一種低溫溶磷中華根瘤菌及其菌劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種低溫溶磷中華根瘤菌及其菌劑，菌種名稱為ATHC?2，分類命名為中華根瘤菌屬Sinorhizobium sp.，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.10651，保藏日期為：2015年3月20日，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。本發(fā)明所述菌株ATHC?2能夠耐受低溫對其生長的影響，且具有較強溶磷活性。通過施用耐低溫根瘤菌劑緩解低溫脅迫對農業(yè)生產中大豆結瘤固氮的影響，提高土壤肥力，減少化肥使用量，提高大豆等農作物產量與品質。CGMCC No. 1065120150320
【專利說明】
一種低溫溶磷中華根瘤菌及其菌劑
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于種植業(yè)與肥料相關領域，涉及一種低溫溶磷中華根瘤菌及其菌劑。
【背景技術】
[0002] 我國農業(yè)生產長期以來采用高投入高產出的發(fā)展模式，導致農業(yè)生產對化學肥料 嚴重依賴?；瘜W肥料的大量使用不僅增加農業(yè)生產成本，而且易于引起土壤板結，造成農作 物減產。大量未被利用的氮、磷、鉀等養(yǎng)分隨降雨進入到地下水與江河等生態(tài)環(huán)境中，導致 江河水體富營養(yǎng)化，生態(tài)失衡與環(huán)境污染，對農業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成威脅。
[0003] 生物固氮具有提高作物產量，培肥土壤維持生態(tài)系統(tǒng)平衡的作用，豆科植物與根 瘤菌共生體固氮能力很強，是大豆氮素的重要來源之一。根瘤菌與豆科植物共生體系具有 很強的固氮能力。豆科植物與根瘤菌形成共生固氮體系，占生物固氮量的65%以上，它為豆 科植物提供生長必須氮素營養(yǎng)，增加了作物產量、改善作物品質。豆科植物接種高效固氮根 瘤菌能夠減少氮肥使用量，從而降低生產成本增加農民收入，有助于減少大量使用化肥帶 來的環(huán)境污染風險。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于通過分離我國高煒度低溫區(qū)大豆根瘤菌，研究其低溫條件下結 瘤固氮能力，通過制備耐低溫根瘤菌劑緩解低溫脅迫對農業(yè)生產中大豆結瘤固氮的影響， 提高土壤肥力，減少化肥使用量，提高大豆等農作物產量與品質。
[0005] 本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術方案如下：
[0006] -種低溫溶磷中華根瘤菌，菌種名稱為ATHC-2,分類命名為中華根瘤菌屬 Sinorhizobium sp.，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號 為CGMCC No.10651，保藏日期為：2015年3月20日，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號。
[0007] 含有上述低溫溶磷中華根瘤菌的生物菌劑，在含有菌株ATHC-2的發(fā)酵液中添加體 積百分比為1-5%羧甲基纖維素，制得有效活菌數(shù)量達到2-5億個/毫升的液體菌劑。
[0008] 含有上述低溫溶磷中華根瘤菌的生物菌劑粉末，將權利要求2所述的液體菌劑經 低溫冷凍干燥制得粉末菌劑，其有效活菌數(shù)量達到1-2億個/克。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：
[0010] 1.本發(fā)明所述根瘤菌ATHC-2革蘭氏陰性（G-)，能夠在Pikovskays's培養(yǎng)基和 NBRIP培養(yǎng)基生長，具有較強溶磷活性。
[0011 ] 2.本發(fā)明所述根瘤菌ATHC-2能夠在4 °C，7 °C和15 °C條件下在YMA培養(yǎng)基生長，能夠 耐受低溫對其生長的影響。7 °C和15°C培養(yǎng)條件下，菌株ATHC-2在Ashby無氮固體培養(yǎng)基上 能夠正常生長，表明菌株ATHC-2能夠在低溫下固氮酶保持活性，有利于防范低溫對農業(yè)生 長造成的危害。
[0012] 3.溫室盆栽試驗和田間小區(qū)實驗結果表明，接種權利要求書2所述菌劑能夠增加 供試大豆根系結瘤數(shù)量，提高大豆地下部與地上部生物量，顯著增加供試大豆產量。
[0013] 4.本發(fā)明所述菌株ATHC-2能夠耐受低溫對其生長的影響，且具有較強溶磷活性。 溫室盆栽試驗與田間小區(qū)實驗結果表明，與不施用氮肥組及施用50%氮肥組相比，添加本 發(fā)明所述菌劑能夠增加供試大豆根系結瘤數(shù)量，提高大豆地下部與地上部生物量，顯著增 加供試大豆產量。該菌劑的使用有助于緩解低溫對我國高煒度低溫區(qū)大豆等農作物生產的 不利影響。通過制備耐低溫根瘤菌劑緩解低溫脅迫對農業(yè)生產中大豆結瘤固氮的影響，提 高土壤肥力，減少化肥使用量，提高大豆等農作物產量與品質。
【附圖說明】
[0014] 圖1為施用本發(fā)明的菌劑對供試大豆品種（黑河68)不同器官生物量的影響，圖中 不同小寫字母表示各處理間差異顯著(p〈〇.05);
[0015] 圖2為施用本發(fā)明的菌劑對供試大豆品種(科豐6)不同器官生物量的影響，圖中不 同小寫字母表示各處理間差異顯著(p〈〇.05)。
【具體實施方式】
[0016] 下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明方法。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術 手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā) 明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背 離本發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改 動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0017] -種低溫溶磷中華根瘤菌，篩選及鑒定過程如下：
[0018] 本發(fā)明菌株ATHC-2分離自吉林省延吉市安圖縣大豆根瘤。將實地采集大豆新鮮根 瘤，放置與無菌離心管中迅速帶回實驗室，通過無菌水大量沖洗去除根瘤表面附著泥土，加 95 %乙醇浸泡2-3min后，加入70 %乙醇浸泡5min，棄去乙醇加入3 %次氯酸鈉浸泡6min，棄 去次氯酸鈉溶液，大量無菌水沖洗4-5次。將表面消毒后根瘤在準備好的YMA培養(yǎng)基上擠碎 涂布，28 °C培養(yǎng)3-7d，設置無菌水沖洗液對照。將YMA培養(yǎng)基上長出菌落，通過形態(tài)觀察挑選 與根瘤菌菌落形態(tài)特征相似菌落通過平板劃線法分離純化，挑選單菌落進行斜面與甘油管 保藏待用。通過形態(tài)學和16S rDNA序列分析鑒定結果表明，菌株ATHC-2屬于中華根瘤菌屬 (Sinorhizobium sp.)，現(xiàn)保藏于：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保 藏號為CGMCC No. 10651，保藏日期為：2015年3月20日，分類命名為中華根瘤菌屬 (Sinorhizobium sp.)，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0019] 本發(fā)明通過分離篩選到的耐低溫溶磷中華根瘤菌(Sinorhizobium sp.)，ATHC_2， 實驗室生理生化特性研究表明，菌株ATHC-2能夠在Pikovskays ' s培養(yǎng)基和NBRIP培養(yǎng)基生 長，具有較強溶磷活性。低溫脅迫試驗結果表明，菌株ATHC-2能夠在4°C_15°C低溫條件下正 常生長，且能夠保持固氮酶活性。溫室盆栽試驗及田間小區(qū)實驗結果表明，接種含有ATHC-2 的菌劑能夠增加供試大豆根系結瘤數(shù)量，提高大豆地下部與地上部生物量，顯著增加供試 大豆產量。
[0020]本發(fā)明還提供一種含有上述低溫溶磷中華根瘤菌的固體生物菌劑，制作方法如 下:通過添加羧甲基纖維素（1 % -5 % v/v)制得含有菌株ATHC-2有效活菌數(shù)量達到2-5億個/ 毫升，液體制劑經真空低溫冷凍干燥法制得，制成品體積小，質量輕，便于運輸保存，其有效 活菌數(shù)量達到1-2億個/克。
[0021]本發(fā)明還提供一種液體根瘤菌劑的制備方法，大豆根瘤菌Sinorhizobium sp.ATHC-2的活化，將-80°C甘油保藏根瘤菌菌種在超凈工作臺中室溫融化，用移液槍吸取 融化后菌液1〇〇μ1，滴加于250ml三角瓶中的無菌液體TY培養(yǎng)基，置于搖床中28°C，180rpm條 件下培養(yǎng)48h。吸取活化后菌液100μΙ，分別滴加與三只準備好的無菌YMA平板，恒溫培養(yǎng)箱 中28°C培養(yǎng)3d，待菌落形成，采用劃線法與常規(guī)染色檢測菌株純度與活性。
[0022]通過鏡檢確定菌株ATHC-2純度后，吸取上述TY培養(yǎng)基菌株培養(yǎng)液，按1 %接種量接 種于3瓶500ml滅菌后冷卻至室溫TY培養(yǎng)基，28°C，180rpm條件下培養(yǎng)72h，將菌液無菌條件 下轉移至滅菌后50ml離心管中，離心法收集菌體（10000rpm，10min)，重復上述操作。將收集 到的菌體加入無菌水反復震蕩洗滌三次，離心棄去上清液，加入0.9 %無菌生理鹽水，震蕩 后懸浮所得菌體備用。無菌條件下吸取上述懸浮液4ml，測定其600nm下吸光度，同時進行梯 度稀釋平板法檢測活菌數(shù)量。通過上述制備過程得菌液添加粘附劑甲基纖維素（1%-5%ν/ v)濃縮制得不同規(guī)格的液體制劑密封包裝，有效活菌數(shù)量達到2-5億個/毫升。
[0023]菌劑的使用方法為:液體菌劑稀釋50-100倍，浸泡植物種子0.5-1小時后播種。固 體制劑按1:20比例溶解于水中，浸泡種子0.5-1小時后播種。
[0024] 本發(fā)明篩選的菌及制備的菌劑的相關特性試驗如下：
[0025] -、試驗處理
[0026] 溫室盆栽與田間小區(qū)實驗處理：
[0027]⑴未接菌對照組(盆栽）；
[0028]⑵添加菌劑ATHC-2組(盆栽）；
[0029] (3)不施用氮肥組（田間）；
[0030] ⑷施用50 %氮肥組（田間）；
[0031] (5)不施用氮肥添加菌劑ATHC-2組（田間）。
[0032] 每個處理設5個重復。上述處理分別在溫室盆栽和田間小區(qū)完成。其中人工氣候室 培養(yǎng)條件為：日光照時長為14h，黑夜時長10h，白晝時段溫度為26 ± 2°C，黑夜時段溫度為20 ± 2 °C，濕度為 60 %-70 %。
[0033] 1.根瘤菌ATHC-2溶解無機磷酸鹽試驗
[0034] 菌株ATHC-2溶磷試驗采用添加 0 · 5 %磷酸三鈣的Pikovskays ' s培養(yǎng)基和NBRIP培 養(yǎng)基（Γ1: : glucose，10g:Ca3(P04)2,5g;MgC12W6H20,5g;MgS047H20,0.25g ;KCl，0.2g; (NH4)2S04,0. lg;瓊脂粉15g)。配制上述培養(yǎng)基分裝于250ml三角瓶中每瓶100ml，121°C， 30min滅菌室溫冷卻后滴加，對數(shù)期菌種懸液(0D6m = 1.0)。30 °C，培養(yǎng)3d，7d后觀察記錄。每 組實驗設3個重復。
[0035] 2.根瘤菌ATHC-2低溫生長與固氮試驗
[0036] 接種對數(shù)期菌株ATHC-2于YMA固體平板，4 °C和7 °C下連續(xù)培養(yǎng)，分別于3d和7d觀察 生長情況并記錄。將菌株ATHC-2接種于Ashby無氮固體培養(yǎng)基，4°C，7°C和15°C下連續(xù)培養(yǎng)， 分別于3d和7d觀察生長情況并記錄。
[0037] 3.溫室條件下接種根瘤菌ATHC-2試驗
[0038]挑選飽滿健全大豆品種:科豐6號和黑河68各約100粒，以無菌水沖洗去種子所帶 泥土，自來水漂洗去掉泥土，3%NaC10表面消毒15min，無菌水漂洗5次。將表面消毒后種子 浸泡于稀釋100倍的菌體懸浮液中，置于恒溫培養(yǎng)箱28°C，培養(yǎng)lh。分別撈出兩種大豆種子， 室溫陰干后播種。以無菌水浸泡作為對照組。溫室大棚培養(yǎng)30d取樣收獲。
[0039] 5.田間小區(qū)實驗
[0040]通過拌種法接種權利要求書2中所述菌劑，在天津濱海新區(qū)中塘鎮(zhèn)南臺村開展田 間小區(qū)實驗。供試大豆品種:科豐6號，試驗小區(qū)采用隨機區(qū)組設計方法，小區(qū)面積約6500平 方米。試驗密度:40萬株/公頃。播種方法:人工開溝單粒點播，人工覆土鎮(zhèn)壓。收獲方法:去 邊行全區(qū)人工收獲，人工脫粒，淸雜去水后統(tǒng)計地上部與地下部生物量，產量等指標。
[0041 ]通過對本發(fā)明所述菌劑實驗室生理特性研究表明，菌株ATHC-2能夠耐受低溫對其 生長的影響，且具有較強溶磷活性，有利于防范我國北方地區(qū)低溫對農業(yè)生長造成的危害。 溫室盆栽試驗與田間小區(qū)實驗結果表明，與不施用氮肥組及施用50%氮肥組相比，添加本 發(fā)明所述菌劑能夠增加供試大豆根系結瘤數(shù)量，提高大豆地下部與地上部生物量，顯著增 加供試大豆產量。該菌劑的使用有助于緩解低溫對我國高煒度低溫區(qū)大豆等農作物生產的 不利影響。通過制備耐低溫根瘤菌劑緩解低溫脅迫對農業(yè)生產中大豆結瘤固氮的影響，提 高土壤肥力，減少化肥使用量，提高大豆等農作物產量與品質。
[0042]二、結果與分析
[0043] 1.菌株ATHC-2溶磷特征分析
[0044] 菌株ATHC-2能夠在Pikovskays ' s培養(yǎng)基NBRIP培養(yǎng)基生長，通過30°C，3d和7d培養(yǎng) 結果表明，菌株G1能夠在上述兩種添加難溶性無機磷酸鹽的培養(yǎng)基中正常生長，且溶磷活 性顯示為陽性，表明菌株G1具有溶解難溶性無機磷酸鹽的能力。
[0045] 2.菌株低溫生長與固氮研究
[0046] 通過YMA培養(yǎng)基在4°C，7°C和15°C條件下生長與固氮研究結果表明，菌株ATHC-2能 夠在7 °C和15 °C條件下在YMA培養(yǎng)基正常生長，而在4 °C條件下長勢較弱。7 °C和15 °C培養(yǎng)條 件下，菌株ATHC-2在Ashby無氮固體培養(yǎng)基上能夠正常生長，表明菌株ATHC-2能夠在低溫下 固氮。
[0047] 3.添加根瘤菌對不同品種大豆生物量的影響
[0048] ⑴通過溫室盆栽試驗研究添加 ATHC-2菌劑對兩種大豆不同器官生物量的影響。結 果表明，添加 ATHC-2菌劑能夠增加供試大豆黑河68根系，莖，葉片和豆莢干重，其中根，莖和 豆莢與對照比達顯著水平(P〈〇.05)。與未接菌對照相比，添加 ATHC-2能夠顯著增加供試大 豆科豐6號根，莖和葉片生物量(p〈0.05)。如圖1，2所示。
[0049] ⑵田間小區(qū)實驗結果表明。添加 ATHC-2菌劑能夠增加供試大豆根系結瘤數(shù)量，提 高大豆地下部與地上部生物量，顯著增加供試大豆產量。如表1，2所示。
[0050] 表1田間小區(qū)實驗處理大豆鮮重、干重及收獲物干重表(單位:g)
[0051]
[0052] 注:0 % N為不施用氮肥組;50 % N為施用50 %氮肥組；
[0053] 表2添加 ATHC-2菌劑對大豆株高及產量影響
[0054]
[0055] 注:0 % N為不施用氮肥組;50 % N為施用50 %氮肥組·
[0056] ATHC-2的 16S rDNA序列如下：
[0057] GGGCGGCAGGCTTACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTA CCCTTTTCTACGGAATAACGCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGAGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGGAAA GGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGG ATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGC GCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATG ACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGG AATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATTGTTAAGTGAGGGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCC TTTCATACTGGCAATCTAGAGTCCAGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGA GGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCTGGAACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTTTACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACG CATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGATCGCGGATACGAGAGATCG TATCCTTCAGTTCGGCTGGATCGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGC CGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGA CAGTGGGCAGCGAGACCGCGAGGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGT GCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC CGTCACACCATGGGAGTTGGTTCTACCCGAAGGTAGTGCGCTAACCGCAAGGAGGCAGCTAACCACGGTAGTCAGCG AAT
【主權項】
1. 一種低溫溶磷中華根瘤菌，其特征在于:菌種名稱為ATHC-2，分類命名為中華根瘤菌 屬Sinorhizobium sp.，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 號為CGMCC No.10651，保藏日期為：2015年3月20日，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號。2. 含有權利要求1所述的低溫溶磷中華根瘤菌的生物菌劑，其特征在于：在含有菌株 ATHC-2的發(fā)酵液中添加體積百分比為1-5%羧甲基纖維素，制得有效活菌數(shù)量達到2-5億 個/毫升的液體菌劑。3. 含有權利要求1所述的低溫溶磷中華根瘤菌的生物菌劑粉末，其特征在于:將權利要 求2所述的液體菌劑經低溫冷凍干燥制得粉末菌劑，其有效活菌數(shù)量達到1-2億個/克。
【文檔編號】C12R1/01GK105838655SQ201610415006
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】郭軍康, 郭瑾, 盧書華, 馮人偉, 王瑞剛, 丁永禎
【申請人】農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所, 天津吉麥生態(tài)農業(yè)技術研究院