檢測棉花輪紋斑病的試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測棉花輪紋斑病的試劑盒，所述試劑盒為PCR檢測試劑盒，包括以下引物：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，并提供了使用上述試劑盒的棉花輪紋斑病的檢測方法。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的檢測棉花輪紋斑病的試劑盒及檢測方法，與現有技術相比，具有操作簡單、靈敏、快速的特點，能夠對棉花輪紋斑病進行診斷及預測。
【專利說明】
檢測棉花輪紋斑病的試劑盒及檢測方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及農作物病害檢測技術領域，具體涉及檢測棉花輪紋斑病的試劑盒及檢 測方法。
【背景技術】
[0002] 棉花輪紋斑?。ˋlternaria leaf spot ,Black leaf spot)又稱黑斑病、腰折病， 多發(fā)生于幼苗期的子葉及成株期的葉片，是棉花葉部病害中分布最廣、危害最嚴重的一種 毀滅性病害。近年來，該病害在我國主三大棉區(qū)均有發(fā)生，尤其在北方棉區(qū)陰濕多雨的年份 極易大面積爆發(fā)，嚴重時葉片全部脫落、植株枯死，造成重大的經濟損失。
[0003] 棉花輪紋斑病是一種侵染性真菌病害，多發(fā)生于幼苗期子葉和成株期的葉片，是 棉花葉部病害中分布最廣、危害最大、流行頻率最高的一種毀滅性病害。其致病菌屬于半知 菌亞門（Duteromyccotina)，絲抱綱（Hyphomyceies)，絲抱目（Hyphomycetoles)，鏈格抱屬 (Alternaria spp.)。病原菌以分生孢子在病葉、病莖上越冬，在棉籽和短絨上也能越冬，研 究發(fā)現棉籽帶菌率達47.5%~84%。帶菌棉籽及田間病殘體是初侵染源，病原菌主要通過氣 流傳播，一般多經傷口入侵，也可直接入侵，先侵染子葉，再產生分生孢子，在田間多次再侵 染。棉花輪紋斑病多在溫暖潮濕環(huán)境下發(fā)生，尤其在苗期1~2片真葉期遇見寒流陰雨天氣， 容易大面積發(fā)生。棉花生長中后期，田間管理不當，植株衰弱，也容易發(fā)病。
[0004] 棉花輪紋斑病鑒定現主要通過傳統的病原真菌分類鑒定:首先從病葉上分離、培 養(yǎng)、純化獲得真菌菌株，然后對所有菌株進行致病性鑒定，從中找到可以引起棉花輪紋斑病 的致病菌株，并對菌落形態(tài)、分生孢子和分生孢子梗等形態(tài)進行形態(tài)學鑒定。該方法費用 高、時間長、操作復雜，且鏈格孢屬的形態(tài)指標易受培養(yǎng)基、溫濕度、光質光強等環(huán)境條件的 影響，表現出極大的變異性，鑒定受環(huán)境影響較大，現有技術無法實現對棉花輪紋斑病的快 速、準確的檢測。
[0005] rDNA序列分析： 核糖體由幾十種蛋白質和rDNA組成。編碼rRNA的基因（稱為rRNA基因或rDNA)是基因組 DNA中的中等重復、并有轉錄活性的基因家族。rDNA-般由轉錄區(qū)和非轉錄區(qū)構成。轉錄區(qū) 包括55、5.88、185、283汕嫩，其中185、5.85和283汕嫩基因組成一個轉錄單元，它們之間 有內轉錄間隔區(qū)ITS(internal transcribed space，ITS)相隔，包括 18S rDNA與5.8S rDNA 之間的ITSl，5.8S rDNA與28S rDNA之間的ITS2;相鄰的兩個重復單元之間由基因內間隔區(qū) IGS(intergenic spacer)隔開。5S、18S、5.8S、28S rDNA基因序列進化緩慢而相對保守，可 在屬、科、目水平上用于不同生物種的比較，而內轉錄區(qū)（ITS)進化較快，常用于屬內種間比 較或種內群體比較。rDNA的ITS區(qū)序列分析己被認為是目前進行真菌種間分類及種內分型 最可靠的方法之一。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種主要目的在于能夠快 速、準確檢測棉花輪紋斑病的檢測試劑盒及檢測方法。
[0007] 為了實現上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為:檢測棉花輪紋斑病的試劑盒，所述 試劑盒為PCR檢測試劑盒，包括以下引物:SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2。
[0008] 進一步的，上述的檢測棉花輪紋斑病的試劑盒，所述引物為濃度ΙΟμΜ的溶液。
[0009] 進一步的，上述的檢測棉花輪紋斑病的試劑盒，所述試劑盒還包括無菌去離子水、 含]\%2+的10\?0?13肚€61、濃度為0.251111的(1犯1 3，濃度為5 1]/^1的了39〇嫩聚合酶。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的是提供了棉花輪紋斑病的檢測方法，包括如下步驟： 1) 將提取的待檢測目標的DNA進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，PCR反應溶液中的上下 游引物的核苷酸序列為：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2; 2) 將步驟1)得到的PCR擴增產物與溴酚藍上樣緩沖液混勻，用瓊脂糖凝膠電泳分離，得 到電泳分離后的PCR擴增產物； 3) 將步驟2)得到的電泳分離后的PCR擴增產物經Go IdView DNA染料染色后在紫外凝膠 成像系統下觀察，出現特異性片段大小為218 bp，則待測目標有棉花輪紋葉斑病。
[0011] 進一步的，上述的棉花輪紋斑病的檢測方法，所述步驟1)中的PCR反應溶液由如下 組分組成:含Mg2+的10 XPCR buffer 1.0 μL，濃度為0.25 mM的dNTP ΙμL，濃度為5 U/μΙ的 TaqDNA聚合酶0.2μ1，濃度為10μΜ的上下游引物溶液各0.25μ1，無菌去離子水補齊至10μ1。
[0012] 進一步的，上述的棉花輪紋斑病的檢測方法，所述步驟1)中的PCR反應過程具體如 下：94 cC 5 min;94 cC 45 sec，52 cC 45sec，72 cC 45sec，35個循環(huán)；72 cC 5 min。
[0013] 進一步的，上述的棉花輪紋斑病的檢測方法，所述步驟2)中的電泳過程具體如下： 將5μ1 PCR產物與ΙμL溴酚藍上樣緩沖液混勻，用1.0%(重量/體積，即g/ml)瓊脂糖凝膠電泳 分咼。
[0014] 進一步的，上述的棉花輪紋斑病的檢測方法，所述步驟3)中，待測目標的DNA提取 步驟如下： a) 剪取待測棉花葉片0.2 g，在研缽中加入液氮充分研磨，研磨好的材料轉入2 ml EP 管中，加入I ml提取緩沖液渦旋混勻，冰浴靜置10min，10000 rpm、4°C離心20 min，棄上清， 得到沉淀； b) 向步驟a)得到的沉淀中加入0.8 ml 65°C預熱的裂解緩沖液，并用銅絲攪松，渦旋混 勻，65°C 水浴 30min; c) 加入0.8 ml氯仿-異戊醇混合液，所述氯仿-異戊醇混合液中按照體積比氯仿:異戊 醇為24:1，翻轉50次以上，10000rpm、15°C離心20min，將上清轉入2 ml的離心管中，加入預 冷的異丙醇，異丙醇的加入比例為按照體積比上清:異丙醇為5:3,緩慢翻轉30次，混勻，靜 置IOmin，1000 Orpm，室溫離心10min，棄上清，于沉淀中加入I ml 70%的乙醇洗滌，并轉入 1.5 ml的離心管中，1000 Orpm離心5min，倒掉上清液，通風干燥20min; d) 加2 ml TE緩沖液溶解，65°C培養(yǎng)10~30min，加等體積的氯仿-異戊醇混合液，緩慢 翻轉50次，混勾，室溫靜置5min，1000 Orpm離心10min; e) 上清液轉入5ml離心管中，加 pH 5.2的3M醋酸鈉，醋酸鈉的加入比例為按照體積比上 清:醋酸鈉為10:1，加等體積的異丙醇后翻轉30次，放置30min，1000 Orpm離心5min，棄上清 液，加 I ml 70%乙醇洗DNA小團，轉入1.5 ml的離心管中，1000 Orpm離心5min。棄上清液，自 然通風干燥DNA沉淀； f)用TE緩沖液溶解DNA，調整DNA濃度至50 ng/μL并保存?zhèn)溆茫鯰E緩沖液組成為 IOmM 、PH 8.0的Tris/HCl，lmM 、PH 8.0的EDTA，PH 8.0。
[0015]進一步的，上述的棉花輪紋斑病的檢測方法，所述步驟a)中，每100ml DNA提取緩 沖液的配制組成為：〇.351葡萄糖6.9368,0.謂1^8.!1(：110.〇1111，51111恥上0了厶1.〇1111，2% PVP 20.0ml，體積比 1%的β-Me 1.0ml，dd水 68.0ml。
[0016] 進一步的，上述的棉花輪紋斑病的檢測方法，所述步驟b)中，每100mL裂解緩沖液 的配制組成為：1.4M NaCl 8.1816g，0.1M Tris.HCl 10.0ml，20mM Na.EDTA 4.0ml，2%CTAB 20.0ml，2% PVP 20.0ml，體積比 1%的β-Me 1.0ml，dd水 45.0ml。
[0017] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供的檢測棉花輪紋斑病的試劑盒及檢測方法，與 現有技術相比，具有操作簡單、靈敏、快速的特點，能夠對棉花輪紋斑病進行診斷及預測。
【附圖說明】
[0018] 圖1為棉花輪紋斑病檢測結果的凝膠電泳圖。
[0019]其中，1-5泳道為實驗田中感染棉花輪紋斑病的棉花葉片檢測結果，6泳道為陰性 對照。
[0020]圖2為棉花輪紋斑病典型發(fā)病葉片病斑所提取DNA與正常葉片的對比凝膠圖。
[0021 ]其中，1-5泳道為棉花輪紋斑病典型發(fā)病葉片病斑所提取DNA，6泳道為健康葉片提 取 DNA。
【具體實施方式】 [0022] 實施例1: 棉花輪紋斑病檢測試劑盒，該試劑盒為PCR試劑盒，該試劑盒包括上游引物和下游引 物，其中 上游引物5: TGAAGAACGC AGCGAAAT -3' 下游引物5'- GCTCCGAAAC CAGTAGGC -3'。
[0023]該試劑盒中的上下游引物對棉花輪紋斑病DNA擴增的特異性片段大小為218 bp。 經GoldView DNA染料染色后在紫外凝膠成像系統下觀察即可做出準確判斷。
[0024] 試劑盒中的各組成部分具體如下，其中上游引物和下游引物的溶液的濃度為10μ M，含Mg2+的10 X PCR buffer，濃度為0.25mM的dNTP，濃度為5 U/μΙ的TaqDNA聚合酶和無菌去 咼子水。
[0025] 棉花輪紋斑病的檢測方法，是通過上述試劑盒實現的，具體包括如下步驟： 1) 將提取的待檢測目標的DNA進行PCR擴增； 2) 將PCR擴增產物與溴酚藍上樣緩沖液混勻，用瓊脂糖凝膠電泳分離； 3 )將電泳分離后的PCR擴增產物經Go I dVi ew DNA染料染色后在紫外凝膠成像系統下觀 察，出現特異性片段大小為218 bp，則待測目標有棉花輪紋葉斑??； 其中PCR反應溶液中的上下游引物的核苷酸序列如下， 上游引物5: TGAAGAACGC AGCGAAAT -3' 下游引物5'- GCTCCGAAAC CAGTAGGC -3'。
[0026] PCR反應溶液的具體組成如下:含Mg2+的10 XPCR buffer 1.0 μL，濃度為0.25 mM 的dNTP ΙμL，濃度為5 υ/μL的TaqDNA聚合酶0.2 μL，濃度為10 μΜ的上下游引物溶液各0.25 μL，無菌去離子水補齊至?〇μ1。
[0027] PCR反應過程具體如下：94 cC 5 min;94 cC 45 sec，52 cC 45sec，72 cC 45sec， 35個循環(huán);72 °C 5 min。
[0028] 電泳過程具體如下：將5 μL PCR產物與I μL溴酚藍上樣緩沖液混勻，用1.0%(g/ ml)瓊脂糖凝膠電泳分離。
[0029]待測目標的DNA提取步驟如下： a) 剪取待測棉花葉片0.2 g，在研缽中加入液氮充分研磨，研磨好的材料轉入2 ml EP 管中，加入1ml提取緩沖液(配方見表1)渦旋混勻，冰浴靜置10 min，l 0000 rpm離心20 min (4 °C)，棄上清，DNA提取緩沖液配方如表1所示； 表1
b) 向沉淀中加入0.8 ml 65°C預熱的裂解緩沖液(配方見表2)，并用銅絲攪松，渦旋混 勻，65 °C水浴30 min，裂解緩沖液配方如表2所示； 表2
c) 加入0.8 ml氯仿:異戊醇(24:1)混合液，翻轉50次以上，1000 Orpm離心20min( 15°C)， 將上清轉入2 ml的離心管中，加 O . 6體積的預冷的異丙醇，緩慢翻轉30次，混勻，靜置10 min，10000 rpm，離心10 min(室溫），棄上清，于沉淀中加入I ml 70%的乙醇洗滌，并轉入 1.5 ml的離心管中，10000 rpm離心5 min。倒掉上清液，通風干燥20 min; d) 加2 ml TE緩沖液溶解，65°C培養(yǎng)10~30min，加等體積的氯仿：異戊醇（24:1)，緩慢 翻轉50次，混勾，室溫靜置5 min，10000 rpm離心10 min; e) 上清液轉入5 ml離心管中，加0.1體積的3 M醋酸鈉 (pH 5.2)，加等體積的異丙醇后 翻轉30次，放置30 min，10000 rpm離心5 min。棄上清液，加 I ml 70%乙醇洗DNA小團，轉入 1.5 ml的離心管中，10000 rpm離心5 min。棄上清液，自然通風干燥DNA沉淀； f) 用TE緩沖液（10 mM Tris/HC1(PH 8.0)，1 mM EDTA(PH 8·0)，ΡΗ 8.0)溶解DNA，調整 DNA濃度至50 ng/μL并保存?zhèn)溆谩?br>[0030]最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可 以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的 保護范圍之內。 序列表 〈11〇>新疆農墾科學院 〈120>檢測棉花輪紋斑病的試劑盒及檢測方法 <210> 1 <211> 18 <212> DNA 〈213>上游引物 <400> 1 tgaagaacgc agcgaaat 18 <210> 1 <211> 18 <212> DNA 〈213>下游引物 〈400> 2 getccgaaac cagtaggc 18
【主權項】
1. 檢測棉花輪紋斑病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為PCR檢測試劑盒，包括以下 引物：SEQ ID N0.1 和SEQ ID N0.2。2. 根據權利要求1所述的檢測棉花輪紋斑病的試劑盒，其特征在于，所述引物為濃度10 μΜ的溶液。3. 根據權利要求1所述的檢測棉花輪紋斑病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括 無菌去離子水、含Mg2+的10 X PCR buf f er、濃度為0.25mM的dNTP，濃度為5 U/μΙ的TaqDNA聚 合酶。4. 棉花輪紋斑病的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 將提取的待檢測目標的DNA進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，PCR反應溶液中的上下 游引物的核苷酸序列為：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2; 2) 將步驟1)得到的PCR擴增產物與溴酚藍上樣緩沖液混勻，用瓊脂糖凝膠電泳分離，得 到電泳分離后的PCR擴增產物； 3) 將步驟2)得到的電泳分離后的PCR擴增產物經GoldView DNA染料染色后在紫外凝膠 成像系統下觀察，出現特異性片段大小為218 bp，則待測目標有棉花輪紋葉斑病。5. 根據權利要求4所述的棉花輪紋斑病的檢測方法，其特征在于，所述步驟1)中的PCR 反應溶液由如下組分組成：含Mg2+的10XPCR buffer 1.0 μL，濃度為0.25 mM的dNTP ΙμL， 濃度為5 U/μΙ的TaqDNA聚合酶0.2μ1，濃度為ΙΟμΜ的上下游引物溶液各0.25μ1，無菌去離子 水補齊至?〇μ1。6. 根據權利要求4所述的棉花輪紋斑病的檢測方法，其特征在于，所述步驟1)中的PCR 反應過程具體如下：94 °C 5 min;94 °C 45 sec，52 °C 45sec，72 °C 45sec，35個循環(huán)；72 °C 5 min〇7. 根據權利要求4所述的棉花輪紋斑病的檢測方法，其特征在于，所述步驟2)中的電泳 過程具體如下:將5μ1 PCR產物與?μL溴酚藍上樣緩沖液混勻，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離。8. 根據權利要求4所述的棉花輪紋斑病的檢測方法，其特征在于，所述步驟3)中，待測 目標的DNA提取步驟如下： a) 剪取待測棉花葉片0.2 g，在研缽中加入液氮充分研磨，研磨好的材料轉入2 ml ΕΡ 管中，加入1 ml提取緩沖液渦旋混勻，冰浴靜置10min，10000 rpm、4°C離心20 min，棄上清， 得到沉淀； b) 向步驟a)得到的沉淀中加入0.8 ml 65°C預熱的裂解緩沖液，并用銅絲攪松，渦旋混 勻，65°C 水浴 30min; c) 加入0.8 ml氯仿-異戊醇混合液，所述氯仿-異戊醇混合液中按照體積比氯仿：異戊 醇為24:1，翻轉50次以上，10000rpm、15°C離心20min，將上清轉入2 ml的離心管中，加入預 冷的異丙醇，異丙醇的加入比例為按照體積比上清:異丙醇為5:3,緩慢翻轉30次，混勻，靜 置lOmin，lOOOOrpm，室溫離心10min，棄上清，于沉淀中加入1 ml 70%的乙醇洗滌，并轉入 1.5 ml的離心管中，lOOOOrpm離心5min，倒掉上清液，通風干燥20min; d) 加2 ml TE緩沖液溶解，65°C培養(yǎng)10~30min，加等體積的氯仿-異戊醇混合液，緩慢 翻轉50次，混勾，室溫靜置5min，lOOOOrpm離心10min; e) 上清液轉入5ml離心管中，加 pH 5.2的3M醋酸鈉，醋酸鈉的加入比例為按照體積比上 清:醋酸鈉為10:1，加等體積的異丙醇后翻轉30次，放置30min，lOOOOrpm離心5min，棄上清 液，加1 ml 70%乙醇洗DNA小團，轉入1.5 ml的離心管中，lOOOOrpm離心5min; 棄上清液，自然通風干燥DNA沉淀； f)用TE緩沖液溶解DNA，調整DNA濃度至50 ng/μL并保存?zhèn)溆?，所述TE緩沖液組成為 10mM 、PH 8.0的Tris/HCl，lmM 、PH 8.0的EDTA，PH 8.0。9. 根據權利要求8所述的棉花輪紋斑病的檢測方法，其特征在于，所述步驟a)中，每 100ml DNA提取緩沖液的配制組成為：0.35M 葡萄糖6.936g，0.1M Tris.HCl 10.0ml，5mM 恥』〇了厶1.〇1111，2%?￥?2〇.〇1111，體積比1%的0-]^1.〇1111，(1(1水68.〇1111。10. 根據權利要求8所述的棉花輪紋斑病的檢測方法，其特征在于，所述步驟b)中，每 100ml 裂解緩沖液的配制組成為：1.4M NaCl 8.1816g，0.1M Tris.HCl 10.0ml，20mM 恥』〇了厶4.〇1111，2%〇^8 2〇.〇1111，2%?￥?2〇.〇1111，體積比1%的0-]^1.〇1111，(1(1水45.〇1111。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086217SQ201610674978
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月16日 公開號201610674978.5, CN 106086217 A, CN 106086217A, CN 201610674978, CN-A-106086217, CN106086217 A, CN106086217A, CN201610674978, CN201610674978.5
【發(fā)明人】孔憲輝, 田琴, 余渝, 陳紅, 劉麗, 王娟, 王旭文, 司愛君, 王方永
【申請人】新疆農墾科學院