專利名稱：防止高度聚合的重組人乳頭瘤病毒l1蛋白的修飾序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人乳頭瘤病毒感染的預(yù)防和治療領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及防止高度聚合的重組人乳頭瘤病毒L1蛋白的修飾氨基酸序列，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列，以及包含這些核苷酸序列的載體和轉(zhuǎn)化子；本發(fā)明還涉及由該氨基酸修飾序列所表達(dá)得到的HPV L1蛋白五聚體在制備疫苗、藥物組合物以及診斷抗原或抗體中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
乳頭瘤病毒(Papilloma virus)是一大類侵染人類和其他動(dòng)物的DNA病毒。其中人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus；HPV)與人類的多種疾病相關(guān)，這些疾病包括良性疣和癌癥。
乳頭瘤病毒含有兩個(gè)用于保護(hù)病毒染色體的結(jié)構(gòu)蛋白(或衣殼蛋白)，分別為L1和L2。360個(gè)L1蛋白分子或72個(gè)L1五聚體形成病毒顆粒的外殼，因此L1成為重要的候選免疫原。
在自然條件下，寄生于人體或其它哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞的乳頭瘤病毒在寄主細(xì)胞衰老及行將死亡前大量繁殖。繁殖時(shí)，病毒在啟動(dòng)自身基因組DNA復(fù)制的同時(shí)啟動(dòng)L1衣殼蛋白基因在寄主細(xì)胞中的表達(dá)，表達(dá)后的L1蛋白自動(dòng)形成五聚體結(jié)構(gòu)，然后這些五聚體自身進(jìn)一步自動(dòng)聚合，最后由72個(gè)五聚體形成一個(gè)野生病毒顆粒，每個(gè)病毒顆粒內(nèi)部儲(chǔ)藏一套病毒的DNA分子。
人體對任何入侵病毒的識別主要是識別病毒表面的衣殼蛋白分子，沒有例外。人乳頭瘤病毒L1衣殼蛋白的五聚體分子表面構(gòu)成了人體的抗原識別表位(即抗原表位)。在病毒被識別后，人體產(chǎn)生特異抗體來中和病毒，對抗病毒的感染和危害。
為了誘導(dǎo)人體產(chǎn)生對抗乳頭瘤病毒的特異抗體，我們通過生物工程的方法表達(dá)和純化病毒的衣殼蛋白，并以純化的L1蛋白作為抗原來生產(chǎn)疫苗。重組L1蛋白五聚體本身就具備完整的抗原表位，因此就可以作為抗原用來制備疫苗。但在生產(chǎn)的過程中，部分L1五聚體可以自動(dòng)聚合形成與野生病毒顆粒大小完全一樣的類病毒顆粒(VLP，virus likeparticle)。VLP的免疫原性及抗原性與L1五聚體沒有實(shí)質(zhì)區(qū)別。
為了降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)乳頭瘤病毒抗原的原核表達(dá)，有必要通過基因改造控制L1蛋白VLP的形成，這樣有利于使抗原分子的大小均勻一致，便于質(zhì)量控制，也有利于提高產(chǎn)率。


發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題 本發(fā)明的目的是提供一種防止高度聚合的重組人乳頭瘤病毒L1蛋白的修飾氨基酸序列；本發(fā)明的又一目的是提供上述重組人乳頭瘤病毒L1衣殼蛋白氨基酸修飾序列的應(yīng)用。
(二)技術(shù)方案 本發(fā)明所述防止高度聚合的重組人乳頭瘤病毒L1蛋白的修飾氨基酸序列，是通過對編碼野生型HPV L1蛋白的DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)堿基替代突變，由突變后的DNA序列表達(dá)得到的重組HPV L1蛋白氨基酸序列，該重組HPV L1蛋白氨基酸序列在不影響L1蛋白生物活性的前提下，不能形成L1蛋白二級和高級結(jié)構(gòu)中的H4α螺旋結(jié)構(gòu)。
其中，所述的替代突變區(qū)域的替換起始位點(diǎn)為野生型HPV L1蛋白氨基酸序列中向保守序列LβγWN或LβγWQ的N端移動(dòng)1-2個(gè)氨基酸處，替換截止位點(diǎn)為向保守序列DP的C端移動(dòng)1-2個(gè)氨基酸處，替代突變方式為將上述區(qū)域內(nèi)的氨基酸全部或部分替代成由2-10個(gè)極性氨基酸組成的連接短肽，其中，β表示E或D，γ表示E、D或N。
優(yōu)選地，所述的替代突變區(qū)域?yàn)橐吧虷PV L1蛋白氨基酸序列中的保守序列LβγWN或LβγWQ至其下游的保守序列DP之間的區(qū)域，其中，β表示E或D，γ表示E、D或N。更優(yōu)選地，所述的連接短肽由S和G組成。
由于編碼不同型HPV L1蛋白的DNA序列在上述修飾區(qū)域均具有很高的保守性，所以上述改造方法適用于所有已知的HPV型，得到的表達(dá)產(chǎn)物均為五聚體，而不能形成VLP。
在本發(fā)明中，進(jìn)行修飾所依據(jù)的野生型HPV L1蛋白氨基酸序列來源于Genebank。具體地，常見的31種HPV型的野生型L1蛋白的氨基酸序列對應(yīng)的Genebank登錄號分別為 HPV1-NC_001356，HPV2-NC_001352，HPV3-NC_001588，HPV4-NC_001457，HPV5-NC_001531，HPV6-NC_000904，HPV11-NC_001525，HPV16-AF402678，HPV18-AY262282，HPV26-NC_001583，HPV31-NC_001527，HPV33-NC_001528，HPV35-NC_001529，HPV39-NC_001535，HPV42-NC_00153，HPV45-NC_001590，HPV51-NC_001533，HPV52-NC_001592，HPV53-NC_001593，HPV54-NC_001676，HPV56-NC_001594，HPV57-NC_001353，HPV58-NC_001443，HPV59-NC_001635，HPV61-NC_001694，HPV66-NC_001695，HPV67-NC_004710，HPV70-NC_001711，HPV72-NC_X94164，HPV73-X94165，HPV82-AF293961。
采用本發(fā)明所述的方法進(jìn)行修飾后，上述常見的HPV型對應(yīng)的重組氨基酸序列分別為HPV1對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，HPV2對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，HPV3對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，HPV4對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO4所示，HPV5對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO5所示，HPV6對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO6所示，HPV11對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQID NO7所示，HPV16對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO8所示，HPV18對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO9所示，HPV26對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO10所示，HPV31對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO11所示，HPV33對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO12所示，HPV35對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO13所示，HPV39對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO14所示，HPV42對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO15所示，HPV45對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO16所示，HPV51對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO17所示，HPV52對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO18所示，HPV53對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO19所示，HPV54對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQID NO20所示，HPV56對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO21所示，HPV57對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO22所示，HPV58對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO23所示，HPV59對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO24所示，HPV61對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO25所示，HPV66對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO26所示，HPV67對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO27所示，HPV70對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ IDNO28所示，HPV72對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO29所示，HPV73對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO30所示，HPV82對應(yīng)的重組氨基酸序列如SEQ ID NO31所示。
本發(fā)明還涉及包含編碼上述修飾氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。編碼上述氨基酸序列的核苷酸序列的共同特征是，表達(dá)得到的產(chǎn)物具有與野生型HPV L1蛋白相同的免疫特性。所述核酸分子包括但不限于以下形式編碼上述修飾氨基酸序列的核苷酸序列與編碼HPV前期蛋白(如E6/E7)的核酸序列組成的融合序列。優(yōu)選地，所述核酸分子即為編碼上述修飾氨基酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明也涉及包含上述核苷酸序列的表達(dá)載體，這些載體是通過將上述核苷酸序列克隆到包含合適啟動(dòng)子和其它合適轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控原件的連接載體中得到的，其中用于連接的載體包括商業(yè)上可獲得的質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體和粘粒。優(yōu)選地，用于連接的載體選自pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3、pET-28a、pcDNA3.1以及其它商業(yè)上可獲得的表達(dá)質(zhì)粒。所用到的分子克隆方法參見《分子克隆》(第三版，科學(xué)出版社，2002年8月出版)。
本發(fā)明還涉及包含上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子，這些轉(zhuǎn)化子是通過將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中所得，宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞中的任意一種。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞選自大腸桿菌。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及HPV L1蛋白五聚體，該五聚體由上述轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)得到，其單體的一級結(jié)構(gòu)由本發(fā)明所述的重組氨基酸修飾序列所組成，其二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)由其一級結(jié)構(gòu)所決定。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)上述HPV L1蛋白五聚體的方法，它包括如下步驟 (1)發(fā)酵培養(yǎng)如前所述的轉(zhuǎn)化子，并表達(dá)HPV L1蛋白； (2)分離、純化表達(dá)產(chǎn)物，得到HPV L1蛋白五聚體。
本發(fā)明公開了上述重組HPV L1蛋白五聚體在制備預(yù)防HPV感染的疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的疫苗是由任意一種或多種HPV型的重組HPV L1蛋白五聚體所組成的單價(jià)或聯(lián)合預(yù)防疫苗。
本發(fā)明所述的疫苗的形式也可以是包含HPV L1蛋白五聚體+L2蛋白的組合蛋白。上述疫苗的免疫組分也包括一種生理上可接受的載體，包括但不限于能保持HPV L1蛋白五聚體完整性的簡單低濃度鹽溶液，例如10mM NaCl，0.1mM EDTA；或者更大范圍上講，載體包括代謝緩慢的大分子如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳糖酸、聚甘油酸、復(fù)合氨基酸、以及失活病毒粒子等。藥理上適用的鹽也可在HPV L1蛋白五聚體的復(fù)合物中使用。例如，礦物鹽如鹽酸鹽、溴化鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；有機(jī)鹽類如乙酸鹽、甘露糖、苯甲酸鹽等。免疫組分還包括液體，如水、生理鹽水、甘油、酒精，以及其他一些物質(zhì)如乳化劑、pH緩沖劑等。
將上述重組HPV L1蛋白五聚體或HPV L1蛋白五聚體+L2蛋白的組合蛋白以免疫有效劑量接種人體后，可誘導(dǎo)人體產(chǎn)生對這些重組蛋白的免疫反應(yīng)。人體的這種特異免疫反應(yīng)可幫助人體預(yù)防人乳頭瘤病毒的入侵或中和清除已經(jīng)入侵的人乳頭瘤病毒。由重組HPVL1蛋白五聚體或HPV L1蛋白五聚體+L2蛋白的組合蛋白制備的疫苗可采用多種方法作用于人體，包括靜脈、肌肉和皮下注射。本發(fā)明所述的疫苗在能引發(fā)對L1蛋白免疫反應(yīng)的有效劑量的范圍使用。用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)的復(fù)合物的特定劑量依照L1復(fù)合物不同而變化。一般而言，L1五聚體的用量在1-500μg/Kg體重之間。上述劑量范圍并不排除更高或更低劑量的可能。例如，具體的劑量會(huì)根據(jù)是否伴隨有其他藥物劑量而定，或取決于個(gè)人的藥代動(dòng)力學(xué)、藥物積累和代謝速率。
本發(fā)明還公開了上述重組HPV L1蛋白五聚體在制備預(yù)防HPV感染的藥物組合物中的應(yīng)用。該藥物組合物包括但不限于下列形式如包含重組HPVL1蛋白五聚體和HPVE6/E7蛋白、以及其它藥物上可接受的輔料的藥物組合物。
本發(fā)明還進(jìn)一步公開了上述重組HPV L1蛋白五聚體在制備HPV病毒免疫診斷抗原或抗體中的應(yīng)用。上述重組HPV L1蛋白五聚體可用來產(chǎn)生對HPV L1蛋白有特異親和力的抗體，這些抗體可被用來直接檢測生物樣品中是否存在與特定病理階段相聯(lián)系的特定HPV型。HPV L1蛋白五聚體還能在免疫測定中用來檢測生物樣品中是否存在HPV病毒的抗體或抗原。包括特異結(jié)合到L1蛋白的單鏈抗體在內(nèi)的多克隆或單克隆抗體能夠被本領(lǐng)域技術(shù)人員用所熟知的技術(shù)生產(chǎn)出來。這些由特異抗原(例如HPV不同亞型)引誘產(chǎn)生的抗體具有識別特定HPV亞型的特異性，例如HPV16和HPV18型。
利用抗體反應(yīng)的免疫測定來檢測L1蛋白的方法包括ELISA、Westernblot、放射免疫測定、免疫組化測定、免疫沉淀等?？贵w和L1五聚體都可作為檢測標(biāo)記，例如酶聯(lián)免疫、放射標(biāo)記、熒光或化學(xué)熒光?？贵w或L1五聚體可以固定在固體支持物(如玻璃或塑料玻片、組織培養(yǎng)板、多孔板、試管、交換柱、交換柱填充物、蛋白)、顆粒(如微球體，包括但不限于乳膠、聚苯乙烯、玻璃球)，或者薄膜(如醋酸纖維或尼龍膜)上。偶聯(lián)蛋白組分的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。只要不防礙抗原抗體特異結(jié)合的能力，任何偶聯(lián)方式都可使用。生物樣品可以是任何被懷疑含有HPV病毒的樣品，例如組織活檢、涂片、組織切樣(如皮膚、子宮、生殖上皮細(xì)胞、喉、上呼吸道、結(jié)膜或口腔組織)。
(三)有益效果 本發(fā)明通過對HPV L1蛋白野生型序列的修飾，有效控制了HPV L1蛋白的聚合程度，表達(dá)得到的是與HPV L1的VLP具有相同免疫原性和抗原性的L1五聚體，L1五聚體相對于L1的VLP而言具有結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、原核表達(dá)更容易實(shí)現(xiàn)、工業(yè)成本大幅降低的優(yōu)點(diǎn)。



圖1是經(jīng)序列修飾后表達(dá)得到的HPV16 L1五聚體電鏡照片； 圖2是經(jīng)序列修飾后表達(dá)得到的六種HPV型的L1五聚體電鏡照片，其中，a表示HPV6，b表示HPV11，c表示HPV18，d表示HPV33，e表示HPV35，f表示HPV58。

具體實(shí)施例方式 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 以HPV16型為例說明對HPV L1蛋白氨基酸序列的修飾 1、人乳頭瘤病毒16型DNA的檢測和分離可能含有野生型HPV16病毒的臨床細(xì)胞樣本廢棄物(用于常規(guī)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的宮頸脫落細(xì)胞的剩余部分)購自北京市安貞醫(yī)院婦科門診。懸浮在1.0毫升水中的脫落細(xì)胞(約1 x 105個(gè))經(jīng)1000單位的蛋白酶K(購自華美生物制品有限公司)在攝氏55度處理300分鐘，經(jīng)10000g高速離心30分鐘，所得上清液可用于檢測是否存在HPV病毒。受感染的HPV16陽性細(xì)胞上清液可直接用于PCR擴(kuò)增HPV16病毒DNA序列的目標(biāo)基因片段。
2、HPV16型L1蛋白DNA的分子克隆HPV16型L1衣殼蛋白基因由目標(biāo)基因特異寡核苷酸引物對經(jīng)DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得。所述的PCR反應(yīng)體系包含20ug DNA模板、1 x PCR緩沖液、正向和反向特異引物(濃度均為0.2μM)、1.5mM鎂離子、1.0單位的TAQ DNA聚合酶。反應(yīng)條件為攝氏95度變性5分鐘，經(jīng)36個(gè)PCR循環(huán)放大(每一循環(huán)為攝氏94度30秒，攝氏55度30秒，攝氏72度2分鐘)，反應(yīng)產(chǎn)物在攝氏72度下溫育10分鐘，然后停止反應(yīng)。PCR反應(yīng)的正向引物序列和反向引物序列見表1。PCR反應(yīng)擴(kuò)增放大的HPV16L1cDNA片段經(jīng)TA克隆(具體操作參見《分子克隆》第三版，科學(xué)出版社，2002年8月出版)克隆到一個(gè)T-Easy vector質(zhì)粒(購自美國Promega生物試劑公司)上。
3、HPV16 L1基因的定點(diǎn)突變(1)在HPV16型L1DNA序列H4結(jié)構(gòu)域N-端處設(shè)計(jì)正向編碼連接多肽GGGSG的寡核苷酸引物的特異引物，該引物含有引入的限制性內(nèi)切酶AccIII位點(diǎn)，使得PCR放大的DNA產(chǎn)物刪除了原來編碼HPV16 H4結(jié)構(gòu)域的全部核苷堿基；(2)在HPV16型L1 DNA序列H4結(jié)構(gòu)域C-端處設(shè)計(jì)反向含有限制性內(nèi)切酶AccIII的寡核苷酸引物的特異引物，使得PCR放大的DNA產(chǎn)物引入一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；(3)將步驟(1)中所得的引物與前述放大L1DNA全長的3’-端反向互補(bǔ)序列引物配對，放大重組HPV16L1 DNA的3’-端DNA片段HPV16V3A，(4)將步驟(2)中所得的引物與前述放大L1DNA全長的5’-端正向序列引物配對，放大重組HPV16L1DNA的5’-端DNA片段HPV16V3B；(5)將HPV16V3A片段與HPV16V3B共同用限制性內(nèi)切酶AccIII酶切，形成特異粘性末端；(6)使用T4DNA連接酶連接AccIII酶切后的HPV16V3A和HPV16V3B片段，使之形成一個(gè)刪除了H4結(jié)構(gòu)域的L1全長cDNA。在該重組HPV16 L1全長cDNA中，原來的H4結(jié)構(gòu)域被編碼連接多肽GGGSG的核苷堿基序列取代。步驟(1)和(2)設(shè)計(jì)的引物序列見表1，所用的PCR反應(yīng)條件均同步驟2。
4、H4替代突變后HPV16 L1基因的表達(dá)將含有堿基替代突變的載有HPV16 L1基因插入片段的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6-1通過熱激法導(dǎo)入大腸桿菌BL21細(xì)胞之后，使用LB培養(yǎng)基(配方見《分子克隆》第三版，科學(xué)出版社，2002年8月出版)進(jìn)行攝氏37度培養(yǎng)，菌種接入后生長12小時(shí)開始用表達(dá)誘導(dǎo)劑IPTG(購自美國Promega公司)誘導(dǎo)，9小時(shí)后收獲細(xì)胞，細(xì)胞用Niro Soavi NS2006型高壓勻質(zhì)機(jī)在800bar下重復(fù)破碎細(xì)胞2次，顯微鏡檢查細(xì)胞破碎率達(dá)到90％以上。上清溶液中的L1蛋白經(jīng)親和色譜純化蛋白預(yù)裝谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂(Amersham公司生產(chǎn)的Glutathione Sepharose 4B)色譜柱，取濃度為50％的Glutathione Sepharose 4B勻漿放入色譜柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml勻漿)。用5-10倍的柱床體積的緩沖液A(組分為50mmol/L Tric-HCl，200mmol/L NaCl，1mmol/LEDTA，pH8.0)洗滌樹脂，將蛋白清液加入色譜柱中，與樹脂混合均勻并在室溫下作用20分鐘后放出濾過液，用10倍柱床體積的緩沖液A洗滌樹脂柱。
檢測將步驟4得到的表達(dá)產(chǎn)物HPV16 L1蛋白送上海生工公司測序，測序結(jié)果如SEQID NO8所示，結(jié)果表明經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組HPV16型L1蛋白序列中原來H4結(jié)構(gòu)域不復(fù)存在，取而代之的是連接多肽GGGSG序列。
用電鏡觀察表達(dá)產(chǎn)物HPV16 L1蛋白，結(jié)果如附圖1所示，得到的是HPV16 L1的五聚體，不再形成VLP。
實(shí)施例2 其余常見的HPV型的L1衣殼蛋白氨基酸序列的修飾 其余常見的HPV型的L1衣殼蛋白氨基酸序列的修飾操作步驟與檢測方法均與實(shí)施例1相同，不同之處見表1。
表1 檢測修飾表達(dá)后得到的產(chǎn)物送上海生工公司測序，測序結(jié)果分別如SEQ ID NO1-SEQ ID NO31所示，結(jié)果表明經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的重組HPV L1蛋白序列中原來H4結(jié)構(gòu)域均不復(fù)存在，取而代之的是表1中所示的連接多肽序列。
抽取六種HPV型的修飾表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果如附圖2所示a表示HPV6，b表示HPV11，c表示HPV18，d表示HPV33，e表示HPV35，f表示HPV58，從圖中可看到表達(dá)產(chǎn)物均為五聚體，有效控制了HPV L1蛋白的聚合。
由于編碼不同型HPV L1蛋白的DNA序列在上述修飾區(qū)域均具有很高的保守性，所以上述改造方法適用于所有已知的HPV型，得到的表達(dá)產(chǎn)物均為五聚體。
序列表
<110>馬潤林
陳小江
<120>防止高度聚合的重組人乳頭瘤病毒L1蛋白的修飾序列
<130>MA0705
<160>31
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>484
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV1 L1
<400>1
<210>2
<211>481
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV2 L1
<400>2
<210>3
<211>474
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV3 L1
<400>3
<210>4
<211>490
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV4 L1
<400>4
<210>5
<211>485
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV5 L1
<400>5
<210>6
<211>472
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV6 L1
<400>6
<210>7
<211>473
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV11 L1
<400>7
<210>8
<211>503
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV16 L1
<400>8
<210>9
<211>541
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV18 L1
<400>9
<210>10
<211>477
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV26 L1
<400>10
<210>11
<211>478
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV31 L1
<400>11
<210>12
<211>471
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV33 L1
<400>12
<210>13
<211>477
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV35 L1
<400>13
<210>14
<211>482
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV39 L1
<400>14
<210>15
<211>500
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV42 L1
<400>15
<210>16
<211>515
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV45 L1
<400>16
<210>17
<211>480
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV51 L1
<400>17
<210>18
<211>501
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV52 L1
<400>18
<210>19
<211>475
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV53 L1
<400>19
<210>20
<211>468
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV54 L1
<400>20
<210>21
<211>506
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV56 L1
<400>21
<210>22
<211>484
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV57 L1
<400>22
<210>23
<211>496
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV58 L1
<400>23
<210>24
<211>482
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV59 L1
<400>24
<210>25
<211>476
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV61 L1
<400>25
<210>26
<211>477
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV66 L1
<400>26
<210>27
<211>503
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV67 L1
<400>27
<210>28
<211>503
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV70
<400>28
<210>29
<211>479
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV72 L1
<400>29
<210>30
<211>478
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV73 L1
<400>30
<210>31
<211>478
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>HPV82 L1
<400>3權(quán)利要求
1、一種防止高度聚合的重組人乳頭瘤病毒L1蛋白的修飾氨基酸序列，其特征在于通過對編碼野生型HPV L1蛋白的DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)堿基替代突變，由突變后的DNA序列表達(dá)得到的重組HPV L1蛋白氨基酸序列，該重組HPV L1蛋白氨基酸序列在不影響L1蛋白生物活性的前提下，不能形成L1蛋白二級和高級結(jié)構(gòu)中的H4α螺旋結(jié)構(gòu)。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于所述的替代突變區(qū)域的替換起始位點(diǎn)為野生型HPV L1蛋白氨基酸序列中向保守序列LβγWN或LβγWQ的N端移動(dòng)1-2個(gè)氨基酸處，替換截止位點(diǎn)為向保守序列DP的C端移動(dòng)1-2個(gè)氨基酸處，替代突變方式為將上述區(qū)域內(nèi)的氨基酸全部或部分替代成由2-10個(gè)極性氨基酸組成的連接短肽，其中，β表示E或D，γ表示E、D或N。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的氨基酸序列，其特征在于所述的替代突變區(qū)域?yàn)橐吧虷PVL1蛋白氨基酸序列中的保守序列LβγWN或LβγWQ至其下游的保守序列DP之間的區(qū)域，其中，β表示E或D，γ表示E、D或N。
4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的氨基酸序列，其特征在于所述的連接短肽由S和G組成。
5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的氨基酸序列，其中所述的HPV型選自HPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV5、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV54、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59、HPV61、HPV66、HPV67、HPV70、HPV72、HPV73、HPV82，其對應(yīng)的氨基酸修飾序列分別如SEQ ID NO1-SEQ ID NO31所示。
6、一種核苷酸序列，其特征在于它包含編碼權(quán)利要求1-5之任一權(quán)利要求所述的氨基酸序列的核苷酸序列。
7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的核苷酸序列，其特征在于它編碼權(quán)利要求1-5之任一權(quán)利要求所述的氨基酸序列。
8、一種表達(dá)載體，其特征在于它由商業(yè)上可獲得的質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體和粘粒等連接載體和權(quán)利要求6所述的核苷酸序列所組成。
9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的連接載體選自pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3、pET-28a、pcDNA3.1以及其它商業(yè)上可獲得的表達(dá)質(zhì)粒。
10、一種轉(zhuǎn)化子，其特征在于它是將權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中所得，所述的宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞中的任意一種。
11、一種HPV L1蛋白的五聚體，其特征在于它由權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)得到。
12、一種生產(chǎn)HPV L1蛋白五聚體的方法，它包括如下步驟
(1)發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化子，并表達(dá)HPV L1蛋白；
(2)分離、純化表達(dá)產(chǎn)物，得到HPV L1蛋白五聚體。
13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的HPV L1蛋白五聚體在制備預(yù)防HPV感染的重組疫苗、免疫診斷抗原或抗體、以及藥物組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了防止高度聚合的重組人乳頭瘤病毒L1蛋白的修飾氨基酸序列，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列，以及包含這些核苷酸序列的載體和轉(zhuǎn)化子；本發(fā)明還公開了由該氨基酸修飾序列表達(dá)得到的HPV L1蛋白五聚體在制備疫苗、藥物組合物、診斷抗原或抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明通過對HPV L1蛋白野生型序列的修飾，有效控制了HPV L1蛋白的聚合程度，表達(dá)得到的是與HPV L1的VLP具有相同免疫原性和抗原性的L1五聚體，L1五聚體相對于L1的VLP而言具有結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、原核表達(dá)更容易實(shí)現(xiàn)、工業(yè)成本大幅降低的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C07K14/005GK101481408SQ200810055700
公開日2009年7月15日 申請日期2008年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月7日
發(fā)明者馬潤林, 陳小江 申請人:馬潤林, 陳小江