抗牛奶且與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)的β-酪蛋白單抗制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗牛奶且與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)的β -酪蛋白單抗制備方法，其生產(chǎn)的抗體可用于免疫印記和酶聯(lián)免疫法檢測水牛奶中是否摻假牛奶，屬于食品質(zhì)量安全檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水牛奶中總固形物、脂肪和蛋白含量均高于牛奶，奶品質(zhì)優(yōu)良，營養(yǎng)價值高，越來越受到消費者的青睞。目前，生鮮水牛奶及其奶制品的市場售價高于牛奶，這導(dǎo)致一些不法的生產(chǎn)經(jīng)營者為了獲取更多的經(jīng)濟利益，存在向水牛奶中摻假牛奶的現(xiàn)象。為此，國內(nèi)外許多學(xué)者采用紅外光譜法、毛細管電泳法、液相色譜法、質(zhì)譜法等技術(shù)探索了奶摻假的研究，并找到了一些可用于摻假檢測的標(biāo)記分子，但因所需儀器設(shè)備昂貴、操作繁雜及費時等方面的原因，目前未能在生產(chǎn)中得到應(yīng)用。
[0003]酪蛋白是牛奶、水牛奶等反芻動物奶中主要的蛋白組分，其含量約為總蛋白含量的35%左右。酪蛋白與asl、as2和κ -酪蛋白形成膠束結(jié)構(gòu)，對奶的穩(wěn)定性及物理化學(xué)性質(zhì)的保持具有重要作用。因此，以牛奶中酪蛋白為標(biāo)記分子，用于檢測奶混合物中牛奶含量，具有易于檢測的特點。但是，因牛奶和水牛奶酪蛋白的氨基酸序列存在97.8%相似度，這極容易導(dǎo)致抗牛奶酪蛋白抗體與水牛奶酪蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0004]目前，單克隆抗體制備方法雖然很成熟，但尚未有特異性抗牛奶β-酪蛋白且與水牛奶無交叉反應(yīng)的抗體產(chǎn)品，及以β-酪蛋白抗體為基礎(chǔ)檢測水牛奶中摻假牛奶的研究報道。因此，本發(fā)明公開了一種抗牛奶酪蛋白而與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)的單克隆抗體制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種抗牛奶且與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)的酪蛋白單抗制備方法。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括以下步驟:
[0007](I)以牛奶β -酪蛋白作為抗原，定期皮下免疫Balb/c雌性小鼠；
[0008](2)加強免疫后，取血并分離血清，用ELISA方法檢測血清中多抗效價；
[0009](3)選擇效價達到10000以上的小鼠，分離脾臟并破碎以獲取脾細胞，將脾細胞與SP2/0細胞混合，采用PEG法進行融合，然后加入小鼠胸腺細胞，用滅菌半固體培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)；
[0010](4)挑選細胞單克隆，培養(yǎng)于用胸腺細胞鋪板的細胞培養(yǎng)皿中；
[0011](5)采用ELISA方法第一次篩選單克隆細胞以獲取抗牛奶中β -酪蛋白的細胞株，以β-酪蛋白為底物篩選陽性雜交瘤細胞株；
[0012](6)在第一次篩選的基礎(chǔ)上，第二次采用ELISA方法進一步篩選陽性雜交瘤細胞株;
[0013](7)采用ELISA方法第三次篩選單克隆細胞以獲取與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)的細胞株，以水牛奶蛋白為底物篩選陰性雜交瘤細胞株；
[0014](8)對單克隆抗體進行鑒定，獲得能分泌IgGl的雜交瘤細胞株。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
[0016]提供了一種抗牛奶且與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)的β -酪蛋白單抗制備方法。該方法的第一步是亞克隆篩選識別奶牛β -酪蛋白的細胞株；第二步是對識別奶牛β -酪蛋白的細胞株進一步篩選；第三步是篩選不識別水牛奶蛋白的細胞株，第三步是該抗體制備的關(guān)鍵。在亞克隆篩選階段，若產(chǎn)生的抗體存在交叉反應(yīng)，則得不到需要的細胞株，由此就無法生產(chǎn)所需的酪蛋白單克隆抗體。
【具體實施方式】
[0017]—種抗牛奶且與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)的β -酪蛋白單抗的制備方法，操作步驟如下:
[0018]1、免疫操作步驟:選4只Balb/c雌性小鼠(編號為:1、2、3、4)進行皮下多點注射式免疫；初免劑量為60 μ g蛋白/只，每隔2周加強免疫一次，加強免疫量為30μg蛋白/只，加強免疫3-4次；取血，檢測血清多抗效價。
[0019]2、效價檢測:
[0020]實驗試劑:包被液(碳酸鹽緩沖液pH為9.6) ；PBS洗滌緩沖液(pH為7.4，用前加0.2%吐溫20);封閉液(0.5%牛血清)；TMB顯色液；終止液(2M H2SO4)。
[0021]具體操作步驟如下:
[0022](I)抗原β-酪蛋白溶于生理鹽水中，用包被液稀釋抗原，終濃度為2 μ g/ml，100 μ I/孔，4°C包被過夜；
[0023](2)用牛血清溶液37°C封閉Ih ;
[0024](3)加抗血清及對照37°C孵育Ih ;
[0025](4)加酶標(biāo)二抗，37°C孵育Ih ；
[0026](5) TMB顯色液室溫下反應(yīng)20min ;加終止液2M H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。
[0027]3、細胞融合實驗:
[0028](I)拉頸處死小鼠，分離脾臟，將脾細胞與SP2/0細胞混合，離心移除上清，吹打充分懸浮細胞，于37°C水浴中緩慢加入Iml的PEG，靜置；然后加入無血清的HffiM，離心移除上清后加入血清。
[0029](2)分離小鼠胸腺，制備胸腺細胞并轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，再加入Iml的HAT，孵育；
[0030](3)在脾細胞與SP2/0細胞混合液中加入胸腺細胞，混合均勻后加入滅菌的半固體培養(yǎng)基，充分混合后倒入細胞培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱孵育。挑選細胞單克隆培養(yǎng)于96孔細胞培養(yǎng)板。
[0031]4、第一次篩選單克隆細胞:用包被液稀釋β -酪蛋白終濃度為2 μ g/ml，100 μ I/孔，包被酶標(biāo)板，對挑選的細胞單克隆采用ELISA方法進行第一次篩選。篩選陽性雜交瘤細胞株。
[0032]5、第二次篩選單克隆細胞:將第一次篩選到的細胞株進一步篩選，用包被液稀釋β -酪蛋白終濃度為2 μ g/ml，100 μ I/孔，包被酶標(biāo)板，篩選陽性雜交瘤細胞株。
[0033]6、第三次篩選單克隆細胞:對第二步篩選到的細胞株用包被液稀釋水牛奶蛋白濃度為2 μ g/ml, 100 μ I/孔，包被酶標(biāo)板，對挑選的細胞單克隆采用ELISA方法進行第三次篩選。篩選陰性雜交瘤細胞株。
[0034]7、小鼠腹腔注射雜交瘤細胞株，將篩選到的細胞株孵育至對數(shù)生長期時制成細胞懸液，注入小鼠腹腔誘導(dǎo)產(chǎn)生腹水，收集腹水純化抗體。
[0035]8、免疫印記驗證:用考馬斯亮藍法測定牛奶和水牛奶蛋白含量，取50 μ g蛋白樣品與上樣緩沖液混合均勻，95°C水浴5min，室溫冷卻后，將蛋白樣品加至預(yù)先灌制的10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，100V電泳lh。然后切膠，用夾心法220V轉(zhuǎn)膜lh，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜。雞血清4°C封閉過夜，酪蛋白抗體室溫孵育1.5h，然后用山羊抗小鼠二抗室溫孵育lh，DAB顯色，結(jié)果表明，β -酪蛋白單克隆抗體僅與牛奶β -酪蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)呈現(xiàn)顏色，而與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)。
[0036]以上所述的本發(fā)明實施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.抗牛奶且與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)的β-酪蛋白單抗制備方法，包括以下步驟: (1)以牛奶β-酪蛋白作為抗原，定期皮下免疫Balb/c雌性小鼠； (2)加強免疫后，取血并分離血清，用ELISA方法檢測血清中多抗效價； (3)選擇效價達到10000以上的小鼠，分離脾臟并破碎以獲取脾細胞，將脾細胞與SP2/0細胞混合，采用PEG法進行融合，然后加入小鼠胸腺細胞，用滅菌半固體培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)； (4)挑選細胞單克隆，培養(yǎng)于用胸腺細胞鋪板的細胞培養(yǎng)皿中； (5)采用ELISA方法第一次篩選單克隆細胞以獲取抗牛奶中β-酪蛋白的細胞株，以β-酪蛋白為底物篩選陽性雜交瘤細胞株； (6)在第一次篩選的基礎(chǔ)上，第二次采用ELISA方法進一步篩選陽性雜交瘤細胞株； (7)采用ELISA方法第三次篩選單克隆細胞以獲取與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)的細胞株，以水牛奶蛋白為底物篩選陰性雜交瘤細胞株； (8)對單克隆抗體進行鑒定，獲得能分泌IgGl的雜交瘤細胞株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗牛奶且與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)的β-酪蛋白單抗制備方法。在制備牛奶β-酪蛋白單抗的過程中，第一步是亞克隆篩選識別奶牛β-酪蛋白的細胞株；第二步是對識別奶牛β-酪蛋白的細胞株進一步篩選；第三步是篩選不識別水牛奶蛋白的細胞株，其中第三步是該抗體制備的關(guān)鍵。在亞克隆篩選階段，若產(chǎn)生的抗體存在交叉反應(yīng)，則得不到需要的細胞株，由此就無法生產(chǎn)所需的β-酪蛋白單克隆抗體。本發(fā)明所獲得的β-酪蛋白單抗能夠特異性識別奶牛β-酪蛋白而與水牛奶蛋白無交叉反應(yīng)。
【IPC分類】C07K16/18
【公開號】CN105198994
【申請?zhí)枴緾N201510695089
【發(fā)明人】楊永新, 趙小偉, 潘孝成, 黃冬維, 齊云霞, 程廣龍, 趙輝玲
【申請人】安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年10月23日