專利名稱：海藻溴酚脲類化合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品添加劑，具體地說是一種海藻中溴酚脲類化合物及其 制備方法和應(yīng)用。
自由基誘導(dǎo)引起的氧化反應(yīng)能導(dǎo)致食品特別是含油食品酸敗變質(zhì)。不 僅如此，氧化反應(yīng)還能導(dǎo)致食品退色、褐變等，從而嚴(yán)重影響食品的質(zhì)量， 降低食品的營養(yǎng)價值。另一方面，自由基引發(fā)的許多氧化產(chǎn)物和中間產(chǎn)物 是公認(rèn)的致癌物，會嚴(yán)重?fù)p害有機體的生物膜、蛋白質(zhì)、酶及細(xì)胞功能， 直接或間接引起許多疾病如癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病、神經(jīng)退行性疾 病以及機體老化等的發(fā)生。
目前常用的防止食用油脂和含油食品氧化變質(zhì)的主要途徑之一是加入 抗氧化劑，以防止或者延緩包括自由基氧化在內(nèi)所引起的氧化反應(yīng)的發(fā)生。
其中叔丁基羥基甲苯(BHT)、叔丁基羥基茴香醚(BHA)是較常用的化 學(xué)合成抗氧化劑、自由基清除劑。但是隨著生活水平的提高，人類對合成 抗氧化劑、自由基清除劑的安全問題越來越關(guān)注，特別是研究發(fā)現(xiàn)BHT、 BHA存在一定的毒性(如能引起肝臟擴大并有可能致癌)，天然抗氧化劑、 自由基清除劑的研究受到越來越廣泛的重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于提供一種海藻中溴酴脲類化合物及其制備方法和應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為 海藻溴酚脲類化合物如結(jié)構(gòu)式(I )所示
其中 R,為-H、-Br或2， 3-二溴-4, 5-二羥基節(jié)基，112為-H、-(CH2) 3C00H、 -CA或吡咯烷酮基，R:'為-H、 -(CH2)3COOH、 -CA或吡咯烷酮基。 海藻溴酚脲類化合物的制備方法-.
1 )將海洋紅藻松節(jié)藻粉碎到60-80目，然后用有機溶液浸取合并提取 液進行濃縮，得到粗提物；
2 )取步驟1 )中所得粗提物的2-3倍體積的水加入步驟1 )的粗提物中，
背景技術(shù)：
并依次用所述加入水體積2-3倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取，萃
取物各自濃縮得相應(yīng)的提取物，備用；
3) 取步驟2)中的乙酸乙酯提取物進行硅膠柱層析，收集洗脫液待用； 步驟3)中可用100: 0到0: 100的梯度的氯仿-甲醇或100: 0到0:
100的梯度乙酸乙酯-甲醇的洗脫液進行洗脫硅。
4) 將步驟3)中以氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇體積比35-40: 1梯度洗 脫下的組分進行硅膠和葡聚糖凝膠柱層析，收集洗脫液濃縮后得目標(biāo)化合 物(I)。
步驟1)中的有機溶液可為濃度在50-100%的乙醇或甲醇。
步驟4)中硅膠柱層析所用的洗脫液可為石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙 酯；葡聚糖凝膠柱層析所用的洗脫液可為甲醇或氯仿-甲醇。
海藻溴酚脲類化合物的應(yīng)用所述化合物可作為延緩、防止自由基誘 導(dǎo)引起的食用油脂氧化變質(zhì)或含油食品添加劑。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點本發(fā)明的天然溴酚脲類化合物，屬于小分子天 然有機化合物，容易制備獲得；本發(fā)明涉及的溴酴脲類化合物具有顯著的 DPPH自由(a,a-diphenyl誦P陽picrylhydrazyl,即，二苯代苦味酰自由基)活 性，可作為食品添加劑延緩或防止食用油脂和含油食品因自由基誘導(dǎo)引起 的氧化變質(zhì)。
本發(fā)明涉及的海洋紅藻松節(jié)藻0 /2O^ me/a cow/erw/^fes)屬于紅藻 門、松節(jié)藻科、松節(jié)藻屬海藻，在中國主要分布于黃海海域。本發(fā)明通過 對松節(jié)藻進行提取和分離，獲得溴酚脲類天然化合物(I),經(jīng)實驗證明， 這些化合物具有顯著的DPPH自由基清除活性，在相同的濃度條件下其作 用強度明顯高于化學(xué)合成品BHT,可廣泛應(yīng)用于食用油脂或含油食品中， 替代化學(xué)合成抗氧化劑、自由基清除劑，防止或延緩由自由基引起的氧化 反應(yīng)的發(fā)生，從而延長保質(zhì)期，提高產(chǎn)品質(zhì)量。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施實例對本發(fā)明做進一步闡述。
實施例1
溴酚脲類化合物的制備方法 采集新鮮的松節(jié)藻經(jīng)海水清洗，除去表面附著的沙礫及雜藻，陰涼處
涼干備用。取涼干后的樣品10Kg，粉碎到60目后用15升95%的乙醇在室 溫下提取三次，每次三天，合并乙醇提取液，在溫度40。C左右減壓濃縮、 回收乙醇，獲得乙醇粗提物。粗提物中加入所得粗提物體積2倍的蒸餾水 使之混懸于水中，依次用上述混懸粗提物的蒸餾水的2倍體積的石油醚、 乙酸乙酯、正丁醇分別萃取各三次，分別濃縮后獲得相應(yīng)的石油醚、乙酸 乙酯、正丁醇提取物。將乙酸乙酯提取物(80克)進行硅膠柱層析，用氯 仿—甲醇以IOO: 0、 90: 1、 85: 1， 70: 1、 50: ]、 40: 1、 30: 1、 20: 1、 10: 1、 5: 1、 3: j、 1: 1到0: IOO的梯度進行洗脫，分別收集洗脫液，
4再用薄層層析(TLC)檢測(用三氯化鐵作為顯色劑)，根據(jù)Rf值來判斷、
合并相同或類似部分，獲得37個組分。將第34組分，其Rf: 0.3-0.4 (200 毫克)，即以氯仿-甲醇40: l梯度洗脫下的組分再由體積比為40: 60到0: 100的石油醚-丙酮為洗脫劑進行硅膠層析，所得各組分合并后經(jīng)葡聚糖凝 膠SephadexLH-20柱層析，用體積比為l: l的氯仿-甲醇洗脫，洗脫液經(jīng) 減壓濃縮獲得純化合物A ( 5. G毫克)，經(jīng)波譜分析，化合物A的結(jié)構(gòu)確定 為AK2，3-二溴-4,5-二羥基芐基)-7V'-(5-羰基-2-吡咯烷酮)個脲基丁酸，英文名 為iV-(2，3- dibromo-4,5-dihydroxybenzyl)-A^'扁(5-oxopyrrolidin-2-yl)卞 ureidobutyric acid,即式(I)中R,為Br、 R2為-(CH2)3COOH、 R3為吡咯烷 酮基時所代表的化合物；
將經(jīng)薄層層析(TLC)檢測(用三氯化鐵作為顯色劑)，第32組分(2 克)，Rf=0. 3-0. 6即以氯仿-甲醇35: 1 (已修改)梯度洗脫下的組分再進 行硅膠柱層析和葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱層析分離，硅膠柱層析時用 梯度在40: 60到0: 100的石油醚-丙酮進行洗脫，葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析用100%濃度的甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)減壓濃縮獲得純化合物B (3. 0亳克)，經(jīng)波譜分析，化合物B的結(jié)構(gòu)確定為AK2,3-二溴-4,5-二羥基 芐基)-7V'-(2-羰基-l-吡咯烷酮)脲，英文名為
iV-(2，3畫dibromo國4,5-dihydroxybenzyl)畫7V'-(2-oxopyrrolidin-l一yl) urea,艮卩式(I ) 中R，為-Br， R2為-H, R3為吡咯烷酮基時所代表的化合物?；衔顰、 B 的結(jié)構(gòu)式如下所示。
Q
5"
化合物A
化合物B
化合物A、 B具有以下理化和波譜特性
化合物A:棕色粉末；旋光度+ 3.81° (CO.l，甲醇)；紅外光譜-.v 3747, 3649, 2926， 2846, 1733, 1640, 1534, 1448, 672 cm";紫外光譜 義麗nm (log ￡) 215.0 (4.07), 233.0 (4.02)， 293.0 (3.60);核磁共振氫譜 ( NMR, DMSO-4 500 MHz) 5 7.88 (1H, br s, NH-1'"), 6.98 (1H, d， J= 8.1 Hz, NH-3'), 6.63 (1H， s, H-6")， 5.37 (1H， m, H-2"'), 4.35 (2H, q, J= 16.7 Hz, H-7")， 3.13 (2H, m， H-4)， 2.30 (2H, m, H-4川)，2.29 (1H, m, H-3"'a), 2.20 (2H, t, /= 7.3 Hz， H-2), 1.84 (1H， m, H-3'"b), 1.68 (2H, t, /= 7.3 Hz, H-3);核磁共振碳譜 (l3C NMR DMSO-^5, 125 MHz) 576.1 (s， C-5'")， 174.5 (s, C-l), 156.5 (s, C-2'), ]45.4 (s, C-5"), ]43.5 (s, C-4"), 129.2 (s， C-]"), 1 ]3.5 (s, C-2"), U3.3 (d，
義，
-NH
、
r
^ (C-6"), 112.8 (s, C-3"), 62.0 (d， C-2"'), 50.4 (t, C-7"), 45.3 (t， C-4), 30.8 (t, C-2), 29.1 (t, C-4'"), 27.5 (t, C-3"'), 23.2 (t, C-3);低分辨質(zhì)譜ESIMS m/z 510 /508 /506 [M - H]- (2,4， 2), 407 (24), 405 (55), 403 (22), 327 (7)， 325 (16), 323 (6), 297 (2), 295 (3), 293 (2);高^辨質(zhì)譜HRFABMS m/z 505.9568 [M -(calcd for C16H1879Br2N306, 505.9562).
化合物B:黃色油狀；紅外光譜v匪3748, 3291， 2919, 1712, 1653， 1540， 1401, 1275, 665 cm";紫外光譜A隨nm (log e) 215.0 (3.96), 230.0 (4.08); 核磁共振氫譜('HNMR, actone-d6, 500 MHz) 5 6.98 (1H, s， H-6'), 4.44 (2H, d， 6.0 Hz, H-7'), 3.76 (2H， t, 7.2 Hz， H-5")， 2.58 (2H， t, J= 8.1 Hz, H-3")， 2.05 (2H, m, H-4");核磁共振碳譜(13C雨R acetone-^， 125 MHz) 5 178.0 (s， C-2"), 154.3 (s, C-2), 145.7 (s, C匿5')， 144.7 (s, C陽4')， 131.8 (s， C-l')， 116.4 (d， C-6'), 115.6 (s， C-2'), 114.0 (s, C-3')， 46.3 (t, C-5"), 45.5 (t， C畫7'), 33.7 (t， C-3"), 17.7 (t, C-4");低分辨質(zhì)譜ESIMS m/z 448/446/444 [M + Na]+ (1, 2, 1)， 433 (2), 431 (4), 429 (2), 139(42);高分辨質(zhì)譜HRFABMS m/z 443.9136 [M + Na]+ (calcd for C12H1379Br2N304Na, 443.9170).
實施例2
與實施例l不同之處在于
將干燥粉碎的松節(jié)藻用濃度80%的乙醇提取4次，每次三天，合并提 取液，室溫下減壓濃縮獲得粗提物，同時乙醇回收。將粗提物懸浮于粗提 物體積3倍的水中，依次用上述混懸粗提物的蒸餾水的2倍體積的石油醚、 乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次，分別濃縮后獲得相應(yīng)的石油醚、乙酸乙酯、 正丁醇提取物。將乙酸乙酯提取物進行硅膠柱(220克，200-300目)層析， 用梯度為100: 0到0: 100的梯度的乙酸乙酯-甲醇進行梯度洗脫，分別收 集洗脫液，以薄層層析(TLC)檢測(用三氯化鐵作為顯色劑)，根據(jù)Rf 值來判斷、合并相同或類似部分；待Rf- 0.25-0.4,即氯仿-甲醇40: l梯 度洗脫下的組分再進行硅膠柱層析和葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析分 離，硅膠層析采用梯度在20: 80到0: 100的石油醚-乙酸乙酯進行洗脫； 葡聚糖凝膠柱層析所用的洗脫劑為梯度為50: 50的氯仿-甲醇進行洗脫，洗 脫液減壓濃縮后獲得純化合物C。
待Rf-0.4-0.6,即氯仿-甲醇35: 1梯度洗脫下的組分再進行硅膠柱層 析和葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱層析分離，硅膠層析采用梯度在20: 80 到0: 100的石油醚-乙酸乙酯進行洗脫；葡聚糖凝膠柱層析所用的洗脫劑為 梯度為50: 50的氯仿-甲醇進行洗脫，洗脫液減壓濃縮后獲得純化合物D。
純化合物C和化合物D，經(jīng)波譜分析，化合物C的結(jié)構(gòu)確定為7V-(2,3-二溴-4,5-二羥基節(jié)基)t脲基丁酸，英文名為A42,3-dibromo-4,5-dihydroxybenzyl)-y-ureidobutyric acid, 即式(I)中R卜為-Br、 R_2為 -(CH2)3COOH、 R3為-H時所代表的化合物；化合物D的結(jié)構(gòu)確—定為7V'-(3-溴-4,5-二羥基節(jié)基)-)'-脲基丁酸，英文名為7V'-(3-bromo-4，5-dihydroxybenzyl) -〕'-ureidobutyric add,即式(I )中R,為-H、 R2為-H, R3為-(CH2)3COOH時所代表的化合物?；衔顲、 D的結(jié)構(gòu)式如下所示。
O
OH
化合物C 化合物D
實施例3
DPPH自由基清除活性
DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，在有機溶劑中呈紫色，在517nm附近有 強吸收，加入抗氧化劑后， 一部分自由基被清除，使吸收減弱，可借此來 評價其抗氧化活性、自由基清除活性的強弱。該方法具有搡作簡便、重現(xiàn) 性好等優(yōu)點。
實驗方法
在2mL實施例1所得化合物A或B中加入2mL DPPH.(甲醇溶液， 0.16mmol/L)混合均勻后，室溫暗處放置50min后，于517nm處測定其吸
光度Asampie。
在2mL實施例1所得化合物A或B加入2mL甲醇溶液于517nm處測 定其吸光度Asampleblank。 2mLDPPH中加入2mL甲醇氯仿混合溶劑于517nm 處測定其吸光度Ac。ntrol。 2mL甲醇中加入2mL甲醇氯仿混合溶劑于517nm 處測定其吸光度Ab^k。
自由基清除率的計算
清除率％ = 100畫(Asample — Asampleblank) xlOO /(Acontrol- Ablank)。 將實施例1所得化合物A或B得到的樣品在0.1pg/mL、 0.25pg/mL、 1.0pg/mL、 2.5 |ig/mL、 5.0(ag/mL、 10.0 |ug/mL、 25.0 |ig/mL不同濃度下分 別測試，每個濃度平行測定三次，取平均值即為樣品清除率，并計算IC50 值。所有測試均以BHT為標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照。
實驗結(jié)果參見表l,數(shù)據(jù)表明上述獲得的溴酚脲類化合物具有顯著的 DPPH清除活性，在低濃度到高濃度下溴酚脲類化合物的活性強度都明顯高 于陽性對照BHT。另外，實驗表明，BHT的ICs。為83.3 pM，而溴酚脲類 化合物A、 B的ICso分別為3.82和3.53 pM,僅為陽性對照BHT的十二分 之一或十三分之一，表明化合物A、 B的的自由基清除活性顯著高于陽性對 照BHT。表1_
自由基清除活性(清除率，％)
(Hg/mL)o.l 0.25 1.0 2.5 5.0 10.0 25.0
AM勿A I'20 1.76 12.51 43.51 69.63 74.21 90.52 3.82 4h^#B0.81 1.5220.54 47.23 62.34 75.21 93.51 3.53
BHT — 2.4 5.6 10.718.1 31.163.5 82.11
實施例4
溴酚脲類化合物在食用油脂抗氧化中的應(yīng)用
取食用油脂1千克，按照其重量的0.02%加入上述化合物A、 B、 C或 D,混合均勻，制得抗自由基氧化的食用油脂。與不含溴酴脲類化合物的食 用油脂相比，含溴酚脲類化合物的食用油脂其保存期是前者的3-4倍以上。
本發(fā)明所涉及的溴酚脲類化合物可應(yīng)用于任何食用油脂中，以防止或延 緩自由基引起的氧化變質(zhì)，延長保質(zhì)期。
權(quán)利要求
1.一種海藻溴酚脲類化合物，其特征在于如結(jié)構(gòu)式(I)所示其中R1為-H、-Br或2，3-二溴-4，5-二羥基芐基，R2為-H、-(CH2)3COOH、-C6H5或吡咯烷酮基，R3為-H、-(CH2)3COOH、-C6H5或吡咯烷酮基。
2. —種權(quán)利要求1所述的海藻溴酚脲類化合物的制備方法，其特征在于1)將海洋紅藻松節(jié)藻粉碎到60-80目，然后用有機溶液浸取合并提取 液進行濃縮，得到粗提物；2 )取步驟1)中所得粗提物的2-3倍體積的水加入步驟1)的粗提物中， 并依次用所述加入水體積2-3倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取，萃 取物各自濃縮得相應(yīng)的提取物，備用；3) 取步驟2)中的乙酸乙酯提取物進行硅膠柱層析，收集洗脫液，洗 脫液經(jīng)薄層層析(TLC)檢測；所述洗脫液為100: 0-0: 100梯度的氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇；4) 將步驟3)中體積比35-40: 1梯度洗脫下的組分進行硅膠和葡聚糖 凝膠柱層析，收集洗脫液濃縮后得目標(biāo)化合物(I)。
3. 按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟l)中的有機溶液 可為濃度在50-100%的乙醇或甲醇。
4. 按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟4)中硅膠柱層 析所用的洗脫液可為石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；葡聚糖凝膠柱層析所 用的洗脫液可為甲醇或氯仿-甲醇。
5. —種權(quán)利要求1所述的海藻溴酚脲類化合物的應(yīng)用，其特征在于 所述化合物可作為延緩、防止自由基誘導(dǎo)引起的食用油脂氧化變質(zhì)或含油 食品添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及食品添加劑，具體地說是一種海藻中溴酚脲類化合物及其制備方法和應(yīng)用。其結(jié)構(gòu)式如圖(I)所示，其中R₁為-H、-Br或2，3-二溴-4，5-二羥基芐基，R₂為-H、-(CH₂)₃COOH、-C₆H₅或吡咯烷酮基，R₃為-H、-(CH₂)₃COOH、-C₆H₅或吡咯烷酮基。制備方法為將松節(jié)藻經(jīng)過濾的海水沖洗干凈、除去表面附著的沙礫及雜藻，陰干、粉碎后浸取、溶劑分配和反復(fù)的層析分離，得到純化獲得的具有清除自由基活性的溴酚脲類化合物。本發(fā)明的天然溴酚脲類化合物，屬于小分子天然有機化合物，容易制備獲得。
文檔編號C07D207/00GK101643442SQ20081013911
公開日2010年2月10日 申請日期2008年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日
發(fā)明者可 李, 李曉明, 王斌貴 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所