專利名稱：抗Lewis^y和Lewis^b抗原的抗癌抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含用于治療癌癥的抗體或抗原結(jié)合片段的結(jié)合復(fù)合 物。特別地，本發(fā)明提供包含與Lewisy和Lewisb抗原結(jié)合的抗體或抗 原結(jié)合片段的結(jié)合復(fù)合物，其中抗體或抗原結(jié)合片段是多聚體形式。 結(jié)合復(fù)合物誘導(dǎo)過表達(dá)Lewi^和LewiSb的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞死亡。
背景技術(shù)：
Lewi^和Lewisb是乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌過表達(dá)的復(fù)雜 碳水化合物。因此，它們可能代表了單克隆抗體(mAb)治療的好耙 點(diǎn)。Lewisy半抗原是在2型血型低聚糖上發(fā)現(xiàn)的雙巖藻糖化的四糖 (Fucal-2Gaipi-4(Fucal-3)GlcNAc)。該抗原是Lewisb半抗原的位置異 構(gòu)體(Fucal-2Gaipi-3(Fucal-4)GlNAc和Lewisx半抗原的巖藻糖化衍 生凈勿(Abe ef a/. (1986) Aasearc/z 46: 2639; Kim a/. (1986)
Ca"ceri "e^r/2 46: 5985)。 Lewisy在乳腺、支氣管、胰腺、生殖泌尿 系統(tǒng)和在胃腸道深部腺體表達(dá)。相反，Lewisb在表面上皮表達(dá)(Sakamoto a/. (1989) Ca"cer 7 esearc/7 49: 745-52; Kitamura W a/. (1994) iVoc. 胸/. icad 91: 12957-61 )。
IgM小鼠mAb C14用標(biāo)準(zhǔn)融合流程抗原發(fā)結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞而產(chǎn) 生，并與Lewisy和Lewisb (延伸的和非延伸的)抗原結(jié)合(Brownda/. (1983)3: 163; Brown & a/. (1984) /"A / C露w 33: 727; Durrant d o/. (1993) Z/j^nWowa 12: 647-60)。 C14抗體與78%的結(jié)腸直 腸癌結(jié)合(Durrant"a/. (1989) J TVa". Owcer/"" 81: 688-95)，然而其 作為鼠IgM不適合進(jìn)行體內(nèi)研究。為生產(chǎn)該抗體的IgG變種，用C14 mAb免疫大鼠，并純化產(chǎn)生的大鼠抗C14抗體。以這種抗血清和 C14gp200抗原免疫大鼠，接著將其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，結(jié) 果產(chǎn)生5種IgG mAb， 2禾中IgG3 (SC101/23、SC101/29 mAb)和3種IgGl (SC101/33、 SC101/42和SC101/43;這5種抗體以前已經(jīng)以"692" mAb 公開)。所有IgG變種均識(shí)別Lewisy和Lewisb抗原并證實(shí)與C14特異性相同。此外，薄層層析和ELISA顯示這些抗體與延伸的和非延伸的
Lewisy和Lewisb半抗原結(jié)合，而不與Lewisx半抗原或H血型半抗原結(jié) 合(Browne/. (1983)6/謹(jǐn)'.3: 163)。
與Lewisy和Lewisb抗原結(jié)合的抗體是已知的，然而，SC101 mAb 的獨(dú)特性在于其能夠識(shí)別Lewi^和Lewisb決定簇。沒有別的mAb并且 僅有一種稀有的凝集素識(shí)別這兩種分子的相似小平面。Lewis y/b主要 作為糖酯在神經(jīng)酰胺骨架上表達(dá)。最近，結(jié)晶學(xué)的研究己表明LewiSy 特異性抗體能具有非常不同的結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)適應(yīng)半抗原內(nèi)N-乙 ?；?葡萄糖胺或巖藻糖殘基(Ramsland " a/. (2004) J Mo/. B/o/. 340: 809-18) 。 SC101由于其結(jié)合位點(diǎn)適應(yīng)于由于彼此互為立體異構(gòu)體而非 常罕見的LewW和Lewisb的方面而再次不同。令人進(jìn)一步感興趣的是 這些抗體在包括胃腸道的絕大多數(shù)正常組織中不能識(shí)別糖酯類，這可 能由于神經(jīng)酰胺或其它非常相關(guān)的分子中的空間位阻效應(yīng)。這使得 SC101抗體的組織分布很獨(dú)特，但卻與許多上皮腫瘤牢固結(jié)合(Brown
(1983)5/固-.3: 163)。
在最初鑒定這些抗體與原發(fā)分解(primary disaggregated)的結(jié)腸 直腸腫瘤的結(jié)合過程中，觀察到這些抗體可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡 能通過包括細(xì)胞凋亡和脹亡(oncosis)的許多機(jī)制而發(fā)生。細(xì)胞凋亡 依賴于半胱天冬酶(caspase)，其特點(diǎn)為細(xì)胞萎縮、皺折(ruffling)質(zhì) 膜的染色質(zhì)濃縮和邊集(margination)，最終使細(xì)胞解體進(jìn)入凋亡小體。 脹亡是壞死性細(xì)胞死亡的早期階段并以膜通透性狀態(tài)不斷增加導(dǎo)致細(xì) 胞腫脹為標(biāo)志。壞死是指細(xì)胞死亡之后出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)改變并能在凋亡 和脹亡之后出現(xiàn)。
本發(fā)明人現(xiàn)已證明SC101/29 mAb殺死了腫瘤細(xì)胞，該抗體直接在 體內(nèi)和體外經(jīng)由與經(jīng)典脹亡有許多相似之處的獨(dú)特機(jī)制殺死過表達(dá) Lewisin Lewisb的腫瘤細(xì)胞。
發(fā)明簡述本發(fā)明的第一方面提供了包含與LewW和Lewisb抗原結(jié)合的抗體 或抗原結(jié)合片段的結(jié)合復(fù)合物，其中抗體或抗原結(jié)合片段是多聚體形 式。
本發(fā)明的第二方面提供了用于誘導(dǎo)過表達(dá)Lewi^和Lewisb抗原的 腫瘤細(xì)胞細(xì)胞死亡的方法，其包含對(duì)受試者使用有效量的本發(fā)明第一 方面所述的結(jié)合復(fù)合物。
本發(fā)明的第三方面提供了治療需要此種治療的受試者癌癥的方 法，其包含對(duì)受試者使用治療有效量的本發(fā)明第一方面所述的結(jié)合復(fù) 合物。
本發(fā)明的第四方面提供了用于誘導(dǎo)過表達(dá)Lewi^和Lewisb抗原的 腫瘤細(xì)胞細(xì)胞死亡的藥物組合物，其包含本發(fā)明第一方面所述的結(jié)合 復(fù)合物和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。


圖la:顯示了 SC101與新鮮分解的結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，如 通過間接免疫熒光測(cè)定的和流式細(xì)胞術(shù)分析的。每個(gè)柱指明了單個(gè)腫 瘤的平均熒光強(qiáng)度。顯示了 SC101與結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞系Cok)205、 C170、 HT29和LoVo的結(jié)合以作比較。
圖lb:顯示了 SC101/29 mAb抑制LoVo和C170細(xì)胞的IC50生 長曲線。生長抑制％以暴露于SC101/29 mAb的細(xì)胞數(shù)目/暴露于對(duì)照 mAb的細(xì)胞數(shù)目表示。生長抑制曲線中的有活性細(xì)胞的數(shù)目利用MTS 通過讀取490nm處的光密度值確定。
圖lc:顯示了 SC101/29 mAb抑制Colo205和HT-29細(xì)胞的IC50 生長曲線。生長抑制％以暴露于SC101/29mAb的細(xì)胞數(shù)目/暴露于對(duì)照 mAb的細(xì)胞數(shù)目表示。生長抑制曲線中有活性細(xì)胞的數(shù)目利用MTS 通過讀取490nm處的光密度值確定。
圖2a:顯示以30昭/mlIgG、 300ng/ml抗-Fas克隆Chl 1 、 30^ig/ml BR96 4小時(shí)或以30昭/ml SC101/29 mAb 30分鐘、2小時(shí)或4小時(shí)處理 2xl05 Colo205細(xì)胞。細(xì)胞于室溫在暗室中用PI染色15分鐘，并用 FC500流式細(xì)胞儀488nm (發(fā)射620nm FL3)進(jìn)行分析。圖2b:顯示以30jig/mlIgG、 300ng/ml抗-Fas克隆Chll、 30嗎/ml BR96 4小時(shí)或以30昭/ml SC101/29 mAb 30分鐘、2小時(shí)或4小時(shí)處理 2xl05 C170細(xì)胞。細(xì)胞于室溫在暗室中用PI染色15分鐘，并用FC500 流式細(xì)胞儀488nm (發(fā)射620nm FL3)進(jìn)行分析。
圖2c:顯示以30嗎/mlIgG、 300ng/ml抗-Fas克隆Ch11、 30昭/ml BR96 4小時(shí)或以30昭/ml SC101/29 mAb 30分鐘、2小時(shí)或4小時(shí)處理 2xl05 HT-29細(xì)胞。細(xì)胞于室溫在暗室中用PI染色15分鐘，并用FC500 流式細(xì)胞儀488nm (發(fā)射620nm FL3)進(jìn)行分析。
圖2d:顯示以30嗎/ml IgG、 300ng/ml抗-Fas克隆Chl 1 、 30|ig/ml BR96 4小時(shí)或以30嗎/ml SC101/29 mAb 30分鐘、2小時(shí)或4小時(shí)處理 2xl05 LoVo細(xì)胞。細(xì)胞于室溫在暗室中用PI染色15分鐘，并用FC500 流式細(xì)胞儀488nm (發(fā)射620nm FL3)進(jìn)行分析。
圖2e:顯示在存在0-10jiM多柔比星30分鐘條件下，用l-100pg/ml SC101/29 mAb處理2xl05 Colo205、 C170、 HT-29或LoVo細(xì)胞4小時(shí)。 細(xì)胞用FC500流式細(xì)胞儀488nm (發(fā)射575nm FL2)進(jìn)行分析。
圖2f:顯示細(xì)胞以識(shí)別p-糖蛋白的mAb (0.3-30pg/ml)染色，并 用FC500流式細(xì)胞儀488nm (發(fā)射525nm FL1)進(jìn)行分析。
圖3a:顯示以SClOl/29或SC101/43或2種mAb處理2xl05 C170 細(xì)胞1小時(shí)。細(xì)胞于室溫在暗室中用PI染色15分鐘，并用FC500流 式細(xì)胞儀488nm (發(fā)射620nm FL3)分析。
圖3b:顯示以100|ig/ml IgG、與卵白素混合的100嗎/ml IgG、 100昭/ml SClOl/29, 100jig/ml SC101/43-生物素或100(ig/ml生物素化的 交聯(lián)卵白素的SC101/43處理2xl05 C170細(xì)胞1小時(shí)。細(xì)胞于室溫在暗 室中用PI染色15分鐘，并用FC500流式細(xì)胞儀488nm (發(fā)射620nm FL3) 進(jìn)行分析。
圖3c:顯示100(ig/ml小鼠SC101/29-人IgG2嵌合抗體30分鐘， 接著以交聯(lián)的抗人IgG抗體(0-100昭/ml)處理lx105 Colo205細(xì)胞。 室溫孵育3小時(shí)后，于暗室中細(xì)胞以7AAD染色20分鐘，并用Cell Quanta SC MPL 488nm進(jìn)行分析。顯示了兩組樣品中死亡(7AAD+) 細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)。圖3d:顯示在0、 1或10(iMz-FMK-vadpan-半胱天冬酶抑制劑存 在條件下，以100jig/ml同型陰性對(duì)照mAb、 100ng/ml抗-Fas或100(ig/ml SC101/29 mAb處理5xl05 C170細(xì)胞約12小時(shí)。于室溫暗室中將細(xì)胞 用膜聯(lián)蛋白V和PI染色15分鐘并用FC500流式細(xì)胞儀488nm (發(fā)射 525nmFLl、 620nmFL3)進(jìn)行分析。
圖3e:顯示將2xl06 C170細(xì)胞暴露于IgG (30嗎/ml)陰性對(duì)照4小 時(shí)，SC101 l-4小時(shí)或0.5M山梨糖醇30分鐘(陽性對(duì)照)。以冰冷的 Tris抽提緩沖液+ 0.5mMNaV04抽提細(xì)胞，并在SDS-PAGE的每個(gè)泳 道加入75jig總蛋白。10%凝膠于130V分離90分鐘并將其在BioRad 半干印跡儀上(12V恒定電壓)轉(zhuǎn)移70分鐘，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。該膜 經(jīng)封閉，并且每2ml P-p38、 P-JNK或P-ERK(1% BSA TBS-T)用 探測(cè)，洗膜并用ECLPlus+顯色。
圖4a:顯示證明SC101/29 mAb、 5-FU/甲酰四氫葉酸或聯(lián)合使用 SC101/29mAb與5-FU/甲酰四氫葉酸對(duì)生長于裸鼠的C170異種移植物 生長的效應(yīng)的圖。于第12、 16、 19和23天時(shí)，C170異種移植物的生 長通過測(cè)定以SC101/29 mAb i.p(0.2mg)、對(duì)照抗體i.p(0.2mg)和5-FU/ 甲酰四氫葉酸(12.5mg/kg; iv)處理動(dòng)物時(shí)的橫斷面面積(mm2)而測(cè)定。 分析第23天的結(jié)果的變異顯示了當(dāng)將SC101/29 mAb與未處理的對(duì)照 組進(jìn)行比較時(shí)p0.004的顯著性數(shù)值，將對(duì)照組加5-FU/甲酰四氫葉酸 組與SC101/29 mAb加5-FU/甲酰四氫葉酸組進(jìn)行比較時(shí)p<0.020。
圖4b:顯示未處理小鼠(組1)、單獨(dú)接種SC101/29mAb (組2)、 單獨(dú)接種5-FU/甲酰四氫葉酸(組3)或聯(lián)合接種SC101/29 mAb和5-FU/ 甲酰四氫葉酸(組4)的終末腫瘤重量。
圖4c:顯示未處理的、單獨(dú)接種SC101/29mAb、單獨(dú)接種5-FU/ 甲酰四氫葉酸或聯(lián)合接種SC101/29 mAb和5-FU/甲酰四氫葉酸的小鼠 的重量。
圖4d:顯示以SC101/29 mAb ip (0.2mg)、 5-FU/甲酰四氫葉酸 (12.5mg/kg iv)或聯(lián)合使用SC101/29 mAb (0.2mg)和5-FU/甲酰四氫葉酸 (12.5mg/kg iv)處理的帶C170異種移植物的動(dòng)物的存活數(shù)據(jù)。在第7天 給予SC101/29 mAb，然后每周3次。在第1、 3、 5和7天給予5-FU/甲酰四氫葉酸。當(dāng)聯(lián)合給予5-FU/甲酰四氫葉酸時(shí)，與載體對(duì)照小鼠相
比，SC101/29mAb顯著增強(qiáng)了存活(p=0.0163 Log Rank)
圖5:顯示代表10嗎或100嗎SC101/29 mAb或載體對(duì)照對(duì) C170HM2肝臟轉(zhuǎn)移裸鼠模型最終肝臟腫瘤重量的效應(yīng)的圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明人已證明，包含與Lewi^和Lewisb抗原結(jié)合的抗體或抗原 結(jié)合片段的結(jié)合復(fù)合物誘導(dǎo)了過表達(dá)LewW和Lewisb的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞死亡。
在第一方面，本發(fā)明提供包含與Lewi《和Lewisb抗原結(jié)合的抗體 或抗原結(jié)合片段的結(jié)合復(fù)合物，其中抗體或抗原結(jié)合片段是多聚體形 式。
本文所用術(shù)語"抗體"是指由4條多肽鏈，即通過二硫鍵互連的2 條重鏈(H鏈)和兩條輕鏈(L鏈)組成的免疫球蛋白分子。每條重鏈 由重鏈可變區(qū)(HCVR或Vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)包含3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，CH1、 Ch2和Ch3。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(LCVR或VJ 和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域cl組成。Vh和Vl區(qū)能 進(jìn)一步細(xì)分成高度可變區(qū)，稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，其被那些更 加保守的稱為框架結(jié)構(gòu)區(qū)(FR)的區(qū)域分隔開。毎條Vh和V^由3個(gè) CDR、4個(gè)FR組成，其從氨末端到羧末端以下列順序排列FR1 、CDR1 、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。
本文所用的術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合片段"是指一種或多種表現(xiàn)出 結(jié)合抗原的能力的免疫球蛋白的成分或衍生物。已表明，抗體的抗原 結(jié)合功能能通過全長抗體的片段進(jìn)行。包含在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合 片段"中的結(jié)合片段的例子包括(i) Fab片段， 一種由V。 VH、 Cl 和Ch1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii) F(ab')2片段， 一種包含在其鉸鏈 區(qū)通過二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由Vh和Ch1結(jié) 構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的Vl和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv 片段；(v)由單條VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域(van den Beuken " a/. (2001) 嵐脂，310, 591)組成的dAb片段(Ward " "/ (1989)胸臟341: 544-546);(vi)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR);和(vii)通過同源框架區(qū)融合的互補(bǔ)性決定區(qū)，如Qiu"a/. (2007) A^wre5/ofec/zw /ogy 25(8): 921-929中所述的那些。而且，盡管Fv片段的2個(gè)結(jié)構(gòu)域V^和VH由 分離的基因編碼，但用重組的方法能將其通過合成接頭連接起來，該 接頭能使其被制成單條蛋白鏈，其中Vl和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)以形成單價(jià) 分子(稱作單鏈Fv (scFv); (Bird " a/. (1988) 5We騰242: 423-426; Huston & a/. (1988)7Vaf/. Jcad SW 85: 5879-5883)。這種單 鏈Fv也包含在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合片段"內(nèi)。其它形式的單鏈Fv 和相關(guān)分子如雙抗體或三抗體也包含在其中。雙抗體是2價(jià)抗體，其 中Vh和V^結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達(dá)，但使用了太短以至于不能使 同一鏈上的2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間形成配對(duì)的接頭，從而強(qiáng)迫結(jié)構(gòu)域與另一 條鏈的互補(bǔ)性結(jié)構(gòu)域配對(duì)并產(chǎn)生2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(見如Holliger "a/. (1993) P賜.扁.腦90: 6444-6448; Poljak " a/. (1994) 5Vra"匿2: 1121-1123)。
本發(fā)明的必要特征為抗體或抗原結(jié)合片段是以多聚體的形式?？?體或抗原結(jié)合片段與Lewisy和Lewisb抗原結(jié)合使得抗原被交聯(lián)。Lewisy 和Lewisb抗原交聯(lián)對(duì)于介導(dǎo)過表達(dá)Lewisy和Lewis b的細(xì)胞的腫瘤細(xì) 胞死亡可能是重要的。
本文所使用的術(shù)語"多聚體"是指形成彼此連接的2條或多條抗 體或抗原結(jié)合片段。而且，多聚體可是同源或異源多聚體。例如，多 聚體可是同源或異源二聚體、同源或異源三聚體或更高。同源多聚體 是包含相同抗體或抗原結(jié)合片段的多聚體，而異源多聚體是包含至少2 條不相似的抗體或抗原結(jié)合片段的多聚體。然而，不管多聚體的組成 如何，每條抗體或抗原結(jié)合片段必須與Lewi^和Lewisb抗原結(jié)合。
在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，多聚體是同源或異源二聚體。
在本發(fā)明的另一進(jìn)一歩優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，抗體不天然二聚體 化或多聚體化。
本文所用的術(shù)語"結(jié)合Lewi《和Lewisb抗原"是指與LewiSy和 Lewisb抗原結(jié)合以使Lewisy和Lewisb抗原交聯(lián)的抗體或抗原結(jié)合片段。
本文所用的術(shù)語"結(jié)合"是指，抗原與抗體的免疫球蛋白可變區(qū) 以lpM或更低的解離常數(shù)(Kd)的結(jié)合，解離常數(shù)如通過使用例如 BIAcoreTM表面等離子體共振系統(tǒng)和BIAcoreTM動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)軟件(例如2.1版本)的表面等離子體共振分析測(cè)定的。特異性結(jié)合相互作用的親和
或解離常數(shù)(Kd)優(yōu)選約500 nM至約50 pM，更優(yōu)選約500 nM或更 低，更優(yōu)選約300 nM或更低，并優(yōu)選至少約300 nM至約50pM，約 200 nM至約50 pM，并更優(yōu)選至少約100 nM至約50pM，約75 nM至 約50 pM,約10 nM至約50 pM。
在本發(fā)明的某些具體實(shí)施方式
中，抗體或抗原結(jié)合片段是雙體或 多體。在本發(fā)明的其它具體實(shí)施方式
中，雙體或多體包含修飾的Fc結(jié) 構(gòu)域。
在本發(fā)明的其它具體實(shí)施方式
中，包含抗體或抗原結(jié)合片段的多 體是IgG抗體。在本發(fā)明的進(jìn)一步具體實(shí)施方式
中，多體是雙體IgGl 抗體。
雖然一些抗體(如IgG3)在體外或體內(nèi)形成二聚體，但I(xiàn)gGl抗體 以單體形式存在。為了使單體抗體或其抗原結(jié)合片段可誘導(dǎo)過表達(dá) Lewis"n Lewisb抗原的腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞死亡，Lewis^B Lewisb抗 原的交聯(lián)通過單體抗體或抗原結(jié)合片段的卵白素/生物素交聯(lián)而進(jìn)行。 此外，單體抗體或抗原結(jié)合片段可通過重組工程交聯(lián)，例如通過使CH3 區(qū)基因上絲氨酸突變成為半胱氨酸，使得在單體的羧末端形成鏈間二 硫鍵(Caron ef (1992) / 她d 1191-1195)。這依次促進(jìn)Lewisy 和Lewisb抗原的交聯(lián)。
在第二方面，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)過表達(dá)LewW和Lewisb抗原的腫 瘤細(xì)胞細(xì)胞死亡的方法，該方法包含對(duì)受試者使用有效量的結(jié)合復(fù)合 物，其包含與Lewisy和Lewisb抗原結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段，其中 抗體或抗原結(jié)合片段是多聚體形式。
在第三方面，本發(fā)明提供了治療需要此種治療的受試者中癌癥的 方法，該方法包含對(duì)受試者使用治療有效量的本發(fā)明第一方面所述的 結(jié)合復(fù)合物，該結(jié)合復(fù)合物與LewW和Lewisb抗原結(jié)合。
術(shù)語"治療有效量"是指在本發(fā)明的癌癥情況下，足以治療或緩 解指定疾病或失調(diào)或其一種或多種癥狀和/或足以預(yù)防或減少疾病或失 調(diào)發(fā)生的抗體或抗原結(jié)合片段的量(包括包含其抗體或抗原結(jié)合片段 的藥物組合物)。當(dāng)用于與治療方法和抗體或其抗原結(jié)合片段(包括包含其抗體或 抗原結(jié)合片段的藥物組合物)的用途有關(guān)時(shí)，"需要此種治療"的個(gè) 體可以是被診斷出患有癌癥或以前已經(jīng)過癌癥治療的個(gè)體。
在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，癌癥選自乳腺癌、肺癌、結(jié)腸 癌或卵巢癌。
在第四方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明第一方面所述的結(jié)合復(fù)合 物和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物，其用于誘導(dǎo)過表達(dá)
Lewis"n Lewisb抗原的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞死亡。
"藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑"包括任何和全部溶劑、分散介 質(zhì)、包衣劑、抗生素、抗真菌劑、等滲或吸收延遲劑等等具有生理相 容性的物質(zhì)。藥學(xué)上可接受的載體的例子包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖 液、葡萄糖、甘油、醇等等及其組合物的一種或多種。在許多情況下， 優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯 化鈉。
組合物可是多種形式，包括液體、半固體或固體的劑型，如液體 溶液(如可注射溶液和難溶溶液)、分散液或混懸液、片劑、丸劑、 散劑、脂質(zhì)體或栓劑。優(yōu)選地，用于免疫的組合物是可注射的溶液形 式。給藥可是靜脈、皮下、腹腔、肌內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)和動(dòng)脈內(nèi)給藥。 優(yōu)選地，劑量形式的范圍是每公斤體重每日、每周、每2周或每3周 或每月給藥從約0.001 mg至約10mg，更優(yōu)選地，每公斤體重每周給 藥約0.05mg至約5 mg。
該組合物也可配制成滅菌粉末以制備滅菌注射溶液。
在某些具體實(shí)施方式
中，結(jié)合復(fù)合物可與載體一起制備，該載體 可保護(hù)化合物使不易快速釋放，如控釋成分，包括埋植劑、經(jīng)皮貼片 和微囊遞送系統(tǒng)?？墒褂孟嗳菪远嗑垠w，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、 聚乙醇酸、膠原、多正酯類或聚乳酸。
也可將該組合物進(jìn)行配制以用于口服給藥。在該具體實(shí)施方式
中， 抗體可包括在硬或軟殼明膠膠囊、壓制入片劑或直接摻入受試者的飲 食中。
也可將組合物配制成用于直腸給藥的形式。可將本發(fā)明的結(jié)合復(fù)合物給藥以在體外和體內(nèi)結(jié)合并鑒定選定的 細(xì)胞，以在體內(nèi)結(jié)合并破壞選定的細(xì)胞，或以在體內(nèi)滲入并破壞選定 的細(xì)胞。
在優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，將組合物給予到人。
為了更清晰地理解本發(fā)明的性質(zhì)，將參考下述非限制性實(shí)施例公 開其優(yōu)選形式。
實(shí)施例l
材料和方法
細(xì)胞系
C170是來源于原發(fā)腫瘤的直腸結(jié)腸細(xì)胞系(Durrant" a/. (1986) & / Ca"cw 53:37-45) 。 Colo205、 HT-29和LoVo是從ATCC獲得的直 腸結(jié)腸細(xì)胞系。將所有細(xì)胞在含10%胎牛血清(FCS F6178; Sigma, Poole, UK)的RPMI 1640培養(yǎng)基(BE12-702F; Cambrex Bio Science, Berkshire, UK)中培養(yǎng)。
單克隆抗體
識(shí)別Lewis"n Lewisb半抗原的SC101 mAb按照以前描述的方法 (Brown a/. (1983) B/asc/. 3: 163; Durrant a/. (1993)場(chǎng)6r/(io附a 12:647-60)純化?？?Fas (人的激活的)克隆Chll (05-201)抗體獲自 Upstate, Br96和IgG陰性對(duì)照來自Sigma (15381)。
對(duì)結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞的抗體結(jié)合
腫瘤樣品在進(jìn)行結(jié)腸直腸癌切除時(shí)獲得。將腫瘤仔細(xì)剪碎，并于 37°C用0.05%膠原酶(IV型，Boehringer Mannheim, Lewes, UK)消化 20分鐘，并用SC101/29和山羊抗小鼠FITC(Dako Ltd， Bucks UK; 1:100 稀釋)進(jìn)行間接免疫熒光染色。將腫瘤細(xì)胞系等分(105)并用SC101/29 mAb或抗-P-糖蛋白(表明多藥耐藥性，BD Pharmingen， San Diego, California USA)于4°C于各種濃度下染色30分鐘。用培養(yǎng)基 (RPMI/10%FCS)沖洗2遍后，將細(xì)胞與二抗(山羊抗小鼠FITC)于 4。C孵育30分鐘，然后沖洗一遍，用FC500流式細(xì)胞儀488nm進(jìn)行分 析(發(fā)射525nmFLl)。
體外殺死結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞在平底96孔板的各個(gè)孔中加入等量lxl(^結(jié)腸直腸細(xì)胞系C170、 Colo205、 HT-29禾nLoVo細(xì)胞，并于37°C放置過夜使貼壁。次日，以 100、 30、 10、 3、 l或0嗎/ml的SC10/29mAb(10(Vl/孔)處理細(xì)胞。使 用同型匹配的陽性或陰性對(duì)照抗體以進(jìn)行比較。使用3孔平行。在向 每個(gè)孔中加入溶液Cell Titer96 Aqueous One Solution (G3580; Promega, Southampton, UK)之前，將細(xì)胞在存在抗體的情況下于37。C放置5 天，讀取490nm光密度值。
攝入PI
將2xl05 Colo205、 C170、 HT-29或LoVo細(xì)胞用30jig/ml IgG、 300ng/ml抗-Fas、 30昭/ml BR96或SC101/29 mAb處理30分鐘、2小 時(shí)、4小時(shí)。接著，在暗室中于室溫將這些細(xì)胞用PI (630110; BD Biosciences, Oxford, UK)染色15分鐘，然后用FC500流式細(xì)胞儀488nm (發(fā)射620nmFL3)進(jìn)行分析。 ,.攝入7AAD
將lx105 Colo205細(xì)胞于室溫在磷酸鹽緩沖液(PBS)中用100|ig/ml 小鼠SC101/29-人IgG2嵌合抗體孵育。30分鐘后，加入不同濃度的交 聯(lián)的抗人IgG抗體(0-100嗎/ml; Sigma)，并將細(xì)胞于室溫孵育3小時(shí)。 然后將細(xì)胞于暗室中用7AAD (Beckman Coulter)染色20分鐘，并用Cell Quanta SC MPL 488nm (Beckman Coulter;發(fā)射濾光片670LP FL3)進(jìn)
行分析。
MDR細(xì)胞系攝取藥物
將2xl05 Colo205、 C170、 HT-29或LoVo細(xì)胞于37°C用0、 1、 3、 10、 30或100嗎/ml SC101/29 mAb處理30分鐘。在細(xì)胞中加入多柔比 星至終濃度為0、 1或IO^iM并于37°C孵育1小時(shí)。將細(xì)胞用冰冷的 5x磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗并用FC500流式細(xì)胞儀488nm (發(fā)射575nm FL2)分析熒光。
半胱天冬酶依賴的細(xì)胞死亡抑制實(shí)驗(yàn)
將5xl05 C170細(xì)胞等分加入24孔平底滅菌板的單個(gè)孔中并于 37°C放置6小時(shí)使細(xì)胞貼壁。用lOOpg/ml同型匹配的陰性對(duì)照mAb、 100ng/ml抗-Fas或100(ig/ml SCI01/29 mAb和0、 1或lOjaM z-FMK-vad (G7232; Perbio Science, UK)處理細(xì)胞。將細(xì)胞于37°C放回過夜并隨后用鈣磷脂結(jié)合蛋白V和PI染色15分鐘，用FC500流式細(xì)胞儀488nm (發(fā) 射525nm FL1， 620nm FL3)分析熒光。
經(jīng)由應(yīng)激相關(guān)激酶的信號(hào)傳遞(signalling)
將2xl06 C170細(xì)胞暴露于IgG (30嗎/ml)陰性對(duì)照4小時(shí)、SC101 (30嗎/ml) 1-4小時(shí)或0.5M山梨醇30分鐘(陽性對(duì)照)。用冰冷的抽 提緩沖液(50mM Tris pH 7.4、 2mM EDTA、 2mM Na4P207、 2mM benzamadine、 lmM PMSF 、 0.5mM NaV04 、 0.5mM DTT 0.1% Triton-X-lOO)抽提細(xì)胞，蛋白質(zhì)濃度用標(biāo)準(zhǔn)的BioRad蛋白質(zhì)檢測(cè)方 法測(cè)定，并在SDS-PAGE的每個(gè)泳道上上樣75昭總蛋白。10%凝膠 于130V分離90分鐘并用BioRad半干轉(zhuǎn)膜儀(12V恒定電壓)運(yùn)行 70分鐘將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上。膜用1%牛血清白蛋白(BSA)、 Tris緩沖鹽溶液0.05%吐溫-20 (TBS-T)封閉1小時(shí)，并且每2ml P-p38、 P-JNK或P-ERK(Promega)用溶于1。/。BSATBS-T的ljil進(jìn)行雜交檢測(cè)。 隨后將膜用TBS-T沖洗3遍并用山羊抗兔HRP (GaR HRP; Dako, P0448) 雜交檢測(cè)，用TBS-T沖洗3遍，用ECLPlus+顯色。
體內(nèi)研究
預(yù)防模型。將結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞系C170在裸鼠中連續(xù)傳代以進(jìn)行 維持。為了治療，處死小鼠并摘除腫瘤。將40只雄性小鼠隨機(jī)分配成 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，皮下注射麻醉劑(Hypnorm,Roche/Hypnovd, Jannsen)將 其麻醉，將腫瘤仔細(xì)剪碎并將3mr^的小塊植入小鼠體內(nèi)。 一組小鼠于 第1、3、5、7、21和22天靜脈(iv)注射5-FU/甲酰四氫葉酸(12.5mg/kg) 進(jìn)行處理。小鼠腹腔(ip)注射0.2mg的SC101/29 mAb，每周3次。 對(duì)照小鼠接受SC101/29 mAb、 5-FU/甲酰四氫葉酸或單獨(dú)的載體。在 第12、 16、 19和23天時(shí)用測(cè)徑器測(cè)定腫瘤大小并計(jì)算腫瘤的橫截面 積。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，將腫瘤稱重以評(píng)價(jià)抗腫瘤效果。將動(dòng)物稱重以評(píng)價(jià) 治療的毒性。
治療模型。將結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞系C170在裸鼠中連續(xù)傳代進(jìn)行維 持。為了治療，處死小鼠并摘除腫瘤。將40只雄性小鼠隨機(jī)分配成4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，皮下注射麻醉劑將其麻醉，將腫瘤仔細(xì)剪碎并將3mm3的 小塊植入小鼠體內(nèi)。小鼠用3mn^的C170異種移植物進(jìn)行了外植。于 第l、 3、 5、 7天對(duì)各組小鼠靜脈注射5-FU/甲酰四氫葉酸(25mg/kg)，
16并且，如果適用的話，從第28天開始循環(huán)。小鼠靜脈注射0.2mg的 SC101/29 mAb，每周3次，對(duì)照組小鼠接受單獨(dú)的SC101/29 mAb或 對(duì)照小鼠用5-FU/甲酰四氫葉酸處理產(chǎn)生的IgG抗體。
轉(zhuǎn)移模型。將C170HM2細(xì)胞在體外在37°C、 5% C02、潮濕條 件下在含有10。/。熱滅活FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至 亞融合狀態(tài)時(shí)用0.025% EDTA進(jìn)行收集，用上述培養(yǎng)基沖洗2遍，并 重懸，為用于體內(nèi)給藥，將溶于lml體積的滅菌PBS (pH7.4)的1.5 x 106個(gè)細(xì)胞注射入30只雄性裸鼠的腹腔內(nèi)。將動(dòng)物分到其治療組，治 療于第1天開始并貫穿整個(gè)研究。在第1天時(shí)，將各組小鼠靜脈注射 lOjig或IOO嗎的SC101/29 mAb或載體對(duì)照進(jìn)行處理，此后每周3次。 40天時(shí)處死小鼠，評(píng)估小鼠體重和腫瘤重量。
統(tǒng)計(jì)分析
通過使用用于PC的Minitab程序上的Analysis of Variance和Log Rank進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
實(shí)施例2 結(jié)果
對(duì)結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞的抗體結(jié)合
以前表明SC101 mAb結(jié)合Lewisy和Lewisb半抗原。圖la中顯示 新鮮分離的結(jié)腸直腸腫瘤強(qiáng)烈著色。該mAb也結(jié)合分離的卵巢和胃部 月中瘤(Brown "a/. (1983)說osd. i ep, 3:163)。此外，這些抗體誘導(dǎo)了 加速的原發(fā)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞死亡。用SC101/29和SC101/33抗體的免疫 組織化學(xué)和流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)明顯地與下列類型的腫瘤細(xì)胞系和腫瘤異 種移植物結(jié)合卵巢、乳腺、肺、前列腺和胰腺(數(shù)據(jù)未顯示)。
體外殺死結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞
為了進(jìn)一步研究這種殺細(xì)胞作用，篩選許多細(xì)胞系與SC101/29 mAb結(jié)合(圖la)并抑制細(xì)胞增殖(圖lb和lc)的能力。C170和 Colo205細(xì)胞系都能與SC 101/29 mAb結(jié)合，然而，多數(shù)原發(fā)腫瘤顯示 更強(qiáng)的結(jié)合。相反地，SC101/29 mAb與HT-29和LoVo細(xì)胞微弱結(jié)合， 其結(jié)合水平相當(dāng)于與原發(fā)腫瘤結(jié)合的20%。特別有趣的是，SC101/29mAb抑制C170和Colo205細(xì)胞的增殖，但不能抑制表達(dá)低水平Lewisy 和Lewisb抗原的HT-29和LoVo細(xì)胞的增殖。 存活力測(cè)試
為了評(píng)價(jià)SC101/29 mAb介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的機(jī)制，將碘化丙錠(PI) 一種在等滲條件下僅能進(jìn)入無活力細(xì)胞的熒光化合物，用作探針以鑒 別那些血漿膜失去完整性的細(xì)胞。如圖2a和2b所示，SC101/29mAb 使Colo205和C170細(xì)胞的通透性快速增加，以至以上75%的細(xì)胞早在 用抗體處理后30分鐘就PI強(qiáng)烈著色。在同一條件下，當(dāng)用已知誘導(dǎo) 凋亡性細(xì)胞死亡的抗-CD95抗體孵育，或與對(duì)照小鼠IgG抗體孵育4 小時(shí)后，少于10。/。的細(xì)胞攝入PI。相似地，BR96， 一種僅結(jié)合Lewisy 而不結(jié)合Lewisb的mAb，在4小時(shí)時(shí)間內(nèi)也不能顯示出明顯攝入PI。 與細(xì)胞增殖抑制一致，SC101/29 mAb不能誘導(dǎo)抗原表達(dá)低的HT-29和 LoVo細(xì)胞PI攝入。
還分析了 SC101/43改變膜通透性的能力，然而與SC101/29形成 直接對(duì)照的是，它不能誘導(dǎo)PI攝入(圖3a)。然而，它在阻斷SC101/29 誘導(dǎo)的PI的攝入方面是非常有效的，這提示它結(jié)合同一或密切相關(guān)的 表位。如果SC101/43通過卵白素/生物素交聯(lián)，它也能誘導(dǎo)有效的細(xì)胞 殺死作用。同樣地，嵌合SC101/29IgG2抗體的交聯(lián)導(dǎo)致直接殺死結(jié)腸 腫瘤細(xì)胞(圖3c)。由于SC101/29是以天然二聚體存在的小鼠IgG3， 因此這些結(jié)果提示，由于其二聚體結(jié)構(gòu)，Lewi/和Lewisb的交聯(lián)對(duì)于 SC101/29誘導(dǎo)細(xì)胞脹亡是重要的，而SC101/43作為IgGl需要人工交 聯(lián)。
MDR細(xì)胞系藥物攝入
膜喪失完整性使得小分子得以進(jìn)入細(xì)胞。這一點(diǎn)可以通過使用熒 光藥物多柔比星證明；在許多(arangeof)細(xì)胞暴露于SC101/29 mAb 后，表達(dá)高水平抗原并顯示膜喪失完整性的細(xì)胞系(Cok)205和C 170) 的多柔比星的攝入作用增強(qiáng)，而具有低抗原密度的細(xì)胞(HT-29和LoVo， 圖2e)則并非如此。這種效應(yīng)甚至在表達(dá)p-糖蛋白的細(xì)胞(C170)也 得到證實(shí)(圖2f)，這提示SC101/29造成的膜攪動(dòng)抑制藥物通過該泵 的外泌。
半胱天冬酶依賴的細(xì)胞死亡抑制實(shí)驗(yàn)?zāi)ね暾钥焖賳适ǔ?dǎo)致脹亡，其中膜上形成的小孔繼續(xù)增大 直到這些孔得以釋放大的胞漿蛋白，如LDH。同時(shí)，PI顯示喪失完整
性，未見同時(shí)釋放來源于C170細(xì)胞的LDH。缺乏LDH的釋放質(zhì)疑 C170細(xì)胞中脹亡的啟動(dòng)，因此，為了確定鑒定的PI染色并不歸因于人 工模仿的經(jīng)典凋亡，使用pan半胱天冬酶抑制劑z-FMK-vad?？傊?， 同時(shí)已發(fā)現(xiàn)抗-Fas暴露僅微弱誘導(dǎo)C170細(xì)胞的凋亡，可發(fā)現(xiàn)，抑制劑 可完全逆轉(zhuǎn)抗體的效應(yīng)(圖3d)。在z-FMK-vad存在條件下，暴露 于SC101/29mAb的腫瘤細(xì)胞未產(chǎn)生可分辨的效應(yīng)，這提示該死亡模式 不依賴于經(jīng)典凋亡途徑。
經(jīng)由應(yīng)激相關(guān)激酶的信號(hào)傳遞
膜通透性與使HSP27磷酸化導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白聚合的p38激活密切相 關(guān)。更強(qiáng)的激活作用4小時(shí)后，在C170細(xì)胞中觀察到弱p38激活1小 時(shí)(圖3e)。與此相比較，無JNK或ERK的激活。應(yīng)激活化的蛋白 激酶p38也能被一些包括5-FU的化療劑誘導(dǎo)產(chǎn)生。所以，為了確定 SC101/29能否在體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，能否與5- FU協(xié)同，對(duì)移植了人 異種移植物的小鼠給予了 SC101/29。
體內(nèi)研究
對(duì)移植了 3mm2 C170腫瘤抽提物的小鼠，或在抗體給藥之前得以 生長5天的C170腫瘤每周使用抗體3次。動(dòng)物單獨(dú)用SC101/29 mAb 或用5-FU/甲酰四氫葉酸或聯(lián)合使用二者進(jìn)行處理，持續(xù)3周。圖4a 顯示，單獨(dú)使用SC101/29 mAb和5-FU/甲酰四氫葉酸導(dǎo)致新鮮移植的 腫瘤的腫瘤生長抑制(p<0.004 ANOVA)。作為對(duì)照，聯(lián)合使用二者 顯示出附加的生長抑制效應(yīng)，僅有2/10小鼠顯示了大于0.3g的移植腫 瘤重量的任何生長(圖4b,pO.02，AN0VA)。所有小鼠已能很好地耐 受SC101/29 mAb的這個(gè)劑量，表現(xiàn)為體重或任何其它大體病理學(xué)未丟 失(圖4c)。當(dāng)對(duì)表達(dá)C170腫瘤的小鼠治療性地聯(lián)合給予SC101/29 mAb 與25mg/kg5-FU/甲酰四氫葉酸(時(shí)，它顯著地抑制腫瘤的生長并促進(jìn) 存活(圖4d: p<0,0163 Log Rank)。
由于殺死細(xì)胞的機(jī)制提示了 SC101/29與微轉(zhuǎn)移細(xì)胞的結(jié)合應(yīng)非常 有效，SC101/29 mAb在預(yù)防肝轉(zhuǎn)移中的治療性效果用C170HM2結(jié)腸 直腸模型評(píng)價(jià)。用較低劑量lOO(ig和10嗎SC101/29 mAb， 1周3次，處理小鼠6周。在研究結(jié)束時(shí)，測(cè)定摘除下來的C170HM2肝腫瘤的重 量。計(jì)算每組中位數(shù)并將數(shù)據(jù)繪圖，如圖5。將每組中位數(shù)和均值進(jìn)行 分析以通過Mann- Whitney檢驗(yàn)得到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。發(fā)現(xiàn)IO昭和IOO嗎 SC101/29mAb (組2和組3)的中位數(shù)與載體對(duì)照(組l)相比具有顯 著性(pO.OOl)。由于SC101/29在該模型上如此有效以至于不需使用 低劑量5-FU。
實(shí)施例3 討論
已鑒定了一些Lewisy抗體，但這些抗體總是與Lewif和H-2型結(jié) 構(gòu)交叉反應(yīng)。這能導(dǎo)致與正常組織的非預(yù)期交叉反應(yīng)，導(dǎo)致臨床試驗(yàn) 的后續(xù)毒性反應(yīng)。例如，在鼠mAb BR55-2的I期研究中，其與H抗
原發(fā)生交叉反應(yīng)，6/12患者出現(xiàn)血尿，2/9患者出現(xiàn)腹瀉，3名患者皮 膚損害僅暫時(shí)性減輕(Tolcher"a/. (1999) / C//". (9"co/. 17:478-84)。 直接抗Lewisy的LMB-1免疫毒素(連接到假單胞菌屬內(nèi)毒素的B3抗 體)僅導(dǎo)致5/38患者發(fā)生免疫應(yīng)答(Pai (1996) Ato. Med 2: 350-3)。 BR96 mAb與B血型而不是與Lewisb發(fā)生交叉反應(yīng)；其胃腸結(jié)合是劑 量限制的并表現(xiàn)出與結(jié)合抗體相關(guān)(Saleh"a/. (2000;U C7/". 0"co/. 18: 2282-92)。最后，表明Lewisy特異性人源化抗體3S193在結(jié)合研究中 具有優(yōu)良的選擇性(Scott " (2000) Ca"cw Ae^wc/z 60: 254-61)并 已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。
SC101抗體識(shí)別Lewisy和Lewisb的唯一平面。已經(jīng)預(yù)言，SC101 抗體將顯示與一些表達(dá)Lewisy或Lewisb的正常組織的強(qiáng)交叉活性，然 而，與其它Lewis抗體不同，在胃腸道內(nèi)僅觀察到微弱的粘蛋白染色 (Brown (1983) i^/ . 3: 163)。這提示，觀察到的BR96 mAb
的胃腸道毒性可用SC101抗體避免。
SC101抗體在沒有免疫效應(yīng)細(xì)胞時(shí)在體外也可能在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤 細(xì)胞死亡，因?yàn)镮gG3抗體是CDC和ADCC的非常弱的介質(zhì)。令人非 常有興趣的是，腫瘤細(xì)胞需要過表達(dá)Lewisy和Lewisb以被殺死。在胃 腸道80%表達(dá)和卵巢/乳腺腫瘤30%表達(dá)的水平上應(yīng)易于殺死細(xì)胞，但 正常組織將被排除，這提供了良好的治療窗。殺死細(xì)胞的機(jī)制令人非常感興趣，這是由于SC101/29mAb造成膜完整性快速喪失。這同在滲 透壓沖擊和氧過多細(xì)胞中觀察到的脹亡導(dǎo)致的細(xì)胞死亡相似(Garmyn "a/. (2001) //騰"D固她/. 117: 1290-5; Moriguchi & a/. (1996) / 所o/. C72綴271: 26981- 8; Romanshko da/. (2003)i^eeH腸/.她d 35: 978-93; Shen " a/. (2002) J所o/. C%em. 277: 45776-84; Tilley ef a/. (1996) F五^Si^tera 395: 133-6)。然而，經(jīng)典的脹亡進(jìn)展隨后產(chǎn)生細(xì) 胞內(nèi)容物如LDH的釋放(Chen W a/. (2001) 7bx/co/.尸/zarwaco/. 171: 1-11)。細(xì)胞死亡的機(jī)制似乎與Lewisy/Lewib結(jié)構(gòu)相關(guān)，因?yàn)锽R96 這一特征非常清楚的抗LewiSy抗體不能表現(xiàn)出任何對(duì)質(zhì)膜的效應(yīng)。 Lewisy和Lewisb也需要交聯(lián)，交聯(lián)通過天然小鼠IgG3 二聚體或通過 IgGl變種的卵白素/生物素交聯(lián)發(fā)生，以導(dǎo)致膜攪動(dòng)。已描述一些其它 能誘導(dǎo)類似腫瘤細(xì)胞死亡的脹亡的抗體。這些抗體包括識(shí)別廣泛表達(dá) 的糖蛋白的抗porimin抗體(Ma ^ a/. (2001)Ato/. JcflJ. 5W. 98: 9778-83)，識(shí)別腎相關(guān)糖蛋白的RE2 (Matsuoka (1995) / ￡xp. M^i. 181: 2007-2015)和識(shí)別新型glycotope的RAV12。然而，SC101是獨(dú)特的， 因?yàn)檫@些抗體中無一能顯示促進(jìn)化療劑的攝入，特別是在MDR細(xì)胞系 中。
細(xì)胞攝入PI伴隨p38激活。這可解釋膜通透性，因?yàn)樽罱褜38 激活歸因于HSP27磷酸化，HSP27的磷酸化導(dǎo)致微絲動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變
(Deschesnes (2001)嵐脂.Ce〃 12: 1569-82; Huot e aZ. (1998) CW/說o/ogy 143: 1361-73)。這種膜完整性喪失是快速事件，是細(xì)胞死 亡的上游。p38激活能導(dǎo)致依賴或不依賴半胱天冬酶的細(xì)胞死亡 (Deschesnes (2001) Mo/祝o/. Ce〃 12: 1569- 82)。由于SC101/29 mAb不 能誘導(dǎo)DNA斷裂(數(shù)據(jù)未顯示)，而且用pan半胱天冬酶抑制劑 z-FMK-vad抑制半胱天冬酶似乎不能阻止細(xì)胞死亡，這暗示該抗體誘 導(dǎo)不依賴半胱天冬酶的細(xì)胞死亡。結(jié)腸直腸腫瘤的凋亡反應(yīng)相關(guān)基因 的>70%發(fā)生突變，任何圍繞該反應(yīng)的治療將具有重要的治療性價(jià)值
(Vogelstein (1988) TV. 7! Med 319: 525-32; Fulda e/1 a/. (2004) 0#r. Cfl"cwDn^7brg她4: 569-76)。 一種不依賴半胱天冬酶的機(jī)制包括從 線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)及其移位至細(xì)胞核，在核內(nèi)，它以未知的方式促進(jìn)激發(fā)細(xì)胞核濃縮(Susin " a/. (2000) J！jWed 192: 571-80)。
應(yīng)激相關(guān)激酶p38也能被一些化療劑誘導(dǎo)并被認(rèn)為在藥物協(xié)同作 用中發(fā)揮樞紐作用(Olson & Hallahan (2004) 7>ewA Mo/ Met/ 10: 125-9) 。 Lewisy和Lewisb在腫瘤細(xì)胞糖蛋白和糖酯上表達(dá)，并能響應(yīng) 細(xì)胞應(yīng)激而被上調(diào)。確實(shí)，Lewisy響應(yīng)細(xì)胞化療應(yīng)激反應(yīng)的上調(diào)(Flieger "a/. (2001) C// ./ww鵬o/. 123: 9-14)，特別是響應(yīng)5-FU應(yīng)激的 上調(diào)已經(jīng)被報(bào)導(dǎo)。所以，因?yàn)?-FU/甲酰四氫葉酸(5-FU/leucovrin)是 結(jié)腸直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物，它能上調(diào)Lewisy并激活p38 (Feng"a/. (2002) Owcer i^化arc/z 62: 1920-6)，在體內(nèi)篩選聯(lián)合使用SC101/29 和5-FU/甲酰四氫葉酸抑制裸鼠結(jié)腸異種移植物生長的能力。單獨(dú)使用 SC101/29 mAb和與5-FU/甲酰四氫葉酸聯(lián)合使用顯著抑制了小的已確 診腫瘤的生長。如果使用嵌合形式的SC101/29 mAb進(jìn)行的I期臨床試 驗(yàn)表明該抗體是安全的，那么在手術(shù)后的結(jié)腸直腸癌患者中聯(lián)合使用 5-FU/甲酰四氫葉酸和SC101/29 mAb和作為比較的單獨(dú)使用藥物的后 續(xù)試驗(yàn)將啟動(dòng)。這種聯(lián)合使用較Panorex/5-FU可更加有效，因?yàn)樵摽?體無直接殺傷活性并依賴于CDC和ADCC，其由于過表達(dá)補(bǔ)體 (complement)調(diào)節(jié)分子而對(duì)固體腫瘤僅具有有限的成功(Li & a/. (2001) Br. / Ca"cw 84: 80-6)。
本發(fā)明人已證明，SC101/29誘導(dǎo)膜通透性，使其允許攝入小分子 量(<800D)藥物而不釋放大的細(xì)胞內(nèi)成分，如LDH。 SC101/29也誘 導(dǎo)應(yīng)激相關(guān)激酶p38而不是JNK的磷酸化，并最終誘導(dǎo)半胱天冬酶非 依賴的細(xì)胞死亡。這尤其是興趣所在，因?yàn)榧罕砻魃窠?jīng)酰胺通過激活 p38釋放包括AIF的多種線粒體蛋白質(zhì)而誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞死亡(Ghatan "a/. (2000) / CW/說W. 150: 335-47; Stoica d cd (2005) Mo/. CW/ A^/msc/. 29:355-71)。由于Lewisy/Lewisb主要表達(dá)在糖酯上，其降解 可導(dǎo)致神經(jīng)酰胺的增加和隨后的p38激活。由于SC101/29不是通過經(jīng) 典描述的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，它可能對(duì)已經(jīng)發(fā)展出使其抵抗經(jīng)典細(xì)胞 凋亡或脹亡的機(jī)制的腫瘤細(xì)胞特別有效。然而，需要更加仔細(xì)地說明 這條途徑以允許進(jìn)一步驗(yàn)證我們的殺傷實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)耐藥的潛在機(jī)制， 并允許我們鑒別優(yōu)化的腫瘤耙點(diǎn)。綜上，SC101/29是識(shí)別Lewisy和Lewisb的新型mAb，它通過誘導(dǎo) 膜喪失完整性而直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。這第一次描述了能以溶瘤細(xì)胞的 方式選擇性殺死腫瘤細(xì)胞的識(shí)別血型抗原的抗體。越來越多的證據(jù)證 明p38在治療協(xié)同反應(yīng)中的作用。SC101/29與5-FU/甲酰四氫葉酸聯(lián) 合使用顯示出增強(qiáng)的殺傷作用，并可與這些藥物聯(lián)合使用以降低毒性 和增強(qiáng)治療癌癥的效果。
貫穿本說明書的單詞"包含"應(yīng)理解為意指包括提及的元素、整 數(shù)或步驟，或元素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其它元素、整數(shù) 或歩驟，或元素、整數(shù)或歩驟的組。
在本說明書中提及的所有出版物通過引用并入本文。任何本說明 書已包括的文件、行為、材料、裝置、文章等的討論僅用于提供本發(fā) 明的上下文。不應(yīng)視為承認(rèn)這些事物的任何或全部形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ) 的部分或是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的一般公知知識(shí)，當(dāng)它在本申請(qǐng)的每項(xiàng)權(quán) 利要求的優(yōu)先權(quán)日之前在澳大利亞或別處存在時(shí)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可對(duì)如本發(fā)明具體實(shí)施方式
中顯示的本 發(fā)明進(jìn)行許多變動(dòng)和/或修改而不脫離廣義上描述的本發(fā)明的本質(zhì)或范 圍。因此應(yīng)視為本具體實(shí)施方式
在所有方面是解釋性的而非限制性的。
權(quán)利要求
1、一種結(jié)合復(fù)合物，其包含與Lewisy和Lewisb抗原結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段，其中抗體或抗原結(jié)合片段是多聚體的形式，并且其中抗體或抗原結(jié)合片段不天然形成多聚體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合復(fù)合物，其中多聚體是同源或異源 多聚體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合復(fù)合物，其中多聚體是同源或 異源二聚體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的結(jié)合復(fù)合物，其中多聚體包 含IgG抗體。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的結(jié)合復(fù)合物，其中多聚體是異源二聚的IgG2/IgG3抗體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的結(jié)合復(fù)合物，其中多聚體包 含并非源于相同物種的抗體或抗原結(jié)合片段。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的結(jié)合復(fù)合物，其中多聚體是 二聚的IgG抗體。
8 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的結(jié)合復(fù)合物，其中抗原結(jié)合 片段選自多體、結(jié)構(gòu)域抗體、Fv片段、Fd片段、Fab片段、F(ab')2片 段、互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)或通過同源框架區(qū)融合的CDR。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的結(jié)合復(fù)合物，其中多體是雙體或三體。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合復(fù)合物，其中多體是雙體。
11、 根據(jù)權(quán)利要求8至10任一項(xiàng)所述的結(jié)合復(fù)合物，其中多體進(jìn)一歩包含修飾的Fc結(jié)構(gòu)域。
12、 一種用于誘導(dǎo)過表達(dá)Lewi^和Lewisb抗原的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞死 亡的方法，其包含對(duì)受試者使用有效量的包含與Lewisy和Lewisb抗原 結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段的結(jié)合復(fù)合物，其中抗體或抗原結(jié)合片段 是多聚體形式，并且其中抗體或抗原結(jié)合片段不天然形成多聚體。
13、 一種用于治療受試者癌癥的方法，其包含對(duì)受試者使用治療 有效量的包含與Lewi^和Lewisb抗原結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段的結(jié) 合復(fù)合物，其中抗體或抗原結(jié)合片段是多聚體形式，并且其中抗體或 抗原結(jié)合片段不天然形成多聚體。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中癌癥選自乳腺癌、肺癌、 結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌或胰腺癌。
15、 根據(jù)權(quán)利要求12至14任一項(xiàng)所述的方法，其中將結(jié)合復(fù)合 物配制成對(duì)受試者使用的藥物組合物。
16、 根據(jù)權(quán)利要求12至15任一項(xiàng)所述的方法，其中結(jié)合復(fù)合物 以可注射溶液的形式給藥。
17、 根據(jù)權(quán)利要求12至16任一項(xiàng)所述的方法，其中結(jié)合復(fù)合物 通過靜脈給藥。
18、 根據(jù)權(quán)利要求12至17任一項(xiàng)所述的方法，其中結(jié)合復(fù)合物 對(duì)人使用。
19、 一種用于誘導(dǎo)過表達(dá)Lewi^和Lewisb抗原的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞死 亡的藥物組合物，該組合物包含治療有效量的包含與Lewi^和Lewisb 抗原結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段的結(jié)合復(fù)合物，和藥學(xué)上可接受的載 體，其中抗體或抗原結(jié)合片段是多聚體的形式，而且其中抗體或抗原結(jié)合片段不天然形成多聚體。
20、 一種治療有效量的包含與Lewisy和Lewisb抗原結(jié)合的抗體或 抗原結(jié)合片段的結(jié)合復(fù)合物在制備用于誘導(dǎo)過表達(dá)Lewi^和Lewisb抗 原的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞死亡的藥物中的用途，其中抗體或抗原結(jié)合片段是 多聚體的形式，而且其中抗體或抗原結(jié)合片段不天然形成多聚體。
21、 一種治療有效量的包含與Lewisy和Lewisb抗原結(jié)合的抗體或 抗原結(jié)合片段的結(jié)合復(fù)合物在制備用于治療受試者癌癥的藥物中的用 途，其中抗體或抗原結(jié)合片段是多聚體的形式，而且其中抗體或抗原 結(jié)合片段不天然形成多聚體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種結(jié)合復(fù)合物，其包含與Lewis^y和Lewis^b抗原結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段，其中抗體或抗原結(jié)合片段是多聚體的形式，并且其中抗體或抗原結(jié)合片段并不天然形成多聚體。
文檔編號(hào)C07K16/30GK101547937SQ200780035160
公開日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2007年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月20日
發(fā)明者L·G·達(dá)蘭特, P·A·詹寧斯 申請(qǐng)人:阿拉納治療有限公司