專利名稱：Fp－生長素釋質(zhì)的制作方法
生長激素，由垂體分泌，刺激所有能夠生長的身體組織生長。另外，已知生長激素對身體代謝過程具有下列基本作用(1)提高所有體細胞中蛋白質(zhì)合成速率；(2)降低體細胞中碳水化合物的利用速率；(3)提高游離脂肪酸的動員和對于能量而言脂肪酸的利用。生長激素分泌的缺乏可以導(dǎo)致各種醫(yī)學(xué)病癥，如侏儒癥。
在本領(lǐng)域已知測定作為生長激素促分泌素的化合物活性的方法。例如，Smith等，Science，260，1640-1643(1993)(參見其中圖2正文)描述了離體測定，但該測定需要使用細胞培養(yǎng)物并且未提供競爭性結(jié)合活性的指征。因此，期望開發(fā)一種可以用于鑒定和表征在生長激素促分泌素的活性中起作用的細胞受體的非放射性標記的配體。還期望可獲得用于檢驗化合物生長激素促分泌素活性的測定的非放射性標記的配體。
這些研究通常需要高比活的放射性配體。先前嘗試使用來源于GHRP-6的[T]-標記或[125I]-標記的肽配體來開發(fā)結(jié)合測定獲得有限的成功。參見R.F.Walker，等Neuropharmacol.989，28，1139和C.Y.Bowers等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1991，178，31。通常，這些肽配體的結(jié)合是低親和力的和過高容量的。此外，結(jié)合親和力與肽的生長激素分泌活性不相關(guān)。結(jié)合與生長激素分泌活性缺乏相關(guān)性很可能是放射性配體相對低的比活(在[T]GHRP-6的情形中)和非特異性結(jié)合性能的結(jié)果。
本發(fā)明擬解決的問題是提供一種可以用于高通量篩選的熒光標記的生長素釋質(zhì)(ghrelin)的類似物。
本發(fā)明涉及下式的標記的生長激素促分泌素R1-Cys-F其中R1是來源于生長素釋質(zhì)多肽序列的肽序列(Seq ID No.1)，并且F是熒光染料。在一個優(yōu)選實施方案中，R1是Seq ID No.2。在另一優(yōu)選實施方案中，R1被辛?；?。在另一優(yōu)選實施方案中，R1是N-辛?；?。在更優(yōu)選的實施方案中，R1是1Gly-Ser-Dapa(N-辛酰基)-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser。N-辛酰化提高生長素釋質(zhì)對酯酶活性的穩(wěn)定性。在還更優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)選自德克薩斯紅，四甲基羅丹明，MR121。(“New fluorescent dyes in thered region for biodiagnostics”M.Sauer等1995 J.Fluoresc.第5卷，第247-261頁，或BODIPY-FL 4，4-二氟-5，7-二甲基-4-bora-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸)。在最優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)為MR121。
以上所述的標記的生長激素促分泌素可以用于鑒定可以與生長激素促分泌素受體結(jié)合的化合物。所述標記的生長激素促分泌素還可以用于鑒定作為生長激素促分泌素受體的細胞受體。
本發(fā)明還提供合成標記的生長素釋質(zhì)的方法，其包含以下步驟a)將Cys與C-末端氨基酸偶聯(lián)；和b)將含硫羥的生長素釋質(zhì)與熒光染料反應(yīng)。優(yōu)選地，所述熒光染料選自德克薩斯紅，四甲基羅丹明，MR121。(“Newfluorescent dyes in the red region for biodiagnostics”M.Sauer等1995 J.Fluoresc.第5卷，第247-261頁，或BODIPY-FL(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸)。
本發(fā)明還涉及鑒定可以與生長激素促分泌素的受體結(jié)合的化合物的方法，其包含在上述標記的生長激素促分泌素的存在下將所述化合物與表達生長激素促分泌素受體的宿主或來自該宿主的膜制劑接觸，和通過測量結(jié)合的上述標記生長激素促分泌素的標記的熒光，監(jiān)視該化合物是否影響上述標記的生長激素促分泌素與生長激素促分泌素的受體的結(jié)合。
宿主可以是組織樣品，原代細胞或培養(yǎng)的細胞，其天然表達生長激素促分泌素受體或用生長激素促分泌素受體瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細胞的方法在本領(lǐng)域公知(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA)。
優(yōu)選地，所述方法是高通量篩選方法。上述方法對于所用測定緩沖液的pH是敏感的。pH偏差0.2導(dǎo)致50％的結(jié)合喪失。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法中使用的測定緩沖液具有7.2的pH。本發(fā)明的肽傾向于吸附于表面。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，塑料器皿包含一個非結(jié)合表面或用酪蛋白溶液封閉。本文所用的術(shù)語“塑料器皿”是指用于測定的平板，以及任何類型的用于制備包含本發(fā)明肽的溶液的管。優(yōu)選地，所述酪蛋白溶液包含1％酪蛋白。更優(yōu)選地，進行過夜封閉。在最優(yōu)選的實施方案中，在使用前用緩沖液洗滌封閉的平板。
本發(fā)明還提供鑒定作為生長激素促分泌素受體的細胞受體的方法，其包含將懷疑表達生長激素促分泌素受體的宿主與上述標記的生長激素促分泌素接觸，和測定結(jié)合是否已經(jīng)發(fā)生。
此外，本發(fā)明涉及鑒定作為生長激素促分泌素的化合物活性的方法，其包含在上述標記的生長激素促分泌素的存在下，將懷疑具有生長激素促分泌素活性的化合物與表達生長激素促分泌素受體的宿主接觸，和監(jiān)視懷疑具有生長激素促分泌素活性的化合物是否影響上述標記的生長激素促分泌素與生長激素促分泌素受體的結(jié)合。
本發(fā)明還提供通過上述方法鑒定的化合物或其藥用鹽。另外，本發(fā)明提供包含上述化合物和藥用載體的藥物組合物。
本文所用的短語“藥用”是指那些化合物，物質(zhì)，組合物，和/或劑型，其在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適用于與人類和動物組織接觸而無過度的毒性，刺激，變態(tài)反應(yīng)，或其它問題或并發(fā)癥，與合理的利益/風(fēng)險比相當(dāng)。
如本文所用，“藥用鹽”是指鑒定的試劑的衍生物，其中通過制備其酸式或堿式鹽來修飾母體試劑。藥用鹽的實例包括但不限于堿性殘基如胺的無機酸或有機酸式鹽；酸性殘基如羧酸的堿式或有機鹽；等等。藥用鹽包括例如由無毒的無機或有機酸形成的母體化合物的常規(guī)無毒鹽或季銨鹽。例如，這些常規(guī)的無毒鹽包括衍生于無機酸的那些和由有機酸制備的鹽，所述無機酸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，氨基磺酸，磷酸，硝酸等，所述有機酸如乙酸，丙酸，琥珀酸，羥基乙酸，硬脂酸，乳酸，蘋果酸，酒石酸，檸檬酸，抗壞血酸，棕櫚酸，馬來酸，羥基馬來酸，苯乙酸，谷氨酸，苯甲酸，水楊酸，對氨基苯磺酸，2-乙酸基苯甲酸，富馬酸，苯磺酸，甲苯磺酸，甲磺酸，乙二磺酸，草酸，羥乙磺酸等。
本發(fā)明的藥用鹽可以通過常規(guī)化學(xué)方法由含有堿性或酸性部分的母體試劑合成。通常，這些鹽可以通過在水或有機溶劑中，或在兩者的混合物中，將這些化合物的游離酸或堿形式與化學(xué)計算量的適當(dāng)堿或酸反應(yīng)來制備；通常優(yōu)選非水性介質(zhì)如醚，乙酸乙酯，乙醇，異丙醇，或乙腈。適當(dāng)?shù)柠}的列表在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，MackPublishing Company，Easton，PA，1985，第1418頁中發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。
可以修飾通過本發(fā)明方法鑒定的試劑以實現(xiàn)(i)改變的作用位點，活性譜，和/或(ii)改善的效力，和/或(iii)減小的毒性(提高的治療指數(shù))，和/或(iv)減小的副作用，和/或(v)改進的作用起始，作用持續(xù)期間，和/或(vi)改進的動力學(xué)參數(shù)(再吸收，分布，代謝和排泄)，和/或(vii)改進的生理化學(xué)參數(shù)(溶解度，吸濕性，顏色，味道，氣味，穩(wěn)定性，狀態(tài))，和/或(viii)改善的全體特異性，器官/組織特異性，和/或(ix)優(yōu)化的施用形式和途徑，所述修飾可以通過以下各項進行(i)酯化羧基，或(ii)用碳氫酸酯化羥基，或(iii)將羥基酯化成例如磷酸酯，焦磷酸酯或硫酸酯或半琥珀酸酯，或(iv)形成藥用鹽，或(v)形成藥用復(fù)合物，或(vi)合成藥物活性聚合物，或(vii)引入親水部分，或(viii)引入/交換芳基(aromate)或側(cè)鏈上的取代基，改變?nèi)〈Ｊ?，?ix)通過引入等排或生物等排部分修飾，或(x)合成同系物，或(xi)引入支化側(cè)鏈，或(xii)將烷基取代基轉(zhuǎn)化為環(huán)狀類似物，或(xiii)將羥基衍生為縮酮類(ketales)，縮醛類(acetales)，或(xiv)N-乙?；癁轷０奉?，苯基氨基甲酸酯類，或(xv)合成曼尼希堿類，亞胺類，或(xvi)將酮或醛轉(zhuǎn)化為席夫堿類，肟類，縮醛類，縮酮類，烯醇酯類，噁唑烷類，噻唑烷(thiozolidine)或其組合；和(b)用芳香或調(diào)味組合物或產(chǎn)品可接受的藥用載體或載體/稀釋劑配制所述修飾的產(chǎn)物。
可以使用任何常規(guī)載體材料。載體材料可以是適于eteral，經(jīng)皮或腸胃外給藥的有機或無機物。適當(dāng)?shù)妮d體包括水，明膠，阿拉伯膠，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，滑石，植物油，聚(亞烷基)二醇，礦脂等。另外，藥物制劑可以包含其它藥物活性劑。按照藥物配制的常例可以加入另外的添加劑如調(diào)味劑，穩(wěn)定劑，乳化劑，緩沖劑等。
本發(fā)明還涉及基本上如上所述，特別是參考下列實施例的標記的配體，化合物，方法，工藝，應(yīng)用和組合物。


圖1HTS測定板的結(jié)構(gòu)圖2來自Zeiss-系統(tǒng)的競爭曲線，HTS條件(condition)。A)生長素釋質(zhì)(1-19)MR121與H6935的競爭；b)生長素釋質(zhì)(1-19)MR121與hexarelin的競爭。
圖3熒光類似物的親和力，在125I-生長素釋質(zhì)競爭分析中測定。A)生長素釋質(zhì)(1-19)MR121；b)生長素釋質(zhì)(1-19)TMR；c)生長素釋質(zhì)(1-19)BoF1(BIODIPY-FL)；d)生長素釋質(zhì)(1-19)德克薩斯紅。
圖4熒光類似物的偏振，按照實施例2.2.1和2.2.2中的方案測定。
紅色(較暗，左手條形)生長素釋質(zhì)(1-19)MR121，藍色(較淺，右手條形)生長素釋質(zhì)(1-19-N-oct)MR121。
1)總的結(jié)合熒光配體的熒光偏振(在GHSR-1a膜的存在下)；2)游離配體的熒光偏振(在GHSR-1a膜和過量競爭者的存在下)；3)在緩沖劑中熒光配體的熒光偏振。
實施例實施例1標記肽的合成實施例1.1合成1Gly-Ser-Ser(辛酰基)-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser-Cys-NH2按照在W.C.Chan和P.D.White編輯的“Fmoc固相肽合成A practicalapproach”(牛津大學(xué)出版社2000)第41-74頁中描述的方法，從Tenta GelS RAM樹脂(0.25mmol/g(Rapp Polymere GmbH，Tübingen，德國)開始，在PioneerTM肽合成系統(tǒng)上進行連續(xù)流動固相合成。將堿不穩(wěn)定的Fmoc基團用于α-氨基保護。側(cè)鏈用下列保護基保護-Asn(Trt)，Glu(OtBu)，Ser(tBu)，His(Trt)，Gln(Trt)，His(Trt)，Arg(Pbf)，Lys(Boc)，Cys(Trt)。用等量的O-(1，2-二氫-2-氧代吡啶-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TPTU)和N，N-二異丙基乙胺(Hünig’s堿)活化Fmoc-氨基酸(4當(dāng)量)。在DMF中用20％哌啶實現(xiàn)Fmoc保護。在將殘基4Phe結(jié)合于靶序列以后中斷自動合成。使用肽合成儀SP650(Labortec AG)半手動地繼續(xù)肽合成。將側(cè)鏈未保護的Fmoc-3Ser-OH(0.65g，2mmol)，TPTU(0.59g，2mmol)，Hünig’s堿(1.03ml)加入肽樹脂并在DMF溶劑(茚三酮陰性)中繼續(xù)偶聯(lián)1小時。
使用辛酸(2.0ml，12mmol)，N，N’-二異丙基碳二亞胺，(1.9ml，12mmol)N，N’-二甲氨基吡啶(18mg，0.15mmol)在N-甲基吡咯烷溶劑中完成側(cè)鏈羥基的辛酰化。在4小時后濾去反應(yīng)混合物，使用標準肽合成方案(如上)繼續(xù)合成。用95％TFA，2.5％H2O，2.5％EDT，2.5％三異丙基硅烷的混合物(100ml)處理1Gly-Ser(tBu)-Ser(辛?；?-Phe-5Leu-Ser(tBu)-Pro-Glu(OtBu)-His(Trt)-10Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Gln(Trt)-Gln(Trt)-15Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-NH2Tenta Gel S-樹脂(2.0g)5小時。濃縮反應(yīng)混合物并倒入二乙醚，通過過濾收集沉淀并從水中凍干。通過制備RP-HPLC純化粗制肽(0.80g)。獲得1Gly-Ser-Ser(辛酰基)-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser-Cys-NH2(0.18g，離子噴霧MS分析(M+2H)2+/2＝1165.4，(M+3H)3+/3＝777.2)。
實施例1.1b1Gly-Ser-Dapa(N-辛?；?-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser-Cys-NH2的合成(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-辛?；被?丙酸；Fmoc-L-Dapa(N-辛?；?-OH向DMF(20ml)中含有辛酸(1.54ml，10mmol)，TPTU(2.8g，9.5mmol)和Hünig’s堿(3.4ml，20mmol)的預(yù)先活化的混合物加入Fmoc-L-Dapa-OHNeosysytem FA04002 8(3.3g，10mmol)在DMF(10ml)中的溶液。攪拌反應(yīng)混合物1小時，在減壓下濃縮，溶解在乙酸乙酯中并用5％/10％KHSO4/K2SO4，鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾并濃縮。從乙酸乙酯/己烷中結(jié)晶3.7g，82％；MS＝451.4(MH)-。
如上所述在PioneerTM肽合成系統(tǒng)上，從Tentagel S-NH2樹脂(0.55mmol)開始進行摻入Fmoc-L-Dapa(N-辛酰基)-OH的肽合成，產(chǎn)生純化的肽1Gly-Ser-Dapa(N-辛酰基)-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser-Cys-NH2135mg；離子噴霧MS(M+2H)2+/2＝1164.8，(M+3H)3+/3＝776.8)。
將肽與熒光團偶聯(lián)實施例1.21Gly-Ser-Ser(辛?；?-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser-Cys(TxR)-NH2；將以上含有硫羥的肽(1.3mg)溶解在9∶1 DMSO∶50mM磷酸鹽緩沖液pH6中至2.5mM的終濃度。加入1.2當(dāng)量的TxR(德克薩斯紅)-馬來酰亞胺(在DMSO中新鮮制備的溶液，30mM)并將混合物置于室溫下反應(yīng)10分鐘。通過RP-HPLC直接純化反應(yīng)混合物0.17mg。MS分析計算的單種同位素質(zhì)量C136H198N36O39S3＝3055.38；實測的單種同位素質(zhì)量3055.35。
實施例1.31Gly-Ser-Ser(辛?；?-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser-Cys(TMR)-NH2；類似于實施例1.2制備TMR(四甲基羅丹明)衍生的肽從1.7mg肽原料分離0.44mg標記的肽。
MS分析計算的單種同位素質(zhì)量C127H185N35O36S＝2808.34；實測的單種同位素質(zhì)量2808.40實施例1.41Gly-Ser-Ser(辛?；?-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser-Cys(MR121)-NH2；類似于實施例1.2制備MR121*衍生的肽從1.5mg肽原料分離0.37mg標記的肽。MS分析計算的單種同位素質(zhì)量C129H196N37O35S＝2855.44；實測的單種同位素質(zhì)量2855.38實施例1.51Gly-Ser-Ser(辛?；?-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser-Cys(BODIPY-FL)-NH2；類似于實施例1.2制備BODIPY-FL(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸)衍生的肽從0.7mg原料分離0.20mg標記的肽。MS分析計算的單種同位素質(zhì)量C119H183BF2N36O34S＝2742.4；實測的單種同位素質(zhì)量2742.4。
實施例1.61Gly-Ser-Dapa(N-辛?；?-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser-Cys(MR121)-NH2；類似于實施例1.2制備MR121*衍生的肽從0.7mg肽原料分離0.17mg標記的肽。MS分析計算的單種同位素質(zhì)量C129H197N36O35S＝2854.46；實測的單種同位素質(zhì)量2854.49。
*MR-121是噁嗪熒光染料。[參見文獻“New fluorescent dyes in thered region for biodiagnostics”M.Sauer等1995 J.Fluoresc.第5卷，第247-261頁]實施例2.結(jié)合測定實施例2.1膜制備在懸浮液中培養(yǎng)人胚腎HEK 293(EBNA)細胞并按照先前所述方法(Schlaeger和Christensen，Cytotechnology，30，71-83，1999)轉(zhuǎn)染。將細胞在500rpm下離心10分鐘，用PBS-0.7mM EDTA/(4℃)洗滌一次，并以2ml/g細胞重懸浮在PBS-EDTA-PI(含有蛋白酶抑制劑混合物)中。用Ultra Turaxlevel green 3×15”，間隔30”在冰上破裂細胞。為了去除碎片，將懸浮液在Sorvall SS34轉(zhuǎn)子中在2000rpm下離心20分鐘。收集上清液并在20’000rpm下離心40分鐘。將沉淀重懸浮在PBS-EDTA中。使用T-MK 0677，通過飽和結(jié)合測定證實受體密度為4.9pmol/mg蛋白質(zhì)。
實施例2.2FP-測定實施例2.2.1進行測定將含有GHSR-1a的細胞膜稀釋于FP-緩沖液25mM Hepes，5mMMgCl2，1mM CaCl2，4％PEG，0.1％BSA(級分V)至終體積為0.5-1ml，通過0.4mm注射器并在保持在冰上同時超聲處理4次，20個脈沖。制備10nMMR121-標記的生長素釋質(zhì)(示蹤物)溶液和FP緩沖液中競爭物的20×濃縮液。為了測定受體結(jié)合的示蹤物的偏振，制備三個180μl的樣品總的結(jié)合膜+示蹤物，游離配體膜+示蹤物+競爭物，熒光背景膜+緩沖液。在混合后立即將3×50μl每個樣品轉(zhuǎn)移至測定平板。
實施例2.2.2對于FP-生長素釋質(zhì)競爭結(jié)合測定的HTS方案圖1.顯示用于高通量篩選的384孔平板的可能布置。
對于第一輪篩選，使用119個樣品板和1個DMSO板(膜p20F1+p22F1)。下列是以MR121為熒光團的HTS方案的代表性的非限制性的實例。關(guān)于測定，使用具有非結(jié)合表面的Costar 384孔UV板。使用下列測定緩沖液25mM Hepes pH7.2，5mM MgCl2，1mM CaCl2，4％聚乙二醇，并每周新鮮加入0.1％BSA(級分V)。如下提供受體如實施例2.1所述分離膜。如通過125I-生長素釋質(zhì)飽和結(jié)合所測定，最終測定濃度為1.4nM GHSR-1a。膜貯液(stock)的典型值為Bmax＝6fmol/μg；蛋白質(zhì)濃度＝50μg/μl。
為了避免沉淀，需要將膜擠過針(3x/0.4mm)并用“Branson超聲儀250”超聲處理，該超聲儀設(shè)定強度水平為3-4，4×20個脈沖，相隔30秒間歇。在超聲處理期間將膜保持在冰上。將膜稀釋至受體終濃度為1.4nM。
從1μM DMSO貯液中將示蹤物生長素釋質(zhì)(1-19)[K19MR12]稀釋在緩沖液中。最終測定濃度為0.5nM。因為肽傾向于吸附于表面，用于稀釋的肽溶液的塑料包含非結(jié)合表面或用1％酪蛋白溶液封閉過夜，然后在使用前用緩沖液洗滌。
下列步驟用于高通量篩選1)將30μl 1.33x膜溶液加入測定平板的所有孔中。
2)將4.4μl緩沖液轉(zhuǎn)移至“FPBLK”/“100％對照”孔和從貯存平板至測定平板將4.4μl參比化合物溶液轉(zhuǎn)移至“STD”和“0％對照”孔。
3)將10μl含有0％DMSO的水加入含有1μl 2mM化合物的化合物貯存平板的3-24列(Endconc.20μM)。
4)將貯存平板的內(nèi)含物混合。
5)將4.4μl稀釋的化合物從貯存平板轉(zhuǎn)移至測定平板。
6)將測定平板的含量混合五次，然后在24℃下溫育30分鐘。
7)除了孔A1至D2(圖1中標記“FPBLK”的孔)以外，將5.6μl 7.143x示蹤物溶液加入測定平板，向其加入5.6μl緩沖液。
8)將測定平板的內(nèi)容物混合五次。
9)將每孔中的30μl溶液從測定平板轉(zhuǎn)移至讀出平板(Coming UV非結(jié)合表面)。
10)將讀出平板在RT下溫育10分鐘。
11)以平行(‖)和交叉(⊥)偏振的設(shè)置，使用Zeiss平板∷影像微量滴定板讀數(shù)器，在650-695nm下從讀出平板中讀出MR121熒光(5 s，聚焦至底部1mm，xy掃描0.5mm)。
序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司<120>熒光標記的生長素釋質(zhì)<130>22229<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>117<212>PRT<213>人<220>
<221>生長素釋質(zhì)前體<222>(1)..(117)<220>
<221>生長素釋質(zhì)<222>(24)..(117)<223>成熟蛋白質(zhì)<220>
<221>生長素釋質(zhì)<222>(26)..(26)<223>辛酰基衍生物殘基<400>1Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln50 55 60Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln85 90 95Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu100 105 110
Ala Pro Ala Asp Lys115<210>2<211>18<212>PRT<213>人<220>
<221>生長素釋質(zhì)(1-19)<222>(1)..(18)<220>
<221>生長素釋質(zhì)(1-19)<222>(3)..(3)<223>辛?；苌?amp;lt;400>2Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys1 5 10 15Glu Ser
權(quán)利要求
1.一種下式的標記的生長素釋質(zhì)R1-Cys-F其中R1是來源于生長素釋質(zhì)多肽序列的肽序列，并且F是熒光染料。
2.權(quán)利要求1的標記的生長素釋質(zhì)，其中R1為Seq ID No.2。
3.權(quán)利要求1的標記的生長素釋質(zhì)，其中R1被辛酰化。
4.權(quán)利要求1的標記的生長素釋質(zhì)，其中R1被N-辛酰化。
5.權(quán)利要求1的標記的生長素釋質(zhì)，其中R1為1Gly-Ser-Ser(辛酰基)-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser。
6.權(quán)利要求1的標記的生長素釋質(zhì)，其中R1為1Gly-Ser-Dapa(N-辛?；?-Phe-5Leu-Ser-Pro-Glu-His-10Gln-Arg-Val-Gln-Gln-15Arg-Lys-Glu-Ser。
7.權(quán)利要求1-6的標記的生長素釋質(zhì)，其中F選自TxR，TMR，MR121或BODIPY-FL。
8.權(quán)利要求1-7中任何一項的標記的生長素釋質(zhì)在鑒定化合物中的應(yīng)用，所述化合物可以與生長激素促分泌素的受體結(jié)合。
9.權(quán)利要求1-7中任何一項的標記的生長素釋質(zhì)在鑒定作為生長激素促分泌素受體的細胞受體中的應(yīng)用。
10.一種合成標記的生長素釋質(zhì)的方法，其包含以下步驟a)將Cys與C-末端氨基酸偶聯(lián)；和b)將含硫羥的生長素釋質(zhì)與熒光染料反應(yīng)。
11.一種鑒定作為生長激素促分泌素受體的細胞受體的方法，其包含將懷疑表達生長激素促分泌素受體的宿主與權(quán)利要求1-7中任何一項的標記的生長激素促分泌素接觸，和測定結(jié)合是否已經(jīng)發(fā)生。
12.一種鑒定可以與生長激素促分泌素的受體結(jié)合的化合物的方法，其包含以下步驟a)在測定緩沖液中在權(quán)利要求1-7中任何一項的標記的生長激素促分泌素的存在下，將所述化合物與從表達生長激素促分泌素受體的宿主分離的膜接觸；b)洗滌所述膜以去除未結(jié)合的標記的生長激素促分泌素；和c)通過測量所述膜的熒光，監(jiān)測所述化合物是否影響權(quán)利要求1-7中任何一項的標記的生長激素促分泌素與生長激素促分泌素的受體的結(jié)合。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述方法是一種高通量篩選方法。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述測定緩沖液具有7.2的pH值。
15.一種鑒定作為生長激素促分泌素的化合物活性的方法，其包含在權(quán)利要求1-7中任何一項的標記的生長激素促分泌素的存在下，將懷疑具有生長激素促分泌素活性的化合物與表達生長激素促分泌素受體的宿主接觸，和監(jiān)測懷疑具有生長激素促分泌素活性的化合物是否影響權(quán)利要求1-7中任何一項的標記的生長激素促分泌素與生長激素促分泌素受體的結(jié)合。
16.通過權(quán)利要求12-15中任何一項的方法鑒定的化合物，或其藥用鹽。
17.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求16的化合物和藥用載體。
18.基本上如上所述的，特別參考前述實施例的標記的配體，化合物，方法，工藝，應(yīng)用和組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及熒光標記的生長激素促分泌素，其可以用于特別是通過高通量篩選鑒定能夠與生長激素促分泌素受體結(jié)合的化合物。
文檔編號C07K14/60GK1637416SQ20041008528
公開日2005年7月13日 申請日期2004年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者蒂洛·恩德勒, 馬丁·格拉夫, 科妮莉亞·赫特爾, 桑納何·詹森·索夫曼, 埃里奇·阿爾吉斯·基塔斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司