一株藍(lán)莓專用的根際促生阿氏芽孢桿菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株藍(lán)莓專用的根際促生阿氏芽孢桿菌及其應(yīng)用，該菌株分類命名為阿氏芽孢桿菌<i>Bacillus aryabhattai</i>，編號為BPR078，已于2016年1月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.11971。本發(fā)明的藍(lán)莓根際促生阿氏芽孢桿菌制成菌劑后接種到藍(lán)莓扦插苗，可明顯加速藍(lán)莓生根，促進(jìn)扦插苗生長，與對照相比，差異達(dá)到顯著水平。因此，本發(fā)明為將來開發(fā)藍(lán)莓專用的微生物肥料提供了優(yōu)良的菌株資源。CGMCC No.1197120160107
【專利說明】
一株藍(lán)莓專用的根際促生阿氏芽孢桿菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一株藍(lán)莓專用的根際促生阿氏芽孢桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍(lán)莓(Vacciniumssp.L.)果實(shí)顏色艷麗，風(fēng)味獨(dú)特，含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、維生 素、果膠物質(zhì)、S0D、黃酮、鉀、磷、鈣等豐富的營養(yǎng)成分;含有大量的天然色素，且經(jīng)研究發(fā)現(xiàn) 在多種水果中，其色素含量最高，已成為保健藥物的原料。
[0003] 植物根際促生細(xì)菌是指生存在植物根圈范圍中，對植物生長有促進(jìn)或?qū)Σ≡?拮抗作用的有益細(xì)菌統(tǒng)稱，對植物生長及病害防治有極其重要的作用。據(jù)不完全統(tǒng)計，已發(fā) 現(xiàn)包括假單胞菌和芽抱桿菌等20多個屬的植物根際促生細(xì)菌具有防病促生潛能的報道。植 物根際促生細(xì)菌可分泌植物促生物質(zhì)，包括植物激素、維生素、氨基酸和其它活性有機(jī)小分 子及衍生物等;還可改善植物根際的營養(yǎng)環(huán)境，有效控制植物病害等。
[0004] 本發(fā)明人已從藍(lán)莓根際土壤中篩選出了藍(lán)莓根際促生紡錘芽孢桿菌L13(保藏編 號為CGMCC No.7068)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)L5(保藏編號為CGMCC No.7667)， 能適應(yīng)藍(lán)莓特定的根際土壤環(huán)境，并能促進(jìn)藍(lán)莓生長。
[0005] 藍(lán)莓為淺根系，無根毛，根系多分布于淺層土壤中，生長環(huán)境較為特殊，常用的功 能微生物接種到藍(lán)莓土壤中，難以存活和定殖，無法產(chǎn)生持續(xù)、穩(wěn)定的功效，基于以上原因， 適宜藍(lán)莓的PGPR菌株資源十分匱乏，繼續(xù)豐富藍(lán)莓菌株資源，對改善藍(lán)莓根系的微生態(tài)環(huán) 境、促進(jìn)藍(lán)莓生長、改善藍(lán)莓品質(zhì)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一株藍(lán)莓專用的根際促生阿氏芽孢桿菌及其應(yīng)用，該菌株能 適應(yīng)藍(lán)莓特定的根際土壤環(huán)境，并能促進(jìn)藍(lán)莓生長。
[0007] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明的第一個目的是提供一株阿氏芽孢桿菌，該菌株的分類命名為阿氏芽孢桿 菌Bacillus aryabhattai，編號為BPR078,已于2016年1月7日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué) 院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 11971。
[0009] 菌落特征及菌體形態(tài)：
[0010]在LB培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為圓形規(guī)則，且菌落較大，培養(yǎng)24h菌落大小約為2-4.5mm， 表面凸起，較濕潤，微黃色，不透明，鏡檢菌體較大，桿狀，有芽孢。
[0011] 生理生化特征：
[0012] 檸檬酸鹽（西蒙氏）試驗陽性，脲酶試驗陽性，棉籽糖試驗陽性，L-鼠李糖試驗陰 性，氧化酶(Ko vacs)試驗陰性，伏-普試驗陰性，甲基紅試驗陰性，吲哚試驗陰性，0NPG試驗 陽性，賴氨酸脫羧酶試驗陰性，鳥氨酸脫羧酶試驗陰性，衛(wèi)矛醇試驗陰性。
[0013] 功能定性及定量測定：
[0014]本發(fā)明的菌株能夠產(chǎn)蛋白酶，于干酪素培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h產(chǎn)生透明圈直徑D為 16mm，菌落直徑d為6.1mm，D/d為2.62，定量測定發(fā)酵液中蛋白酶酶活為52.895μg/ml。
[0015]利用美國Waters高效液相色譜儀515型，Waters2487雙波長紫外檢測器測定發(fā)酵 液有機(jī)酸種類及含量。色譜條件為色譜柱：美國Thermo Hypersil GOLD aQ 250X4.6mm， 5u;流動相：10mmoLNH4H2P〇4(磷酸調(diào)pH=2.3):甲醇= 98:2(V:V);檢測波長:210nm，靈敏度： 0.5AUFS，進(jìn)樣量：lOuL，流速:0.8mL/min，柱溫：28°C。檢測結(jié)果顯示，BPR078產(chǎn)草酸濃度為 452.36μg/ml，產(chǎn)乙酸濃度為9542μg/ml，產(chǎn)檸檬酸濃度為3865μg/ml。
[0016] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種微生物混合物，其特點(diǎn)是至少包含本發(fā)明的菌 株，所述微生物混合物可以包含其他具有促進(jìn)植物生長(特別是促進(jìn)藍(lán)莓生長)并與本發(fā)明 的菌株共生的微生物。
[0017] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種包含本發(fā)明菌株或本發(fā)明微生物混合物的產(chǎn)品， 該產(chǎn)品可以是菌劑或組合物等形式。
[0018] 優(yōu)選的，所述產(chǎn)品包括載體;所述載體可以為固體載體或液體載體。所述固體載體 或液體載體均為常規(guī)的載體材料，其中，固體載體可以選自粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白 碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇;液體載體可以為植物油、礦物油或水。
[0019] 優(yōu)選的，所述產(chǎn)品為粉末形式、溶液形式、懸浮劑形式、片劑形式、顆粒形式或其他 形式。
[0020] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述粉末形式可以為凍干粉末形式;所述片劑形式為含有所述凍 干粉末和任選營養(yǎng)素(例如維生素、礦物鹽等)的片劑形式。
[0021 ] 所述產(chǎn)品的活性成分為阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)BPR078，該活性成 分可以以被培養(yǎng)的活細(xì)胞、活細(xì)胞的發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)物的濾液或細(xì)胞與濾液的混合物的 形式存在。
[0022] 本發(fā)明的第四個目的是保護(hù)本發(fā)明的阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai) BPR078發(fā)酵液。
[0023] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種本發(fā)明的菌株、本發(fā)明的微生物混合物或者本發(fā) 明的包含本發(fā)明菌株或本發(fā)明微生物混合物的產(chǎn)品在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用，所述植物具 體為藍(lán)莓。
[0024]本發(fā)明的菌株可促進(jìn)藍(lán)莓扦插苗生根，促進(jìn)藍(lán)莓生長，并可提高藍(lán)莓根際土壤中 蛋白酶和蔗糖酶的活性。
[0025]本發(fā)明的第六個目的是提供一種促進(jìn)藍(lán)莓生長的方法，該方法包括使需要生長的 藍(lán)莓的根際周圍環(huán)境與本發(fā)明的菌株-阿氏芽孢桿菌(Baci 1 lus aryabhattai)BPR078接觸 的步驟。
[0026]優(yōu)選的，所述藍(lán)莓的根際周圍環(huán)境為藍(lán)莓根際土壤。
[0027] 優(yōu)選的，使需要生長的藍(lán)莓的根際周圍環(huán)境與本發(fā)明的菌株-阿氏芽孢桿菌 (Baci 1 lus aryabhattai )BPR078接觸的步驟在于：用本發(fā)明的菌株-阿氏芽孢桿菌 (Bacillus aryabhattai)BPR078接種需要生長的藍(lán)莓根際土壤中。
[0028] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的藍(lán)莓根際促生阿氏芽孢桿菌接種到藍(lán)莓扦插苗， 可明顯加速藍(lán)莓生根，促進(jìn)扦插苗生長，并可提高藍(lán)莓根際土壤中蛋白酶和蔗糖酶的活性， 與對照相比，差異達(dá)到顯著水平。因此，本發(fā)明為將來開發(fā)藍(lán)莓專用的微生物肥料提供了優(yōu) 良的菌株資源。
【附圖說明】
[0029] 圖1是本發(fā)明菌株的菌落形態(tài)圖。
[0030] 圖2是本發(fā)明菌株的光學(xué)顯微鏡鏡檢圖。
[0031] 圖3是采用本發(fā)明菌株的發(fā)酵液的藍(lán)莓組培苗和對照組的藍(lán)莓組培苗對比照片。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 實(shí)施例1本發(fā)明阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)BPR078的篩選
[0033] (1)篩選過程
[0034]在青島膠南佳沃藍(lán)莓種植基地不同大棚內(nèi)采集藍(lán)莓根際土壤樣品3個。通過梯度 稀釋法，從根際土樣中分離出細(xì)菌分離物。通過三區(qū)劃線法對分離到的細(xì)菌進(jìn)行純化，并通 過鏡檢判斷菌株是否純化，對純化后的細(xì)菌進(jìn)行編號，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到LB斜面上保存?zhèn)?用。
[0035]向含有L-色氨酸的R2A液體培養(yǎng)基中接菌，28°C，180rpm，搖床培養(yǎng)4d。取50微升菌 懸液滴于白色陶瓷板上，同時加入50微升Salkowski比色液（50ml 35%HCL〇4+lmlO ? 5mol/L FeCl3)。將加入50mg/L IAA的比色液作為陽性對照。白色陶瓷板于室溫避光放置30min后觀 察，顏色變紅者表示能夠分泌IAA，初篩出分泌IAA的細(xì)菌。
[0036]對初篩獲得的分泌IAA的細(xì)菌進(jìn)行定量測定，繼續(xù)篩選具有應(yīng)用潛力的根際促生 細(xì)菌。最后通過藍(lán)莓的盆栽實(shí)驗，確定一株促進(jìn)藍(lán)莓生長效果最好的細(xì)菌，編號為BPR078。 [0037] (2)菌落特征及菌體形態(tài)
[0038]如圖1和圖2所示，在LB培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為圓形規(guī)則，且菌落較大，培養(yǎng)24h菌落 大小約為2-4.5mm，表面凸起，較濕潤，微黃色，不透明，鏡檢菌體較大，桿狀，有芽孢。
[0039] (3)生理生化特征
[0040]檸檬酸鹽（西蒙氏）試驗陽性，脲酶試驗陽性，棉籽糖試驗陽性，L-鼠李糖試驗陰 性，氧化酶(Ko vacs)試驗陰性，伏-普試驗陰性，甲基紅試驗陰性，吲哚試驗陰性，0NPG試驗 陽性，賴氨酸脫羧酶試驗陰性，鳥氨酸脫羧酶試驗陰性，衛(wèi)矛醇試驗陰性。
[0041] (4)功能定性及定量測定
[0042]菌株能夠產(chǎn)蛋白酶，于干酪素培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h產(chǎn)生透明圈直徑D為16mm，菌落直 徑d為6.1mm，D/d為2.62，定量測定發(fā)酵液中蛋白酶酶活為52.895μg/ml。
[0043]利用美國Waters高效液相色譜儀515型，Waters2487雙波長紫外檢測器測定發(fā)酵 液有機(jī)酸種類及含量。色譜條件為色譜柱：美國Thermo Hypersil GOLD aQ 250X4.6mm， 5u;流動相：10mmoLNH4H2P〇4(磷酸調(diào)pH=2.3):甲醇= 98:2(V:V);檢測波長:210nm，靈敏度： 0.5AUFS，進(jìn)樣量：lOuL，流速:0.8mL/min，柱溫：28°C。檢測結(jié)果顯示，BPR078產(chǎn)草酸濃度為 452.36μg/ml，產(chǎn)乙酸濃度為9542μg/ml，產(chǎn)檸檬酸濃度為3865μg/ml。
[0044] (5)16S rDNA序列分析
[0045] 本發(fā)明菌株的16S rDNA基因序列，見核苷酸序列表所示。將所測16S rDNA序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對。
[0046] BPR078系統(tǒng)發(fā)育樹中同阿氏芽抱桿菌(Bacillus aryabhattai)處于同一分枝，其 16S rDNA序列與阿氏芽孢桿菌(Baci 1 lus aryabhattai)的相似性達(dá)98 ? 77%。結(jié)合菌落形 態(tài)，生理生化特征和16SrDNA序列分析，將本發(fā)明的菌株BPR078鑒定為阿氏芽孢桿菌 (Bacillus aryabhattai)〇
[0047]實(shí)施例2對藍(lán)莓生長具有促生作用
[0048]將保存在斜面上的BPR078用三區(qū)劃線的方法活化在LB (蛋白胨10g; NaCl 10g;酵 母浸膏58;瓊脂15-2(^;水100〇1111$117.〇-7.2，分裝，121<€滅菌2〇111；[11)平板上。挑取單菌落 至相應(yīng)的l0ml液體培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)24h。按1 %接種量將種子液接種至相應(yīng)的 50ml液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，37°C，180rpm培養(yǎng)2d安排藍(lán)莓組培苗的穴盤苗試驗。
[0049] 穴盤苗試驗于2015年4月30青島沃林藍(lán)莓生產(chǎn)基地進(jìn)行，選用藍(lán)莓組培苗，，每個 穴盤為1個處理，扦插200棵組培苗。每個處理施加100mL促生菌發(fā)酵液，稀釋至1000mL均勻 澆灌，正常管理，2015年7月30取樣調(diào)查，結(jié)果如下表1~3和圖3所示?？梢钥闯?，接種BPR078 可促進(jìn)藍(lán)莓扦插苗生根，促進(jìn)藍(lán)莓生長，并可提高藍(lán)莓根際土壤中蛋白酶和蔗糖酶的活性。 由此可見，BPR078在藍(lán)莓栽培種具有很大的應(yīng)用潛力。
[0050]表1營養(yǎng)缽苗試驗植株生長指標(biāo)
[0052]表2營養(yǎng)缽苗試驗植株生物量
[0054]表3營養(yǎng)缽苗試驗土壤酶活測定
[0056] 實(shí)施例3
[0057] -種微生物混合物，其特點(diǎn)是包含本發(fā)明的菌株阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai )BPR078，還包含其他微生物，所述其他微生物為促進(jìn)藍(lán)莓生長并與阿氏芽孢 桿菌(Bacillus aryabhattai)BPR078不產(chǎn)生詰抗作用的微生物。經(jīng)過實(shí)驗驗證，該微生物 混合物明顯促進(jìn)藍(lán)莓扦插苗生根，促進(jìn)藍(lán)莓生長，并可提高藍(lán)莓根際土壤中蛋白酶和蔗糖 酶的活性。
[0058] 實(shí)施例4
[0059] -種包含本發(fā)明菌株或本發(fā)明微生物混合物的菌劑，菌劑中包括載體和該本發(fā)明 所述的菌株-阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)BPR078,所述載體可以為固體載體或 液體載體。所述固體載體或液體載體均為常規(guī)的載體材料，其中，固體載體可以選自粘土、 滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇;液體載體可 以為植物油、礦物油或水。菌劑的形式為凍干粉末形式。經(jīng)過實(shí)驗驗證，該菌劑以阿氏芽孢 桿菌(Bacillus aryabhattai)BPR078為活性成分，可以促進(jìn)藍(lán)莓扦插苗生根，促進(jìn)藍(lán)莓生 長，并可提高藍(lán)莓根際土壤中蛋白酶和蔗糖酶的活性。
【主權(quán)項】
1. 一株阿氏芽孢桿菌，其特征是：該菌株分類命名為阿氏芽孢桿菌Bacillus aryabhattai，編號為BPR078，已于2016年1月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 11971。2. -種微生物混合物，其特征是:至少包含權(quán)利要求1所述的阿氏芽孢桿菌。3. 包含權(quán)利要求1所述的阿氏芽孢桿菌或權(quán)利要求2所述的微生物混合物的產(chǎn)品。4. 如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征是:所述產(chǎn)品為粉末形式、溶液形式、懸浮劑形式、 片劑形式、顆粒形式或其他形式。5. 包含權(quán)利要求1所述的阿氏芽孢桿菌的發(fā)酵液。6. 權(quán)利要求1所述的阿氏芽孢桿菌或權(quán)利要求2所述的微生物混合物或權(quán)利要求3所述 的產(chǎn)品或權(quán)利要求5所述的發(fā)酵液在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是:所述植物為藍(lán)莓。8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是:接種權(quán)利要求1所述的阿氏芽孢桿菌或權(quán)利要 求2所述的微生物混合物或權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求4所述的發(fā)酵液能提高藍(lán)莓根 際土壤中的蛋白酶和蔗糖酶的活性。9. 一種促進(jìn)藍(lán)莓生長的方法，其特征是：該方法包括使需要生長的藍(lán)莓的根際周圍環(huán) 境與權(quán)利要求1所述的阿氏芽孢桿菌接觸的步驟。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征是，使需要生長的藍(lán)莓的根際周圍環(huán)境與權(quán)利要 求1所述的阿氏芽孢桿菌接觸的步驟在于:采用權(quán)利要求1所述的阿氏芽孢桿菌接種需要生 長的藍(lán)莓的根際土壤中。
【文檔編號】A01N63/02GK105820986SQ201610368365
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】杜秉海, 馬海林, 丁延芹, 劉方春, 姚良同, 杜振宇, 范玲超, 馬丙堯, 徐文鳳, 李麗
【申請人】山東省林業(yè)科學(xué)研究院