專利名稱:單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物、試劑盒和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物、試劑盒和檢測方法。
背景技術(shù)：
單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)(以下簡稱“單增李斯特菌”)是一種重要的人畜共患病致病菌，廣泛存在于土壤、動物和水產(chǎn)品等，主要通過奶及奶制品、蔬菜、水產(chǎn)品、肉制品等食物傳播。該菌已被列為90年代4大食品致病菌之一，成為許多國家食品衛(wèi)生的必檢項(xiàng)目。
傳統(tǒng)的單增李斯特菌生化檢測方法全過程至少需要7 10d，檢出限較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。免疫法比較快，但單克隆抗體制備比較困難，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性差。而PCR或熒光定量PCR方法快速，特異、靈敏度很高，但需要昂貴的PCR儀。國外曾有少量文獻(xiàn)報(bào)道利用mRNA模板針對iap基因以RT-PCR檢測活體單增李斯特氏菌，但需要以膜雜交來顯示檢測結(jié)果，時(shí)間長、技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)用高，不易推廣應(yīng)用。熒光染色技術(shù)可以對活菌進(jìn)行檢測，但技術(shù)復(fù)雜，需要高端儀器。因此建立一種簡便、靈敏、快速、特異的方法很有必要。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplication,簡稱LAMP)(國際專利公開號W000/28082)是2000年Notomi等開發(fā)出的一種核酸擴(kuò)增新技術(shù)，針對待測靶基因序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)一套兩對特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在65°C左右等溫條件下能夠特異性、高效、快速的進(jìn)行核酸擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果可直接對擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過肉眼進(jìn)行判斷或檢測其濁度，也可用結(jié)合雙鏈的熒光染料優(yōu)選SYBR Green I染色，即可通過肉眼判定。由于LAMP技術(shù)擴(kuò)增的兩對引物是針對靶基因的6個(gè)區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時(shí)是等溫條件下即不需PCR儀等特殊儀器，且樣品的前處理非常簡單、單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增效率更高等優(yōu)點(diǎn)，已引起人們的關(guān)注。
中國發(fā)明專利(申請?zhí)枮?200710030435.0,200710030437. X,200710132320. 2,200710026389. 7,200810052321. 0,200810015001. 8,200810093986. 6)分別公開了采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢測病菌的方法。但是，目前還沒有用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢測單增李斯特菌的試劑盒的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有單增李斯特菌的檢測方法不簡便、靈敏低、時(shí)間長、特異性差的技術(shù)缺陷。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplication,LAMP)技術(shù)快速檢測用引物；本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供使用上述檢測用引物的試劑盒；本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供使用上述檢測用引物的試劑盒檢測方法。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法具有簡便、靈敏、快速、特異好的特點(diǎn)，可廣泛用可廣泛用于食品、水產(chǎn)品、化妝品與醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域。[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案
單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物，所述的引物為一套單增李斯特菌特征性引物組，一套引物組由兩對引物組成，一對引物為外引物，一對為內(nèi)引物，共有六套引物，序列分別為
弓丨物組一
外引物I :CAAGCACTGTAGTAGTCGA外引物2 : CGTAATAATACTGTTATCAACACC
內(nèi)引物 I :GTTTGCTTTTTTAATTGCGTCAACATTTTAGCTGGTGATACTCTTTGG
內(nèi)引物 2 ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG
或引物組二
外引物I :GGTGATACTCTTTGGGGTAT
外引物2 : CGTAATAATACTGTTATCAACACC
內(nèi)引物 I :GACCTGGTACGATTTTATCTGTTGTTTTTCGCACAAAGTAAAGGGAC
內(nèi)引物 2 ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG 或弓丨物組三
外引物I TTAAACGTCCGTACTGGC
外引物2 : CACTTCTTGTGTTGGTGC
內(nèi)引物 I :CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGITTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA
內(nèi)引物 2 GCTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 或弓丨物組四
外引物I :ACTGGITTCGTTAACGGTAA
外引物2 : TGTCACCGCTTTTGACAG
內(nèi)引物 I :AGGTGCAGCTTGTTGAGTAGTAGTITTGCAGTAAGCACTCCAGTTG
內(nèi)引物 2 CCTGCGCCTAAAGTAGCAGAATTTTGTGTGTAGTAGCATTTTGATCT 或弓I物組五
外引物I TTAAACGTCCGTACTGGC
外引物2 : CACTTCTTGTGTTGGTGC
內(nèi)引物 I : CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGTTTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA
內(nèi)引物 2 CTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 或弓丨物組六
外引物I :GGTAACGGACCAACTACA
外引物2 : TCATTTGACCATTACCAACAT
內(nèi)引物 I : TGTACGTGGAAGGGAGATACCTTTTTGATTGCTCTGGTTACACT
內(nèi)引物 2 : TCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTTTTTCGTGAGAAATTCCGCTACC。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案
單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括上述技術(shù)方案中的任意一組引物組、反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、樣品預(yù)處理液和陽性對照液。
作為優(yōu)選，所述的引物組由體積比為I :1 4 4的20-30 μ M外引物I、外引物2、內(nèi)引物I與內(nèi)引物2組成。
作為優(yōu)選,所述的反應(yīng)液是由體積比為5 2 1 2的IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、7. 5 12. 5mM dNTP, 100 200mM MgSO4與25 37. 5M甜菜堿組成。作為再優(yōu)選，所述的IOXThermopol反應(yīng)緩沖液含有200mM pH8. 8三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和體積百分比濃度為I %曲拉通X-100。[0039]作為優(yōu)選，所述的Bst DNA聚合酶每微升含8 16個(gè)活性單位。
作為優(yōu)選，所述的樣品預(yù)處理液是由20mM pH8. OTris-HCl，2mM EDTA,體積百分比濃度為I. 2%曲拉通X-100。
作為優(yōu)選，所述的該試劑盒還包括顯色劑，顯色劑為熒光染料。優(yōu)選熒光染料為SYBR Green I ；
作為優(yōu)選，所述的陽性對照液為單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案
單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測方法，采用上述的任意一個(gè)技術(shù)方案所述的試劑盒，該方法包括以下的步驟
I)單增李斯特菌DNA的提取A、取50ul過夜培養(yǎng)的增菌液于印pendorf管中， IOOOrpm離心2min，棄上清；B、加入80ul樣品預(yù)處理液于離心管中，與沉淀所得菌體混合均勻；C、沸水中煮IOmin后立即冷卻IOmin ;D、IOOOOrpm離心2min,上清即可作為待檢的模板DNA ；
2)反應(yīng)體系為2. 5μ L引物組、5μ L反應(yīng)液、I μ LBst DNA聚合酶、2 μ L待檢模板DNA或陽性對照液和14. 5 μ L ddH20 ；
3)單增李斯特菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增將配制好的PCR管于60 65V反應(yīng)I
I.5h，80°C終止反應(yīng)；
4)分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果在反應(yīng)產(chǎn)物中加入2. 5ul熒光染料，混勻，靜置5min，若顯現(xiàn)綠色則為陽性，橙色則為陰性；或者，通過肉眼觀察鑒定，與陰性對照管比較顯示，檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。
本發(fā)明所說的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermalamplication,簡稱LAMP)，快速檢測樣品單增李斯特菌的方法是利用Bst DNA聚合酶和根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)的兩對特殊的內(nèi)、外引物，特異性識別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動互補(bǔ)鏈合成，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖一環(huán)DNA混合物。進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(簡稱LAMP反應(yīng))過程中，從dNTP
析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物-----焦磷酸鎂乳白色沉淀，即
可通過肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(65°C左右)條件下45至90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時(shí)間長、容易污染及檢測成本高等缺點(diǎn)。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增法。將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，而且檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)。國內(nèi)目前尚未有這方面的試劑盒出售。目前國家標(biāo)準(zhǔn)中以微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié)合生化分析和血清學(xué)分型鑒定的通行方法，初步鑒定需2-3天，完成鑒定報(bào)告需10至15天；采用本發(fā)明中的基因診斷試劑盒檢測僅需2小時(shí)。并且，本發(fā)明的反應(yīng)液中添加了熒光染料，鑒定結(jié)果更為直觀清晰。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(I)、不需要特殊試劑與設(shè)備；(2)、高特異性應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，陽性率可達(dá)大于99.9%，假陽性率小于O. 1% ; (3)、快速、高效擴(kuò)增檢測時(shí)間2小時(shí)左右；(4)、靈敏度高擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少，最低檢測極限達(dá)到10CFU/ml ;標(biāo)本的檢出率達(dá)到99% ； (5)、鑒定簡便通過肉眼觀察鑒定，無需電泳等其他任何分析步驟，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，可通過肉眼觀察鑒定；加入熒光染料后，陽性結(jié)果顯色為綠色，陰性結(jié)果為橙色，更加明顯可靠；￠)、用途廣可廣泛用于食品、水產(chǎn)品、化妝品與醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域安全快速檢測
具體實(shí)施方式
下面提供具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用不限于實(shí)施例。
實(shí)施例I試劑盒的制備
本發(fā)明所提供的基因診斷試劑盒是由一套引物組，一套引物組包括兩對引物，BstDNA聚合酶，反應(yīng)液，樣品預(yù)處理液，顯色劑與陽性對照液等組成。
(I)其中所說的引物有6套，分別為
引物組一
外引物I :CAAGCACTGTAGTAGTCGA
外引物2 : CGTAATAATACTGTTATCAACACC
內(nèi)引物 I : GTTTGCTTTTTTAATTGCGTCAACATTTTAGCTGGTGATACTCTTTGG
內(nèi)引物 2 ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG 或弓丨物組二
外引物I : GGTGATACTCTTTGGGGTAT
外引物2 : CGTAATAATACTGTTATCAACACC
內(nèi)引物 I :GACCTGGTACGATITTATCTGTTGTITTTCGCACAAAGTAAAGGGAC
內(nèi)引物 2 ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG 或弓丨物組三
外引物I :TTAAACGTCCGTACTGGC
外引物2 : CACTTCTTGTGTTGGTGC
內(nèi)引物 I : CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGTTTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA
內(nèi)引物 2 GCTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 或弓丨物組四
外引物I :ACTGGITTCGTTAACGGTAA
外引物2 : TGTCACCGCTTTTGACAG
內(nèi)引物 I :AGGTGCAGCTTGTTGAGTAGTAGTITTGCAGTAAGCACTCCAGTTG
內(nèi)引物 2 CCTGCGCCTAAAGTAGCAGAATTTTGTGTGTAGTAGCATTTTGATCT 或弓I物組五
外引物I TTAAACGTCCGTACTGGC
外引物2 : CACTTCTTGTGTTGGTGC
內(nèi)引物 I : CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGTTTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA
內(nèi)引物 2 CTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 或弓丨物組六
外引物I :GGTAACGGACCAACTACA
外引物2 TCATTTGACCATTACCAACAT
內(nèi)引物 I : TGTACGTGGAAGGGAGATACCTTTTTGATTGCTCTGGTTACACT[0079]內(nèi)引物 2 : TCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTTTTTCGTGAGAAATTCCGCTACC
引物由I 1 4 4的20-30 μ M外引物I、外引物2、內(nèi)引物I與內(nèi)引物2組成
(2)反應(yīng)液為由 5 :2 1 2 的 IOXThermopol 反應(yīng)緩沖液、7. 5-12. 5mMdNTP,100-200mM MgS04與25-37. 5M甜菜堿組成；其中，10 X Thermopol反應(yīng)緩沖液含有200mMpH8. 8三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和體積百分比濃度為I %曲拉通X-100 ；
(3) Bst DNA聚合酶為Bst DNA polymerase,每微升含8個(gè)活性單位；
(4)樣品預(yù)處理液為20mM pH8. OTris-HCl，2mM EDTA,體積百分比濃度為I. 2%曲拉通x-100組成；
(5)顯色劑為熒光染料，優(yōu)選SYBR Green I ；
(6)陽性對照液為單增李斯特菌基因組DNA。
實(shí)施例2檢測方法
被檢樣品將少許食品或體液等被檢樣品置于增菌液中37°C培養(yǎng)。
(I)、對被檢樣品的預(yù)處理按常規(guī)方法提取DNA基因
A、取50ul過夜培養(yǎng)的增菌液于eppendorf管中，IOOOrpm離心2分鐘，棄上清；
B、加入80ul樣品預(yù)處理液于離心管中，與沉淀所得菌體混合均勻；
C、沸水中煮10分鐘后立即冷卻10分鐘；
D、IOOOOrpm離心2分鐘，上清即可作為待用的模板DNA。
(2)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過程
A、在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物混合物2. 5ul，反應(yīng)液5. Oul,BstpolymeraseLarge Fragmentlul (8U),準(zhǔn)備好的模板 DNA2ul,加 14. 5ul ；
B、將配制好的PCR管于65°C反應(yīng)1-1. 5h，80°C終止反應(yīng)。
(3)、分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果在反應(yīng)產(chǎn)物中加入2. 5ul熒光染料(SYBRGREENI)，混勻，靜置5min，若顯現(xiàn)綠色則為陽性，橙色則為陰性。
序列表
〈110〉中國計(jì)量學(xué)院
〈120〉單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物、試劑盒和檢測方法
<160>24
<210>1
<211>19
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>1
CAAGCACTGTAGTAGTCGA 19
<210>2
<211>24
<212>DNA[0111]〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>2

CGTAATAATACTGTTATCAACACC 24<210>3
<211>48
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>3
GTTTGCTTTTTTAATTGCGTCAACATTTTAGCTGGTGATACTCTTTGG 48
<210>4
<211>48
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>4
ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG 48
<210>5
<211>20
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>5

GGTGATACTCTTTGGGGTAT 20
<210>6
<211>24
<212>DNA
>213〉人工序列
〈223〉引物
<400>6

CGTAATAATACTGTTATCAACACC 24
<210>7
<211>47
<212>DNA[0146]〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>7

GACCTGGTACGATTTTATCTGTTGTTTTTCGCACAAAGTAAAGGGAC 47
<210>8〈211>45
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
〈400>8

ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG 48
<210>9
<211>18
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>9

TTAAACGTCCGTACTGGC 18
<210>10
<211>18
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>10


CACTTCTTGTGTTGGTGC 18
<210>11
<211>51
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>11
CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGTTTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA 5I
<210>12
<211>48
<212>DNA[0181]〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>12
GCTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 48
<210>13
<211>20
<212>DNA〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>13

ACTGGTTTCGTTAACGGTAA 20
<210>14
<211>18
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>14

TGTCACCGCTTTTGACAG 18
<210>15
〈211 >46
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
〈400〉15
AGGTGCAGCTTGTTGAGTAGTAGTTTTGCAGTAAGCACTCCAGTTG 46
<210>16
<211>47
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>16
CCTGCGCCTAAAGTAGCAGAATTTTGTGTGTAGTAGCATTTTGATCT 47
<210>17
<211>18
<212>DNA[0216]〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>17


TTAAACGTCCGTACTGGC 18
<210>18[0221]<211>18
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
〈400〉18

CACTTCTTGTGTTGGTGC 18
<210>19
<211>51
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
〈400〉19
CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGTTTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA 5I
〈210>20
〈211>48
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>20
CTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 48
<210>21
<211>18
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>21

GGTAACGGACCAACTACA 18
<210>22
<211>21
<212>DNA[0251]〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>22

TCATTTGACCATTACCAACAT 21
〈210>23
<211>44
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>23

TGTACGTGGAAGGGAGATACCTTTTTGATTGCTCTGGTTACACT 44
<210>24
<211>47
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物<400>24
TCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTTTTTCGTGAGAAATTCCGCTACC 47
權(quán)利要求
1.單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物，其特征在于所述的引物為一套單增李斯特菌特征性引物組，一套引物組由兩對引物組成，一對引物為外引物，一對為內(nèi)引物，序列分別為 外引物 I GGTGATACTCTTTGGGGTAT 外引物 2 CGTAATAATACTGTTATCAACACC
內(nèi)引物 I :GACCTGGTACGATITTATCTGTTGTITTTCGCACAAAGTAAAGGGAC
內(nèi)引物 2 ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTGo
2.單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括如權(quán)利要求
I所述的引物組、反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、樣品預(yù)處理液和陽性對照液。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于所述的引物組由體積比為I : I : 4 : 4的20-30 μ M外引物I、外引物2、內(nèi)引物I與內(nèi)引物2組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于所述的反應(yīng)液是由體積比為5 : 2 : I : 2的IOXThermopol反應(yīng)緩沖液、7. 5 12. 5mM dNTP, 100-200mM MgSO4 與 25 37. 5M 甜菜堿組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于所述的IOXThermopol反應(yīng)緩沖液含有200mM pH8. 8三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和體積百分比濃度為I %曲拉通X-100。
6.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于Bst DNA聚合酶每微升含8 16個(gè)活性單位。
7.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于樣品預(yù)處理液是由20mM pH 8. O Tris_HCl，2mM EDTA，體積百分比濃度為I. 2%曲拉通X-100組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括顯色劑，顯色劑為熒光染料。
9.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測試劑盒，其特征在于陽性對照液為單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA。
專利摘要
本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物、試劑盒和檢測方法。單增李斯特菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物，所述的引物為一套單增李斯特菌特征性引物組，一套引物組由兩對引物組成，一對引物為外引物，一對為內(nèi)引物，共有六套引物。本發(fā)明的試劑盒由一套引物、反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、樣品預(yù)處理液、顯色劑和陽性對照液等組成；檢測方法包括細(xì)菌DNA的提取、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增和顯色檢測等。使用本試劑盒通過對樣品簡單的處理便可快速檢測樣品中的單增李斯特菌，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單、通過肉眼即可判定結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/04GKCN101368203 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200810121029
公開日2012年8月8日 申請日期2008年9月16日
發(fā)明者傅小偉, 劉軍, 唐喬, 張明洲, 方結(jié)紅, 方美明, 胡華軍, 陳宗倫, 龔云飛 申請人:中國計(jì)量學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),