專利名稱：一種聯(lián)合診斷胃病或評價胃癌風險的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種診斷疾病的試劑盒，尤其涉及一種通過測定受試者胃蛋白酶原I 及胃蛋白酶原II的濃度并與設定的cut-off值比較來診斷胃病或早期胃癌的酶聯(lián)免疫吸 附試劑盒，本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方法，屬于胃病或早期胃癌的診斷或檢測領域。
背景技術：
胃蛋白酶原(PG)是一種門冬氨酸蛋白酶前體，是分子質量為42kDa的單鏈多肽， 包括3個二巰鍵，等電點為3. 7。人類PG依其電泳遷移率可以分為7個組分，較快移向陽性 的1-5組分的免疫原性近似，稱為胃蛋白酶原I(PGI)，主要由胃腺的主細胞和黏液頸細胞 分泌；組分6-7被稱為胃蛋白酶原II(PGII)，除由胃體和胃底黏膜的泌酸腺的主細胞分泌 夕卜，泌酸腺的黏液頸細胞、賁門腺和胃竇的幽門腺的黏液細胞以及十二指腸上段的Brimner 腺也能產(chǎn)生PGII。胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的基因位點、免疫反應性及生化特性上 均存在一定差異。不同種的PG的產(chǎn)生似乎與以下幾種因素相關結構基因的數(shù)量、個體等 位基因的差異以及翻譯后的修飾。胃蛋白酶原無活性，在胃內鹽酸作用下，或在酸性條件 下，通過自身催化，從N端水解42個氨基酸殘基后而轉變?yōu)橛谢钚缘奈傅鞍酌?。胃蛋白?為內切酶，可分解大部分蛋白質為標和胨，產(chǎn)生的多肽或氨基酸較少。在PG轉變成胃蛋白 酶的過程中，分子量由42kDa降為35kDa，等電點由3. 7降為_1，主細胞中的PG貯存在細胞 頂部的分泌顆粒中，當細胞受到刺激時，通過胞吐作用大部分釋入腺腔，只有進入血液 循環(huán)。在正常人血清中的PGI濃度是PGII的6倍。由于胃幾乎是PG的唯一來源，并且在 分泌階段的分泌量會發(fā)生變化，因此，血清PGI和PGII不僅反映了胃黏膜腺體和細胞的數(shù) 量，也間接反映了胃黏膜不同部位的分泌功能。胃酸分泌過多的淺表性胃炎和H pylori感 染的胃炎，PGI和PGII的分泌會增加；而在慢性嚴重萎縮性胃炎，當主細胞減少時PGI含量 下降；當萎縮性胃炎伴有腸化、胃竇腺假幽門腺化生，PGII含量會隨之增高。當腸上皮化生 (intestinal metaplasia, IM)、不典型增生時，PGI分泌會減少，PGI/PGII也會發(fā)生變化， 因此，血清PG可作為監(jiān)測胃粘膜變化的一個可靠的標志物。高濃度的PGI還作為十二指腸 潰瘍及其并發(fā)癥的危險性的一個亞臨床指征，也可以作為觀察H pylori感染根除治療療效 的一個指標。胃粘膜萎縮和腸上皮化生(特別是不完全型結腸化生)及異型增生是胃癌的癌前 病變，對CAG患者尤其是伴有腸化和異型增生者進行病情監(jiān)測，對于早期胃癌的發(fā)現(xiàn)意義 重大。日本和中國胃癌患者的總數(shù)幾乎占到全球胃癌患者總數(shù)的一半。胃癌的篩查工作始 于60年代胃癌高發(fā)的日本，當時采用胃腸雙重對比造影一胃鏡一病理檢查階梯式的篩查 方法，人力物力花費較大。自1991年開始，日本先后以血清PGI < 50ng/ml并PGI/GPII比 值< 3. 0和PGI < 70ng/ml并PGI/PGII比值< 3. 0作為胃癌篩查的初篩指標，歷經(jīng)5年共 檢測血清樣本25415例，檢出胃癌43例(0. 17% )，其中早癌32例(74%)。另以血清GPI < 70ng/ml并GPI/GPII比值< 3. 0為胃癌篩檢的Cut-off值，其靈敏度84. 6 %，特異度 73.5%,陽性預測值0. 81 %，陰性預測值99. 9%。繼后十年中已有13萬余人接受了血清PG法胃癌篩查，檢出胃癌患者123人，檢出率0. 13%。中國專家組于1997-1999年在中國胃癌高發(fā)區(qū)采用兩輪篩選法進行胃癌篩查，以 胃鏡病理組織學診斷為標準比較評價了兩種初篩方法鋇劑-X線雙對比照影和血清胃蛋 白酶原I/II含量檢測。結果顯示，在接受血清胃蛋白酶原I/II (PGI/PGII)檢測的1750人 中，分別以 PGI ^ 50+PGI/PGII < 3 和 PGI ^ 70+PGI/GPII 比值;^ 3 為初篩 Cut-off 值， 后者篩出應胃鏡精查者近400人，符合胃癌診斷者17例，檢測敏感度約為53%。特異度達 到78%，第二輪胃鏡精查在這組人群中檢出胃癌32例。據(jù)此，血清胃蛋白酶原I/II(PGI/ PGII)含量檢測優(yōu)于雙對比照影，血清PGI含量和PGI/GPII值相結合更適合于作為中國人 胃癌初篩和胃部重大疾病普查標準。

發(fā)明內容
本發(fā)明的主要目的是提供一種敏感度高、特異性強和準確性好的診斷胃病或早期 胃癌的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒；本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的方法；本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種診斷胃病或早期胃癌的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，包括包被有抗胃蛋白酶原I 抗體或抗胃蛋白酶原II抗體的微孔板、酶標抗體、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液。為了達到更好的檢測效果，優(yōu)選的所述的酶標抗體優(yōu)選為辣根過氧化物酶標記的鼠抗人單克隆抗體；所述的顯色劑優(yōu)選為TMB單組分顯色液；所述的終止液優(yōu)選為2M硫酸溶液；所述的封閉液優(yōu)選為1 X PBS ；所述的濃縮洗滌液優(yōu)選為IOX磷酸鹽緩沖液(pH = 7. 4)；此外，本發(fā)明試劑盒還可含有校準品和質控品。所用到校準品或質控品是采用從人胃粘膜分離的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II為了達到更好的檢測效果，所述的胃蛋白原I或蛋白酶原II是從人胃粘膜組織中 提取的天然蛋白；其提取方法可以是離子交換及凝膠過濾層析法等方法。作為參考，一種從人胃粘膜組織中提取胃蛋白原原I或蛋白酶原II天然蛋白的方 法，包括(1)收集外科手術切除的正常胃組織，用磷酸鹽緩沖液漂洗，分離胃粘膜，吸干，稱 重，加入磷酸鹽緩沖液，搗碎勻漿，離心，收集上清，沉淀磷酸鹽緩沖液重懸，再次離心，合并 上清液，得到胃蛋白酶原粗提液；(2)將胃蛋白酶原粗提液加入已經(jīng)平衡的DEAE-52層析柱，用PBS緩沖液洗脫層析 柱至在^Onm處，吸光值為0，繼續(xù)用PBS緩沖液洗脫層析柱，合并洗脫峰，得到含有活性的 胃蛋白酶原； (3)取活性蛋白酶原峰，上樣于凝膠層析柱中，用50mmol PB-S (含0. 05mol/ LNa2SO4)洗脫，流速3. Oml/min,壓力為8Kpa，洗脫曲線為顯示4個蛋白洗脫峰，第三個蛋白 峰即為胃蛋白酶原I，第四個蛋白峰為胃蛋白酶原I及胃蛋白酶原II的混合物；
(4)采用Q-2陰離子交換層析柱分離胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的混合物，凝膠層析后的第四個洗脫峰先用0. 05mol/L Tris-HCL, pH7. 0透折后上樣陰離子層析柱，用 濃度為0-0. 5mol/L NaCL梯度洗脫，流速為lmL/min ；出現(xiàn)三個蛋白峰，其中第1，2個峰為 PGI，第三峰為PGII。經(jīng)過上述方法純化獲得的胃蛋白酶原I的純度> 98%，比活性為13. 6U/mg ；胃蛋 白酶原II的純度彡96. 8%，比活性為19. 7U/mg。將所制備的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II免疫小鼠制備融合細胞就可進一步得 到分泌抗胃蛋白酶抗原I或胃蛋白酶抗原II的單克隆抗體；優(yōu)選的，所述抗胃蛋白酶原I或抗胃蛋白酶原II單克隆抗體的制備方法，包括(1)融合細胞的制備用50-100 μ g人胃蛋白酶原I或人胃蛋白酶原II與福氏完 全佐劑等體積混合皮下注射免疫8周齡的雌性BALB/C小鼠，間隔2-3周后，用同樣劑量的 抗原加強免疫2-3次，末次免疫后后3-4天取尾靜脈血檢測，當效價達到4000以上時，即準 備融合；將經(jīng)免疫的小鼠處死后，局部消毒剖腹，無菌條件下取脾，制備成脾細胞懸液；融 合前2-3天，將每瓶Sp2/0骨髓瘤細胞傳至4瓶細胞，取處于對數(shù)生長期的細胞用于融合； 將脾細胞和SP2/0細胞分別計數(shù)后，按7 1的比例加入50ml離心管中混合均勻，離心10 分鐘，倒盡上清液，使兩種細胞混勻成糊狀，加入37°C預溫的50% PEG 4000，邊滴加邊攪拌 完成細胞融合。(2)融合后的細胞用含20%小牛血清的HAT培養(yǎng)液制備成細胞懸液，分劃于192 孔細胞培養(yǎng)板中進行選擇培養(yǎng)；在選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)4天后，其它細胞逐漸消失，只有融合 的雜交瘤成簇生長，形成小的細胞集落，8天后，停止使用HAT培養(yǎng)液，改用HT培養(yǎng)液，一周 后換用含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；待雜交瘤細胞長滿培養(yǎng)孔底部的1/3時，這時吸 取培養(yǎng)上清進行篩選。用間接酶聯(lián)吸附法(ELISA)進行特異性抗體檢測，有分泌抗ALB抗 原抗體的雜交瘤細胞；(3)以人胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II為包被抗原，用間接ELISA方法對雜交瘤 細胞進行篩選，以免疫小鼠的血清為陽性對照，以Sp2/0細胞培養(yǎng)的上清液為空白對照，以 細胞培養(yǎng)板中未長出克隆的培養(yǎng)上清為陰性對照；選取對胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II抗 原陽性反應的雜交瘤細胞集落，以有限稀釋法進行克隆化培養(yǎng)，選擇抗體效價高，呈單個克 隆生長，形態(tài)良好的細胞孔，繼續(xù)按有限稀釋法進行2次克隆和擴大培養(yǎng)，得到分泌特異抗 體的雜交瘤細胞株；(4)在同系的6周齡BALB/c腹腔注射液體石蠟，約第8天將克隆后分泌特異單克 隆抗體的雜交瘤細胞注入腹腔(1-2 X IO6細胞/鼠)，待小鼠腹部開始增大后，收集腹水；一 只小鼠收集腹水2-3次后，殺死小鼠一次性取腹水，腹水取出后，無菌過濾后，小包裝分裝 后于-20°C凍存，亦可取部分進一步進行純化；(5)離心除去腹水中的細胞和細胞碎片，加入等體積的飽和硫酸銨到上清液中， 將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時，使蛋白質充分沉淀，將沉淀物溶于少量的PBS中，用 10mmol/LPBS(pH7. 4)在4°C透析M小時。然后通過DEAE-S印hadexA52層析柱，收集并合 并洗脫液中含蛋白的部分，即得到純化的抗胃蛋白酶抗原I或抗胃蛋白酶抗原II單克隆抗 體。本發(fā)明采用了從人胃粘膜分離的胃蛋白酶原I及胃蛋白酶原II免疫小鼠制備單 克隆抗體的免疫原，所用到標準品也是采用從人胃粘膜分離的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II，彌補了采用動物胃蛋白酶原與人的胃蛋白酶原結構不同帶來的缺陷，提高了產(chǎn)品診斷 的敏感度、特異性和準確性。本發(fā)明試劑盒采用雙抗夾心法進行檢測。酶標微板包含固定化的特異性抗體、受 檢標本及酶標抗體加入酶標微板的反應孔中，保溫反應后形成包含特異性抗體-抗原-酶 標抗體的固相免疫復合物，洗滌除去未結合的酶標抗體。此時固相載體帶有的酶量與標本 中受檢抗原的含量直接相關，加入顯色底物后，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物，通過比 色分析，可測定未知標本中抗原的含量(質量濃度)。本發(fā)明通過測定分析物的胃蛋白酶原I (PGI)、胃蛋白酶II(PGII)來評估受試者 胃粘膜狀況，特別適用于診斷粘膜胃變化，例如萎縮性胃炎，并可診斷早期胃癌，所述方法 包括從所述受試者的樣品中測量胃蛋白酶原I和胃蛋白酶II的濃度值；將分析物濃度測 量值與該分析物的預定臨界值進行比較，得到受試者特定的比較結果的組合。分析物測量 值是否大于、等于或小于各自的臨界值，及兩個分析物的比值來評估受試者胃粘膜狀況，進 而得出受試者患胃癌的風險產(chǎn)生的該信息是關于由所得的比較結果作出診斷意見或對治 療或進一步觀察和/或檢測提出建議，并提示受試者患早期胃癌的風險。本發(fā)明的試劑盒的制備(以PGII為例)，包括以下內容1溶液配制a)包被緩沖液配方0. 05M碳酸鹽緩沖液將包被緩沖液稀釋到工作濃度。b)包被工作液取包被原料，按1 μ g/ml的濃度加入包被緩沖液中，攪拌混勻。c)封閉液將封閉液稀釋到工作濃度。2 包被a)按所需的數(shù)量準備酶聯(lián)免疫微孔板；b)用八道移液器進行包被，每孔加入100 μ 1的包被工作液，震蕩混勻，移入冰箱 (2 8°C )放置16-20小時。c)封閉甩掉包被液，按照洗板機操作方法洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔分別 加入封閉液200μ 1，37°C，放置1小時。d)干燥包被板甩掉封閉液，按照洗板機操作方法洗滌3次，在吸水紙上拍干。放 鼓風干燥箱干燥4-6小時。e)封袋貼簽從干燥間中取出，立即進行封袋。封袋后放置15分鐘檢查無漏氣， 如果有漏氣需重新封袋。經(jīng)檢驗合格后貼簽后置2-8°C保存。3酶標記抗體3. 1 標記a)按活化辣根過氧化物酶抗體=7.5 1的比例混合，用標記啟動劑調pH至 9. 5，4度過夜；b)按每IOOug抗體加入終止劑10uL，混勻，室溫震蕩15min ；c)用IM HCl調pH至7. O，加入等量丙三醇及0. 05%的防腐劑，混勻后冷凍保存。3. 2酶標記物稀釋液的配制
將酶標記物稀釋到工作濃度。3. 3 分裝將檢測合格的酶標記物工作液進行分裝，貼上標簽后，置于2 8°C保存。4 洗液4. 1濃縮洗滌液的配制含1 % Tween-20的0. 2M pH值7. 4磷酸鹽緩沖液。使用時用純化水稀釋20倍。4. 2 檢測濃縮洗滌液應澄清透明無沉淀或絮狀物。用純化水稀釋20倍后溶液pH值應為 7. 2-7. 4。4. 3 分裝檢測合格后，將配制好的濃縮洗滌液分裝到50ml白色塑料瓶中，50ml/瓶。貼上標 簽后置室溫保存。5TMB 顯色液5. ITMB顯色液的配制將TMB顯色液稀釋到工作濃度。5. 2 分裝經(jīng)檢驗合格后，將TMB顯色液分裝到15ml棕色塑料瓶中，12ml/瓶；TMB顯色底物 液置2 8°C保存。6校準品及質控品取大小合適的容器5個，配制濃度點依次為4. 4,8. 8,18,39. 5、62· 4μ g/L的B、C、 D、E、F校準品各點，以及25 μ g/L的質控品，經(jīng)過計算，各濃度點要^加入的原料濃溶液， 混勻。7.1分裝，貼簽及保存經(jīng)檢驗合格后，將配制好的校準品分裝到Iml塑料瓶中，0. 6ml/瓶。質控品ImL/ 瓶。將分裝好的校準品及質控品貼上簽。將貼簽后的校準品質控品置于2-8°C保存。本發(fā)明試劑盒的使用方法(以PGI酶聯(lián)免疫試劑盒為例)檢驗原理采用雙抗體夾心免疫檢測法。酶標微孔板包含固定化的特異性抗體，受 檢標本及酶標抗體加入酶標微板的反應孔中，保溫反應后形成包含特異性抗體-抗原-酶 標抗體的固相免疫復合物。洗滌除去未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標 本中受檢抗原的含量直接相關。加入顯色底物后，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通 過比色分析，可測得未知標本中抗原的含量。表1本發(fā)明試劑盒的主要組成成份
組成裝量主要成分校準品0. 6mL/ 瓶胃蛋白酶抗原I原料質控品ImL/ 瓶胃蛋白酶抗原I原料
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權利要求
1.一種診斷胃病或評價胃癌風險的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，包括包被有抗胃蛋白酶原 I抗體或抗胃蛋白酶原II抗體的微孔板、酶標抗體、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液。
2.按照權利要求1所述的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于所述的胃蛋白酶原I或 胃蛋白酶原II是從人胃粘膜組織中提取得到的天然蛋白。
3.按照權利要求2所述的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于，所述的從人胃粘膜組織 中提取得到胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的方法，包括(1)收集外科手術切除的正常胃組織，用磷酸鹽緩沖液漂洗，分離胃粘膜，吸干，稱重， 加入磷酸鹽緩沖液，搗碎勻漿，離心，收集上清，沉淀磷酸鹽緩沖液重懸，再次離心，合并上 清液，得到胃蛋白酶原粗提液；(2)將胃蛋白酶原粗提液加入已經(jīng)平衡的DEAE-52層析柱，用PBS緩沖液洗脫層析柱至 在^Onm處，吸光值為0，繼續(xù)用PBS緩沖液洗脫層析柱，合并洗脫峰，得到含有活性的胃蛋 白酶原；(3)取活性蛋白酶原峰，上樣于凝膠層析柱中，用50mmol含0.05mol/LNa2S04的PBS洗 脫，流速3. Oml/min，壓力為8Kpa，洗脫曲線為顯示4個蛋白洗脫峰，第三個蛋白峰即為胃蛋 白酶原I，第四個蛋白峰為胃蛋白酶抗原I及胃蛋白酶原II的混合物；(4)采用Q-2陰離子交換層析柱分離胃蛋白酶原I和胃蛋白酶抗原II的混合物，凝膠 層析后的第四個洗脫峰先用0. 05mol/L Tris-HCL,pH7. O透折后上樣陰離子層析柱，用濃度 為0-0. 5mol/L NaCL梯度洗脫，流速為lmL/min ；出現(xiàn)三個蛋白峰，其中第1個，2個峰為胃 蛋白原原I，第三峰為胃蛋白原原II。
4.按照權利要求1所述的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于所述的抗胃蛋白酶原I 抗體或抗胃蛋白酶原II抗體的制備方法包括將權利要求2或3所述的胃蛋白酶原I或胃 蛋白酶原II免疫小鼠制備融合細胞，得到分泌抗胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的雜交瘤 細胞株，培養(yǎng)雜交瘤細胞株，分別得到抗胃蛋白酶原I單克隆抗體或抗胃蛋白酶原II單克 隆抗體。
5.按照權利要求4所述的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于所述的抗胃蛋白酶原I 抗體或抗胃蛋白酶原II抗體的制備方法包括(1)融合細胞的制備用50-100 μ g權利要 求2或3所述的人胃蛋白酶原I或人胃蛋白酶原II與福氏完全佐劑等體積混合皮下注射 免疫8周齡的雌性BALB/C小鼠，間隔2-3周后，用同樣劑量的抗原加強免疫2_3次，末次免 疫后3-4天取尾靜脈血檢測，當效價達到4000以上時，準備融合；將經(jīng)免疫的小鼠處死后， 局部消毒剖腹，無菌條件下取脾，制備成脾細胞懸液；融合前2-3天，將每瓶Sp2/0骨髓瘤細 胞傳至4瓶細胞，取處于對數(shù)生長期的細胞用于融合；將脾細胞和SP2/0細胞分別計數(shù)后， 按7 1的比例加入離心管中混合均勻，離心，倒盡上清液，使兩種細胞混勻成糊狀，加入預 溫的50% PEG4000，邊滴加邊攪拌完成細胞融合；(2)融合后的細胞用含20%小牛血清的HAT培養(yǎng)液制備成細胞懸液，分劃于192孔細 胞培養(yǎng)板中進行選擇培養(yǎng)；在選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)4天后，其它細胞逐漸消失，只有融合的雜 交瘤成簇生長，形成小的細胞集落，8天后，停止使用HAT培養(yǎng)液，改用HT培養(yǎng)液，一周后換 用含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；待雜交瘤細胞長滿培養(yǎng)孔底部的1/3時，這時吸取培 養(yǎng)上清進行篩選。用間接酶聯(lián)吸附法(ELISA)進行特異性抗體檢測，有分泌抗ALB抗原抗 體的雜交瘤細胞；(3)以人胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II為包被抗原，用間接ELISA方法對雜交瘤細胞 進行篩選，以免疫小鼠的血清為陽性對照，以Sp2/0細胞培養(yǎng)的上清液為空白對照，以細胞 培養(yǎng)板中未長出克隆的培養(yǎng)上清為陰性對照；選取對胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II抗原陽 性反應的雜交瘤細胞集落，以有限稀釋法進行克隆化培養(yǎng)，選擇抗體效價高，呈單個克隆生 長，形態(tài)良好的細胞孔，繼續(xù)按有限稀釋法進行2次克隆和擴大培養(yǎng)，得到分泌特異抗體的 雜交瘤細胞株；(4)在同系的6周齡BALB/c腹腔注射液體石蠟，約第8天將克隆后分泌特異單克隆 抗體的雜交瘤細胞注入腹腔，待小鼠腹部開始增大后，收集腹水；一只小鼠收集腹水2-3次 后，殺死小鼠一次性取腹水，腹水取出后，無菌過濾后，小包裝分裝凍存，亦可取部分進一步 進行純化；(5)離心除去腹水中的細胞和細胞碎片，加入等體積的飽和硫酸銨到上清液中，將溶液 放在磁力攪拌器上攪拌6小時，使蛋白質充分沉淀，將沉淀物溶于少量的PBS中，用IOmmol/ LPBS透析；然后通過DEAE-S^hadex A52層析柱，收集并合并洗脫液中含蛋白的部分，即得 到純化的抗胃蛋白酶原I或抗胃蛋白酶原II單克隆抗體。
6.按照權利要求1所述的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于所述的酶標抗體為辣根 過氧化物酶標記的鼠抗人單克隆抗體。
7.按照權利要求1所述的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于所述的顯色劑為TMB單 組分顯色液；所述的終止液為2M硫酸溶液；所述的封閉液為IXPBS ；所述的濃縮洗滌液為 PH = 7. 4的IOX磷酸鹽緩沖液。
8.按照權利要求1所述的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于還含有校準品和質控品。
9.按照權利要求8所述的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于所述校準品或質控品是 采用從人胃粘膜分離的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聯(lián)合診斷胃病或評價胃癌風險的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒及其制備方法。該試劑盒的組成包括包被有抗胃蛋白酶抗原I抗體或抗胃蛋白酶抗原II抗體的微孔板、酶標抗體、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液。其中，所述的胃蛋白原抗原I或胃蛋白酶抗原II是從人胃粘膜組織中提取得到的天然蛋白。本發(fā)明試劑盒采用了從人胃粘膜分離的胃蛋白酶原I及胃蛋白酶原II免疫小鼠制備單克隆抗體的免疫原，所用到標準品也是采用從人胃粘膜分離的胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II，彌補了采用動物胃蛋白酶原與人的胃蛋白酶原結構不同帶來的缺陷，本發(fā)明試劑盒能準確診斷出胃病或早期胃癌，具有敏感度高、特異性強和準確性好等優(yōu)點。
文檔編號C07K16/40GK102087279SQ20101012278
公開日2011年6月8日 申請日期2010年3月11日 優(yōu)先權日2010年3月11日
發(fā)明者王瑞環(huán), 金鑫 申請人:北京美康生物技術研究中心