本發(fā)明屬于多肽的制備領(lǐng)域，具體是涉及一種地龍多肽組及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、公開該背景技術(shù)部分的信息旨在增加對(duì)本發(fā)明總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

2、創(chuàng)面不愈為外科治療難題，據(jù)統(tǒng)計(jì)占外科總住院人數(shù)的1.5%~3%，而瘢痕的形成是人體組織創(chuàng)傷修復(fù)過程中不可避免的產(chǎn)物，其組織學(xué)特征在于成纖維細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉淀。瘢痕組織早期過度愈合或后期過度萎縮均會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響，如皮膚外觀改變及功能障礙等。而發(fā)于下肢的難愈性創(chuàng)面又因其易潰、難斂、易反復(fù)發(fā)作、病程長、嚴(yán)重者導(dǎo)致骨髓炎、少數(shù)有癌變可能等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及身心健康，已經(jīng)成為臨床亟待解決的問題。

3、對(duì)于創(chuàng)面的治療西醫(yī)多集中于抗感染、生物敷料、負(fù)壓吸引治療、抗生素骨水泥、高壓氧、植皮及皮瓣修復(fù)、手術(shù)等治療措施，有一定療效，但缺乏安全有效的加速創(chuàng)面愈合的積極措施。所以，尋找一種溫和的替代藥物對(duì)于治療創(chuàng)面來說至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種地龍多肽組及其制備方法和應(yīng)用，該地龍多肽組可用于制備皮膚創(chuàng)面愈合或消除瘢痕藥物，該應(yīng)用消除了服用異蛋白等引起的免疫原反應(yīng)，減小了不良反應(yīng)發(fā)生率。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、一種地龍多肽組，所述多肽組由特征多肽1和特征多肽2組成；其中特征多肽1的氨基酸序列為valsviqr（seq?id?no.1），特征多肽2的氨基酸序列為vipslngk（seq?id?no.2）。

4、進(jìn)一步地，上述地龍多肽組的制備方法，采用以下步驟：

5、（1）將地龍粉碎過篩，加水，加熱煮沸；

6、（2）將步驟（1）得到的混合溶液冷卻后，調(diào)節(jié)ph值，酶解，煮沸后，分離純化；

7、（3）將步驟（2）得到的純化樣品處理后進(jìn)行l(wèi)c-tof-ms分析，得出活性多肽valsviqr（seq?id?no.1）和活性多肽vipslngk（seq?id?no.2）。

8、進(jìn)一步地，所述valsviqr（seq?id?no.1），命名為vr-8，即異纈氨酸-丙氨酸-亮氨酸-絲氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-谷氨酰胺-精氨酸，分子量為884.54?da，等電點(diǎn)為11.11，疏水指數(shù)為8.15?kcal·mol-1，水溶性較好。

9、進(jìn)一步地，所述vipslngk（seq?id?no.2），命名為vk-8，即纈氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-絲氨酸-亮氨酸-天冬酰-甘氨酸-賴氨酸，分子量為826.49?da，等電點(diǎn)為10.14，疏水指數(shù)為10.47?kcal·mol-1，水溶性較好。

10、進(jìn)一步地，步驟（2）中，所述酶解的方法為：混合溶液加熱煮沸后，冷至約35～45℃，調(diào)節(jié)ph值1.0～3.0，加入0.5～2%胃蛋白酶，40℃酶解1?h，調(diào)節(jié)ph值7.0～9.0，加入0.5～2%胰蛋白酶，保溫3～5?h，煮沸10～15?min；所述分離純化為3500～4500?rpm離心15～20min，電滲析或透析袋脫鹽后，上清液通過3?kd超濾膜超濾，進(jìn)行陽離子樹脂和rp-hplc半制備分離純化。

11、進(jìn)一步地，步驟（3）所述的lc-tof-ms分析的納升液相色譜分析柱條件：c18反相分析柱75?mm×20?cm×3?μm；流動(dòng)相a：99.9%水和0.1%甲酸混合液，流動(dòng)相b：80%乙腈和0.1%甲酸混合液；液相梯度洗脫為：0-2?min，2-6%?b；2-95?min，6-20%?b；95-107?min，20%-32%b；107-108?min，32-100%?b；108-120?min，100%?b；流動(dòng)相流速為300?nl/min；esi+模式，采用數(shù)據(jù)依賴性掃描模式，在分辨率為70000(agc?3e6)的軌道阱中進(jìn)行全掃描采集(m/z350-1800)，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能（nce）為28.0，毛細(xì)管的溫度是275℃，噴霧電壓是1800?v，ms2分辨率為17500?(agc?1e5)，全掃描和ms2掃描的最大填充時(shí)間分別設(shè)置為50?ms和45?ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為30?s。

12、進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述地龍粉碎過篩的標(biāo)準(zhǔn)目數(shù)為80目；所述加水質(zhì)量為地龍質(zhì)量的8～12倍；所述加熱煮沸時(shí)間為15～30?min。

13、一種上述地龍?zhí)卣鞫嚯慕M的應(yīng)用，其特征在于，所述地龍肽多肽組可用于制備皮膚創(chuàng)面愈合或消除瘢痕的藥物。

14、進(jìn)一步地，所述藥物包括所述地龍?zhí)卣鞫嚯慕M以及藥學(xué)上可接受的輔料。

15、進(jìn)一步地，所述輔料為制備水浸劑、粉劑、洗劑、酊劑、油劑、乳劑、軟膏、硬膏或氣霧劑中的一種所需的輔料。

16、一種上述地龍?zhí)卣鞫嚯慕M的應(yīng)用，所述地龍肽多肽組用于制備皮膚創(chuàng)面愈合或消除瘢痕的藥物。

17、進(jìn)一步地，所述藥物包括所述地龍?zhí)卣鞫嚯慕M以及藥學(xué)上可接受的輔料。

18、優(yōu)選地，所述輔料為制備水浸劑、粉劑、洗劑、酊劑、油劑、乳劑、軟膏、硬膏或氣霧劑中的一種所需的輔料。

19、有益效果：（1）本發(fā)明所述的多肽vr-8和vk-8純度高，安全有效，消除了服用異蛋白引起的免疫原反應(yīng)，減小了不良反應(yīng)發(fā)生率。

20、（2）現(xiàn)有技術(shù)中并沒有公開聯(lián)合使用vr-8肽和vk-8肽用于治療皮膚創(chuàng)面及瘢痕的報(bào)道，本發(fā)明為研究開發(fā)一種新型的治療藥物提供了參考。

21、（3）本發(fā)明的2種多肽結(jié)構(gòu)是地龍仿生酶解小分子肽類經(jīng)精制純化并經(jīng)分析得到的高含量、高活性的小分子生物活性肽成分，此2種小分子生物活性肽成分為首次發(fā)現(xiàn)，未見有關(guān)報(bào)道。

22、（4）本發(fā)明對(duì)地龍多肽的研究證實(shí)了其治療皮膚創(chuàng)面及瘢痕的藥用價(jià)值，為臨床應(yīng)用地龍肽治療皮膚創(chuàng)面及瘢痕提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為動(dòng)物藥活性肽物質(zhì)的開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持。

技術(shù)特征：

1.一種地龍多肽組，其特征在于，所述多肽組由特征多肽1和特征多肽2組成；其中特征多肽1的氨基酸序列為valsviqr，特征多肽2的氨基酸序列為vipslngk。

2.一種權(quán)利要求1所述地龍多肽組的制備方法，其特征在于，采用以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中，所述酶解的方法為：混合溶液加熱煮沸后，冷卻至35～45℃，調(diào)節(jié)ph值為1.0～3.0，加入0.5～2%胃蛋白酶，40℃酶解1?h，調(diào)節(jié)ph值為7.0～9.0，加入0.5～2%胰蛋白酶，保溫3～5?h，煮沸10～15?min。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中，所述分離純化的方法為采用3500～4500?rpm離心15～20?min，電滲析或透析袋脫鹽后，上清液通過3?kd超濾膜超濾，進(jìn)行陽離子樹脂和rp-hplc半制備分離純化。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（3）中，所述lc-tof-ms分析采用納升液相色譜分析柱，分析條件為：c18反相分析柱75?mm×20?cm×3μm；流動(dòng)相a：99.9%水和0.1%甲酸混合液，流動(dòng)相b：80%乙腈和?0.1%甲酸混合液；液相梯度洗脫為：0-2?min，2-6%b；2-95?min，6-20%b；95-107?min，20%-32%b；107-108?min，32-100%b；108-120?min，100%b；流動(dòng)相流速為300?nl/min。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（3）中，將步驟（2）得到的純化樣品處理的方法為：取1-5?mg純化樣品加入200?μl?25?mm碳酸氫銨溶液溶解，加入2?μl?1?m的dtt?60℃水浴放置>40?min，再加入8?μl新鮮配置的1?m碘乙酰胺，室溫避光放置30?min。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）中，所述地龍粉碎過篩的標(biāo)準(zhǔn)目數(shù)為80目；所述加水的操作為加入地龍質(zhì)量8～12倍的水；所述加熱煮沸時(shí)間為15～30min。

8.一種權(quán)利要求1所述地龍多肽組的應(yīng)用，其特征在于，所述地龍多肽組用于制備皮膚創(chuàng)面愈合或消除瘢痕的藥物。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物包括所述地龍多肽組以及藥學(xué)上可接受的輔料。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述輔料為制備水浸劑、粉劑、洗劑、酊劑、油劑、乳劑、軟膏、硬膏或氣霧劑中的一種所需的輔料。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于多肽的制備領(lǐng)域，特別涉及一種地龍多肽組及其制備方法和應(yīng)用。所述地龍多肽組氨基酸序列為VALSVIQR（SEQ?ID?NO.1）和VIPSLNGK（SEQ?ID?NO.2）。本發(fā)明通過對(duì)地龍粉碎過篩、加熱煮沸后進(jìn)行二次酶解，取上清液超濾、脫鹽后，分離純化，將該地龍肽經(jīng)LC?TOF?MS進(jìn)行分析，得出活性多肽結(jié)構(gòu)；本發(fā)明所述2種小分子生物活性多肽為首次發(fā)現(xiàn)，未見有關(guān)報(bào)道。本發(fā)明對(duì)所述地龍多肽的研究證實(shí)了其治療皮膚創(chuàng)面及瘢痕的藥用價(jià)值，為臨床應(yīng)用地龍多肽治療皮膚創(chuàng)面及瘢痕提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為動(dòng)物藥活性肽物質(zhì)的開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員：高鵬,李亞男,徐天任,于小鈞
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東中醫(yī)藥大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/28