一種雞腸炎沙門(mén)氏菌感染抗性性狀分子標(biāo)記gga-miR-1662及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種雞腸炎沙口氏菌感染抗性分子標(biāo)記 gga-miR-1662及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸炎沙口氏菌（Salmonella enteritidis)為革蘭氏陰性菌，是世界公認(rèn)的食源性 致病菌之一，不僅對(duì)蛋雞生產(chǎn)造成重大影響，而且它能通過(guò)家禽副產(chǎn)品給人類的健康帶來(lái) 很大的威脅。運(yùn)種病菌主要是通過(guò)動(dòng)物性產(chǎn)品包括禽肉，雞蛋和奶類及奶制品等導(dǎo)致人中 毒甚至死亡。因此如何獲得抗性高的遺傳個(gè)體成為亟待解決的問(wèn)題之一。
[0003] 小RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約22nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，與祀基因3'UTR(非翻譯 區(qū)）結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控祀基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、調(diào)亡、神經(jīng)發(fā)育、脂肪代謝等 多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，結(jié)合長(zhǎng)期研究和探索，提供了一種雞 腸炎沙口氏菌感染抗性分子標(biāo)記gga-miR-1662及其檢測(cè)方法，該抗性分子標(biāo)記為雞miRNA gga-miR-1662，發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，gga-miR-1662可W通過(guò)調(diào)控TLR1LA基因的表達(dá)調(diào)控 腸炎沙口氏菌對(duì)雞的感染，因此gga-miR-1662可W作為腸炎沙口氏菌感染抗性檢測(cè)的分子 標(biāo)記，發(fā)明人進(jìn)一步提供了其檢測(cè)方法，從而為雞的抗病遺傳育種奠定基礎(chǔ)。
[0005] 發(fā)明人提供的具體技術(shù)方案如下：
[0006] 發(fā)明人首先提供了一種雞腸炎沙口氏菌感染抗性分子標(biāo)記，該抗性分子標(biāo)記為雞 miRNA gga-miR-1662,其核巧酸序列如沈Q ID NO: 1所示；
[0007] 發(fā)明人進(jìn)一步給出了該分子標(biāo)記的檢測(cè)方法如下：
[000引 gga-miR-1662的表達(dá)量檢測(cè)
[0009] miRNA反轉(zhuǎn)錄
[0010] 用One St邱PivimeS.cript麼miRNA cDNA Synthesis Kit(Perfect Real Time)試 劑盒，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄體系為20化(具體見(jiàn)表1)。反應(yīng)程序?yàn)?37°C，60min;85°C， 5s;反應(yīng)完成后獲得的cDNA置于-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0011] 表1 miRNA反轉(zhuǎn)錄體系（20yL)
[0012]
[0013]其中所述的盲腸總RNA為雞盲腸總RNA，采用常規(guī)方法獲得，
[0014] gga-miR-1662 巧光定量 PCR
[0015] 根據(jù)gga-miR-1662成熟序列設(shè)計(jì)引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成。 利用所設(shè)引物，采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)，在Stratagene MX3000P巧光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表3所 /J、- 〇
[0016] 表2 miRNA定量檢測(cè)引物
[0017]
[0019] 其中〉gga-miR-1662和U6分別作為Forward qPCR Primer,而Uni-miR qPCR Primer選用試劑盒中自帶引物；
[0020] 巧光定量PCR反應(yīng)程序采用兩步法:95°C預(yù)變性30s，1個(gè)循環(huán);95°C5s，60°C30s，40 個(gè)循環(huán)；最后添加溶解曲線(95°CImin，62°C30s，95°C30s)，1個(gè)循環(huán)，每個(gè)cDNA樣品重復(fù)Ξ 次。WU6作為內(nèi)參基因，用方法來(lái)計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量，用SAS8.1軟件中單因素方 差分析對(duì)miRNA表達(dá)量差異進(jìn)行分析。
[0021] 表3巧光定量PCR體系（2化L)
[0022]
[0023] 發(fā)明人為了驗(yàn)證上述gga-miR-1662的功能采用了祀基因檢測(cè)的方式，利用 TargetScan及miRanda等軟件預(yù)測(cè)到TLR1LA是gga-miR-1662的祀基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)分別 比較腸炎沙口氏菌感染組與未感染組中miRNA與祀基因的調(diào)控方向，可知gga-miR-1662在 感染組中顯著下調(diào)，祀基因化R1LA在感染組中的表達(dá)量顯著高于未感染組(如圖1所示），即 gga-miR-1662與化R1LA調(diào)控方向相反，表現(xiàn)出相互作用關(guān)系。說(shuō)明gga-miR-1662可W通過(guò) 調(diào)控化R1LA基因的表達(dá)調(diào)控腸炎沙口氏菌對(duì)雞的感染。因此gga-miR-1662可W作為腸炎沙 口氏菌感染抗性檢測(cè)的分子標(biāo)記。
[0024] 綜上所述，本發(fā)明提供了一種雞腸炎沙口氏菌感染抗性分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法， 該抗性分子標(biāo)記為雞gga-miR-1662，發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，gga-miR-1662可W通過(guò)調(diào)控 化R1LA基因的表達(dá)調(diào)控腸炎沙口氏菌對(duì)雞的感染，因此gga-miR-1662可W作為腸炎沙口氏 菌感染抗性檢測(cè)的分子標(biāo)記，發(fā)明人進(jìn)一步提供了其檢測(cè)方法，從而為雞的抗病遺傳育種 奠定基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[00巧]圖1為gga-miR-1662與祀基因化RILA在感染組相對(duì)未感染組中的表達(dá)差異倍數(shù)柱 狀圖，
[00%]由圖可知，gga-miR-1662在感染組中顯著下調(diào)，TLR1LA在感染組中的表達(dá)量顯著 高于未感染組，即gga-miR-1662與TLR1LA調(diào)控方向相反，表現(xiàn)出相互作用關(guān)系。說(shuō)明gga- miR-1662可W通過(guò)調(diào)控TLR1LA基因的表達(dá)調(diào)控腸炎沙口氏菌對(duì)雞的感染。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下述實(shí)施例中除特殊說(shuō)明之外，所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0028] 實(shí)施例1
[0029] gga-miR-1662的表達(dá)量檢測(cè)
[0030] miRNA 反轉(zhuǎn)錄
[0031 ]用One St邱'PrlmeSc.ri:pt'?miRNA cDNA Synthesis Kit(F*e;rfect Real Time)試 劑盒，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄體系為20化(表1)。反應(yīng)程序?yàn)?37°C，60min; 85°C，5s;反 應(yīng)完成后獲得的cDNA置于-20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0032] 表1 miRNA反轉(zhuǎn)錄體系（20yL) Γ00331
[0034] 其中所述的盲腸總RNA為雞盲腸總RNA，采用常規(guī)方法獲得，
[0035] gga-miR-1662 巧光定量 PCR
[0036] 根據(jù)gga-miR-1662成熟序列設(shè)計(jì)引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成。 利用所設(shè)引物，采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)，在Stratagene MX3000P巧光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表3所 /J、- 〇
[0037] 表2 miRNA定量檢測(cè)引物 [00；3 引
[0039] 其中〉gga-miR-1662和U6分別作為Forward qPCR Primer,而Uni-miR qPCR Primer選用試劑盒中自帶引物；
[0040] 巧光定量PCR反應(yīng)程序采用兩步法:95°C預(yù)變性30s，1個(gè)循環(huán);95°C5s，60°C30s，40 個(gè)循環(huán)；最后添加溶解曲線(95°CImin，62°C30s，95°C30s)，1個(gè)循環(huán)，每個(gè)cDNA樣品重復(fù)Ξ 次。WU6作為內(nèi)參基因，用方法來(lái)計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量，用SAS8.1軟件中單因素方 差分析對(duì)miRNA表達(dá)量差異進(jìn)行分析。
[0041 ] 表3巧光定量PCR體系（20μυ
[0042]
[0043] 實(shí)施例2
[0044] 祀基因 TLRILA的表達(dá)量檢測(cè)
[0045] mRNA反轉(zhuǎn)錄
[0046] 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，利用TaKaRa Primer ScriptTM RT reagent kit (Perfect Real Time)試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，放在-20°C保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄體系如表4 所示。反轉(zhuǎn)錄步驟:37°C，15min;85°C，5s。
[0047] 表4反轉(zhuǎn)錄體系 [004引
[0049] TLR1LA 巧光定量 PCR
[00加]根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)mRNA序列（登錄號(hào):NM_001007488)，用Primer Premie巧.0設(shè)計(jì)巧 光定量PCR引物(表5所示），引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0051]表5引物序列
[0化2]
[0053] 采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SY服Premix Ex TaqTM說(shuō)明書(shū)，在 Stratagene MX3000P巧光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20化(表6):SYBR Primer Ex TaqTM(2 X)ΙΟμΙ,Forward Primer(10μΜ)0.4μ1,Reverse Primer(10μΜ)0.4μ1,ROX Ref erence Dye Π (50 X )0.4化，cDNA模板化L，滅菌雙蒸水（d地2〇)6.祉L，終體積20化。反 應(yīng)程序?yàn)閮刹椒?95°C預(yù)變性30s，PCR反應(yīng)為:95°C，5s; 60°C，30s;循環(huán)40次;添加溶解曲 線:95°C，Imin;ere，30s;95°C，30s;每個(gè)樣品重復(fù)3次。Wf3-act in作為內(nèi)參，用2^AGt方法 來(lái)計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，用SAS8.1軟件中單因素方差分析對(duì)mRNA表達(dá)量差異進(jìn)行分析。
[0054] 表6巧光定量PCR體系
[0化5]
[0056] 實(shí)施例3
[0057]雞接種腸炎沙口氏菌試驗(yàn)
[005引將沙口氏菌陰性白來(lái)航蛋雞分為感染組與未感染組，感染組每只雞接種5.8 X 108CRJ腸炎沙口氏菌，未感染組接種憐酸鹽緩沖液(PBS)，接種后第7天采集盲腸組織樣品。 按照使用說(shuō)明，用Trizol法提取盲腸總RNA。
[0059] gga-miR-1662與腸炎沙口氏菌感染的相關(guān)性分析
[0060] 利用實(shí)施例1所述方法，檢測(cè)腸炎沙口氏菌感染后盲腸組織gga-miR-1662表達(dá)變 化。定量結(jié)果顯示，gga-miR-1662在感染組盲腸中的表達(dá)量顯著低于未感染組（Fold change = -2.44)。說(shuō)明gga-miR-1662與腸炎沙口氏菌感染具有較強(qiáng)的相關(guān)性。
[0061 ] TLR1LA與腸炎沙口氏菌感染的相關(guān)性分析
[0062] 利用實(shí)施例2所述方法，檢測(cè)盲腸化R1LA表達(dá)與腸炎沙口氏菌感染的相關(guān)性。結(jié)果 顯示，感染組化R1LA的表達(dá)量顯著高于未感染組，是未感染組的1.55倍（P<0.05)。說(shuō)明 TLR1LA與雞腸炎沙口氏菌感染相關(guān)。
[0063] gga-miR-1662與其祀基因 TLR1LA的互作分析
[0064] 通過(guò)分別比較感染組與未感染組中miRNA與祀基因的調(diào)控方向，可知gga-miR- 1662在感染組中顯著下調(diào)，TLR1LA在感染組中的表達(dá)量顯著高于未感染組(如圖1)，即gga- miR-1662與化R1LA調(diào)控方向相反，表現(xiàn)出相互作用關(guān)系。說(shuō)明gga-miR-1662可W通過(guò)調(diào)控 化R1LA基因的表達(dá)調(diào)控腸炎沙口氏菌對(duì)雞的感染。因此gga-miR-1662可W作為腸炎沙口氏 菌感染抗性檢測(cè)的分子標(biāo)記。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雞腸炎沙口氏菌感染抗性分子標(biāo)記，該抗性分子標(biāo)記為雞miRNA gga-miR- 1662,其核巧酸序列如沈Q ID NO: 1所示。2. 權(quán)利要求1所述雞腸炎沙口氏菌感染抗性分子標(biāo)記檢測(cè)方法，具體步驟如下： gga-miR-1662的表達(dá)量檢測(cè) miRNA反轉(zhuǎn)錄 用One St邱時(shí).imeScri.p:愧'miRNA cDNA Synthesis Kit(Perfect Real Time)試劑盒， 嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;反轉(zhuǎn)錄體系為20化，如表1所示;反應(yīng)程序?yàn)?37°C，60min; 85°C，5s;反 應(yīng)完成后獲得的cDNA置于-20°C保存?zhèn)溆茫? 表1 miRNA反轉(zhuǎn)錄體系gga-miR-1662 巧光定量 PCR 根據(jù)gga-miR-1662成熟序列設(shè)計(jì)引物，如表2所示；利用所設(shè)引物，采用SYBR Green I 染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)，在Stra化gene MX3000P巧光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表3所示； 表2 miRNA定量檢測(cè)引物巧光定量PCR反應(yīng)程序采用兩步法:95°C預(yù)變性30s，1個(gè)循環(huán);95°C5s，60°C30s，40個(gè)循 環(huán);最后添加溶解曲線(95°(31111111，62°03〇3,95°03〇3)，1個(gè)循環(huán)，每個(gè)〇0臟樣品重復(fù)^次；^ U6作為內(nèi)參基因，用方法來(lái)計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量，用SAS8.1軟件中單因素方差分 析對(duì)gga-miR-1662表達(dá)量差異進(jìn)行分析。
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種雞腸炎沙門(mén)氏菌感染抗性分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法，該抗性分子標(biāo)記為雞miRNA？gga-miR-1662，發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，gga-miR-1662可以通過(guò)調(diào)控TLR1LA基因的表達(dá)調(diào)控腸炎沙門(mén)氏菌對(duì)雞的感染，因此gga-miR-1662可以作為腸炎沙門(mén)氏菌感染抗性檢測(cè)的分子標(biāo)記，發(fā)明人進(jìn)一步提供了其檢測(cè)方法，從而為雞的抗病遺傳育種奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/113
【公開(kāi)號(hào)】CN105543227
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610015399
【發(fā)明人】李顯耀, 吳桂賢, 劉麗英, 劉肖意
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月11日