一種通過納米金顆粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種通過納米金顆粒介導(dǎo)基因 轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 男性更年期綜合征，是由于睪丸的萎縮，睪丸酮的分泌減少，萎縮的睪丸對(duì)促性腺 激素的反應(yīng)降低，使體內(nèi)性激素的調(diào)節(jié)功能失衡而引起的一系列癥狀。主要表現(xiàn)為精神心 理癥狀：精力不集中，記憶力減退，抑郁，焦慮，易怒，多疑，神經(jīng)質(zhì)，工作能力下降。血管舒縮 癥狀有心悸，潮熱，出汗。性方面的癥狀有性興趣降低，性欲降低，陽痿。生理體能癥狀有睡 眠減少，容易疲勞，食欲不振，骨骼與關(guān)節(jié)疼痛。
[0003]目前臨床主要應(yīng)用化學(xué)合成的雄性激素進(jìn)行替代治療。然而人體長期應(yīng)用化學(xué)合 成雄激素易引起肝功能損害、高血脂癥及前列腺癌等并發(fā)癥，短期過量補(bǔ)充還可引起人情 緒不穩(wěn)等多種副反應(yīng)。近年來國內(nèi)外專家嘗試開展了近親供體移植術(shù)或干細(xì)胞移植術(shù)治療 睪丸損失或男性性腺低下癥，取得較好效果。但這種移植術(shù)存在供體來源有限、手術(shù)復(fù)雜、 經(jīng)費(fèi)高等缺點(diǎn)，受者需長期服用免疫抑制劑等。
[0004] 近來，調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成分泌雄激素的因素也越來越受到人們的重視。經(jīng)調(diào) 研，尚未見經(jīng)納米金顆粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法 相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是構(gòu)建一種通過納米金顆粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì) 干細(xì)胞分化睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，主要是通過10-30nm直徑的納米膠體金顆粒將類固醇生 成因子 1(SteroidogenicFactor1，SF_1)和促黃體生成激素受體（luteotropichormone receptor，LHR)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，然后用化合物或生長因子誘導(dǎo)人臍帶 間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而分泌生成睪酮。
[0006] -種通過納米金顆粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化睪丸間質(zhì)細(xì)胞 的方法，包含以下步驟： 1) 納米金顆粒的合成，納米金顆粒對(duì)基因載體的包被，納米金顆粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染； 2) 采用化合物或生長因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞 所述納米金顆料為直徑10-30nm的納米膠體金顆粒，優(yōu)選20nm。
[0007] 所述納米金顆料的合成過程如下： (1)將氯金酸（HAuC14)配制成0.01 %水溶液，取100mL加熱至沸。
[0008] (2)攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入1. 5mL的1%檸檬酸三鈉（Na3C6H507 ? 2H20)水溶液。
[0009] (3)繼續(xù)加熱煮沸15min。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入 后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約2 - 3min。
[0010] (4)冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積備用。
[0011] 所述納米金顆粒介導(dǎo)的基因包被及基因轉(zhuǎn)染，其步驟如下： 將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)貼壁培養(yǎng)，按6孔培養(yǎng)板中每孔4X105個(gè)細(xì)胞，并按 以下試劑量操作：取兩種待轉(zhuǎn)質(zhì)粒（分別含類固醇生成因子1基因和促黃體生成激素受體 基因）各2yg溶于100y1PBS緩沖液，再加入16y1納米金顆粒溶液，渦旋Is混勻，室溫 放置2-5min后加入細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染24小時(shí)更換培養(yǎng)液后換成誘導(dǎo)培養(yǎng)液； 采用化合物或生長因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染24 小時(shí)后加入以下配方的誘導(dǎo)培養(yǎng)基：5X10 7mol/L維A酸和lX103mol/L8-溴-環(huán)磷腺 苷，誘導(dǎo)分化7天后，檢測(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞中類固醇合成相關(guān)蛋白。
[0012] 有益效果： 本發(fā)明提供一種通過納米金顆粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為睪丸 間質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法高效、安全，分化后的睪丸間質(zhì)細(xì)胞可作為研究替代模型；可用 于以睪丸間質(zhì)細(xì)胞在臨床上細(xì)胞治療的種子細(xì)胞，提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生替代治療的應(yīng)用 前景。
[0013] 所述方法開拓了一種新的干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染途徑，為干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞提 供一種高效、安全的方法； 所述方法分化后的睪丸間質(zhì)細(xì)胞能作為研究睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)功能影響因素研 究的替代模型。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是本發(fā)明的范圍 不受這些實(shí)施例的限制。
[0015] -種通過納米金顆粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化睪丸間質(zhì)細(xì)胞 的方法，包含以下步驟： 3) 納米金顆粒的合成，納米金顆粒對(duì)基因載體的包被，納米金顆粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染； 4) 采用化合物或生長因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞 所述納米金顆料的合成過程如下： (1)將氯金酸（HAuC14)配制成0.01 %水溶液，取100mL加熱至沸。
[0016] (2)攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入1. 5mL的1%檸檬酸三鈉（Na3C6H507 ? 2H20)水溶液。
[0017] (3)繼續(xù)加熱煮沸15min。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入 后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約2 - 3min。
[0018] (4)冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積備用。
[0019] 所述納米金顆粒介導(dǎo)的基因包被及基因轉(zhuǎn)染，其步驟如下： 將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)貼壁培養(yǎng)，按6孔培養(yǎng)板中每孔4X105個(gè)細(xì)胞，L-DMEM+ 5%FBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱溫度37度，C02濃度為5%，并按以下試劑量操作：取兩種待轉(zhuǎn)質(zhì)粒 (分別含類固醇生成因子1基因和促黃體生成激素受體基因）各2yg溶于100y1PBS緩 沖液，再加入16y1納米金顆粒溶液，渦旋Is混勻，室溫放置2-5min后加入細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染24 小時(shí)更換培養(yǎng)液后換成誘導(dǎo)培養(yǎng)液； 采用化合物或生長因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染24 小時(shí)后加入以下配方的誘導(dǎo)培養(yǎng)基：5X10 7mol/L維A酸和lX103mol/L8-溴-環(huán)磷腺 苷，誘導(dǎo)分化7天后，檢測(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞中類固醇合成相關(guān)蛋白。
[0020] 使用放射性免疫法檢測(cè)由間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化成的睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的 情況。
[0021] 具體檢測(cè)方法為：睪酮分泌測(cè)定按照睪酮測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行。取出酶標(biāo)板， 依照次序?qū)?yīng)分別加入50yL的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中；分別標(biāo)記樣品編號(hào)，加入50yL樣 品于空白微孔中；在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入100yL的酶標(biāo)記洛液；37C解育反應(yīng)60min; 濃縮洗液與蒸餾水1 :20倍稀釋后清洗酶標(biāo)板5次，每次靜置10 - 20S;每孔加入底物A、B 液各50yL;37°C下避光孵育反應(yīng)15min;每孔加入50yL終止液，終止反應(yīng)。在波長450nm 的酶標(biāo)儀上測(cè)定0D值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出睪酮濃度值。
[0022] 結(jié)果表明，測(cè)得溶劑對(duì)照組睪酮含量0. 20nmol/L，誘導(dǎo)組分化而來的細(xì)胞具有分 泌睪酮的能力，三次平行實(shí)驗(yàn)睪酮濃度分別為 0. 95nmol/L，0. 91nmol/L和0. 98nmol/L(見表1 )，對(duì)照組所得睪酮含量為分化試劑中 的血清背景影響。
[0023] 表1 :未分化及分化后細(xì)胞培養(yǎng)液中睪酮的含量
在上述實(shí)施例中，對(duì)本發(fā)明的最佳實(shí)施方式做了描述，很顯然，在本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思 下，仍可做出很多變化。在此，應(yīng)該說明，在本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思下所做出的任何改變都將落 入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種通過納米金顆粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化睪丸間質(zhì)細(xì)胞的 方法，其特征在于包括以下步驟： 納米金顆粒的合成，納米金顆粒對(duì)基因載體的包被，納米金顆粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染； 采用化合物或生長因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述納米金顆料為直徑10_30nm的納米膠 體金顆粒。3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述納米金顆料為直徑20nm的納米膠 體金顆粒。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其他在于：所述納米金顆粒的合成過程為： (1) 將氯金酸（HAuC14)配制成0.01 %水溶液，取100 mL加熱至沸； (2) 攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入I. 5mL的1%檸檬酸三鈉（Na3C6H507 ? 2H20)水溶液； (3) 繼續(xù)加熱煮沸15min，此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很 快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色，全過程2 - 3 min ; (4) 冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積備用。5. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述納米金顆粒對(duì)基因載體的包被，納米金顆 粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染過程為： 將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)貼壁培養(yǎng)，按6孔培養(yǎng)板中每孔4X IO5個(gè)細(xì)胞，并按 以下試劑量操作：取兩種待轉(zhuǎn)質(zhì)粒（分別含類固醇生成因子1基因和促黃體生成激素受體 基因）各2 y g溶于100 y I PBS緩沖液，再加入16 y 1納米金顆粒溶液，渦旋Is混勻，室溫 放置2-5min后加入細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染24小時(shí)更換培養(yǎng)液后換成誘導(dǎo)培養(yǎng)液。6. 權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述采用化合物或生長因子誘導(dǎo)人臍帶 間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5X10 7mol/ L維A酸和I X 10 3mol/L8_溴-環(huán)磷腺苷。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，是將帶有類固醇生成因子1基因和促黃體生成激素受體基因的質(zhì)粒通過納米金顆粒共轉(zhuǎn)染入人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，然后用化合物或生長因子誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明提供一種高效、安全的睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化方法以，分化后的睪丸間質(zhì)細(xì)胞可作為研究替代模型；可用于以睪丸間質(zhì)細(xì)胞在臨床上細(xì)胞治療的種子細(xì)胞，提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生替代治療的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12N5/077, C12N5/10
【公開號(hào)】CN105062978
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510498088
【發(fā)明人】馮文峰, 黃鵬, 昌芒
【申請(qǐng)人】廣州思丹福生物科技有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月14日