專利名稱：：一種抗耐藥菌的多肽及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及一種高效抗耐藥菌功能的多肽。具體地說，本發(fā)明涉及一種東亞鉗蝎抗菌肽對耐青霉素葡萄球菌的高效抗菌作用；也涉及一種東亞鉗蝎抗菌肽對耐甲氧西林葡萄球菌的高效抗菌功能。對于抗生素敏感菌而言，其抗菌效果與青霉素相當(dāng)，但不會產(chǎn)生耐受性。對于耐受菌而言，其抗菌效果與萬古霉素相當(dāng)，但沒有副作用；同時涉及一種東亞鉗蝎抗菌多肽對耐青霉素葡萄球菌引起的敗血癥的藥物中的用途。在預(yù)防和治療由耐受菌引起醫(yī)院感染中效果顯著，可作為抗菌藥物開發(fā)。
背景技術(shù)：
：1929年，英國細(xì)菌學(xué)家弗萊明在其實(shí)驗(yàn)室中發(fā)現(xiàn)點(diǎn)青霉分泌的一種未知物質(zhì)(即"青霉素")具有強(qiáng)力抑菌作用。在此后幾十年里，抗生素已發(fā)展成為幾大系列上百個品種的重要臨床藥物。二十世紀(jì)初抗生素的發(fā)現(xiàn)堪稱為醫(yī)藥技術(shù)發(fā)展史上重大里程碑之一。但近幾年來細(xì)菌耐藥現(xiàn)象己成為各國醫(yī)療界所面臨的一嚴(yán)重問題。如何對付越來越普遍的耐藥細(xì)菌已成為國際醫(yī)學(xué)界所面臨的一棘手難題。中國是世界上濫用抗生素較為嚴(yán)重的國家，耐藥菌引起的醫(yī)院感染人數(shù)，已占到住院感染患者總?cè)藬?shù)的百分之三十左右。美國《美國醫(yī)學(xué)會雜志》刊登一份政府調(diào)查報告說，被稱為"超級病菌"的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)在美國國內(nèi)正呈蔓延趨勢，每年預(yù)計有超過9萬人嚴(yán)重感染這一病菌。專家警告說，MRSA在美國每年致死的人數(shù)可能超過艾滋病。MRSA自l恥l年被發(fā)現(xiàn)后，到上世紀(jì)80年代后期就已成為全球發(fā)生率最高的醫(yī)院內(nèi)感染病原菌之一。全世界范圍內(nèi)，目前能夠被證實(shí)對MRSA有效的只有萬古霉素，MRSA被列為世界三大最難解決感染性疾患的第一位。然而，作為對付細(xì)菌的抗生素最后一道防線萬古霉素不但有嚴(yán)重的副作用(如引起神經(jīng)性耳聾)，而且在臨床上也分離到了耐萬古霉素的細(xì)菌。因此，迫切需要開發(fā)新的"抗菌物質(zhì)"。近年來尋找新的抗菌活性多肽成為了藥物學(xué)家們對付細(xì)菌耐藥和抗藥的首選策略?？咕钚远嚯牟粫蟪Ｒ?guī)抗生素那樣容易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥，這無疑是天然和人工合成抗菌活性多肽研發(fā)的一個莫大的鼓勵。事實(shí)上，國外越來越多的藥物公司和科研機(jī)構(gòu)正投入大量的人力和物力致力于抗菌活性多肽的研制。蝎子是我國的一種傳統(tǒng)名貴中藥，2000多年前就記載了蝎子的藥用史。明朝《本草綱目》更詳細(xì)記載蝎主治"諸風(fēng)癮疹、中風(fēng)、半身不遂、口眼歪斜、語澀、手足抽摯，小兒驚癇風(fēng)搐"等多種疾病，具有抗腫瘤，殺蟲，抑菌和抗菌功效，其作用主要來源于蝎尾毒腺分泌的毒液。對東亞鉗蝎有實(shí)驗(yàn)研究表明，全蝎乙醇提取物在體外對8種表淺致病真菌均有抑制作用，尤其對裴氏著色菌、中克氏孢子絲菌、石膏樣毛癬菌、絮狀表皮癬菌較為敏感，其抗真菌作用優(yōu)于大蒜浸出液。采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和高效分離純化技術(shù)，從多種蝎毒中鑒定了一類小分子抗菌活性肽，這類肽是在蝎體液中經(jīng)免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的，含3對二硫鍵或不含二硫鍵，多數(shù)帶正電荷，具有影響革蘭氏陽性菌膜通透性的功能。例如Possani等從蝎毒腺分離得到了一批抗菌肽，包括Scorpine、Cecropines、Hadrurin等，它們除了具有殺菌功能，還可以殺滅瘧原蟲。Tytgat也從蝎毒腺中分離到了幾禾中抗菌膚Parabutoporin,Opistoporinl禾口0pistoporin2，對它們進(jìn)行了——系歹[|的功能研究，發(fā)現(xiàn)Opistoporinl和Parabutoporin這兩個肽更能有效地抑制革蘭氏陰性菌的生長，且它們都能抑制真菌的生長。因此，蝎毒液中蘊(yùn)藏著大量的天然抗菌活性物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供一種蝎毒抗菌多肽，抗耐受菌活性高，殺菌速度快，該抗菌肽含有13個氨基酸，生產(chǎn)成本低，水溶性好。本發(fā)明還涉及一種抗菌多肽在制備治療對耐青霉素葡萄球菌引起的敗血癥的藥物中的應(yīng)用，具有高效治療功能的多肽，治療效果好，無副作用。多肽ABP-W1在制備治療或預(yù)防耐青霉素金黃葡萄球菌、耐青霉素表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黃葡萄球菌、耐甲氧西林人葡萄球菌、耐甲氧西林溶血性葡萄球菌、對耐青霉素葡萄球菌引起的敗血癥和感染疾病的藥物中的應(yīng)用。在預(yù)防和治療由4耐青霉素葡萄球菌或耐等革蘭氏陽性菌引起的醫(yī)院感染效果顯著。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采用化學(xué)合成的方法，獲得了蝎毒抗菌多肽ABP-W1，抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌多肽ABP-W1對臨床分離的耐青霉素高達(dá)lOOOOpg/ml的金黃葡萄球菌P1383和表皮葡萄球菌P1389的最小抑菌濃度MIC均為4pg/ml，抗菌效果比萬古霉素(萬古霉素對其最小抑菌濃度MIC均為8pg/ml)高1倍，具有高效的抗菌效果。同時，ABP-W1對臨床分離的耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1381(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)5000pg/ml和400pg/ml)和耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1386(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)10000(ig/ml和400pg/ml)、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)4000ng/ml和100pg/ml)和耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P1369(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)20000ng/ml和400嗎/ml)的最小抑菌濃度MIC均為8嗎/ml，抗菌效果與萬古霉素相當(dāng)，具有高效的抗菌功能。以耐青霉素金黃葡萄球菌P1383感染小鼠，獲得典型的敗血癥模型小鼠，10mg/kg的ABP-W1藥物可以使敗血癥小鼠完全康復(fù)，其療效與70mg/kg的萬古霉素療效相當(dāng)，而70mg/kg的青霉素鈉幾乎無療效?？咕嚯腁BP-W1可開發(fā)成高效的抗菌藥物。本發(fā)明提供的一種蝎毒抗菌多肽。首先構(gòu)建高質(zhì)量東亞鉗蝎毒腺組織cDNA文庫，具體包括蝎毒腺總RNA的分離和mRNA純化，cDNA的第一鏈和第二鏈合成，雙鏈cDNA與pSPORTl載體(購自美國Invitrogen)的連接和轉(zhuǎn)化，獲得蝎毒腺組織cDNA文庫。在構(gòu)建文庫的基礎(chǔ)上，隨機(jī)挑選50克隆子進(jìn)行測序，序列分析發(fā)現(xiàn)W1克隆子為一個新的東亞鉗蝎抗菌肽基因，命名為ABP-W1。一種分離的多肽基因，其序列為SEQIDN0:1所示的核苷酸序列ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaBctcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttctttttctagttgttttattattagcaatttcacaatcagaagctttcELttggtgctgttgctagtcttctcagaaa朋tttttggaaaaag朋gtatgagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaactaatggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctattttagattataaatatttcttttgaaaEiaaaeiaaaaeLaaaaaaaaaaaaaaaoABP-W1的前體組織形式編碼70個氨基酸殘基，由三個部分組成，即信號肽(23個殘基)、成熟肽(13個殘基)和前體肽(34個殘基)。基于蝎毒素前體C末端殘基的加工規(guī)則，ABP-W1末端最后的殘基Phe被特異性羧肽酶(Carboxypeptidase)切除，且被酰氨化。因此，本發(fā)明提供一個東亞鉗蝎蝎毒抗菌肽FIGAIARLLRKIF-NH2(SEQIDN0:2)。本發(fā)明提供的一種高效抗耐青霉素葡萄球菌的多肽(SEQIDNO:2)。通過固相化學(xué)合成的辦法，得到了純度達(dá)95%以上的合成多肽ABP-W1?？咕Y(jié)果表明合成多肽ABP-W1對耐青霉素金黃葡萄球菌P1383(青霉素的最小抑菌濃度MIC高達(dá)10000pg/ml)和耐青霉素表皮葡萄球菌P1389(青霉素的最小抑菌濃度MIC高達(dá)10000嗎/ml)的高效抗菌作用，其最小抑菌濃度MIC均為4pg/ml，ABP-W1抗菌效果比萬古霉素(最小抑菌濃度MIC均為8pg/ml)高1倍，而比青霉素高2500倍。本發(fā)明提供的一種高效抗耐甲氧西林葡萄球菌的多肽(SEQIDN0:2)。合成的ABP-W1多肽對臨床分離的耐甲氧西林的金黃葡萄球菌P1381(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)500(^g/ml和400pg/ml)和耐甲氧西林的金黃葡萄球菌P1386(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)10000lig/ml和400pg/ml)、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)4000(ig/ml和100pg/ml)和耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P1369(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)20000ng/ml和400pg/ml)的最小抑菌濃度MIC均為8pg/ml，請見表1。生長抑制曲線結(jié)果表明，抗菌多肽ABP-W1對耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1386(圖2、圖3和圖4)和敏感金黃葡萄球菌P969(圖6、圖7和圖8)的生長抑制效果顯著(圖5和圖9)?？咕Чc萬古霉素相當(dāng)，具有高效的抗耐甲氧西林葡萄球菌功能。本發(fā)明提供的一種對耐青霉素葡萄球菌引起的敗血癥具有高效治療功能的多肽。以耐青霉素金黃葡萄球菌P1383感染小鼠，獲得典型的敗血癥模型小鼠，10mg/kg的ABP-W1藥物可以使敗血癥小鼠完全康復(fù)，其療效與70mg/kg的萬古霉素療效相當(dāng)，而70mg/kg的青霉素鈉幾乎無療效(請見表2)，治療效果好，無副作用。在預(yù)防和治療由耐青霉素葡萄球菌或耐甲氧西林葡萄球菌等革蘭氏陽性菌引起的醫(yī)院感染效果顯著。本發(fā)明涉及的ABP-W1抗菌多肽，只含有13個氨基酸，生產(chǎn)成本低，水溶性好。對于抗生素敏感菌而言，ABP-W1多肽抗菌效果與青霉素相當(dāng)，但不會產(chǎn)生耐藥性。對于耐藥菌而言，ABP-W1多肽抗菌效果與萬古霉素相當(dāng)，但沒有副作用。在預(yù)防和治療由耐受菌引起醫(yī)院感染中效果顯著。該抗菌肽與現(xiàn)有的抗生素相比，具有高效、不產(chǎn)生耐藥性、無副作用和殺菌速度快的優(yōu)點(diǎn)。圖1東亞鉗蝎蝎毒抗菌肽ABP-Wl基因及其氨基酸。cDNA序列下方為推斷的對應(yīng)氨基序列；信號肽氨基酸以單下劃線標(biāo)記；成熟肽氨基酸以黑體標(biāo)記；方框部分氨基酸為羧肽酶識別位點(diǎn)；陰影部分氨基酸為C端前體肽。圖2青霉素鈉對耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1386的生長抑制曲線。青霉素鈉鹽的濃度單位為^g/ml。圖3頭孢噻肟對耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1386的生長抑制曲線。頭孢噻肟的濃度單位為嗎/ml。圖4萬古霉素對耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1386的生長抑制曲線。萬古霉素的濃度單位為^g/ml。圖5抗菌多肽ABP-W1對耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1386的生長抑制曲線。抗菌多肽ABP-Wl的濃度單位為嗎/ml。圖6青霉素鈉鹽對敏感金黃葡萄球菌P969的生長抑制曲線。青霉素鈉鹽的濃度單位為嗎/ml。圖7頭孢噻肟對敏感金黃葡萄球菌P969的生長抑制曲線。頭孢噻肟的濃度單位為嗎/ml。圖8萬古霉素對敏感金黃葡萄球菌P969的生長抑制曲線。萬古霉素的濃度單位為(ig/ml。圖9抗菌多肽ABP-W1對敏感金黃葡萄球菌P969的生長抑制曲線?？咕嚯腁BP-Wl的濃度單位為嗎/ml。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1:一種蝎毒抗菌多肽的制備。步驟如下A:蝎毒腺總RNA的提取(TrizolLS—步法TrizolLS購自美Invitrogen)①取500mg的蝎尾腺在液氮中研成細(xì)粉末，加入10mlTRIZOLreagent混勻，室溫(20-25'C，以下相同)放置5分鐘；②然后加入2ml氯仿混合15秒，室溫放置2-3分鐘，4。C下12000g離心15分鐘；③取水相加1倍體積異丙醇，室溫放置10分鐘，4匸下12000g離心10分鐘得RNA沉淀；沉淀用5ml75X乙醇洗滌，7500g離心5分鐘；⑤RNA沉淀干燥后溶于DEPC-treatedwater,55-60。C保溫10分鐘以徹底溶解RNA。整個過程參照TRlZOL(TotalRNAIsolation)ReagentKit推薦方法進(jìn)行。制備的蝎毒腺總RNA采用甲醛變性凝膠電泳檢測其質(zhì)量。得到了高質(zhì)量的蝎毒腺總RNA。B:raRNA的分離純化采用PolyATractmRNA分離系統(tǒng)(Promega,USA)分離和純化mRNA，其工作原理是基于01igo(dT)與mRNA3'端poly(A)尾的互補(bǔ)配對特性，用生物素標(biāo)記01igo(dT)，通過它與niRNA3'端poly(A)的退火形成雜交體，然后用標(biāo)有親合素的磁珠和磁性分離架捕獲并洗滌生物素01igo(dT)/mRNA雜交體，最后用無RNA酶的ddH20將之洗脫下來，達(dá)到從總RNA中分離mRNA的目的。(p樣品的制備將RNA加入到含有32pie-巰基乙醇的800^1的GTC中。②探針的退火取250pM濃度Oligo(dT)5pl，加蒸餾水至50pl;加入1.6ml預(yù)熱的dilutionbuffer(dilutionbuffer已加入32)alP—巰基乙醇)，與RNA混勻，7(TC溫育5分鐘。③磁珠的活化取1.2ml的磁珠SA-PMPS(購自美Proraega)于1.5ml的離心管中；用0.5XSSC重懸SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原體積0.5XSSC洗滌SA-PMPS3次。④raRNA的獲取將70°C溫育的RNA與SA-PMPS混合，室溫放置5分鐘放磁架上吸附磁珠，棄上清液；2ml的0.5XSSC懸浮磁珠，洗滌重復(fù)2次，最后一次盡量去除SSC;加入無RNA酶的ddH20至磁珠中，輕輕混勻，然后離心U2000gX3分鐘)或磁架吸附磁珠；取上清，獲得mRNA。通過電泳和紫外測定mRNA的濃度和純度。⑤mRNA的沉淀將④獲得的mRNA中加入糖原和2.5倍體積的無水乙醇，沉淀過夜，mRNA將用于cDNA的合成。C:第一鏈cDNA合成①在1.5mlEp管中加入2|alAbtIPrimer-adapter和6jalraRNA(含3叫raRNA)，70。C溫育10min，迅速放于冰上，離心后，加入下列成分4^15Xfirststrandbuffer;2pl0.1MDTT;lpl10mMdNTPs;lplH20。輕輕混勻后離心，37。C放至2min;②加入5pl逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻后取2pl，加1^1[a-52P]dCTP(4pCi)(示蹤管)。與上述反應(yīng)組分(樣品管)同時37。C溫育lh，然后放入冰上終止反應(yīng)；③對于示蹤管，依次加入43pl20mMEDTA和5^1酵母tRNA,混勻后，分別取兩份10^1點(diǎn)于兩張濾膜上，1份用10%TCA洗3次，每次5min,95%乙醇洗1次，空氣干燥后，放入1.5ml閃爍液中(為l'樣品)；另l份空氣干燥后，放入1.5ml閃爍液(為2#樣品)。另3(Vl示蹤液，加1.5^17.5M醋酸氨(,40&。和90pl無水乙醇(-20°C)，混勻后立即14，OOOrpm離心20min，棄上清，加入0.5ml70%無水乙醇(-2(TC)，14，OOOrpm離心2min，棄上清，37。C干燥10min讓乙醇揮發(fā)，溶于10^1TEN溶液，加入1(^12X加樣緩沖液，取10pl用于堿性凝膠電泳。用[a-:12P]dCTP標(biāo)記入DNA歷/7t/EI1片段作分子量標(biāo)記；混勻后室溫下放置15min，加入2pl0.2MEDTA終止反應(yīng)。取6|al反應(yīng)液和6ml2X堿性電泳緩沖液混勻，電泳5h后，用7。/。TCA浸泡20min，直至溴酚蘭變黃。然后用衛(wèi)生紙吸干(8h左右)，進(jìn)行放射自顯影；⑤對于樣品管，用于第二鏈的合成。歷'/7t/III10Xbuffer2|ildGTP0.2mMdATP0.2mMdCTP2pCi〃j.yc/IIImarkersl|agKlenowDNApolymerase2unitAddddH20tofinalvolumeof20(^19D:第二鏈cDNA合成①冰上在樣品管中依次加入下列成分；②輕輕混勻后，16匸溫育2h;(D加入2pl(10units)T4DNA聚合酶，繼續(xù)16。C反應(yīng)5min;④轉(zhuǎn)入冰上，加入10^10.5MEDTA;⑤加入等體積(150^1)酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)，徹底渦旋后，室溫下14，000rpm離心5min。將水相(140^1)轉(zhuǎn)入另一1.5mlEp管；⑥加入70pl的7.5MNH40Ac和0.5ML無水乙醇(-20°C)，渦旋后，室溫下14，000rpm離心20min;⑦棄上清，加入O.5ml70。/。乙醇(-20。C)，同上離心2min。棄上清，37。C干燥10min。DEPC-treatedwater92|_tl5Xsecondstrandbuffer30|jl10mMdNTPmix3plE.coliDNAligase(10units/pl)lplE.coliDNApolymerase(lOunits/pl)4|jJE.coliRNaseH(2units/Vl)1^1FinalVolume150^1E:雙鏈cDNA與I銜接頭的連接①用25pl滅菌水溶解實(shí)D的cDNA樣品，然后按下表依次加入；②輕輕混勻，16。C反應(yīng)過夜(約20h)。③用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提和朋40&0/乙醇沉淀后，37'C干燥10min。5XT4DNAligasebufferlOplSalIadapterslOjxlT廁ligase5^1FinalVolume50)^1F:AbtI消化雙鏈cDNA①將E的樣品溶于41pl，然后按下表依次加入；②混勻后，37。C溫育2h;③用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提一次，然后用7.5MMU)ac/乙醇沉淀，37。C干燥10min。④溶于70plTEN，取1^1用于定量，其余-2(TC保存?zhèn)溆谩EACT3buffer5^1NotI4plFinalVolume50^1G:去除雙鏈cDNA分子中的過量I銜接頭和酶切小片段用nucleonextractionandpurificationkit(Amersham，USA)去除過量I銜接頭和酶切小片段。①室溫下懸浮樹脂，然后取60(^1加于離心柱中，2000rpm離心10s，去掉液體。在樹脂中央加入40^1上述cDNA溶液。同上離心；②收集洗脫液用于連接反應(yīng)。H:雙鏈cDNA與pSP0RTl載體的連接和轉(zhuǎn)化①在1.5mlEp管中依次加入下列成分；②室溫下反應(yīng)16h;③在②反應(yīng)液中依次加入下列成分5.0^1yeasttRNA,12.5^17.5MNH40ac，無水乙醇(-20°C)。渦旋混勻后立即14000離心20min;沉淀用70%乙醇(-20°C)洗滌，37。C干燥后溶于4^1;⑤取2^1電擊轉(zhuǎn)化50pl￡coh'K12MC1061。用PCR方法鑒定文庫的質(zhì)量，正向引物5'TCGACCCACGCGTCCG3'(按SalI銜接頭序列設(shè)計)；反向引物5'GAGCGGCCGCCCT153'(按Notl引物-銜接頭的序列設(shè)計)。5XT4DNAligasebuffer4plpSP0RTl，NotI-SalI-Cut(50ng/pl)1^1cDNA(3ng/pl)4nlT4DNAligaseljalAddddH20tofinalvolume20|olI:隨機(jī)測序策略篩選cDNA文庫隨機(jī)從構(gòu)建好的東亞鉗蝎毒腺cDNA文庫中挑選50克隆子，送上海三博公司測序。序列錄入軟件為BioEditv4.5.8(TomHall,1999)，同源性比較和信號肽切割位點(diǎn)預(yù)測軟件分別為CLUSTALX1.8(Thompsonetal.,1997)和PC/GENE(IntelligeneticsInc.,Switzerland)。序列分析表明克隆子Wl為一個全新的抗菌肽基因，命名為ABP-W1。其序列為SEQIDNO:l所示的核苷酸序列ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttctttttctagttgttttattattagcaatttcacaatcagaagctttcattggtgctgttgctagtcttctcagaaaaatttttggaaaaagaagtatgagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaactaatggaaaattactgattatttgaatataata8tgttatctctatttt3gatt3taaatatttcttttgaaaaaaaaaaaa^aaa朋aa3aB幼333(圖1)。ABP-W1的前體組織形式編碼70個氨基酸殘基，由三個部分組成，即信號肽(23個殘基)、成熟肽(13個殘基)和前體肽(34個殘基)?；谛舅厍绑wC末端殘基的加工規(guī)則，ABP-W1末端最后的殘基Phe被特異性羧肽酶(Carboxyp印tidase)切除，且被酰氨化。ABP-W1抗菌多肽氨基酸序列，一種分離的東亞鉗蝎抗菌多肽序列，其序列為FIGAIARLLRKIF-NH2所示的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。J:化學(xué)合成蝎毒抗菌多肽ABP-Wl從東亞鉗蝎毒腺中分離了一個由13氨基酸組成的多肽ABP-W1，且被酰氨化。采用固相化學(xué)合成的辦法獲得高純度的ABP-W1多肽FIGAIARLLRKIF-NH2。實(shí)施例2:抗菌多肽ABP-W1藥物對耐青霉素葡萄球菌的最小抑菌濃度多肽ABP-W1在制備治療或預(yù)防耐青霉素金黃葡萄球菌或青霉素表皮葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用過程是A將耐青霉素金黃葡萄球菌P1383或耐青霉素表皮葡萄球菌P1389培養(yǎng)到OD,=0.8時，稀釋400倍后取80nl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20nl經(jīng)等比稀釋的ABP-W1，達(dá)到終濃度為100Pg/ml，10Pg/ml,1Pg/ml，0.1Pg/ml。陰性對照孔加入的1%BSA;B37。C培養(yǎng)12小時后，用酶標(biāo)儀測96孔板中各孔的在630nM波長處的吸光值;C確定藥物ABP-W1的IO倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的A和B步驟。最終確定抗菌肽ABP-W1對耐青霉素金黃葡萄球菌P1383或耐青霉素表皮葡萄球菌P1389的最低抑制濃度。同時測定抗生素藥物萬古霉素、青霉素鈉和頭孢噻肟對耐青霉素金黃葡萄球菌P1383和耐青霉素表皮葡萄球菌P1389的最小抑菌濃度。抗菌結(jié)果表明合成多肽ABP-W1對耐青霉素金黃葡萄球菌P1383和耐青霉素表皮葡萄球菌P1389的高效抗菌作用，其最小抑菌濃度MIC均為4pg/ml，而萬古霉素對它們的最小抑菌濃度MIC均為8pg/ml，ABP-W1抗菌效果比萬古霉素高1倍。青霉素鈉對它們的最小抑菌濃度MIC高達(dá)10000pg/ml，ABP-W1抗菌效果而比青霉素高2500倍。實(shí)施例3:抗菌多肽ABP-Wl藥物對耐甲氧西林葡萄球菌的最小抑菌濃度抗菌肽ABP-Wl在制備治療或預(yù)防耐甲氧西林葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用過程是A將耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1386和P1381、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374或耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P1369培養(yǎng)到0D6。。=0.8時，稀釋400倍后取80^1加入到96孔板中，然后分別向多孔加入2(^1經(jīng)等比稀釋的ABP-W1，達(dá)到終濃度為100Pg/ml，10Pg/ml，lPg/ml，0.lPg/ml。陰性對照孔加入20nl的1%BSA;B37"C培養(yǎng)12小時后，用酶標(biāo)儀測96孔板中各孔的在630nM波長處的吸光值；C確定藥物ABP-W1的IO倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)A和B步驟。最終確定抗菌肽ABP-W1對耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1386和P1381、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374或耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P1369的最低抑制濃度。同時測定抗生素藥物萬古霉素、青霉素鈉和頭孢噻肟對耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1386和P1381、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374、耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P1369的最小抑菌濃度。ABP-W1多肽對臨床分離的耐甲氧西林的金黃葡萄球菌P1381(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)5000ng/ml和400ng/ml)和耐甲氧西林的金黃葡萄球菌P1386(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)10000jag/ml和40(^g/ml)、耐甲氧西林人葡萄球菌P1374(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)4000嗎/ml禾口100嗎/ml)和耐甲氧西林溶血性葡萄球菌P136913(青霉素和頭孢噻肟的最小抑菌濃度MIC分別高達(dá)20000pg/ml和400|ag/ml)的最小抑菌濃度MIC均為8|ag/ml?？咕Чc萬古霉素相當(dāng)，具有高效的抗耐甲氧西林葡萄球菌功能。實(shí)施例4:抗菌多肽ABP-W1藥物對敏感葡萄球菌的最小抑菌濃度多肽ABP-W1在制備治療或預(yù)防敏感葡萄球菌的藥物中應(yīng)用過程是A將臨床分離的敏感金黃葡萄球菌P969、敏感表皮葡萄球菌Pllll和P1368培養(yǎng)到0D6。(,=0.8時，稀釋400倍后取80pl加入到96孔板中，然后分別向多孔加入經(jīng)等比稀釋的ABP-W1，達(dá)到終濃度為10(￥g/ml,醇gM，lPg/ml，0.lPg/mL陰性對照孔加入20^1的1%BSA;B37。C培養(yǎng)12小時后，用酶標(biāo)儀測96孔板中各孔的在630nM波長處的吸光值；C確定藥物ABP-W1的10倍稀釋的最低抑制濃度后，將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)試驗(yàn)的前兩個步驟A和B。最終確定抗菌肽ABP-W1對敏感金黃金黃葡萄球菌P969、敏感金黃表皮葡萄球菌Pllll和P1368的最低抑制濃度。同時測定抗生素藥物萬古霉素、青霉素鈉和頭孢噻肟對敏感金黃葡萄球菌P969、敏感表皮葡萄球菌Pllll和P1368的最小抑菌濃度?？咕Y(jié)果表明，ABP-Wl藥物對敏感金黃葡萄球菌P969、敏感表皮葡萄球菌Pllll和P1368的最小抑菌濃度均為4pg/ml，而萬古霉素對它們的最小抑菌濃度均為8嗎/ml，青霉素鈉對它們的最小抑菌濃度分別為4嗎/ml、40pg/ml和40嗎/ml，頭孢噻肟對它們的最小抑菌濃度分別為5嗎/ml、5嗎/ml和10ng/ml。ABP-Wl藥物對臨床分離敏感金黃葡萄球菌和敏感表皮葡萄球菌的抗菌效果良好，比傳統(tǒng)的抗生素效果要高l倍以上。實(shí)施例5:抗菌多肽ABP-Wl藥物對耐甲氧西林金黃葡萄球菌的生長抑制曲線多肽ABP-W1在制備治療或預(yù)防耐甲氧西林金黃葡萄球菌的藥物中應(yīng)用過程是:將耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1386培養(yǎng)到0D6,)。=0.8時，稀釋400倍后取80^1加入到96孔板中，然后分別向多孔加入2(^1經(jīng)等比稀釋的ABP-W1，達(dá)到終濃度為40Pg/ml，8Pg/ml，2l^/ml，0.叫g(shù)/ral。陰性對照孔加入20^1的1%BSA;37'C培養(yǎng)搖床培養(yǎng)，分別在3、4、5、6、7和8小時后，用酶標(biāo)儀測96孔板中各孔的在630nM波長處的吸光值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)和菌液在630nM處的吸光度為縱坐標(biāo)做生長曲線。同時測定抗生素藥物萬古霉素(濃度為40Pg/ml，8Pg/ml和2Mg/ml)、青霉素鈉(40000Pg/ml，4000^g/ral，400Pg/ni1和參g/ml)和頭孢噻肟(400Pg/ml，40Pg/ml，扭g/ml和0.4^g/ml)對耐甲氧西林金黃葡萄球菌P1386的生長曲線。ABP-W1多肽對臨床分離的耐甲氧西林的金黃葡萄球菌P1386具有高效的抗菌效果，2pg/ml的ABP-W1多肽可以完全抑制耐甲氧西林的金黃葡萄球菌P1386的正常生長。實(shí)施例6:抗菌多肽ABP-W1藥物對敏感葡萄球菌的生長抑制曲線多肽ABP-Wl在制備治療或預(yù)防敏感葡萄球菌的藥物中應(yīng)用過程是將臨床分離的敏感金黃葡萄球菌P969培養(yǎng)到0D=0.8時，稀釋400倍后取8(^1加入到96孔板中，然后分別向多孔加入20fil經(jīng)等比稀釋的ABP-W1，達(dá)到終濃度為40Pg/ml，8Pg/ml，2l^g/ml，0.4^g/ml。陰性對照孔加入20nl的1%的1%BSA;37。C培養(yǎng)搖床培養(yǎng)，分別在3、4、5、6、7和8小時后，用酶標(biāo)儀測96孔板中各孔的在630nM波長處的吸光值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)和菌液在630nM處的吸光度為縱坐標(biāo)做生長曲線。同時測定抗生素藥物萬古霉素(濃度為40[xg/ml，8Pg/ml、2^g/ml和0.4Pg/ml)、青霉素鈉(400Pg/ral，40^g/ml，4^g/ml和0.4Pg/ml)和頭孢噻肟(柳g/ml，脅g/ml,2Pg/ml和0.扭g/ml)對臨床分離的敏感金黃葡萄球菌P969的生長曲線。ABP-W1多肽對臨床分離的敏感金黃葡萄球菌P969具有高效的抗菌效果，2嗎/ml的ABP-W1多肽可以完全抑制敏感金黃葡萄球菌P969的正常生長。實(shí)施例7:ABP-Wl藥物對耐青霉素葡萄球菌引起的敗血癥小鼠的治療試驗(yàn)多肽ABP-Wl在制備治療或預(yù)防對耐青霉素葡萄球菌引起的敗血癥的藥物中應(yīng)用過程是將臨床分離的耐青霉素葡萄球菌P1383培養(yǎng)到0D6。。=0.8時，離心收集菌體，將耐青霉素葡萄球菌P1383以107ml的濃度配制在O.3%的胃粘素中。挑選30只18-20g的小白鼠，按照6只/組隨機(jī)分組，共5組。一組腹腔注射0.5ml的0.3%胃粘素做對照，剩下四組共25只小鼠腹腔注射0.5ml的107/ml耐青霉素葡萄球菌P1383。1小時后，對四組小白鼠分別用生理鹽水、ABP-Wl(10mg/kg)、萬古霉素(70mg/kg)和青霉素鈉(70mg/kg)藥物注射腹腔，進(jìn)行藥物治療，連續(xù)室溫飼養(yǎng)小鼠7天，記錄各組小鼠的死亡數(shù)目。0.3%胃粘素做對照組小鼠全部存活。生理鹽水注射敗血癥小鼠對照組在第一天全部死亡。ABP-Wl藥物和萬古霉素藥物治療敗血癥小鼠試驗(yàn)組全部存活。而青霉素鈉治療敗血癥小鼠試驗(yàn)組在第一天有3只小鼠死亡，第二天有2只小鼠死亡，第三天有1只小鼠死亡，該組6只小鼠全部死亡。治療試驗(yàn)結(jié)果表明，在動物水平上，10mg/kg的ABP-Wl藥物劑量可以使耐青霉素葡萄球菌引起的敗血癥小鼠恢復(fù)正常，其治療效果與70mg/kg的萬古霉素藥物相當(dāng)。試驗(yàn)結(jié)果請見下表表1為抗菌多肽ABP-W1對耐青霉素葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌和敏感葡萄球菌的最小抑菌濃度以及與萬古霉素、青霉素鈉和頭孢噻肟的最小抑菌濃度的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2為ABP-W1藥物對耐青霉素葡萄球菌P1383引起的敗血癥小鼠的治療試<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>權(quán)利要求1、一種分離的東亞鉗蝎抗菌多肽，其序列為SEQIDNO2所示的氨基酸序列。2、多肽ABP-W1在制備治療或預(yù)防耐青霉素金黃葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用。3、多肽ABP-W1在制備治療或預(yù)防耐青霉素表皮葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用。4、多肽ABP-W1在制備治療或預(yù)防耐甲氧西林金黃葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用。5、多肽ABP-W1在制備治療或預(yù)防耐甲氧西林人葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用。6、多肽ABP-W1在制備治療或預(yù)防耐甲氧西林溶血性葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用。7、多肽ABP-W1在制備治療或預(yù)防對耐青霉素葡萄球菌引起的敗血癥的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗耐藥菌的多肽及用途，通過化學(xué)合成的方法，獲得蝎毒抗菌多肽，然后采用96孔板培養(yǎng)法測定了該蝎毒抗菌多肽對耐青霉素金黃葡萄球菌、耐青霉素表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黃葡萄球菌、耐甲氧西林人葡萄球菌和耐甲氧西林溶血性葡萄球菌的最小抑制濃度和生長抑制曲線，結(jié)果表明該抗菌多肽對耐青霉素葡萄球菌和耐甲氧西林葡萄球菌具有高效的抗菌功能，其活性與萬古霉素相當(dāng)。多肽ABP-W1在制備治療或預(yù)防由耐青霉素葡萄球菌或耐甲氧西林葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的藥物中的應(yīng)用，效果顯著。本發(fā)明的抗菌多肽對耐青霉素葡萄球菌和耐甲氧西林葡萄球菌的抗菌活性高，殺菌快，方法簡便，可作為抗菌藥物開發(fā)。文檔編號C07K14/435GK101450966SQ20071016852公開日2009年6月10日申請日期2007年11月29日優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日發(fā)明者吳英亮,潮戴,曹志賤,李文鑫,馬一保申請人:唐克煌