免疫球蛋白嵌合單體-二聚體雜合體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫球蛋白嵌合單體-二聚體雜合體。本發(fā)明涉及嵌合單體-二聚體雜合體蛋白，其中所述蛋白包含第一和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)和生物活性分子，所述第二多肽鏈包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，不含第一鏈的生物活性分子。本發(fā)明還涉及本發(fā)明嵌合單體-二聚體雜合體蛋白的使用方法和制備方法。
【專利說明】免疫球蛋白嵌合單體-二聚體雜合體
[0001] 本申請(qǐng)是W下申請(qǐng)的分案申請(qǐng)：申請(qǐng)日；2004年5月6日；申請(qǐng)?zhí)枺?201110082150. 8 ;發(fā)明名稱；同上。
[0002] 本發(fā)明要求2003年5月6日提出的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/469, 600、2003年7月17日 提出的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/487, 964、2004年1月26日提出的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/539, 207 的優(yōu)先權(quán)，所有上述臨時(shí)申請(qǐng)通過引用整體結(jié)合到本文中。2004年5月6日同時(shí)申請(qǐng)的題 為''免疫球蛋白嵌合蛋白的化學(xué)合成方法"的美國非臨時(shí)申請(qǐng)通過引用結(jié)合到本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明主要涉及由兩條多膚鏈組成的治療性嵌合蛋白，其中第一鏈由治療性生物 活性分子組成，第二鏈不由第一鏈的治療性生物活性分子組成。更具體的說，本發(fā)明涉及由 兩條多膚鏈組成的嵌合蛋白，其中兩條鏈都由至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)組成，其中第 一鏈被修飾成進(jìn)一步包含生物活性分子，而第二鏈沒有被如此修飾。因此，本發(fā)明涉及為單 體-二聚體雜合體的嵌合蛋白，即具有二聚體方面和單體方面的嵌合蛋白，其中二聚體方 面涉及如下事實(shí)，即嵌合蛋白由兩條多膚鏈組成，每條鏈由一部分免疫球蛋白恒定區(qū)組成， 而單體方面涉及如下事實(shí)，即兩條鏈中只有一條鏈由治療性生物活性分子組成。圖1闡明 了單體-二聚體雜合體的一個(gè)實(shí)例，其中生物活性分子是促紅細(xì)胞生成素巧P0)，免疫球蛋 白恒定區(qū)部分是IgGFc區(qū)。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 免疫球蛋白由四條多膚鏈組成，其中兩條是重鏈，另兩條是輕鏈，它們通過二硫鍵 結(jié)合，形成四聚體。每條鏈還由一個(gè)可變區(qū)和一個(gè)恒定區(qū)組成?？勺儏^(qū)介導(dǎo)抗原識(shí)別與結(jié) 合，而恒定區(qū)特別是重鏈恒定區(qū)介導(dǎo)多種效應(yīng)子功能，例如補(bǔ)體結(jié)合和化受體結(jié)合（參見 例如美國專利 6, 086, 875 成 624, 821 ;5, 116, 964)。
[0006] 恒定區(qū)還由表示為CH(恒定區(qū)重鏈）結(jié)構(gòu)域（CH1、C肥等）的結(jié)構(gòu)域組成。取決于 同種型（即IgG、IgM、IgA、I曲、I班），恒定區(qū)可由H個(gè)或四個(gè)CH結(jié)構(gòu)域組成。一些同種型 (例如 IgG)恒定區(qū)還包含較鏈區(qū)（Janeway等，2001，Immunobiology，Ga;rlandPublishing， N. Y. , N. Y.) 〇
[0007] 已有文獻(xiàn)描述了由目的蛋白或其片段與免疫球蛋白恒定區(qū)連接組成的嵌 合蛋白的構(gòu)建（參見例如美國專利5, 480, 981和5, 808, 029 ;Gascoi即e等，1987， Proc.化1:1. Acad. Sci. USA84 : 2936 ;Capon 等，1989，Nature337 : 525 ;Traunecker 等，1989， Nature339:68 ;Zettmeissl 等，1990， DNACellBiol.USA9:347 ;Byrn 等， 1990, Nature344:667 ;Watson 等，1990, J. Cell. Biol. 110:2221 ;Watson 等，1991， 化1:山"6；349:164 ;Aruffo 等，1990，Cell61:1303 ;Linsley 等，1991，J. Exp. Med. 173:721 ; Linsley 等，1991，J.Exp. Med. 174:561 ;Stamenkovic 等，1991，Cell66:1133 ;Ashkenazi 等， 1991，Proc.P'Jatl. Acad. Sci.USA88:10535 ;Lesslauer 等，1991，Eur.J. Immunol. 27:2883 ; P邱pel 等，1991，J. Exp. Med. 174:1483 ;Bennett 等，1991，J. Biol. Chem. 266:23060 ; Kurschner 等，1992，J. Biol. Qiem. 267:9354 ;Chalupny 等，1992，Proc.P'Jatl. Acad. Sci. USA89:10360 ;Ridgway 和 Gorman, 1991，JCellBiol. 115，摘要號(hào) 1448 ;Zheng 等，1995， J. Immun. 154:5590)。該些分子通常具有與所連接的目的分子相關(guān)的生物活性W及效應(yīng)子 功能，或者某些與免疫球蛋白恒定區(qū)相關(guān)的其他合乎需要的特性（例如生物穩(wěn)定性、細(xì)胞 分泌）。
[0008] 取決于免疫球蛋白的同種型，免疫球蛋白恒定區(qū)的化部分可包括C肥、C冊(cè)和 CH4結(jié)構(gòu)域W及較鏈區(qū)。包含免疫球蛋白化部分的嵌合蛋白賦予嵌合蛋白某些合乎需要 的性質(zhì)，包括穩(wěn)定性提高、血清半壽期提高（參見Capon等，1989,化化re337:525) W及與 化受體如新生化受體（化化）的結(jié)合（美國專利6,086,875、6,485,726、6,030,613;W0 03/0778：M ;US2003-0235536A1)。
[0009] 化化活躍于成人上皮組織中，并表達(dá)于腸內(nèi)腔、肺氣道、鼻表面、陰道表面、結(jié)腸和 直腸表面（美國專利6, 485, 726)。包含化化結(jié)合配偶體（如IgG、化片段）的嵌合蛋白通 過化化能有效地穿過上皮屏障，從而提供了全身性給予所需治療性分子的非侵入性方法。 另外，包含化化結(jié)合配偶體的嵌合蛋白被表達(dá)化化的細(xì)胞所胞吞。但是該些嵌合蛋白不 是被標(biāo)記進(jìn)行降解，而是被再循環(huán)到體內(nèi)循環(huán)中，從而增加該些蛋白的體內(nèi)半壽期。
[0010] 免疫球蛋白恒定區(qū)各部分（例如化化結(jié)合配偶體）通常通過二硫鍵和其他非特 異性相互作用互相結(jié)合形成二聚體和更高等級(jí)的多聚體。本發(fā)明部分基于該樣的意外發(fā) 現(xiàn)，即包含F(xiàn)cRn結(jié)合配偶體的嵌合蛋白的胞轉(zhuǎn)作用似乎受限于嵌合蛋白的分子量，分子量 較高的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)效率較低。
[0011] 一旦給予包含生物活性分子的嵌合蛋白，其通常會(huì)與祀分子或細(xì)胞發(fā)生相互作 用。本發(fā)明還部分基于該樣的意外發(fā)現(xiàn)，即只有一個(gè)生物活性分子、但有兩個(gè)免疫球蛋白恒 定區(qū)部分（例如兩個(gè)化化結(jié)合配偶體）的單體-二聚體雜合體比同源二聚體（在本文中 也簡稱"二聚體"）或具有兩個(gè)或更多個(gè)生物活性分子拷貝的更高等級(jí)多聚體能更有效地發(fā) 揮功能和被轉(zhuǎn)運(yùn)。該在部分上是由于該樣一個(gè)事實(shí)，即包含兩個(gè)或多個(gè)生物活性分子、W二 聚體和更高等級(jí)的多聚體形式存在的嵌合蛋白，由于存在兩個(gè)或多個(gè)相互鄰近的生物活性 分子，且生物活性分子對(duì)其本身具有很高的親合性，在空間上會(huì)被阻礙與其祀分子或細(xì)胞 發(fā)生相互作用。
[0012] 因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供可被轉(zhuǎn)運(yùn)穿過上皮屏障的包含生物活性分子的嵌合 蛋白。本發(fā)明的另一方面提供包含至少一個(gè)能與其祀分子或細(xì)胞發(fā)生相互作用、而又少有 或沒有位阻或自身聚集作用的生物活性分子的嵌合蛋白。
[0013] 本發(fā)明各方面提供了包含第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白，第一鏈包含至少一部分 免疫球蛋白恒定區(qū)，其中免疫球蛋白恒定區(qū)部分已被修飾成包括生物活性分子，第二鏈包 含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，其中免疫球蛋白恒定區(qū)部分沒有同樣被修飾成包括第一 鏈的生物活性分子。
[0014] 發(fā)明概沐
[0015] 本發(fā)明涉及包含一個(gè)生物活性分子和兩個(gè)免疫球蛋白恒定區(qū)至少一部分分子的 嵌合蛋白。所述嵌合蛋白與由至少兩個(gè)生物活性分子和至少兩個(gè)疫球蛋白恒定區(qū)的一部分 組成的嵌合蛋白相比，能夠W較小的位阻與祀分子或細(xì)胞發(fā)生相互作用。本發(fā)明還涉及包 含至少一個(gè)生物活性分子和兩個(gè)免疫球蛋白恒定區(qū)至少一部分分子的嵌合蛋白，所述嵌合 蛋白比相應(yīng)的同源二聚體（即其中兩條鏈連接到同一個(gè)生物活性分子上）能更有效地轉(zhuǎn)運(yùn) 穿過上皮屏障。因此，本發(fā)明涉及包含連接在一起的第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白，其中所 述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，所述第二鏈包含至少一部分 免疫球蛋白恒定區(qū)，但不含免疫球蛋白可變區(qū)并不連接有任何生物活性分子。
[0016] 本發(fā)明涉及包含連接在一起的第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包 含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白 恒定區(qū)，但不含免疫球蛋白可變區(qū)或任何生物活性分子，且其中所述第二鏈不與分子量大 于lkD、2kD、5kD、10kD或20kD的任何分子共價(jià)連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二鏈不與分子 量大于0-2kD的任何分子共價(jià)連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二鏈不與分子量大于5-lOkD的 任何分子共價(jià)連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二鏈不與分子量大于15-20kD的任何分子共價(jià) 連接。
[0017] 本發(fā)明涉及包含連接在一起的第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包 含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白 恒定區(qū)，所述部分不與除所述第一多膚鏈免疫球蛋白部分之外的任何其他分子共價(jià)連接。
[0018] 本發(fā)明涉及包含連接在一起的第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包 含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，所述第二鏈由至少一部分免疫球蛋白恒 定區(qū)和任選的親合標(biāo)記物組成。
[0019] 本發(fā)明涉及包含連接在一起的第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包 含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，所述第二鏈基本由至少一部分免疫球蛋 白恒定區(qū)和任選的親合標(biāo)記物組成。
[0020] 本發(fā)明涉及包含連接在一起的第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包 含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白 恒定區(qū)，但不含免疫球蛋白可變區(qū)或任何生物活性分子，任選包含分子量小于10kD、5kD、 2kD或IkD的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二鏈包含分子量小于15-20kD的分子。在一個(gè)實(shí) 施方案中，第二鏈包含分子量小于5-lOkD的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二鏈包含分子量 小于l-2kD的分子。
[0021] 本發(fā)明涉及包含第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包含生物活性分 子、至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)和至少第一結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域具有至少一種特異 性結(jié)合配偶體，其中所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)和至少第二結(jié)構(gòu)域，但 不含任何免疫球蛋白可變區(qū)或生物活性分子，其中所述第二結(jié)構(gòu)域是所述第一結(jié)構(gòu)域的特 異性結(jié)合配偶體。
[0022] 本發(fā)明涉及制備包含第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多膚鏈 和第二多膚鏈不相同，所述方法包括用包含編碼第一多膚鏈（包含生物活性分子和至少一 部分免疫球蛋白恒定區(qū)）的DNA分子和任選接頭的第一 DNA構(gòu)建物，及包含編碼第二多膚 鏈（包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，但不含任何生物活性分子或免疫球蛋白可變區(qū)） 的DNA分子和任選接頭的第二DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞；在第一 DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈得W表 達(dá)和第二DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈得W表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；分離包含第一 DNA構(gòu)建物編 碼多膚鏈和第二DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈的單體-二聚體雜合體。
[0023] 本發(fā)明涉及制備包含第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多膚鏈 和第二多膚鏈不相同，其中所述第一多膚鏈包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恒 定區(qū)和至少第一結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域具有至少一種特異性結(jié)合配偶體，其中所述第二 多膚鏈包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)和至少第二結(jié)構(gòu)域，其中所述第二結(jié)構(gòu)域是所述 第一結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合配偶體，但不含任何生物活性分子或免疫球蛋白可變區(qū)，所述方 法包括用包含編碼所述第一多膚鏈的DNA分子的第一 DNA構(gòu)建物，及包含編碼所述第二多 膚鏈的DNA分子的第二DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞；在第一 DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈得W表達(dá)和第 二DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈得W表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；分離由第一 DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈 和第二DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈組成的單體-二聚體雜合體。
[0024] 本發(fā)明涉及制備本發(fā)明嵌合蛋白的方法，所述方法包括用包含編碼第一多膚鏈 (包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)）的DNA分子和任選接頭的第一 DNA 構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞；在第一 DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈得W表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；分離第一 DNA 構(gòu)建物編碼的多膚鏈；用包含編碼第二多膚鏈（包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，但不 含任何生物活性分子或免疫球蛋白可變區(qū)）的DNA分子的第二DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞；在第 二DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈得W表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；分離第二DNA構(gòu)建物編碼的多膚鏈； 在包含第一 DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈和第二DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈的單體-二聚體雜合體得 W形成的條件下，合并第一 DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈和第二DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈；分離所述 單體-二聚體雜合體。
[0025] 本發(fā)明涉及制備包含第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多膚鏈 和第二多膚鏈不相同，所述方法包括用包含編碼多膚鏈（包含至少一部分免疫球蛋白恒定 區(qū)）的DNA分子的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞；在DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈得W表達(dá)，其N末端為半 脫氨酸，從而形成多膚鏈二聚體的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；分離由兩個(gè)拷貝的DNA構(gòu)建物編碼多 膚鏈組成的二聚體；并使分離的二聚體與生物活性分子在生物活性分子主要只與二聚體一 條多膚鏈反應(yīng)的條件下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，其中所述生物活性分子具有C末端硫醋，從而形成 單體-二聚體雜合體。
[0026] 本發(fā)明涉及制備包含第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多膚鏈 和第二多膚鏈不相同，所述方法包括用包含編碼多膚鏈（包含至少一部分免疫球蛋白恒定 區(qū)）的DNA分子的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞；在DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈得W表達(dá)，其N末端為半 脫氨酸，從而形成多膚鏈二聚體的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；分離由兩個(gè)拷貝的DNA構(gòu)建物編碼多 膚鏈組成的二聚體；使分離的二聚體與生物活性分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，其中所述生物活性分 子具有C末端硫醋，使得生物活性分子與二聚體的每條鏈連接；使由與生物活性分子連接 的免疫球蛋白部分組成的二聚體變性，形成單體鏈；將單體鏈與包含至少一部分免疫球蛋 白恒定區(qū)（其沒有連接生物活性分子）的多膚鏈結(jié)合，形成單體-二聚體雜合體；分離單 體-二聚體雜合體。
[0027] 本發(fā)明涉及制備包含第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多膚鏈 和第二多膚鏈不相同，所述方法包括用包含編碼多膚鏈（包含至少一部分免疫球蛋白恒定 區(qū)）的DNA分子的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染細(xì)胞；在W下條件下培養(yǎng)細(xì)胞：DNA構(gòu)建物編碼的多膚鏈 被表達(dá)為兩條多膚鏈的混合物，其中所述混合物包含具有N末端半脫氨酸的多膚和鄰近N 末端處具有半脫氨酸的多膚；分離由DNA構(gòu)建物編碼多膚鏈的混合物組成的二聚體；使分 離二聚體與生物活性分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，其中所述生物活性分子具有活性硫醋，從而形成 至少一些單體-二聚體雜合體；從所述混合物分離單體-二聚體雜合體。
[0028] 本發(fā)明涉及治療疾病或病癥的方法，所述方法包括給予本發(fā)明嵌合蛋白，從而治 療疾病或病癥。
[0029] 本發(fā)明另外的目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將在下述說明中進(jìn)行部分闡述，部分從下述說明中將容 易理解到，或可從本發(fā)明的實(shí)施中發(fā)現(xiàn)。通過所附權(quán)利要求書中具體指出的要素和組合，本 發(fā)明的目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將得W實(shí)現(xiàn)和達(dá)到。
[0030] 應(yīng)當(dāng)理解，W上概述和W下詳述只是示范性和說明性內(nèi)容，并不對(duì)要求保護(hù)的本 發(fā)明構(gòu)成限制。
[00引]附圖簡沐
[0032] 圖1是比較EPO-Fc同源二聚體或二聚體的結(jié)構(gòu)與EP0-FC單體-二聚體雜合體的 結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0033] 圖2a是嵌合蛋白VII因子-Fc的氨基酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其 被細(xì)胞切割，W及前膚（粗線），其被維生素K依賴性y駿化酶識(shí)別，所述駿化酶能修飾VII 因子，W獲得完全活性。所述序列隨后被PACE切割，產(chǎn)生VII因子-Fc。
[0034] 圖化是嵌合蛋白IX因子-Fc的氨基酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其 被細(xì)胞切割，W及前膚（粗線），其被維生素K依賴性y駿化酶識(shí)別，所述駿化酶能修飾IX 因子，W獲得完全活性。所述序列隨后被PACE切割，產(chǎn)生IX因子-Fc。
[00巧]圖2c是嵌合蛋白IFN a-化的氨基酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其被細(xì) 胞切割，產(chǎn)生成熟的IFNa -Fc。
[0036] 圖2d是嵌合蛋白IFNa-FcA接頭的氨基酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線）， 其被細(xì)胞切割，產(chǎn)生成熟的IFNa-Fc A接頭。
[0037] 圖2e是嵌合蛋白Flag-Fc的氨基酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其被細(xì) 胞切割，產(chǎn)生成熟的Flag-Fc。
[0038] 圖2f是嵌合蛋白化0-CCA-化的氨基酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其被 細(xì)胞切割，產(chǎn)生成熟的化o-CCA-Fc。酸性卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域也W粗線表示。
[0039] 圖2g是嵌合蛋白CCB-化的氨基酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其被細(xì)胞 切割，產(chǎn)生成熟的CCB-Fc。堿性卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域也W粗線表示。
[0040] 圖化是嵌合蛋白切S-化的氨基酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其被細(xì)胞 切割，產(chǎn)生成熟的切s-Fc。當(dāng)該序列在C冊(cè)細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)，一部分序列分子被信號(hào)膚酶不 正確地切割，使得在N末端保留兩個(gè)多余的氨基酸，從而防止具有C末端硫醋的生物活性分 子的連接（例如通過自然連接反應(yīng)）。當(dāng)該些不正確切割的序列分子與正確切割的切s-Fc 形成二聚體并隨后與具有C末端硫醋的生物活性分子反應(yīng)時(shí)，就形成單體-二聚體雜合體。 [00川圖2i是嵌合蛋白IFNa -GS15-FC的氨基酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線）， 其被細(xì)胞切割，產(chǎn)生成熟的IFNa -GS15-FC。
[0042] 圖2j是嵌合蛋白化0-化的氨基酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其被細(xì)胞 切割，產(chǎn)生成熟的化o-Fc。8氨基酸接頭也W粗線表示。
[0043] 圖3a是嵌合蛋白VII因子-Fc的核酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線）和被 維生素K依賴性Y駿化酶識(shí)別的前膚（粗線），所述駿化酶能修飾VII因子，W獲得完全活 性。翻譯序列隨后被PACE切割，產(chǎn)生成熟的VII因子-Fc。
[0044] 圖3b是嵌合蛋白IX因子-化的核酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線）和被維 生素K依賴性y駿化酶識(shí)別的前膚（粗線），所述駿化酶能修飾IX因子，W獲得完全活性。 翻譯序列隨后被PACE切割，產(chǎn)生成熟的IX因子-Fc。
[0045] 圖3c是嵌合蛋白IFN a-化的核酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其在翻譯 后被細(xì)胞切割，產(chǎn)生成熟的IFNa -Fc。
[0046] 圖3d是嵌合蛋白IFNa-FcA接頭的核酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其 在翻譯后被細(xì)胞切割，產(chǎn)生成熟的IFNa-Fc A接頭。
[0047] 圖3e是嵌合蛋白Flag-Fc的氨基酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其在翻 譯后被細(xì)胞切割，產(chǎn)生成熟的Flag-Fc。
[0048] 圖3f是嵌合蛋白化0-CCA-化的核酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其在翻 譯后被細(xì)胞切割，產(chǎn)生成熟的化o-CCA-Fc。酸性卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域也W粗線表示。
[0049] 圖3g是嵌合蛋白CCB-化的核酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其在翻譯后 被細(xì)胞切割，產(chǎn)生成熟的CCB-Fc。堿性卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域也W粗線表示。
[0050] 圖化是嵌合蛋白切S-化的核酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其在翻譯后 被細(xì)胞切割，產(chǎn)生成熟的切s-Fc。
[005。 圖3i是嵌合蛋白IFNa -GS15-FC的核酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其 在翻譯后被細(xì)胞切割，產(chǎn)生成熟的IFNa -GS15-FC。
[0052] 圖3j是嵌合蛋白化0-化的核酸序列。該序列包括信號(hào)膚（下劃線），其在翻譯后 被細(xì)胞切割，產(chǎn)生成熟的化o-Fc。編碼8氨基酸接頭的核酸序列也W粗線表示。
[0053] 圖4表示通過自然連接反應(yīng)形成單體-二聚體雜合體的方法。
[0054] 圖5a顯示化MESNA的氨基酸序列（SEQ ID N0:4)。
[00巧]圖化顯示化MESNA的DNA序列（SEQ ID NO: W。
[0056] 圖6比較IFN a同源二聚體（即由2個(gè)IFN a分子組成）和IFN a單體-二聚體 雜合體（即包含1個(gè)IFNa分子）的抗病毒活性。
[0057] 圖7是Vila因子-Fc嵌合單體-二聚體雜合體（一個(gè)VII因子分子）和Vila因 子-化嵌合同源二聚體（兩個(gè)VII因子分子）的凝血活性的比較。
[0058] 圖8比較Vila因子-Fc嵌合單體-二聚體雜合體（一個(gè)VII因子分子）和Vila 因子-化嵌合同源二聚體（兩個(gè)VII因子分子）在新生大鼠中的口服劑量。
[0059] 圖9比較IX因子-化嵌合單體-二聚體雜合體（一個(gè)IX因子分子）和嵌合同源 二聚體在新生大鼠中的口服劑量。
[0060] 圖10是比較口服給予新生大鼠IX因子-化嵌合單體-二聚體雜合體（一個(gè)IX 因子分子）和口服給予嵌合同源二聚體的時(shí)間進(jìn)程研究。
[0061] 圖11說明肺部單劑量給藥后與化o-Fc單體-二聚體雜合體相比化o-Fc二聚體 在食蟹猴（cynomolgus monkey)中的藥物動(dòng)力學(xué)。
[0062] 圖12比較皮下給藥的化0-化單體-二聚體雜合體和皮下給藥的Aranesp?' (阿 法達(dá)貝泊?。┰诤镏械难鍧舛取?br> [006引圖13比較靜脈內(nèi)給藥的Epo-Fc單體-二聚體雜合體和靜脈內(nèi)給藥的Ai'anesp ' (阿法達(dá)貝泊?。┖虴pogen? (阿法依泊?。┰诤镏械难鍧舛?。
[0064]圖 14 顯示獲自 Mimetic Red2? 柱（；ProMetic LifeSciences，Inc.，Wayne, NJ)的 曲線及含化O化單體-二聚體雜合體、Epo化二聚體和化的柱級(jí)份的SDS-PAGE。Epo化單 體-二聚體雜合體出現(xiàn)在級(jí)份n、12、13和14。Epo化二聚體出現(xiàn)在級(jí)份18。化出現(xiàn)在級(jí) 份 1/2。
[006引圖15顯示肺部單劑量給藥后帶有8氨基酸接頭的IFN目化在食蟹猴中的藥物動(dòng) 力學(xué)。
[0066] 圖16顯示食蟹猴中應(yīng)答IFN目-Fc同源二聚體和IFN目-FCN297A單體-二聚體雜 合體的新蝶嶺刺激作用。
[0067] 圖17a顯示目干擾素-化的核巧酸序列；圖1化顯示目干擾素-化的氨基酸序 列。
[006引 圖18顯示T20(a)、T21化）和T1249(c)的氨基酸序列。
[0069] 連施方案的說明
[0070] A.定義
[0071] 親合標(biāo)記物，在本文中用W指與另一個(gè)目的分子連接的分子，其能夠與特異性結(jié) 合配偶體相互作用，W分離或鑒定所述另一個(gè)目的分子。
[0072] 本發(fā)明嵌合蛋白或者與本發(fā)明嵌合蛋白實(shí)際等同的蛋白質(zhì)或膚的類似物，在本 文中用W指蛋白質(zhì)或膚的相關(guān)氨基酸序列與特定序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %、97 %、98 %、99 %或100 %的一致性。舉例說，該種序列可W是衍自各種物種的 變體，或者它們可W通過截短、缺失、氨基酸置換或添加從特定序列衍生。兩個(gè)氨基酸序列 之間的一致性百分率通過標(biāo)準(zhǔn)的比對(duì)算法確定，所述算法例如Altschul等，1990, J.Mol. Biol. ,215:403-410 中描述的基本局部比對(duì)工具炬LAST) ;Needleman 等，1970, J. Mol. Biol.，48:444-453 的算法；IVteyers 等，1988，Comput. Appl. Biosci.，4:11-17 的算法；或 者 hUisova 等，1999,陽MSMicrobiol. Lett.，174:247-250 等。該些算法整合到 BLASTN、 BLASTP和"BLAST2序列"程序中（參見WWW. ncbi. nim. nih. gov/BLAST)。當(dāng)采用該些程序時(shí)， 可W使用缺省參數(shù)。例如，對(duì)于核巧酸序列，W下設(shè)置可用于"BLAST2序列程序BLASTN、 匹配獎(jiǎng)分2、錯(cuò)配罰分-2、開放空位罰分和拓展空位罰分分別為5和2、gapx_^opofT50、期 望值10、字長11、濾器開。對(duì)于氨基酸序列，W下設(shè)置可用于"BLAST2序列程序BLASTP、 矩陣化0SUM62、開放空位罰分和拓展空位罰分分別11和l、gapx_^opofT50、期望值10、字 長3、濾器開。
[0073] 生物利用度，在本文中用W指某物質(zhì)被吸收到生命系統(tǒng)中或在生理活動(dòng)位點(diǎn)可得 W利用的程度和速度。
[0074] 生物活性分子，在本文中用W指能夠在生物背景中（例如在生物體、細(xì)胞或它們 的體外模型中）治療疾病或病癥，或者通過發(fā)揮某種功能或作用，或通過刺激或應(yīng)答某種 功能、作用或反應(yīng)，將某種分子局限于或祀向體內(nèi)疾病或病癥位點(diǎn)的非免疫球蛋白分子或 其片段。生物活性分子可包括至少多膚、核酸、小分子（如有機(jī)或無機(jī)小分子）之一。
[0075] 嵌合蛋白，在本文中用W指由衍自第一來源的第一氨基酸序列與衍自第二來源的 第二氨基酸序列共價(jià)或非共價(jià)連接組成的任何蛋白質(zhì)，其中第一和第二來源不相同。互不 相同的第一來源和第二來源可包括兩種不同的生物實(shí)體，或同一生物實(shí)體的兩種不同的蛋 白質(zhì)，或某種生物實(shí)體和某種非生物實(shí)體。嵌合蛋白可包括例如衍自至少兩種不同生物來 源的蛋白質(zhì)。生物來源可包括任何非合成法產(chǎn)生的核酸或氨基酸序列（例如基因組或cDNA 序列、質(zhì)?；虿《据d體、天然病毒顆?；蛘呱鲜鋈魏我环N的突變體或類似物（如本文的進(jìn) 一步描述））。合成來源可包括通過化學(xué)法而不是通過生物系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或核酸序列 (例如氨基酸序列的固相合成）。嵌合蛋白也可包括衍自至少兩種不同的合成來源的蛋白 質(zhì)或者衍自至少一種生物來源和至少一種合成來源的蛋白質(zhì)。嵌合蛋白還可包含衍自第一 來源的、與衍自任何來源的核酸或者衍自任何來源的有機(jī)或無機(jī)小分子共價(jià)或非共價(jià)連接 的第一氨基酸序列。嵌合蛋白在第一和第二氨基酸序列之間，或在第一氨基酸序列和核酸 之間，或在第一氨基酸序列和有機(jī)或無機(jī)小分子之間，可包含接頭分子。
[0076] 凝血因子，在本文中用W指在患有止血病癥的對(duì)象中防止或縮短出血發(fā)作持續(xù)時(shí) 間的任何天然或重組產(chǎn)生的分子或其類似物。換句話說，凝血因子指具有凝血活性的任何 分子。
[0077] 凝血活性，在本文中用W指參與最終導(dǎo)致形成血纖蛋白塊和/或減少出血或流血 發(fā)作的嚴(yán)重性、持續(xù)時(shí)間或頻率的生化反應(yīng)級(jí)聯(lián)的能力。
[0078] 二聚體，在本文中用W指包含第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白，其中所述第一和第 二多膚鏈均包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)。同源二聚體指其中兩個(gè)生 物活性分子相同的二聚體。
[0079] W二聚體形式連接的單體-二聚體雜合體指包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū) (例如免疫球蛋白的化片段）、生物活性分子和連接上述兩者從而使一個(gè)生物活性分子與 兩條多膚鏈（每條鏈包含一部分免疫球蛋白恒定區(qū)）結(jié)合的接頭的嵌合蛋白。圖4給出W 二聚體形式連接的單體-二聚體雜合體的一個(gè)實(shí)例。
[0080] DNA構(gòu)建物，在本文中用W指該樣的單鏈或雙鏈DNA分子或該種分子的克隆，所述 DNA分子已通過人工干預(yù)而被修飾，從而含有W某種方式結(jié)合在一起的各DNA區(qū)段，所述方 式使得所述各區(qū)段作為整體不會(huì)在自然界中另外存在。DNA構(gòu)建物含有指導(dǎo)目的多膚的表 達(dá)所需的信息。DNA構(gòu)建物可包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。含有指導(dǎo)目的多膚分泌所 需信息的DNA構(gòu)建物也含有至少一種分泌信號(hào)序列。
[0081] 結(jié)構(gòu)域，在本文中用W指多膚（根據(jù)該個(gè)術(shù)語的定義，包括蛋白質(zhì)）中具有某些區(qū) 別性物理特征或功能的區(qū)域，包括例如由多膚鏈的一段組成的獨(dú)立折疊結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域可含 有多膚的區(qū)別性物理特征序列，或可含有保留其結(jié)合特性（即其能結(jié)合第二結(jié)構(gòu)域）的物 理特征片段。結(jié)構(gòu)域可與另一結(jié)構(gòu)域聯(lián)合。換句話說，第一結(jié)構(gòu)域可自然結(jié)合第二結(jié)構(gòu)域。
[0082] 片段，在本文中用W指包含具有至少2個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘 基、至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至 少25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少40個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少50個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少100 個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或至少200個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列，或者包含蛋白質(zhì)、膚或多 膚的任何缺失或截短的膚或多膚。
[0083] 止血，在本文中用W指停止流血或出血；或者停止血液流過血管或身體部位。
[0084] 止血障礙，在本文中用W指由于血纖蛋白塊形成能力受損或無此能力導(dǎo)致的、W 自發(fā)性或創(chuàng)傷性出血傾向?yàn)樘卣鞯倪z傳性或獲得性病癥。
[0085] 連接，在本文中用W指第一核酸序列與第二核酸序列共價(jià)結(jié)合。第一核酸序列可 直接與第二核酸序列直接結(jié)合或并列，或者插入序列可將第一序列與第二序列共價(jià)結(jié)合。 連接在本文中也可用W指第一氨基酸序列與第二氨基酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合。第一氨基 酸序列可直接與第二氨基酸序列直接結(jié)合或并列，或者插入序列可將第一氨基酸序列與第 二氨基酸序列共價(jià)結(jié)合。
[0086] 有效連接，在本文中用W指第一核酸序列與第二核酸序列連接，從而兩個(gè)序列都 能夠被表達(dá)為生物活性蛋白質(zhì)或膚。
[0087] 多膚，在本文中用W指氨基酸聚合物，但不是指特定長度的產(chǎn)物；因此，膚、寡膚和 蛋白質(zhì)都包括在多膚的定義內(nèi)。該個(gè)術(shù)語并不排斥多膚的表達(dá)后修飾，例如糖基化、己醜 化、磯酸化、聚己二醇化、脂質(zhì)部分的添加或者任何有機(jī)或無機(jī)分子的添加。包括在此定義 內(nèi)的例如有含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物（包括例如非天然氨基酸）的多膚和含有取代鍵 的多膚，W及其他本領(lǐng)域公知的天然或非天然修飾的多膚。
[0088] 高嚴(yán)格性，在本文中用W包括技術(shù)人員根據(jù)例如DNA的長度容易確定的條件。通 常，該種條件在 Sambrook 等，Molecular Cloning:A L油oratory Manual,第 2 版，第 1 卷， 1.101-104 頁，Cold Spring Harbor L油oratory Press(1989)中定義，包括使用硝酸纖 維素濾膜預(yù)漂洗溶液；5X SSC，0. 5%SDS，1.0mM邸TA(P服.0);雜交條件；50%甲醜胺，6X SSC，42°C (或其他類似的雜交溶液如Stark溶液，50%甲醜胺中，42C);和漂洗條件；約 68°C，0.2X SSC，0. 1% SDS。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，溫度和漂洗溶液鹽濃度可根據(jù)例如探針的 長度等因素按需要進(jìn)行調(diào)整。
[0089] 中等嚴(yán)格性，在本文中用W包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)例如DNA的長度容易 確定的條件。Sambrook 等，Molecular Cloning:A L油oratory Manual,第 2 版，第 1 卷， 1. 101-104 頁，Cold Spring Harbor L油oratory Press (1989)規(guī)定了基本的條件，包括使 用硝酸纖維素濾膜預(yù)漂洗溶液；5X SSC，0. 5% SDS，1. OmM邸TA(p服.0);雜交條件；50%甲 醜胺，6X SSC，42°C (或其他類似的雜交溶液如Stark溶液，50%甲醜胺中，42C);和漂洗 條件；6(TC，0. 5X SSC，0. 1 % SDS。
[0090] 無機(jī)小分子，在本文中用W指不含碳原子且不大于50kD的分子。
[0091] 有機(jī)小分子，在本文中用W指含至少一個(gè)碳原子且不大于50kD的分子。
[0092] 治療，在本文中用W指W下任何一項(xiàng)；降低疾病或病癥的嚴(yán)重性；減少疾病過程 持續(xù)時(shí)間；改善與疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀；為患有疾病或病癥的對(duì)象提供有益 效果，而不必治愈疾病或病癥；預(yù)防與疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀。
[0093] B.本發(fā)明一些實(shí)施方案提供的改進(jìn)效果
[0094] 本發(fā)明提供包含第一和第二多膚鏈的嵌合蛋白（單體-二聚體雜合體），其中所述 第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，所述第二鏈包含至少一部分免 疫球蛋白恒定區(qū)，但不含任何生物活性分子或免疫球蛋白的可變區(qū)。圖1將傳統(tǒng)的融合蛋 白二聚體與本發(fā)明單體-二聚體雜合體的一個(gè)實(shí)例進(jìn)行對(duì)比。
[0095] 如同其他包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)的嵌合蛋白一樣，本發(fā)明提供的嵌合 蛋白與單獨(dú)的生物活性分子相比，其穩(wěn)定性提高，生物利用度增加。而且此外，由于嵌合蛋 白的兩條鏈中只有一條包含生物活性分子，所述嵌合蛋白的分子量比其中所有的鏈均包含 生物活性分子的嵌合蛋白更低，雖然不想園于任何理論，但該確會(huì)導(dǎo)致嵌合蛋白更容易地 例如通過與化化受體結(jié)合而被胞轉(zhuǎn)穿過上皮屏障，從而增加嵌合蛋白的半壽期。在一個(gè)實(shí) 施方案中，本發(fā)明因此提供給予本發(fā)明治療性嵌合蛋白的改進(jìn)非侵入性方法（例如通過任 何黏膜表面如口腔、口頰、舌下、鼻、直腸、陰道，或者通過肺部或眼部途徑）。本發(fā)明因此提 供與前述嵌合蛋白（例如由至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)和生物活性分子組成的嵌合蛋 白，其中嵌合蛋白所有的鏈均包含生物活性分子）相比，使用更低頻率和更少劑量而達(dá)到 本發(fā)明嵌合蛋白的治療水平的方法。
[0096] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供給予本發(fā)明治療性嵌合蛋白的侵入性方法，例如 皮下、靜脈內(nèi)給藥。本發(fā)明治療性嵌合蛋白的侵入性給藥方法能增加治療性嵌合蛋白的半 壽期，結(jié)果與前述嵌合蛋白（例如由至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)和生物活性分子組成的 嵌合蛋白，其中嵌合蛋白所有的鏈均包含生物活性分子）相比，可采用更低頻率和更少劑 量。
[0097] 其中只有一條鏈包含生物活性分子的嵌合蛋白的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，其與其中所有的 鏈均包含生物活性分子的嵌合蛋白相比，由于位阻減少、疏水作用減少、離子相互作用減少 或分子量降低，生物活性分子對(duì)祀細(xì)胞或分子的可達(dá)性提高。
[009引 C.嵌合蛋白
[0099] 本發(fā)明涉及包含一個(gè)生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)和任選至少一 個(gè)接頭的嵌合蛋白。所述免疫球蛋白部分須同時(shí)具有N末端或氨基末端和C末端或駿基末 端。所述嵌合蛋白可含有與所述免疫球蛋白部分的N末端連接的生物活性分子?；蛘?，生 物活性分子可與所述免疫球蛋白部分的C末端連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接鍵是共價(jià)鍵。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接鍵是非共價(jià)鍵。
[0100] 嵌合蛋白可任選包含至少一個(gè)接頭；因此，生物活性分子不必直接與免疫球蛋白 恒定區(qū)部分連接。接頭可插入在生物活性分子和免疫球蛋白恒定區(qū)部分中間。接頭可連接 到免疫球蛋白恒定區(qū)部分的N末端，或免疫球蛋白恒定區(qū)部分的C末端。如果生物活性分 子包含至少一個(gè)氨基酸，該生物活性分子須具有N末端和C末端，接頭可連接到生物活性分 子的N末端，或生物活性分子的C末端。
[0101] 本發(fā)明涉及式X-Lg-F:F或F:F-Lg-X的嵌合蛋白，其中X是生物活性分子，L是任 選的接頭，F(xiàn)是至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，a是任何任何整數(shù)或零。本發(fā)明還涉及式 L-X-L,-F:F或L-F:F-L,-X的嵌合蛋白，其中X是生物活性分子，L是任選的接頭，F(xiàn)是至 少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，a是任何任何整數(shù)或零，T是第二接頭或者可用W幫助嵌合蛋 白純化的標(biāo)記，例如FLAG標(biāo)記、組氨酸標(biāo)記、GST標(biāo)記、麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)記，（:）表示化學(xué) 締合作用，例如至少一個(gè)非膚鍵。在某些實(shí)施方案中，化學(xué)締合作用即（:）是共價(jià)鍵。在其 他實(shí)施方案中，化學(xué)締合作用即（:）是非共價(jià)鍵，例如離子相互作用、疏水相互作用、親水 相互作用、范德華相互作用和氨鍵。技術(shù)人員應(yīng)能理解，當(dāng)a等于0時(shí)，X將直接與F連接。 因此，例如，a可W是〇、1、2、3、4、5或大于5。
[0102] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明嵌合蛋白包含圖2a的氨基酸序列（SEQ ID NO:6)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明嵌合蛋白包含圖化的氨基酸序列（SEQ ID NO:8)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明嵌合蛋白包含圖2c的氨基酸序列（SEQ ID NO: 10)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明嵌合蛋白包含圖2d的氨基酸序列（SEQ ID NO: 12)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明嵌合蛋白 包含圖2e的氨基酸序列（SEQ ID N0:14)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明嵌合蛋白包含圖2f 的氨基酸序列（SEQ ID NO: 16)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明嵌合蛋白包含圖2g的氨基酸序 列（SEQ ID NO: 18)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明嵌合蛋白包含圖化的氨基酸序列（SEQ ID N0:20)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明嵌合蛋白包含圖2i的氨基酸序列（SEQ ID N0:22)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明嵌合蛋白包含圖2j的氨基酸序列（SEQ ID N0:24)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明嵌合蛋白包含圖17b的氨基酸序列（SEQ ID N0:27)。
[0103] 1.嵌合蛋白變體
[0104] 本發(fā)明嵌合蛋白的衍生物、抗本發(fā)明嵌合蛋白的抗體和抗本發(fā)明嵌合蛋白結(jié)合配 偶體的抗體均被考慮在內(nèi)，它們可通過置換、添加和/或缺失/截短從而改變氨基酸序列， 或者通過引入能導(dǎo)致產(chǎn)生功能相當(dāng)分子的化學(xué)修飾來制備。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)能理解 至IJ，任何蛋白質(zhì)序列中的某些氨基酸可被其他氨基酸置換，而不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的活性產(chǎn)生不 利的影響。
[0105] 在本發(fā)明嵌合蛋白的氨基酸序列或其DNA編碼序列中可制造各種變化，而又不 明顯喪失本發(fā)明嵌合蛋白的活性、功能或效用。由該種變化產(chǎn)生的衍生物、類似物或突變 體及該種衍生物的應(yīng)用都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在某個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述衍生物具有 功能活性，即能夠表現(xiàn)出與本發(fā)明嵌合蛋白相關(guān)的一種或多種活性，例如化化結(jié)合、病毒 抑制、止血、紅細(xì)胞生成。有許多能夠檢測(cè)包含生物活性分子的嵌合蛋白的活性的試驗(yàn)法 為本領(lǐng)域所公知。在生物活性分子是HIV抑制劑的情況中，可通過使用公知方法測(cè)量逆 轉(zhuǎn)酶活性來檢測(cè)活性（參見例如Barre-Sinoussi等，1983，Science220:868 ;Gallo等， 1984, Science224:500)。或者，可通過測(cè)量促融活性來檢測(cè)活性（參見例如Nussbaum等， 1994, J.Virol.68巧）：5411)。在生物活性為止血的情況中，可進(jìn)行StaCLot FVIIa-rTF 試驗(yàn)來評(píng)估Vila因子衍生物的活性（Johannessen等,2000, Blood Coagulation and Fibrinolysisll:S159)。
[0106] 序列中氨基酸的置換物可選自該氨基酸所屬類別的其他成員（參見表1)。此 夕F，各種氨基酸通常都用中性氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、額氨酸、脯氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸和甲硫氨酸來置換（參見例如MacLennan等，1998，Acta化ysiol.Scand. Su卵 1. 643:55-67 ;Sasaki 等，1998, Adv. Biophys. 35:1-24)。
[0107] 衷 1 [010 引
【權(quán)利要求】
1. 一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈，其中所述第一鏈包含生物活 性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，其中所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恒定 區(qū)，不含生物活性分子或免疫球蛋白可變區(qū)。
2. -種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈，其中所述第一鏈包含生物活 性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，其中所述第二鏈由至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū) 和任選的親合標(biāo)記組成。
3. -種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈，其中所述第一鏈包含生物活 性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，其中所述第二鏈基本由至少一部分免疫球蛋白恒 定區(qū)和任選的親合標(biāo)記組成。
4. 一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈， a) 其中所述第一鏈包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)和具有至少一種 特異性結(jié)合配偶體的第一結(jié)構(gòu)域； b) 其中所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白，但不含生物活性分子或免疫球蛋白可 變區(qū)，進(jìn)一步包含第二結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域是所述第一結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合配偶體。
5. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的嵌合蛋白和藥物可接 受賦形劑。
6. -種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈， a) 其中所述第一鏈包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)和具有至少一種 特異性結(jié)合配偶體的第一結(jié)構(gòu)域； b) 其中所述第二鏈由至少一部分免疫球蛋白、第二結(jié)構(gòu)域和任選的親合標(biāo)記組成，所 述第二結(jié)構(gòu)域是所述第一結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合配偶體。
7. -種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈， a) 其中所述第一鏈包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)和具有至少一種 特異性結(jié)合配偶體的第一結(jié)構(gòu)域； b) 其中所述第二鏈基本由至少一部分免疫球蛋白、第二結(jié)構(gòu)域和任選的親合標(biāo)記組 成，所述第二結(jié)構(gòu)域是所述第一結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合配偶體。
8. -種下式的嵌合蛋白 X-La-F:F 或 F:F-La-X 其中X是生物活性分子，L是接頭，F(xiàn)是至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，a是任何整數(shù)或 零。
9. 一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含連接在一起的第一和第二多肽鏈，其中所述第一 鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，所述第二鏈包含至少一部分免疫球 蛋白恒定區(qū)，但不含第一鏈的生物活性分子，且其中所述第二鏈不與分子量大于2kD的任 何分子共價(jià)連接。
10. -種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含連接在一起的第一和第二多肽鏈，其中所述第一 鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，所述第二鏈包含至少一部分免疫球 蛋白恒定區(qū)，除所述第一多肽鏈的免疫球蛋白部分之外不與任何其他分子共價(jià)連接。
【文檔編號(hào)】C07K16/44GK104448003SQ201410443460
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2004年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2003年5月6日
【發(fā)明者】R.T.彼得斯, A.R.梅佐, D.S.賴夫拉, A.J.比通蒂, J.M.斯塔特爾, S.C.羅 申請(qǐng)人:血友病生物基因Idec有限公司