中使用的pH值可以是7.0到10.0，以增加非肽基聚合物結(jié)合到第30位賴氨酸的比例。從而，本發(fā)明的優(yōu)選的特異性位點(diǎn)生理活性多肽結(jié)合物是將PEG連接到第27位賴氨酸上的exendin-4結(jié)合物、將PEG連接到N-末端的降鈣素結(jié)合物、將PEG連接到第27位賴氨酸或第30位賴氨酸上的胃泌酸調(diào)節(jié)素結(jié)合物或其類似物、將PEG連接到B鏈的Wrel 的N-末端、A鏈的Glyl的N-末端、或B鏈的第四位賴氨酸的人類胰島素結(jié)合物或其類似物，或?qū)EG連接到第34位賴氨酸或第30位賴氨酸的GLP-I或GLP-2結(jié)合物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面中，可以使用一種肽衍生物(或類似物)來促進(jìn)非肽基聚合物和生理活性多肽之間的特異性位點(diǎn)鍵合。衍生物指的是具有任何其他刪除的或保護(hù)的非靶向氨基酸位點(diǎn)以防止不期望的連接。例如，對(duì)于促胰島素釋放肽例如exendin，可以使用各種exendin衍生物，例如式(I)的脫-氨基-組氨?；?DA)-exendin-4 (Des-amino -histidyl (DA)-exendin-4)、式(II)的 β-羥基-咪唑丙酰基(HY)-exendin-4、式(III) 的咪唑并乙?；?exendin-4 (Imidazoacetyl (CA) -exendin-4)，以及式(IV)的二甲基-組氨酰基-exendin-4 (Dimethyl-histidyl (DM) -exendin-4)，使用但并不僅限于如下方法制備它們其中N-末端氨基酸，組氨酸的α-胺基被缺失，N-末端胺基被羥基取代、組氨酸的 N-末端α-胺基用二個(gè)甲基修飾，或者N-末端組氨酸的α-碳和其上結(jié)合的胺基被缺失從而留下咪唑并乙?；?。這樣的實(shí)例性的exendin衍生物的結(jié)構(gòu)和其制備方法記載在韓國(guó)未審查的專利公報(bào)No. 2009-0008151中，通過引用其被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備特異性位點(diǎn)生理活性多肽結(jié)合物的方法，包括步驟i)在包含特定量的醇和具有特定PH以使非肽基聚合物和生理活性多肽的靶向位點(diǎn)結(jié)合的反應(yīng)媒介中用非肽基聚合物處理生理活性多肽；及 )從步驟i)的反應(yīng)混合物中使用醇并通過離子交換色譜分離和純化生理活性多肽結(jié)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中生理活性多肽選自促胰島素釋放肽、血液因子、消化激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、甲狀腺激素、腸激素、細(xì)胞因子、酶、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)肽、促垂體激素、促垂體素、抗肥胖肽、抗病毒肽以及保持生理活性性質(zhì)的非天然肽衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中生理活性多肽選自促紅細(xì)胞生成素、GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、淀粉素、胰高血糖素、胰島素、生長(zhǎng)激素抑制素、PYY(肽YY)、 NPY (神經(jīng)肽Y)、GLP-l、GLP-2、exendin-4,胃泌酸調(diào)節(jié)素、饑餓激素、血管緊張肽、血管舒緩激肽、降鈣素、促腎上腺皮質(zhì)激素、唾液腺十一肽、胃泌素、瘦素、催產(chǎn)素、加壓素、LH(促黃體激素)、催乳素、FSH(卵泡刺激素),PTH(甲狀旁腺激素)、腸促胰液素、舍莫瑞林、hGH(人類生長(zhǎng)激素)、生長(zhǎng)激素釋放肽、G-CSFs (粒細(xì)胞集落刺激因子)、干擾素、白介素、催乳素釋放肽、促食素、甲狀腺釋放肽、縮膽囊素、胃泌素抑制肽、鈣調(diào)蛋白、胃泌素釋放肽、促胃動(dòng)素、 血管活性腸肽、ANP (心房利鈉肽)、BNP (腦鈉肽)、CNP (C型利鈉肽)、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)介肽、腎素、內(nèi)皮素、角蝰毒素肽、酪啡肽、皮啡肽、強(qiáng)啡肽、內(nèi)啡肽、蛋腦啡肽、T細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子受體、尿激酶受體、腫瘤抑制因子、膠原酶抑制劑、促胸腺生成素、 胸腺九肽、胸腺五肽、胸腺肽、胸腺體液因子、腎上腺髓質(zhì)素、咽側(cè)體抑制素、淀粉樣β蛋白片段、抗菌肽、抗氧化肽、鈴蟾肽、骨鈣素、CART肽、E-選擇素、ICAM-1、VCAM-1、白細(xì)胞激肽、 kringle-5、層粘連蛋白、抑制素、甘丙肽、纖連蛋白、胰抑制素和恩夫韋地。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中生理活性多肽是exendin、胰島素、GLP-l、GLP-2、 胃泌酸調(diào)節(jié)素、饑餓激素、降鈣素或其一種衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中衍生物是具有選自式(I)到(IV)的任意結(jié)構(gòu)的 exendin、胃泌酸調(diào)節(jié)素、GLP-I或GLP-2的衍生物
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中非肽基聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基多醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物如PLA(聚(乳酸))和PLGA(聚乳乙醇酸)、脂類聚合物、幾丁質(zhì)透明質(zhì)酸及其組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟i)和ii)中使用的醇是具有1到10個(gè)碳數(shù)目的伯醇、仲醇或叔醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中醇是乙醇或異丙醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中基于反應(yīng)媒介的總量，反應(yīng)媒介中醇的存在量為 35%到60%體積份。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中當(dāng)生理活性多肽是exendin或其衍生物時(shí)，步驟 i)中所用的PH值為7.0到10.0。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中當(dāng)生理活性多肽是胃泌酸調(diào)節(jié)素或其衍生物時(shí)，步驟i)中所用的PH值為7. 0到10. 0。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中當(dāng)生理活性多肽是人類胰島素或其衍生物時(shí)，步驟i)中所用的PH值為4. 0到10. 0。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中當(dāng)生理活性多肽是GLP-I或其衍生物時(shí)，步驟i) 中所用的PH值為7.0到10.0。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中當(dāng)生理活性多肽是GLP-2或其衍生物時(shí)，步驟i) 中所用的PH值為7.0到10.0。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中特異性位點(diǎn)生理活性多肽結(jié)合物是PEG連接到第27位賴氨酸上的exendin-4結(jié)合物、PEG連接到N-末端上的降鈣素結(jié)合物、PEG連接到第27位賴氨酸或第30位賴氨酸上的胃泌酸調(diào)節(jié)素結(jié)合物、PEG連接到A鏈的Glyl的N-末端上或B-鏈的第四位賴氨酸上的人類胰島素結(jié)合物、PEG連接到第34位賴氨酸位或第30 位賴氨酸上的GLP-I或GLP-2結(jié)合物，或其類似物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在一種醇和特定pH的存在下，用非肽基聚合物處理生理活性多肽，以高產(chǎn)率制備特異性位點(diǎn)生理活性多肽結(jié)合物的方法，其可望用于開發(fā)具有高體內(nèi)活性和明顯延長(zhǎng)的血液半衰期的各種肽類藥物的長(zhǎng)效制劑。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102369209SQ201080012890
公開日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2010年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者宋大海, 樸榮敬, 權(quán)世昌, 李寬淳, 李才敏, 申載熙 申請(qǐng)人:韓美控股株式會(huì)社