專利名稱:水華魚腥藻厚壁孢子的誘導(dǎo)技術(shù)及其干藻粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域：
的優(yōu)化生產(chǎn)方法，具體是一種水華魚腥藻厚壁孢子的誘導(dǎo)技術(shù)及其干藻粉的制備方法。
背景技術(shù)：
水華魚腥藻(Anabaena flos-aquae)由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供(編號FACHB_245),記載于《Jianying Shen, Antomo DiTommaso, Mingquan Shen,Wei Lu, and Zhengming Li ；Molecular basis for differential metabolic responsesto monosulfuron inthree nitrogen-fixing cyanobacteria, Weed Science,2009,57 :178-188〉〉、〈〈Jianying Shen, JingJiang, Peizhong Zheng ；Effects of Light andMonosulfuron on growth and PhotosyntheticPigments of Anabaena flos-aquae Breb,Water Resource and Protection, 2009,1 :408_413》、《鄭培忠，沈健英；有機溶劑丙酮對固 氮藍(lán)藻生長效應(yīng)的研究，上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010. 4 :33-38))等中公開。
水華魚腥藻能固定大氣中的游離氮，是固氮藍(lán)藻的一種。它生長繁殖迅速，固氮量達(dá)10_51kg/ha，其藻體沉入土壤后可被作物根系吸收，特有的藻促生長素能促進(jìn)作物茁壯生長，使作物增產(chǎn)10-30%，因此這是一種良好的有機肥。而農(nóng)用化學(xué)肥料和農(nóng)藥的生產(chǎn)、施用又會帶來大量的溫室氣體排放，因此開發(fā)農(nóng)業(yè)生物固氮技術(shù)，降低化肥施用量，是當(dāng)前發(fā)展低碳農(nóng)業(yè)的重要途徑。
水華魚腥藻的用途主要有提取天然色素、藻膽蛋白和多糖，藻毒素研究及利用，生物固氮及其他方面等。用途雖多，但是因為水華魚腥藻含水量高導(dǎo)致容易霉變，占用體積大導(dǎo)致難以運輸，施用不方便導(dǎo)致不能大面積推廣，因而不便于利用。為了大量并且方便應(yīng)用這種藍(lán)藻，可以通過施加某些條件，誘導(dǎo)厚壁孢子大量生成，再把水華魚腥藻的藻液干燥，制備成干藻粉，以便長距離運輸和長時間保存。在自然條件下，厚壁孢子比營養(yǎng)細(xì)胞的存活率要高很多，應(yīng)用稻田后更容易萌發(fā)?，F(xiàn)有的水華藍(lán)藻中已知含有微量的厚壁孢子，厚壁孢子不僅耐低溫，就是在高溫下也不易死亡。天然存在的厚壁孢子因為極微量，所以應(yīng)用于稻田后萌發(fā)率不高，肥效不明顯。
目前為止國內(nèi)外對水華藍(lán)藻的異形胞有所研究，而對水華藍(lán)藻厚壁孢子的誘導(dǎo)的研究則幾乎沒有。公開號為CN 1380901A的專利文獻(xiàn)，公開了大量生產(chǎn)Trichodermaherzianum SK-55的菌絲體的厚壁抱子的方法。Trichoderma herzianum SK-55屬于真菌，而水華魚腥藻則屬于細(xì)菌，尚未見關(guān)于水華魚腥藻厚壁孢子大量生產(chǎn)的技術(shù)公開。
藍(lán)藻的干燥方法有很多有攤開在玻璃板上干燥，有放置在大瓷盤里干燥，還有直接在大小培養(yǎng)皿里干燥，但是這些干燥方法都很難把干燥的藍(lán)藻收集儲存。本發(fā)明的簡易干燥方法是把倒去培養(yǎng)液的水華魚腥藻轉(zhuǎn)移到滅過菌的覆蓋有塑料膜的大培養(yǎng)皿或瓷盤中，待干燥時藍(lán)藻會自動與塑料膜剝離，非常便于收集。

發(fā)明內(nèi)容
[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種水華魚腥藻厚壁孢子的誘導(dǎo)技術(shù)及其干藻粉的制備方法，針對目前大力推廣低碳農(nóng)業(yè)，減少化肥和農(nóng)藥的施用，提高有機肥的用量和肥效的政策，和水華藍(lán)藻的含水量高、占用體積大，不便于運輸保存的弊端，以及水華魚腥藻不便于收獲的缺陷，本發(fā)明提供了一種以水華藍(lán)藻為原料，外加理化條件大量誘導(dǎo)厚壁孢子形成并借助塑料膜制備干藻粉的高效安全方便的生產(chǎn)肥料的技術(shù)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
本發(fā)明涉及水華魚腥藻厚壁孢子的一種誘導(dǎo)方法，使用含有磷酸氫二鉀、檸檬酸鐵、鑰酸和碳酸鈣的液體培養(yǎng)基在PH調(diào)到6-7，蔗糖或葡萄糖調(diào)到80-100mg/L的條件下培養(yǎng)水華魚腥藻3-4天，實現(xiàn)水華魚腥藻厚壁孢子的誘導(dǎo)。
所述的水華魚腥藻是指將含水量約10%的水華魚腥藻干藻粉密閉保存于4°C的冰箱中兩周后取出，轉(zhuǎn)移到加有培養(yǎng)液的小燒杯中并用打藻機打碎。
所述的培養(yǎng)液的組分為75g/L磷酸氫二鉀、10g/L檸檬酸鐵、10g/L鑰酸、100g/L 碳酸鈣，余量為50g/L的土壤提取液。
所述的在pH調(diào)到6-7的環(huán)境下培養(yǎng)是指將水華魚腥藻以接種量為280_300mg/L接種在液體培養(yǎng)基中，在光強為3000±200Lx，溫度為30±2°C，pH為6_7的環(huán)境下定時開
蓋攪拌培養(yǎng)。
所述的定時是指每天在同一個時間段攪拌一次。
所述的攪拌是指借助滅過菌的三角棒或玻璃棒或移液槍把細(xì)胞打散打勻。
本發(fā)明涉及上述水華魚腥藻厚壁孢子的干藻粉的制備方法，通過將所述水華魚腥藻厚壁孢子平鋪瓷盤中，置于35-40°C的烘箱烘干或30°C的無菌室中干燥3-5天得到干藻粉。
所述的平鋪是指采用厚度不超過Icm的高度平鋪在瓷盤底部且使其均勻散開。
所述的瓷盤是指鋪有滅過菌的塑料膜的白瓷盤。
本發(fā)明的優(yōu)點在于有效的理化條件大量提高了厚壁孢子的含量；簡易的干燥方式可以更加高效的收獲干藻粉；以水華藍(lán)藻為原料制備干藻粉的方法涉及的工藝簡單；月巴料施用安全高效，易于推廣實施；實施后不會對環(huán)境、食品安全造成新的污染；所以本發(fā)明具有極大的理論價值和應(yīng)用價值。


圖I是本發(fā)明中水華魚腥藻厚壁孢子的誘導(dǎo)及其干藻粉制備的原理圖
圖2是實施例中在不同pH的誘導(dǎo)條件下，水華魚腥藻厚壁孢子在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量。
圖3是實施例中在不同培養(yǎng)液的誘導(dǎo)條件下，水華魚腥藻厚壁孢子在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量。
圖4是實施例中在不同保存溫度的誘導(dǎo)條件下，水華魚腥藻厚壁孢子在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量。
圖5是實施例中水華魚腥藻的三類細(xì)胞。
圖6是實施例中水華魚腥藻厚壁孢子的透射電鏡圖。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例I
主要材料氫氧化鈉、鹽酸、蔗糖、培養(yǎng)液、干藻粉、塑料膜、大瓷盤。
如圖I所示，具體方案是稱取O. Olg左右的水華干藻粉，溶解在含有IOmL培養(yǎng)液的小燒杯中，用75%酒精滅菌的打藻機打碎3次，每次10s，再把藻液轉(zhuǎn)移到90X 15mm的小培養(yǎng)皿中，用培養(yǎng)液沖洗燒杯再倒在培養(yǎng)皿中,最后培養(yǎng)皿補加培養(yǎng)液到35mL。用氫氧化鈉和鹽酸將pH調(diào)到6，然后加3mg蔗糖于培養(yǎng)皿中，最后放置在光強為3000±200Lx、溫度為30±2°C的無菌室中培養(yǎng)。一般培養(yǎng)3天后厚壁孢子含量將達(dá)到峰值，此時倒出多余培養(yǎng)液，保留水華魚腥藻。再把藍(lán)藻轉(zhuǎn)移到滅過菌的覆蓋有塑料膜的大瓷盤中，平鋪厚度不超 過1cm，并且使其均勻散開，置于30°C的光照室，大概3-5天后水華魚腥藻將會自動與薄膜剝離，非常容易收獲。
顯微計數(shù)在培養(yǎng)第三天，取樣進(jìn)行顯微計數(shù)，經(jīng)計算得知，細(xì)胞總數(shù)為6. 15X105個/mL，厚壁孢子數(shù)為I. 03 X IO5個/mL，占細(xì)胞總數(shù)的16.75%。
如圖5所示，為實施例中水華魚腥藻的三類細(xì)胞；對應(yīng)如圖6所示,為水華魚腥藻厚壁孢子的透射電鏡圖。
實施例2
主要材料氫氧化鈉、鹽酸、葡萄糖、培養(yǎng)液、干藻粉、塑料膜、大瓷盤。
具體方案是稱取O. Olg左右的水華干藻粉，溶解在含有IOmL培養(yǎng)液的小燒杯中，用75%酒精滅菌的打藻機打碎3次，每次10s，再把藻液轉(zhuǎn)移到90X 15mm的小培養(yǎng)皿中，用培養(yǎng)液沖洗燒杯再倒在培養(yǎng)皿中，最后培養(yǎng)皿補加培養(yǎng)液到35mL。用氫氧化鈉和鹽酸將pH調(diào)到6，然后加3mg葡萄糖于培養(yǎng)皿中，最后放置在光強為3000±200Lx、溫度為30±2°C的無菌室中培養(yǎng)。一般培養(yǎng)3天后厚壁孢子含量將達(dá)到峰值，此時倒出多余培養(yǎng)液，保留水華魚腥藻。再把藍(lán)藻轉(zhuǎn)移到滅過菌的覆蓋有塑料膜的大瓷盤中，平鋪厚度不超過1cm，并且使其均勻散開，置于30°C的光照室，大概3-5天后水華魚腥藻將會自動與薄膜剝離，非常容易收獲。
顯微計數(shù)在培養(yǎng)第三天，取樣進(jìn)行顯微計數(shù)，經(jīng)計算得知，細(xì)胞總數(shù)為1.02X106個/mL，厚壁孢子數(shù)為I. 13 X IO5個/mL，占細(xì)胞總數(shù)的11.08%。
實施例3
主要材料氫氧化鈉、鹽酸、葡萄糖、培養(yǎng)液、干藻粉、塑料膜、大培養(yǎng)皿、烘箱。
具體方案是稱取O. Olg左右的水華干藻粉，溶解在含有IOmL培養(yǎng)液的小燒杯中，用75%酒精滅菌的打藻機打碎3次，每次10s，再把藻液轉(zhuǎn)移到90X 15mm的小培養(yǎng)皿中，用培養(yǎng)液沖洗燒杯再倒在培養(yǎng)皿中，最后培養(yǎng)皿補加培養(yǎng)液到35mL。用氫氧化鈉和鹽酸將pH調(diào)到7，然后加3mg葡萄糖于培養(yǎng)皿中，最后放置在光強為3000±200Lx、溫度為30±2°C的無菌室中培養(yǎng)。一般培養(yǎng)3天后厚壁孢子含量將達(dá)到峰值，此時倒出多余培養(yǎng)液，保留水華魚腥藻。再把藍(lán)藻轉(zhuǎn)移到滅過菌的覆蓋有塑料膜的150 X 15_大培養(yǎng)皿中，平鋪厚度不超過1cm，并且使其均勻散開，置于40°C的烘箱中干燥，大概12h后水華魚腥藻將會自動與薄膜剝離，非常容易收獲。
顯微計數(shù)在培養(yǎng)第三天，取樣進(jìn)行顯微計數(shù)，經(jīng)計算得知，細(xì)胞總數(shù)為8. 23 X IO5個/mL，厚壁孢子數(shù)為I. 53 X IO5個/mL，占細(xì)胞總數(shù)的18. 59%。
實施例4
主要材料氫氧化鈉、鹽酸、蔗糖、培養(yǎng)液、干藻粉、塑料膜、大培養(yǎng)皿、烘箱。
具體方案是稱取O. Olg左右的水華干藻粉，溶解在含有IOmL培養(yǎng)液的小燒杯中，用75%酒精滅菌的打藻機打碎3次，每次10s，再把藻液轉(zhuǎn)移到90X 15mm的小培養(yǎng)皿中，用培養(yǎng)液沖洗燒杯再倒在培養(yǎng)皿中，最后培養(yǎng)皿補加培養(yǎng)液到35mL。用氫氧化鈉和鹽酸將pH調(diào)到7，然后加3mg蔗糖于培養(yǎng)皿中，最后放置在光強為3000±200Lx、溫度為30±2°C的無菌室中培養(yǎng)。一般培養(yǎng)3天后厚壁孢子含量將達(dá)到峰值，此時倒出多余培養(yǎng)液，保留水華魚腥藻。再把藍(lán)藻轉(zhuǎn)移到滅過菌的覆蓋有塑料膜的150 X 15_大培養(yǎng)皿中，平鋪厚度不超過 Icm,并且使其均勻散開，置于40°C的烘箱中干燥，大概12h后水華魚腥藻將會自動與薄膜剝離，非常容易收獲。
顯微計數(shù)在培養(yǎng)第三天，取樣進(jìn)行顯微計數(shù)，經(jīng)計算得知，細(xì)胞總數(shù)為5.83X105個/mL，厚壁孢子數(shù)為I. 15 X IO5個/mL，占細(xì)胞總數(shù)的19. 73%。
以上實施例不是對本發(fā)明的限制，具體實施時可以在權(quán)利要求
限定的范圍內(nèi)按一定比例配制大體積的培養(yǎng)液，如IOOmL培養(yǎng)液中加9mg葡萄糖或鹿糖,加O. 03g水華干藻粉；轉(zhuǎn)移水華時可以用滅過菌的覆蓋有塑料膜的大瓷盤。如圖2-圖4所示，為在不同pH、不同培養(yǎng)液、不同保存溫度誘導(dǎo)條件下，水華魚腥藻厚壁孢子在連續(xù)培養(yǎng)7天的含量比較。
權(quán)利要求
1.一種水華魚腥藻厚壁孢子的誘導(dǎo)方法，其特征在于，使用含有磷酸氫二鉀、檸檬酸鐵、鑰酸和碳酸鈣的液體培養(yǎng)基在添加蔗糖或葡萄糖80-100mg/L的基礎(chǔ)上，pH調(diào)到6_7的環(huán)境下培養(yǎng)水華魚腥藻3-4天，實現(xiàn)厚壁孢子的誘導(dǎo)； 所述的水華魚腥藻是指將含水量10%的水華魚腥藻干藻粉密閉保存于4°C的冰箱中兩周后取出，轉(zhuǎn)移到加有培養(yǎng)液的小燒杯中并用打藻機打碎； 所述的培養(yǎng)液的組分為75g/L磷酸氫二鉀、10g/L檸檬酸鐵、10g/L鑰酸、100g/L碳酸鈣，余量為50g/L 土壤浸提液； 所述的在pH調(diào)到6-7的環(huán)境下培養(yǎng)是指通過添加氫氧化鈉和鹽酸，將pH調(diào)為6-7的環(huán)境下定時開蓋攪拌培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的水華魚腥藻厚壁孢子的誘導(dǎo)方法，其特征是，所述的定時是指每天在同一個時間段攪拌一次。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的水華魚腥藻厚壁孢子的誘導(dǎo)方法，其特征是，所述的攪拌是指借助滅過菌的三角棒或玻璃棒或移液槍把細(xì)胞打散打勻。
4.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求
所述方法制備得到水華魚腥藻厚壁孢子的干藻粉的制備方法，其特征在于，通過將所述水華魚腥藻厚壁孢子平鋪瓷盤中，置于35-40°C的烘箱烘干或30°C的無菌室中干燥3-5天得到干藻粉；所述的瓷盤是指覆蓋有塑料膜的白色的瓷盤。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的干藻粉的制備方法，其特征是，所述的平鋪是指采用厚度不超過Icm的高度平鋪在瓷盤底部且使其均勻散開。
專利摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域：
的水華魚腥藻厚壁孢子的誘導(dǎo)方法，使用含有磷酸氫二鉀、檸檬酸鐵、鉬酸和碳酸鈣的液體培養(yǎng)基在添加土壤提取液、蔗糖或葡萄糖的基礎(chǔ)上，在pH調(diào)到6-7的環(huán)境下培養(yǎng)水華魚腥藻3-4天，實現(xiàn)厚壁孢子的誘導(dǎo)。再將所述的水華魚腥藻平鋪于瓷盤或150×15mm的大培養(yǎng)皿中，置于35-40℃的烘箱烘干或30℃的無菌室中干燥3-5天得到干藻粉。本發(fā)明有效的理化條件大量提高了厚壁孢子的含量；簡易的干燥方式可以更加高效的收獲干藻粉；以水華藍(lán)藻為原料制備干藻粉的方法涉及的工藝簡單；肥料施用安全高效，易于推廣實施；實施后不會對環(huán)境、食品安全造成新的污染；所以本發(fā)明具有極大的理論價值和應(yīng)用價值。
文檔編號C12N3/00GKCN102242078 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201110046706
公開日2013年1月9日 申請日期2011年2月25日
發(fā)明者沈健英, 萬旗東, 鄭培忠, 陳瑞 申請人:上海交通大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (4),