專利名稱：使用iridoptin在昆蟲中誘導(dǎo)毒性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改良的通過蛋白質(zhì)工程在昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)毒性的方法。更具體來說， 本發(fā)明涉及使用iridoptin，一種從istk基因產(chǎn)物衍生而來的高活性剪切多肽，用于在昆 蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)高水平的凋亡和抑制宿主蛋白質(zhì)合成，并在蚜蟲中誘導(dǎo)死亡。
背景技術(shù)：
結(jié)合涉及通過蛋白質(zhì)工程在昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)毒性的改進(jìn)的方法，對背景進(jìn)行了描 述，該描述不對本公開方法的范圍構(gòu)成限制。蚜蟲、草盲蝽、銀葉粉虱、棉籽象鼻蟲和夜蛾造成的經(jīng)濟(jì)影響，對美國來說估計(jì)為 每年37億美元，對德克薩斯州來說為每年4億美元。這些昆蟲造成了對水的需求增加，并 引起了數(shù)十億美元的農(nóng)業(yè)損失。消滅計(jì)劃和化學(xué)防治具有局限性；例如，化學(xué)防治為了有效，需要?jiǎng)┝坎粩嗵岣摺?這些提高的劑量對于有益的昆蟲和地下水具有不利的副作用。需要改進(jìn)的生物防治方法。 因此，極為需要轉(zhuǎn)基因抗害蟲作物和能殺滅昆蟲的微生物。鑒定和開發(fā)毒素基因?qū)τ趯?shí)施 這樣的方法是相當(dāng)關(guān)鍵的。在2001年授予本發(fā)明人的美國專利No. 6，200，561 (‘ 561專利)中公開了使用病 毒蛋白防治棉籽象鼻蟲和其他昆蟲害蟲。該題為“使用病毒蛋白防治棉籽象鼻蟲和其他昆 蟲害蟲，，(Use of Viral Proteins forControlling the Cotton Boll Weevil and Other Insect Pests)的美國專利No. 6，200，561的全部公開內(nèi)容，通過引用并入于此?！?61專 利涉及螟蟲虹彩病毒(Chilo iridescent virus) (CIV ；新西蘭株)衣殼蛋白提取物，它殺 死新生幼蟲，抑制宿主表達(dá)并誘導(dǎo)凋亡。CIV在幾個(gè)目的昆蟲中引起感染。本發(fā)明公開了被 鑒定為iridoptin的組合物的使用，它能更加有效地在昆蟲中誘導(dǎo)凋亡和抑制宿主蛋白質(zhì) 合成，并且還在蚜蟲中誘導(dǎo)死亡。發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供了防治昆蟲的改進(jìn)的手段，包括使用iridoptin在目標(biāo)昆蟲中 誘導(dǎo)毒性的生物防治方法。它是針對非鱗翅目昆蟲的第一種病毒毒素，與現(xiàn)有的細(xì)菌毒 素不同，例如對于蚜蟲或大多數(shù)甲蟲無效的蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)毒 素，以及桿狀病毒科(Baculoviridae)，該科是目前用作生物防治藥劑的主要的病毒種類。 Iridoptin可具體用于對農(nóng)業(yè)害蟲的防治。Iridoptin可用于增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率，減少由介體 和住宅害蟲引起的疾病傳播。通過擴(kuò)展，Iridoptin可用于癌癥治療和其他關(guān)鍵在于用凋 亡除去某些細(xì)胞的醫(yī)學(xué)治療中?？偟膩碚f，本發(fā)明公開了改良的通過蛋白質(zhì)工程在昆蟲細(xì)胞和蚜蟲中誘導(dǎo)毒性的 方法。更具體來說，本公開的方法可用于在昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)高水平的凋亡并抑制宿主蛋白 質(zhì)合成，以及在蚜蟲群體中誘導(dǎo)死亡。附圖簡述為了更完全理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在將參考本發(fā)明的詳細(xì)描述以及隨附的圖，在這些圖中
圖IA描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案，istk基因序列在CIV基因組中的位置。圖IB描繪了編碼完整istk基因的2-kbp區(qū)域的核苷酸序列(SEQID N0:1)；圖IC描繪了 CIV基因組中istk基因的核苷酸序列，以及編碼iridoptin的istk 基因的亞基因片段(下劃線)；圖2描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案，從ISTK產(chǎn)物中切下的多肽；圖3是根據(jù)本公開的實(shí)施方案的iridoptin產(chǎn)物的電泳分析；圖4A描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案暴露于iridoptin的芽蟲細(xì)胞(CF)中的凋 亡；圖4B描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案暴露于放線菌素D的芽蟲細(xì)胞(CF)中的凋 亡；圖4C描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案暴露于熱失活iridoptin的芽蟲細(xì)胞(CF)中 的凋亡；圖4D描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案暴露于對照緩沖液的芽蟲細(xì)胞(CF)中的凋 亡；圖5A描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案暴露于iridoptin的棉籽象鼻蟲細(xì)胞(AG)中 的凋亡；圖5B描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案暴露于熱失活的iridoptin的棉籽象鼻蟲細(xì) 胞(AG)中的凋亡；圖5C描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案暴露于放線菌素D的棉籽象鼻蟲細(xì)胞(AG)中 的凋亡；圖5D描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案暴露于對照緩沖液的棉籽象鼻蟲細(xì)胞(AG)中 的凋亡；圖5E是根據(jù)本公開的實(shí)施方案對AG細(xì)胞中iridoptin誘導(dǎo)的(10 μ g/ml)凋亡 的TUNEL分析；圖5F是根據(jù)本公開的實(shí)施方案對AG細(xì)胞中iridoptin誘導(dǎo)的(20 μ g/ml)凋亡 的TUNEL分析；圖5G是根據(jù)本公開的實(shí)施方案對AG細(xì)胞中放線菌素D誘導(dǎo)的凋亡的TUNEL分 析；圖5H是根據(jù)本公開的實(shí)施方案對AG細(xì)胞中對照緩沖液誘導(dǎo)的凋亡的TUNEL分 析；圖5J是根據(jù)本公開的實(shí)施方案對AG細(xì)胞中iridoptin誘導(dǎo)的凋亡的劑量響應(yīng)分 析；圖6A描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案在棉籽象鼻蟲細(xì)胞中iridoptin誘導(dǎo)的蛋白 質(zhì)合成的抑制；圖6B描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案在棉籽象鼻蟲(AG)中量化的iridoptin誘導(dǎo) 的蛋白質(zhì)合成的抑制；圖6C描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案在棉籽象鼻蟲(AG)細(xì)胞中iridoptin誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成抑制的劑量響應(yīng)分析；圖7描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案在芽蟲(CF)細(xì)胞中iridoptin誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的抑制；圖8描繪了根據(jù)本公開的實(shí)施方案iridoptin誘導(dǎo)的蚜蟲的死亡。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本文公開了改良的通過蛋白質(zhì)工程在昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)毒性的方法，其中將昆蟲細(xì) 胞暴露于iridoptin，然后在昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，抑制宿主蛋白質(zhì)合成，并在蚜蟲群體中 導(dǎo)致死亡?，F(xiàn)具體參考幾個(gè)實(shí)施方案(是示例性的，而不是限制性的)，對本發(fā)明的大量創(chuàng) 新性內(nèi)容進(jìn)行描述。首先參考

圖1A、1B和1C，對螟蟲虹彩病毒(Chilo iridescent virus) (CIV ；新西 蘭株)DNA中的istk基因區(qū)域進(jìn)行定位和測序，并確定了絲氨酸/蘇氨酸激酶的開放閱讀 框。通過引物步移法(primer walking)確定了編碼所推測的istk基因的開放閱讀框，并 將其定位到CIV基因組中跨過將片段B和U分開的Eco RI位點(diǎn)(‘ ”)的一 2-kbp的區(qū) 域中(在圖IA中用實(shí)心灰色塊表示)。該基因顯示出是有活性的，并被命名為istk(虹彩 病毒絲氨酸蘇氨酸激酶)。圖IB顯示了所確定的編碼完整的1236-bp istk基因(在圖IB 中顯示為下劃線)的2-kbp區(qū)域的核苷酸序列?；虍a(chǎn)物(ISTK)是49-kDa的多肽。該基 因的起始和終止位點(diǎn)在圖IB中用粗體標(biāo)出。現(xiàn)在參考圖2，其中分析了衍生自ISTK的剪切后的37-kDa多肽的C-末端序列。 正如前面指出的，以前的美國專利No. 6，200, 561確定了能夠殺死新生棉籽象鼻蟲幼蟲、抑 制宿主表達(dá)并誘導(dǎo)凋亡的螟蟲虹彩病毒衣殼蛋白提取物。進(jìn)一步的研究顯示，CIV含有絲 氨酸-蘇氨酸激酶。該基因現(xiàn)已被克隆并表達(dá)該酶，并已證明，其49-kDa的產(chǎn)物(ISTK)在 63%的處理過的昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，在其余細(xì)胞中誘導(dǎo)壞死。凋亡通過DNA片段化、空泡 化以及通過TUNEL分析進(jìn)行檢測。本發(fā)明人現(xiàn)在做出了重要發(fā)現(xiàn)，即ISTK 49-kDa蛋白的 37-kDa剪切產(chǎn)物在群體的幾乎所有細(xì)胞中誘導(dǎo)了凋亡效應(yīng)。因此，對于完整的效應(yīng)來說，不 需要其他因子或基因產(chǎn)物，并且49-kDa基因產(chǎn)物的翻譯后加工對于該活性來說非常重要。 剪切后的新多肽對于完整的毒性效應(yīng)來說是必要的和充分的。使用空泡形成分析在CF和 AG細(xì)胞中進(jìn)行的劑量響應(yīng)研究表明，為了在50%的細(xì)胞群體中誘導(dǎo)凋亡，分別需要IOOng/ ml 和 900ng/ml 的 37-kDa 多肽。在本發(fā)明中，鑒定了 ISTK上的剪切位點(diǎn)，該信息已被用于定制istk基因的亞基因 片段(在圖IC中顯示為下劃線)。s/t激酶結(jié)構(gòu)域和ATP結(jié)合位點(diǎn)的位置在圖IC中突出 顯示。istk基因序列的亞基因組片段(下劃線)與畢赤酵母表達(dá)載體(pPICZ C)C-末端的 多聚組氨酸標(biāo)簽進(jìn)行框內(nèi)(in-frame)克隆，而表達(dá)載體中多聚組氨酸標(biāo)簽后的終止密碼 子被用于終止。本發(fā)明還公開了現(xiàn)在命名為iridoptin的37-kDa多肽的修改過的編碼基 因，該多肽能比來自原始基因的產(chǎn)物更有效地誘導(dǎo)凋亡和抑制宿主蛋白質(zhì)合成。圖2描繪了 37-kDa多肽在羧肽酶Y消化后的C-末端測序，由密歇根州立大學(xué)生物化學(xué)系大分子結(jié)構(gòu)、測序與分析月艮務(wù)中心(Macromolecular Structure, Sequencing and Synthesis Facility,Department of Biochemistry at Michigan State University)進(jìn) 行。C-末端氨基酸是天冬酰胺-甘氨酸(Asn-Gly，或N-G)。圖2顯示了在從CIVistk基因 的相應(yīng)區(qū)域得到的氨基酸序列中有兩個(gè)位點(diǎn)處可檢測到N-G(圖2中下劃線)?；谠撔?列，剪切將發(fā)生在甘氨酸-天冬氨酸(Gly-Asp，G-D)位點(diǎn)處。在氨基末端的G-D殘基處剪 切將導(dǎo)致形成只含有ATP結(jié)合位點(diǎn)的26-kDa的多肽。在羧基末端的G-D位點(diǎn)處剪切將產(chǎn)生同時(shí)具有ATP結(jié)合位點(diǎn)和s/t激酶基序這二者的預(yù)測的37-kDa多肽。在奧斯汀的德克薩斯大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)核心服務(wù)中心設(shè)施研究所 (Institute for Cellular and Molecular Biology Core Facility, University of Texas, Austin)進(jìn)行的MALDI-TOF分析(基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜)，證實(shí) 了 37-kDa多肽的身份以及ATP結(jié)合和s/t激酶基序的存在。使用專門設(shè)計(jì)的引物和CIV 基因組DNA，擴(kuò)增了編碼37-kDa多肽的亞基因DNA序列，并在畢赤酵母系統(tǒng)(Invitrogen) 中表達(dá)，以產(chǎn)生帶有6xHis標(biāo)簽的產(chǎn)物。現(xiàn)在參考圖3，其中顯示了來自畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)的酵母裂解物含有帶His標(biāo) 簽的37-kDa產(chǎn)物，其通過聚丙烯酰胺凝膠的銀染和western印跡法檢測。該材料通過結(jié)合 帶6xHis標(biāo)簽多肽的鎳柱(ProBond，Invitrogen, CA)進(jìn)行純化，得到純的37-kDa多肽，即 iridoptin，其可用6xHis抗體探針和總蛋白的銀染所檢測。圖3顯示了在畢赤酵母系統(tǒng) 中表達(dá)并通過親和層析純化的iridoptin產(chǎn)物使用銀染凝膠和western印跡(使用6xHis 抗體探針)進(jìn)行的分析。如圖3中所示，“U”下的列顯示了未誘導(dǎo)的酵母裂解物不表達(dá) iridoptin. “L”下的列顯示了誘導(dǎo)的酵母裂解物顯現(xiàn)出預(yù)計(jì)的iridoptin條帶?！癊”顯示 了在結(jié)合His的鎳親和柱(ProBond)上純化的iridoptin保留有6xHis標(biāo)簽，通過銀染和 western印跡可以檢測為純的蛋白?！癕”列顯示了分子量標(biāo)準(zhǔn)品，其中數(shù)字表示分子量，單 位為千道爾頓。現(xiàn)在參考圖4A、4B、4C和4D，其中顯示了 iridoptin在云杉芽蟲(CF 124T)細(xì)胞中 誘導(dǎo)凋亡。將細(xì)胞在Nunc 60孔盤(5. 6xl03個(gè)細(xì)胞每孔，在7 μ 1培養(yǎng)基中)中進(jìn)行處理， 在28°C溫育，在處理后24小時(shí)，通過相差顯微鏡檢查凋亡性空泡的形成。Iridoptin產(chǎn)物 在超過90%的CF細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡性空泡形成，與此相比，在放線菌素D處理的陽性對照中 是98%。結(jié)果表現(xiàn)在圖4A中，該圖顯示了 Iridoptin 從亞基因istk表達(dá)的37-kDa多肽 (畢赤酵母；10yg/ml) ；92%空泡形成，SD 4.7。圖4B顯示了放線菌素D(4y g/ml ；陽性對 照)；98%空泡形成，SD 1.1。圖 4C 顯示了 Δ Iridoptin (熱失活的 iridoptin，10 μ g/ml， 65°C，30min)，5%空泡。圖4D顯示了用緩沖液(IX Rinaldini' s平衡鹽溶液；RBSS)所做 的模擬處理，空泡形成。在圖4A-4D中放大倍數(shù)為800x。現(xiàn)在參考圖5A-5D，其中顯示了 iridoptin在棉籽象鼻蟲細(xì)胞(AG3A)中誘導(dǎo)凋亡， 其可通過細(xì)胞空泡形成來檢測。將AG3A細(xì)胞接種在60-孔Terasaki板中，在28°C溫育24 小時(shí)。在50%細(xì)胞群體中誘導(dǎo)空泡的最高稀釋度是大約0.9 μ g/ml。在圖5A中，空泡形成 分析顯示20 μ g/ml的iridoptin在棉籽象鼻蟲細(xì)胞系A(chǔ)G3A中誘導(dǎo)了 87%的空泡形成。圖 5B顯示了熱失活的iridoptin (20 μ g/ml，65°C，30min)誘導(dǎo)了 7%的空泡形成。圖5C顯示 了放線菌素D(4y g/ml ；陽性對照)誘導(dǎo)了 99%的空泡形成。圖5D顯示了使用RBSS緩沖 液的模擬處理誘導(dǎo)了可被忽略的空泡形成(2. 7% )?，F(xiàn)在參考圖5E-5H，其中TUNEL分析證實(shí)了 iridoptin誘導(dǎo)的凋亡。圖5E描繪了用10 μ g/ml Iridoptin處理的AG3A細(xì)胞在53%的細(xì)胞群體中顯示出證實(shí)凋亡的核二氨 基聯(lián)苯胺(DAB)信號。圖5F描繪了用20 μ g/ml Iridoptin處理的AG3A細(xì)胞顯示出84% 的核DAB。圖5G描繪了用放線菌素D (ACT D)處理的AG3A細(xì)胞誘導(dǎo)了 96%的核DAB信號。 圖5H描繪了用RBSS模擬處理的AG3A具有1 %的核DAB?，F(xiàn)在參考圖5J，其中顯示了通過空泡形成檢測的iridoptin誘導(dǎo)的針對棉籽象鼻蟲細(xì)胞(AG3A)的凋亡的劑量響應(yīng)分析。結(jié)果顯示，0.5yg iridoptin足以在50%的AG 細(xì)胞群體中誘導(dǎo)凋亡。對于CF細(xì)胞獲得了類似的結(jié)果。結(jié)果表現(xiàn)在圖5J中，其中按照空 泡形成百分率顯示了 iridoptin對棉籽象鼻蟲細(xì)胞(AG3A)的劑量響應(yīng)。將AG3A細(xì)胞以 4. 2xl03個(gè)細(xì)胞每孔接種在60-孔Terasaki板中，用iridoptin的連續(xù)10倍稀釋液處理， 在28°C溫育24小時(shí)。放線菌素D(4y g/ml)是陽性對照，熱失活的iridoptin (20 μ g/ml, 65°C，30min)是陰性對照；模擬處理使用Rinadini ‘ s平衡鹽溶液(RBSS)。數(shù)據(jù)點(diǎn)代表每 個(gè)視野大約200個(gè)細(xì)胞的空泡形成百分率。在50%的細(xì)胞群體中誘導(dǎo)空泡的最高稀釋度 是大約0.5 μ g/ml。使用Microsoft Excel產(chǎn)生了線性回歸線y = 17. 51og x+55，其中χ 是iridoptin的濃度，單位為μ g/ml, y是具有空泡的細(xì)胞群體的百分?jǐn)?shù)；r = 0. 94。對照 顯示出了預(yù)計(jì)的空泡形成(放線菌素D :99%，SD 1.5;熱失活的iridoptin :7%，SD 1.7; RBSS 3%, SD 1. 9)。分析采用三份平行樣。現(xiàn)在參考圖6A，其中顯示了 iridoptin在棉籽象鼻蟲(AG3A)細(xì)胞中誘導(dǎo)蛋白合成 的抑制。將AG3A細(xì)胞接種在Costar 24孔板中，用所顯示的濃度的iridoptin處理。對照包 括放線菌素 D (A，陽性，4 μ g/ml)，熱失活的 iridoptin ( Δ，陰性，10 μ g/ml, 65°C，30min.) 和模擬處理(M，RBSS)。從處理后3小時(shí)開始，將細(xì)胞用35S-甲硫氨酸脈沖1小時(shí)，使用 SDS-PAGE 樣品緩沖液(2% SDS，20% 甘油，20mM Tris-HClpH 8,2% β-巰基乙醇和 0. Img/ ml溴酚藍(lán))裂解，使用SDS-PAGE進(jìn)行分級。蛋白合成的相對速度使用感光成像儀進(jìn)行定 量。實(shí)驗(yàn)采用三份平行樣。現(xiàn)在參考圖6B，其中對iridoptin在棉籽象鼻蟲(AG3A)細(xì)胞中誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成 的抑制進(jìn)行了量化。26 μ g/ml的Iridoptin抑制了 90%以上的宿主蛋白質(zhì)合成，而放線菌 素D抑制了 68%的蛋白質(zhì)合成。將AG3A細(xì)胞接種在Costar 24孔板中，用圖6B中顯示濃 度(μ g/ml.)下的iridoptin處理。對照包括放線菌素D (ActDA,陽性對照，4 μ g/ml)，熱失 活的iridoptin (加熱的，陰性對照，10μ g/ml，65°C，30min.)和用Rinaldini' s平衡鹽溶 液模擬處理的細(xì)胞(模擬)。在處理后3小時(shí)開始，將細(xì)胞用35S-甲硫氨酸脈沖1小時(shí)，使 用SDS-PAGE樣品緩沖液裂解，使用SDS-PAGE進(jìn)行分級。條帶使用感光成像儀可視化。蛋 白合成的相對速度使用感光成像儀的功能進(jìn)行量化。實(shí)驗(yàn)采用三份平行樣。使用來自三次 獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的全部主要條帶來確定抑制。26 μ g/ml的Iridoptin抑制了超過90%的宿主蛋 白質(zhì)合成?，F(xiàn)在參考圖6C，其中顯示了 iridoptin在棉籽象鼻蟲(AG3A)細(xì)胞中誘導(dǎo)的蛋白 質(zhì)合成的抑制的劑量響應(yīng)分析。來自圖6A的數(shù)據(jù)使用感光成像儀的功能進(jìn)行了量化。抑 制90%宿主蛋白質(zhì)合成的最高稀釋度是大約23 μ g/ml。將iridoptin濃度的對數(shù)對蛋白 抑制百分率進(jìn)行作圖。使用Microsoft Excel 2003產(chǎn)生了具有下列方程的線性回歸線y =98. 4x-44. 9，其中χ是單位為μ g/ml的iridoptin稀釋度的對數(shù)，y是宿主蛋白質(zhì)合成 的抑制百分率。擬合的線的r2值是0.99?，F(xiàn)在參考圖7，其中顯示了 iridoptin在CF細(xì)胞中誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的抑制。使用iridoptin的抑制(Iridoptin ；7 μ g/ml ；63% )是使用陽性對照放線菌素D觀察到的 抑制(Act D ；4 μ g/ml ；68% )的 93% ；而使用加熱過的 iridoptin 的抑制(Δ Iridoptin ； 7yg/ml,65°C,30min)是陽性對照的18%。來自SDS-PAGE凝膠中相關(guān)道的等同區(qū)域的光 密度，使用模擬道作為對照進(jìn)行了計(jì)算，并轉(zhuǎn)化成透光度百分?jǐn)?shù)。從針對模擬道的透光率百分?jǐn)?shù)確定了抑制值?，F(xiàn)在參考表1，其中描述了 iridoptin的蛋白激酶活性。蛋白激酶的分析顯示出 iridoptin的顯著活性。Y32P-ATP用作標(biāo)記物，魚精蛋白用作底物。將樣品點(diǎn)在磷酸纖維 素紙上，在洗掉過量標(biāo)記物后對放射活性進(jìn)行計(jì)數(shù)。激酶的比活力被表示成在使用的酶制 備物中每Pg總蛋白的cpm。Iridoptin的比活性略高于CIV毒粒蛋白提取物(CVPE)的。 在加熱過的iridoptin (65°C，30min)和BSA對照中激酶活性低。 表 1現(xiàn)在參考圖8，其中描繪了 iridoptin在蚜蟲中誘導(dǎo)的死亡。生物分析顯示 iridoptin在處理的蚜蟲中誘導(dǎo)了 72%的死亡率，與此相比，對照中為14%死亡率。 iridoptin處理對棉花蚜蟲的影響顯示在圖8中，其中將12只蚜蟲放置在涂有下列制備 物的棉花葉片上1) Iridoptin 在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)iridoptin基因；酵母裂解物在 鎳柱(ProBond)上純化；將洗脫液脫鹽，用RBSS交換，用含有終濃度為20 μ g/ml酪蛋白， 1 μ g/ml抑胃酶肽A和2 μ g/ml亮抑蛋白酶肽的RBSS稀釋到50 μ g/ml ；2)模擬處理不含 iridoptin基因的畢赤酵母菌株(X33)按照上面的描述進(jìn)行處理；將裂解物進(jìn)行模擬純化， 以制備iridoptin時(shí)使用的比例將上述溶劑稀釋；以及3)未處理的將蚜蟲在28°C溫育 3天，使用解剖顯微鏡檢查死亡率。結(jié)果顯示為高于未處理葉片上的死亡蚜蟲的數(shù)量。在 iridoptin、模擬處理和未處理葉片中蚜蟲的死亡率分別為72%、14%和0%。實(shí)驗(yàn)采用三 份平行樣。條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。下面，對本公開的方法和裝置進(jìn)行一般性描述，作為本發(fā)明的具體實(shí)施方案并為 了證明其實(shí)踐和優(yōu)點(diǎn)，引入了下面的實(shí)施例。應(yīng)該理解，給出實(shí)施例僅僅是為了說明，而不 打算以任何方式限制本說明書或權(quán)利要求書。為了便于理解本發(fā)明，下面對幾個(gè)術(shù)語進(jìn)行定義。本文定義的術(shù)語具有本發(fā)明相 關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員所通常理解的意義。不指明數(shù)量的實(shí)體不打算僅僅指稱單數(shù)實(shí) 體，而是包括其具體例子可用于說明的通類。本文中的術(shù)語被用于描述本發(fā)明的具體實(shí)施 方案，但是，除了可能在權(quán)利要求書中有概述的之外，它們的使用不為本公開的方法劃界。TUNEL 在凋亡細(xì)胞的核中檢測片段化DNA的染色分析方法；陽性細(xì)胞被診斷為凋 亡細(xì)胞。凋亡程序化細(xì)胞死亡，其中細(xì)胞萎縮，經(jīng)歷核DNA片段化，并在表面產(chǎn)生空泡。 實(shí)施例通過對iridoptin的凋亡活性、在細(xì)胞培養(yǎng)物中抑制宿主蛋白質(zhì)合成以及導(dǎo)致蚜 蟲死亡進(jìn)行試驗(yàn)，顯示了來自CIV的修飾的istk基因的產(chǎn)物iridoptin，在90%以上的處理過的昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)了非常高水平的凋亡，抑制了宿主蛋白質(zhì)合成，并殺死了超過對照 處理63%的蚜蟲群體。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈提示iridoptin對其他昆蟲，包括棉籽象鼻蟲、草盲 蝽、粉虱和夜蛾具有毒性或抑制性效應(yīng)。此外，本發(fā)明的應(yīng)用包括使用編碼iridoptin的基因片段進(jìn)行工程改造和生產(chǎn) (i)抗蚜蟲、棉籽象鼻蟲、草盲蝽、粉虱、夜蛾和其他昆蟲害蟲的棉花和其他作物，(ii)用于 防治農(nóng)業(yè)害蟲以及植物、動(dòng)物和人類疾病介體以及住宅害蟲的微生物，以及(iii)大量的 iridoptin用于直接防治控制農(nóng)業(yè)和住宅害蟲以及疾病介體。通過擴(kuò)展，發(fā)現(xiàn)Iridoptin可 用于癌癥療法和其他關(guān)鍵步驟在于用凋亡除去某些細(xì)胞的醫(yī)學(xué)治療中。應(yīng)該理解，本文描述的具體實(shí)施方案僅僅是說明性的，不對本發(fā)明構(gòu)成限制。本發(fā) 明的原則特點(diǎn)可用于各種不同實(shí)施方案中，而不背離本發(fā)明的范圍。本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人 員將會(huì)認(rèn)識到，或能夠確定，僅使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法就可以產(chǎn)生本文描述的具體步驟的大 量等同體。這樣的等同體被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并被權(quán)利要求書所覆蓋。所有在說明書中提到的出版物和專利申請，說明了在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè) 人員的技術(shù)水平。所有出版物和專利申請通過引用并入于此，其程度與每個(gè)出版物或?qū)＠?申請被具體地、單獨(dú)地通過引用合并于此相同。在權(quán)利要求書中，所有過渡性措辭例如“包含(comprising) ”、“包括 (including)”、“帶有(carrying)，，、“具有(having)”、“含有(containing) ”、“涉及 (involving) ”等，被理解為是開放性的，即意味著包括但不限于。只有過渡性措辭“由……
構(gòu)成(consistingof) ”和“基本上由......構(gòu)成(consisting essentially of) ”分別將是封
閉性或半封閉性過渡性措辭。在本文中公開和要求權(quán)利的所有組合物和/或方法，可以根據(jù)本公開不需要過多 的實(shí)驗(yàn)就能做出或執(zhí)行。盡管已經(jīng)根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案對本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了描 述，但對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說，顯然可以對組合物和/或方法以及在本文描述的 方法的步驟或一系列步驟中進(jìn)行修改，而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體來說，顯然某些化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的因子可用于代替本文描述的因子，同 時(shí)仍能獲得相同的或相似的結(jié)果。所有這些本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員顯而易見的類似替代和 修改，被視為處于隨附的權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。參考文獻(xiàn)Bernal, J. , Gonzalez, D, Ε. Τ. Natwick, J. G. Loya, R. Leon-Lopez, W. E. Bendixen. (1993).在加利福尼亞鑒定到的俄羅斯小麥蚜的天敵(Natural enemies of Russian wheat aphid identified in California), California Agric. 47 :24-28.Bernal, J. , Gonzalez, D. , Natwick, Ε. Τ. , Loya, J. G. , Leon-Lopez, R. , Bendixen, W. E. (1993) · California Agric. 47 :24_28.Burkness, E. C, Hutchison, W. D. ， Weinzierl， R. Α. ，ffedberg, J. L. ， Wold S. J.， Shaw J. T. (2002). Crop Protection,21 (2) :157_169.Cabrera, H. M.， Argandona;, V. H.， Zufiiga, G. E.，Corcuera L.J. (1995).
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權(quán)利要求
編碼完整的istk基因的分離的核苷酸序列，如SEQ ID NO1中從46位核苷酸到1275位核苷酸所示，其中istk基因產(chǎn)物是絲氨酸-蘇氨酸激酶49-kDa多肽(ISTK)。
2.權(quán)利要求1的ISTK多肽，其中多肽能夠在昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，或抑制昆蟲細(xì)胞中 蛋白的合成。
3.權(quán)利要求1的istk基因的亞基因片段，其中所述亞基因片段具有如SEQID N0:3中 所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3的亞基因片段，其中所述亞基因片段編碼如SEQIDN0 2中1-290位所 示的37-kDa多肽(iridoptin)，并且其中該多肽包含絲氨酸-蘇氨酸激酶。
5.權(quán)利要求4的iridoptin多肽，其中所述多肽與ISTK相比，對昆蟲顯示出增強(qiáng)的毒性。
6.生產(chǎn)如SEQID NO 2中1-290位所示的37_kDa多肽(iridoptin)的方法，所述方 法包括下列步驟(a)提供如SEQID N0:1中從46位核苷酸到1275位核苷酸所示的編碼完整istk基 因的分離的核苷酸序列，其中istk基因產(chǎn)物是絲氨酸-蘇氨酸激酶49-kDa多肽(ISTK)；(b)鑒定ISTK多肽上的剪切位點(diǎn)；(c)鑒定C-末端氨基酸；(d)在從istk基因衍生的氨基酸序列中檢測C-末端氨基酸；以及(e)剪切ISTK多肽，以產(chǎn)生同時(shí)含有ATP結(jié)合位點(diǎn)和絲氨酸-蘇氨酸激酶的37_kDa多 肽(iridoptin)。
7.分離如SEQID NO :3所示的istk基因的亞基因片段的方法，其中亞基因片段編碼 權(quán)利要求4的多肽，所述方法包括(a)對如SEQID NO 2中1-290位所示的37-kDa多肽(iridoptin)進(jìn)行C-末端測序；(b)確定37-kDa多肽的分子量和并對其N-末端測序；(c)使用專門設(shè)計(jì)的引物和螟蟲虹彩病毒基因組DNA，對編碼37-kDa多肽的亞基因DNA 序列進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；以及(d)利用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物。
8.載體，其含有編碼如SEQID NO :2的1-290位所示的多肽的多核苷酸序列，其中所 述多肽與螟蟲虹彩病毒衣殼蛋白提取物相比，對昆蟲表現(xiàn)出增強(qiáng)的毒性。
9.宿主細(xì)胞，其含有編碼如SEQID NO 2的1-290位所示的多肽的多核苷酸序列，其 中所述多肽與螟蟲虹彩病毒衣殼蛋白提取物相比，對昆蟲表現(xiàn)出增強(qiáng)的毒性。
10.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的細(xì)胞，其中植物細(xì)胞是棉花細(xì)胞。
12.生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的方法，所述方法包括將編碼具有SEQIDN0 2中1-290位的 37-kDa多肽(iridoptin)的istk基因的亞基因片段導(dǎo)入到細(xì)胞中，并且其中所述細(xì)胞是植 物細(xì)胞或微生物細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的方法，其中細(xì)胞是植物細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的方法，其中植物細(xì)胞是棉花細(xì)胞。
15.生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的方法，所述方法包括將如SEQID NO :3所示的核苷酸序列導(dǎo)入 到細(xì)胞中，并且其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞或微生物細(xì)胞。
16.生產(chǎn)抗昆蟲植物的方法，所述方法包括下列步驟(a)將如SEQID NO :3所示的核苷酸序列導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，用于表達(dá)殺昆蟲蛋白；(b)篩選轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；以及(c)從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物，其中所述植物包含所述核苷酸序列。
17.來自按照權(quán)利要求16的方法生產(chǎn)的植物的種子或后代，其中所述種子或后代含有 所述核苷酸序列。
18.植物，其含有如SEQID NO :3所示的核苷酸序列。
19.來自權(quán)利要求18的植物的種子或后代，其中所述種子或后代含有所述核苷酸序列。
20.植物，其從權(quán)利要求19的種子長成。
21.在作物田間防治昆蟲侵襲的方法，所述方法包括向昆蟲提供該昆蟲以之為食的 轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)如SEQ ID NO :2中的1-290位所示的多核苷酸序列編碼 的殺昆蟲蛋白。
22.防治昆蟲侵襲植物的方法，所述方法包括向昆蟲提供該昆蟲以之為食的轉(zhuǎn)基因 植物，所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)如SEQ ID NO :2中的1-290位所示的多核苷酸序列編碼的殺昆 蟲蛋白。
23.昆蟲防治組合物，包含適合的載體和昆蟲防治量的分離的殺昆蟲的螟蟲虹彩病毒 蛋白，所述蛋白包含編碼如SEQ ID NO :2的1-290位所示的多肽的多核苷酸序列，其中所述 多肽與螟蟲虹彩病毒衣殼蛋白提取物相比，對昆蟲表現(xiàn)出增強(qiáng)的毒性。
24.防治在植物、人類或動(dòng)物之間侵染或傳播疾病的昆蟲害蟲或昆蟲疾病介體的方法， 包括在有待防治昆蟲的位置施加昆蟲防治量的分離的殺昆蟲的螟蟲虹彩病毒蛋白，所述 蛋白包含編碼如SEQ IDNO :2的1-290位所示的多肽的多核苷酸序列，其中所述多肽與螟蟲 虹彩病毒衣殼蛋白提取物相比，對昆蟲表現(xiàn)出增強(qiáng)的毒性。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述多肽被昆蟲攝取或通過接觸導(dǎo)入昆蟲。
26.權(quán)利要求24的方法，其中昆蟲被所述多肽噴灑。
27.權(quán)利要求24的方法，其中昆蟲是蚜蟲或同翅目(Homoptera)的其他成員。
28.權(quán)利要求24的方法，其中昆蟲選自棉籽象鼻蟲、草盲蝽、粉虱和夜蛾。
29.權(quán)利要求24的方法，其中所述位置是植物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中植物選自棉花、玉米、苜蓿、油菜、豆、土豆和水稻植物。
全文摘要
用于防治昆蟲的改進(jìn)的方法和化合物，包括使用iridoptin在目標(biāo)昆蟲中誘導(dǎo)毒性的生物防治方法。本發(fā)明在昆蟲細(xì)胞中誘導(dǎo)高水平的凋亡并抑制宿主蛋白的合成。它是針對非鱗翅目昆蟲的第一種病毒毒素，與現(xiàn)有的細(xì)菌毒素不同，例如對于大多數(shù)甲蟲，包括棉籽象鼻蟲無效的蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)毒素，以及桿狀病毒科(Baculoviridae)，該科是目前用作生物防治藥劑的主要類型的病毒。Iridoptin將可用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治。它將增加生產(chǎn)率，減少由介體和住宅害蟲引起的疾病傳播。通過擴(kuò)展，它可用于癌癥治療和其他關(guān)鍵在于用凋亡除去某些細(xì)胞的醫(yī)學(xué)治療中。
文檔編號C07H21/02GK101849004SQ200880114763
公開日2010年9月29日 申請日期2008年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日
發(fā)明者單·比利莫里亞 申請人:德克薩斯理工大學(xué)