專利名稱：新用途或環(huán)木脂體以及新環(huán)木脂體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新化合物，以及新的及已知的化合物抑制胰島素樣生長因子-1受體IGF-1R，用于治療IGF-1R依賴性疾病尤其是癌癥的用途。
背景技術(shù)：
胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)在惡性細(xì)胞的增生、對抗細(xì)胞凋亡及其轉(zhuǎn)變中起著重要作用。此外，IGF-1R對保持腫瘤細(xì)胞的惡性表型也非常重要，并參與腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物耐藥性的產(chǎn)生。與之相反，IGF-1R對正常細(xì)胞的生長似乎并非絕對需要。
IGF-1R由負(fù)責(zé)配體結(jié)合的兩個同樣的細(xì)胞外α-亞基，以及包含跨膜結(jié)構(gòu)域的β-亞基及細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成。配體-受體的相互作用導(dǎo)致酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基的磷酸化，其跨越β-亞基的973～1229位氨基酸。磷酸化的主要位點為在第1131、1135及1136位的簇聚酪氨酸(LeRoith，D.，等，Endocr Rev 1995 April；16(2)，143-63)。自身磷酸化后，受體激酶磷酸化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，如胰島素受體底物及Shc，該蛋白質(zhì)又分別激活磷脂酰肌醇-3激酶及具促分裂原活化蛋白激酶的信號通路。
基于IGF-1R在惡性細(xì)胞中的關(guān)鍵性作用，其作為癌癥治療的靶標(biāo)正日益明確(Baserga，R.，等，Endocrine Vol.7，no.1，99-102，August1997)。一種阻滯IGF-1R活性的策略是誘導(dǎo)IGF-1R酪氨酸激酶的選擇性抑制。然而，迄今為止仍無可用的選擇性IGF-1R抑制劑。
包括環(huán)木脂體鬼臼毒素藥物的使用已逾百年，其抗癌活性尤為引人注目。然而，鬼臼毒素的副作用阻礙了其用作抗癌藥物。鬼臼毒素的細(xì)胞毒性機(jī)制歸因于其與β-微管蛋白的結(jié)合引起微管聚集的抑制以及細(xì)胞有絲分裂的停頓。在無細(xì)胞體系中，鬼臼毒素對微管的作用需要μM濃度。已經(jīng)直到鬼臼毒素內(nèi)酯環(huán)的反式構(gòu)型是其與β-微管蛋白結(jié)合所必需的。與此一致的是，在內(nèi)酯環(huán)上具有順式構(gòu)型的立體異構(gòu)體苦鬼臼脂素(picropodophyllin)對微管的親和力下降50倍，在鼠中的LD50高出35倍。由于苦鬼臼脂素對微管的低親和力，該化合物一直沒有引起注意。在過去的數(shù)十年間，對鬼臼毒素衍生物的興趣集中在依托泊苷，其為4′-去甲基-表鬼臼毒素的亞乙基葡糖苷衍生物。依托泊苷為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑，對微管無活性，當(dāng)前用于癌癥的治療。該類環(huán)木脂體中的4′-羥基基而非4′-甲氧基，是其抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II所絕對需要的。
背景技術(shù)：
Parrizas M等(Endocrinology 1997，Vol.138，No.4，1427-1433)從事了許多合成的酪氨酸激酶抑制劑的研究，該類抑制劑為酪氨酸磷酸化抑制劑。IGF-1R為酪氨酸激酶受體家族的成員，該家族包括胰島素受體、表皮生長因子受體(EGF)、神經(jīng)生長因子受體(NGF)及血小板衍生生長因子受體(PDGF)。由于它們高度同源，所有對IGF-1R有活性的酪氨酸磷酸化抑制劑對胰島素受體有交叉活性，盡管其中有兩種對IGF-1R表現(xiàn)出中度的選擇性。因而該結(jié)果暗示設(shè)計并合成能夠區(qū)分這兩種受體的小分子是可能的。
Blum，G等討論了IGF-1受體激酶的底物競爭抑制劑，Biochemistry2000，39，15705-15712。已經(jīng)報道了許多為分離的IGF-1R激酶抑制劑的先導(dǎo)化合物。尋找這些化合物借助了胰島素受體激酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)知識，該結(jié)構(gòu)與IGF-1R激酶結(jié)構(gòu)有84％同源性。已發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的抑制劑為酪氨酸磷酸化抑制劑AG538，其IC50為400nM。然而，該抑制劑也阻滯胰島素受體激酶。
Kanter-Lewensohn，L.，等Molcular and Cell Endocrinology 165(2000)，131-137中考察了它莫西芬(TAM)對黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性是否依賴于干擾胰島素樣生長因子-1受體的表達(dá)或功能。研究發(fā)現(xiàn)，盡管TAM并不能強(qiáng)烈影響IGF-1的結(jié)合以及細(xì)胞表面IGF-1R的表達(dá)，但15μM的TAM有效地阻滯IGF-1R的β-亞基的酪氨酸磷酸化。
此前從未開展鬼臼毒素與IGF-1R之間的相關(guān)研究。在J.L.HartWell等的鬼臼根化學(xué)(Chemistry of Podophyllum)中，F(xiàn)ortschritte der Chemieorganischer Naturstoffe 15，1958，83-166，概述了鬼臼毒素及其不同衍生物，該衍生物來源于兩種商業(yè)化的植物足葉草(Podophyllum peltatum)及桃兒七(Podophyllum emodi)。正如所說，觀察到的鬼臼毒素細(xì)胞毒性作用歸因于其與微管蛋白結(jié)合阻滯了細(xì)胞的有絲分裂。據(jù)描述去氧鬼臼毒素對細(xì)胞具有同樣的效果，這就解釋了這兩種化合物及其對應(yīng)的4′-去甲基類似物可用于治療銀屑病(WO86/04062)的原因。然而，鬼臼毒素的大鼠LD50較低(14mg/kg)，而去氧衍生物的LD50卻奇怪地高出15倍。其它具有高大鼠LD50的鬼臼毒素衍生物，如乙酰鬼臼毒素(185mg/kg)及表鬼臼毒素(＞200mg/kg)都認(rèn)為基本上沒有生物活性(Seidlova-Masinova V.，等J Nat Cancer Inst，18，359-371，1957)。
Batra，J等Biochemical Pharmacology，Vol.35，No.22，4013-4018，1986評價了與鬼臼毒素結(jié)構(gòu)相似的許多芐基-苯并間二氧雜環(huán)戊烯的嗎啉代衍生物的構(gòu)效關(guān)系，。測試了這些化合物抑制微管聚合的能力，然而與鬼臼毒素結(jié)構(gòu)最相近的化合物在該系列中活性最低。
2，4-二叔丁基苯酚及1，3-苯并間二氧雜環(huán)戊烯的芐基及肉桂基衍生物為已知的昆蟲化學(xué)不育劑(chemosterilants)(Jurd，L.，等，J.Agric.Food Chem.Vol.27，No.5，1007-1016，1979)。
發(fā)明目的本發(fā)明目的在于發(fā)現(xiàn)一種通過抑制胰島素樣生長因子-1受體從而治療IGF-1R依賴性疾病尤其是癌癥的新化合物及新方法。
附圖概述

圖1顯示了包括IGF-1受體的第1131、1135和1136位酪氨酸的12個氨基酸肽的計算機(jī)模型。
圖2A顯示化合物鬼臼毒素及去氧鬼臼毒素的結(jié)構(gòu)式，圖2B顯示表鬼臼毒素及乙酰鬼臼毒素的結(jié)構(gòu)式。
發(fā)明描述利用計算機(jī)程序分析了IGF-1R酪氨酸結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的三維結(jié)構(gòu)，該序列包括第1131、1135以及1136位的酪氨酸殘基，以期發(fā)現(xiàn)能夠模擬酪氨酸殘基及干擾其磷酸化的化合物。隨后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用12個氨基酸的肽時，3個關(guān)鍵酪氨酸中必須在IGF-1R中自身磷酸化活化的第1135及1136兩個酪氨酸，彼此間隔可近達(dá)0.95nm(9.5)，這些基團(tuán)間的明顯角度約60°。該序列的構(gòu)型如圖1所示。如此近的間隔在胰島素受體相應(yīng)的酪氨酸中并沒有觀察到。圖1也描繪了鬼臼毒素及去氧鬼臼毒素的空間結(jié)構(gòu)。
分子模擬表明，具有抑制活性的分子可被僅由一個碳原子分開的兩個苯環(huán)組成。當(dāng)更換為兩個碳原子橋時，苯環(huán)取代基間的距離則太長，約1.3nm(13)。
相應(yīng)于酪氨酸中羥基的抑制劑取代基選擇為甲氧基或亞甲基二氧基，由于它們化學(xué)上相對穩(wěn)定，即不易被氧化或磷酸化。這些取代基間的距離應(yīng)當(dāng)約0.95±0.10nm(9.5±1.0)。
然后令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，包括鬼臼毒素在內(nèi)的一些環(huán)木脂體類兩個呈一定角度的取代苯環(huán)，幾乎可以完全模擬第1135及1136位酪氨酸，表明鬼臼毒素及其衍生物可干擾這些酪氨酸殘基的自身磷酸化。
為進(jìn)入受體，具有抑制活性的分子必須為小分子。當(dāng)例如鬼臼毒素結(jié)合葡糖苷衍生物時，鬼臼毒素-4，6-O-苯亞甲基-β-D-吡喃葡萄糖甙，對IGF-1R的作用完全消失。此外，將內(nèi)酯環(huán)還原為二醇結(jié)構(gòu)，由于還原的取代基突出分子導(dǎo)致分子的體積增大，而最終導(dǎo)致還原化合物的活性劇降。通過形成鬼臼毒素二醇的亞甲基二氧基衍生物或丙酮化合物(acetonide)增大分子體積也可導(dǎo)致化合物活性的減小或喪失。
抑制劑分子還必須為相對地非極性，如此方可自由穿透細(xì)胞膜及IGF-1受體，但也必需足夠的極性以保證合理的水溶性。分子的極性由氧基團(tuán)的數(shù)量及性質(zhì)決定。當(dāng)水溶性介于去氧鬼臼毒素的水溶性，即約0.01mM，及鬼臼毒素的水溶性，約0.1-0.2mM之間時，極性似乎最佳。分子不帶電或不含有強(qiáng)極性基團(tuán)。
本發(fā)明涉及式I化合物用作胰島素樣生長因子-1受體酪氨酸磷酸化的抑制劑的用途，
其中，亞甲基的碳原子與甲氧基碳原子之間的距離為0.85～1.05nm。R為OH、OCH3、OC2H5或C1-5線性或支鏈烴鏈，該烴鏈任選包含氧官能團(tuán)且任選與頂端苯環(huán)A的碳原子(第5號)成鍵。
R1可相同或不同，為OH或OCH3，且n為0～2。
在上下文中的氧官能團(tuán)指羥基、氧代、羧基、甲氧基、亞甲基二氧基、內(nèi)酯和/或酯基。
依照本發(fā)明，可使用的一組化合物具有式Ib的結(jié)構(gòu)， 其中R為OH、OCH3、OC2H5、CH3、C2H5或C2H4OH；R及n如上所定義。相對于底端的苯環(huán)，該組化合物的R取代基可處于R或S位。
式I化合物可經(jīng)由下述的代表性方法進(jìn)行合成。
可經(jīng)由此方法合成的化合物實例如下6-(3，4，5-三甲氧基-α-羥基-芐基)-1，3-苯并間二氧雜環(huán)戊烯(Ia)6-(3，4，5-三甲氧基-α-甲氧基-芐基)-1，3-苯并間二氧雜環(huán)戊烯(Ib)6-(3，4，5-三甲氧基-α-甲基-芐基)-1，3-苯并間二氧雜環(huán)戊烯(Ic)
依照本發(fā)明，可使用的另一組化合物具有式II的結(jié)構(gòu)， 其中，R2、R3及R4可相同或不同，為H、OH、O、OCH3、OC2H5，或R2及R3一起形成亞甲基二氧基，或R3及R4為丙酮化合物、碳酸酯或亞甲基二氧基；R1及n如上所定義。當(dāng)取代基R2、R3及R4為非氧代時，可為α或β位。底端的苯環(huán)優(yōu)選位于α位。
式II的化合物可經(jīng)由下述的代表性方法合成

在上述方法中，NBS為N-溴代琥珀酰亞胺，PPA為聚磷酸，TTN為三水硝酸鉈，p-TSA為對甲苯磺酸，DMF為N，N-二甲基甲酰胺，及LDA為二烷基酰胺鋰(lithium dialkylamide)。
可經(jīng)由此方法合成的化合物實例如下1-(4-甲氧基-苯基)-6，7-亞甲基二氧基-1，2，3，4-四氫萘(tetrahydro-naphtalene)(IIa)3-羥基-1-(4-甲氧基-苯基)-6，7-亞甲基二氧基-1，2，3，4-四氫萘(IIb)1-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-6，7-亞甲基二氧基-1，2，3，4-四氫萘(IIg)3-羥基-1-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-6，7-亞甲基二氧基1，2，3，4-四氫萘(IIh)。
式II的化合物還可經(jīng)由下述的方法合成

可經(jīng)由此方法合成的化合物實例如下2-羥基-1-(4-甲氧基-苯基)-6，7-亞甲基二氧基-1，2，3，4-四氫萘(IIc)1-(4-甲氧基-苯基)-2-氧代-6，7-亞甲基二氧基-1，2，3，4-四氫萘(IId)2-羥基-1-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-6，7-亞甲基二氧基1，2，3，4-四氫萘(IIi)1-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-2-氧代-6，7-亞甲基二氧基-1，2，3，4-四氫萘(IIj)。
式II的化合物還可經(jīng)由下述的方法合成
可經(jīng)由此方法合成的化合物實例如下2，3-二羥基-1-(4-甲氧基-苯基)-6，7-亞甲基二氧基-1，2，3，4-四氫萘(IIe)1-(4-甲氧基-苯基)-2，3-亞甲基二氧基-6，7-亞甲基二氧基-1，2，3，4-四氫萘(IIf)2，3-二羥基-1-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-6，7-亞甲基二氧基-1，2，3，4-四氫萘(IIk)1-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-2，3-亞甲基二氧基-6，7-亞甲基二氧基-1，2，3，4-四氫萘(IIl)上述合成的具體條件參見Advanced Organic Chemistry，Jerry March(ed.)，4th edition，Wiley-Interscience Publication，New York，1992。
依照本發(fā)明，可使用的另一組化合物為式III化合物 其中，R2、R5及R6可相同或不同，為H、OH、OOCH3、OOCH2CH3、OCH3或OC2H5，或R5及R6共同形成醚或內(nèi)酯；R1及n如上所定義。當(dāng)取代基R2為游離的羥基時，其不能處于α位，例如在鬼臼毒素中。其它的非氧代R2取代基可在α或β位。特別地，底端的苯環(huán)處于α位，第8及第9號碳原子之間為β鍵，第8′及第9′號碳原子之間為α鍵，它們由此形成反式構(gòu)型，如在去氧鬼臼毒素及鬼臼毒素中一樣。
本發(fā)明特別涉及任何相對無毒性的環(huán)木脂體，如表鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素及乙酰鬼臼毒素，用作胰島素 生長因子-1受體的酪氨酸自身磷酸化的抑制劑，然而應(yīng)該避免使用較高細(xì)胞毒性及組織刺激性的化合物，如鬼臼毒素及4′-去甲基-鬼臼毒素。
一些式III化合物為天然產(chǎn)物，如去氧鬼臼毒素及鬼臼毒素。為制備純凈形式的該類物質(zhì)，以有機(jī)溶劑萃取諸如桃兒七或足葉草的精細(xì)粉碎的干燥根莖。然后將萃取物過濾并在硅膠上濃縮。收集包含目標(biāo)物質(zhì)的級分，再經(jīng)酸性三氧化二鋁及硅膠等層析純化，最后重結(jié)晶。鬼臼毒素可用作合成較低毒性衍生物的起始原料。
表鬼臼毒素易于從鬼臼毒素制備得到。將5mg鬼臼毒素溶于2.5ml丙酮中。向該溶液中加入0.5ml濃鹽酸，將混合物煮沸2小時。然后，將溶液用碳酸氫鈉水溶液(約0.5g碳酸氫鈉溶于5ml水中)中和，蒸干丙酮后，以乙酸乙酯萃取得產(chǎn)品表鬼臼毒素。
乙酰鬼臼毒素(鬼臼毒素的乙酸酯衍生物)可從鬼臼毒素進(jìn)行制備，將0.1mg鬼臼毒素用1ml乙酐與1ml吡啶在50℃溫育16小時。蒸除部分溶劑后，加入10ml水及10ml乙酸乙酯，萃取水相得產(chǎn)品。
丙酮化合物及亞甲基二氧基衍生物可以二醇物為起始原料制備，二醇物可依照標(biāo)準(zhǔn)方法還原天然木聚素的內(nèi)酯環(huán)得到。
可以提及的其它式III化合物的實例有鬼臼脂酮，及4′-去甲基-去氧鬼臼毒素。
本發(fā)明還涉及式I的新化合物 其中R為OH、OCH3、OC2H5、CH3、C2H5或C2H4OH；R1及n為如上所定義，條件是當(dāng)R1為OCH3及n為2時，R不為OH；當(dāng)R為CH3或C2H5時，R1為OH及n為1或2；當(dāng)R為C2H5時，R1不為OH。
為保持兩個取代基之間的距離在既定范圍即0.95±0.10nm(9.5±1.0)之內(nèi)，本發(fā)明的分子應(yīng)具有相當(dāng)?shù)膭傂?。形成的烴鏈結(jié)構(gòu)或內(nèi)酯可防止苯環(huán)的旋轉(zhuǎn)或運(yùn)動。
本發(fā)明還涉及式II表示的新化合物， 其中，R2、R3及R4可相同或不同，為H、OH、O、OCH3，或R2及R3一起形成亞甲基二氧基，或R3及R4為丙酮化合物、碳酸酯或亞甲基二氧基；且R1及n如上所定義。
為了設(shè)計用于治療目的的IGF-1R酪氨酸激酶抑制劑，非常重要的是，該抑制劑不與胰島素受體激酶產(chǎn)生交叉反應(yīng)，后者與IGF-1R高度同源。同時抑制胰島素受體將導(dǎo)致體內(nèi)的致糖尿病性反應(yīng)。該反應(yīng)包括極其嚴(yán)重的副作用，由于受體激酶被阻滯，該副作用不能經(jīng)胰島素治療克服。我們已證實，鬼臼毒素及其衍生物為遠(yuǎn)較酪氨酸磷酸化抑制劑類化合物強(qiáng)的IGF-1R抑制劑，且完全不干擾胰島素受體酪氨酸激酶。其也不干擾表皮生長因子、血小板衍生生長因子或成纖維細(xì)胞生長因子受體的酪氨酸磷酸化。
鬼臼毒素長期以來一直被用于治療癌癥，然而其具有難以接受的副作用。鬼臼毒素抗癌效果及其副作用都源于其對微管聚集的抑制以及細(xì)胞的有絲分裂的停頓?，F(xiàn)已證實，鬼臼毒素及其較低毒性的類似物為極強(qiáng)的特異性胰島素樣生長因子-1受體酪氨酸磷酸化抑制劑，該受體作為生存因子在癌癥細(xì)胞中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。與鬼臼毒素的抗微管效應(yīng)相比，低100倍的濃度足以鈍化IGF-1R。最重要的是，鬼臼毒素及其類似物并不抑制胰島素受體，胰島素受體與IGF-1R高度同源。此外，它們也不抑制其它主要的生長因子受體激酶。
毒性較低的式I化合物可用于治療IGF-1R依賴性疾病，如癌癥、動脈粥樣硬化，包括預(yù)防血管手術(shù)后冠狀動脈的再狹窄、銀屑病及肢端肥大癥。
包含式I化合物以及生理上可接受的載體及任選添加劑的藥學(xué)組合物，可以任何合適的途徑施用于患者，例如非胃腸途徑，優(yōu)選靜脈輸液，或局部使用，如貼片劑。
本發(fā)明涉及式I或式II的新化合物用作藥物，特別是用于制備治療癌癥的藥物。
生物實驗結(jié)果顯示，亞微摩爾濃度的鬼臼毒素及其低毒性的類似物如去氧鬼臼毒素或表鬼臼毒素，足以引起腫瘤細(xì)胞的死亡。然而，據(jù)信長期保持相對恒定的抑制劑血漿濃度是重要的，這可使其持續(xù)飽和所有的IGF-1Rs，也因此最終殺死盡可能多的惡性細(xì)胞。因而，在持續(xù)輸液鬼臼毒素衍生物，并同時監(jiān)測血漿濃度為一種治療策略，而不是反復(fù)(例如，每日)注射，反復(fù)給藥可引起治療間隔中IGF-1R的反復(fù)重新激活。
本發(fā)明因此還涉及一種治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用藥學(xué)組合物的步驟，該藥物組合物包含式I化合物以及生理上可接受的載體，通過給腫瘤患者恒速輸液，監(jiān)控化合物的血漿水平，并調(diào)整輸液速率以將血漿水平保持在0.05-5.0μM之間(取決于化合物的一般毒性)，保持時間足夠腫瘤被控制或腫瘤消失。
至于不完全依賴IGF-1R的腫瘤，本發(fā)明化合物可用來增加腫瘤細(xì)胞對其它抗癌藥物的作用的敏感性。
實驗材料化學(xué)物質(zhì)培養(yǎng)基、胎牛血清及抗生素等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自Gibco，Sweden。除非另有說明，其它所有化學(xué)試劑均購自Sigma(St.Louis.MO，USA)?？沽姿崂野彼岬男∈髥慰寺】贵w(PY99)以及抗IGF-1Rα亞基的多克隆抗體(N20)自Santa Cruz Biotechnology Inc(SantaCruz，CA，USA)獲得。IGF-1Rα亞基的單克隆抗體(IR-3)購自O(shè)ncogene Science(NY，USA)。去氧鬼臼毒素及鬼臼毒素(99.97％純度)、以及乙酰鬼臼毒素、鬼臼脂酮及4′-去甲基鬼臼毒素(純度＞95％)由Analytecon SA，Switzerland惠贈。
細(xì)胞培養(yǎng)人惡性黑色素細(xì)胞系SK-MEL-2、SK-MEL-5及SK-MEL28，前列腺癌細(xì)胞系PC-3，及乳腺癌細(xì)胞系MCF-7源自American Tissue Culture Collection，USA。惡性黑素瘤細(xì)胞系BE及FM55從R Kiessling教授(CCK，KarolinskaHospital，Stockholm，Sweden)處獲得。R-及P6細(xì)胞系由R.Baserga教授(Thomas Jefferson University，Philadelphia，PA，USA)惠贈。所有細(xì)胞系在Minimal Essential Medium中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基包含10％的胎牛血清、谷氨酰胺、1％芐青霉素及鏈霉素。細(xì)胞呈單層生長于組織培養(yǎng)燒瓶中，該燒瓶保持在95％空氣/5％CO2氣氛37℃的濕度培養(yǎng)箱中。為了進(jìn)行實驗，將細(xì)胞培養(yǎng)在35mm或60mm塑料皿或96孔塑料板中。實驗于亞融合生長條件下開始。
人慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞系K562/S及K562/VcR30、急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞系HL60/0及HL60/Nov獲自ATCC。K562/S及K562/VcR30為野生型(無抗性)細(xì)胞，而K562/Vcr30及HL60/Nov為細(xì)胞靜止抗性亞系。所有白血病細(xì)胞系在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基另外加入10％的胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、1％芐青霉素及鏈霉素。細(xì)胞生長于組織培養(yǎng)燒瓶中，該燒瓶保持在95％空氣/5％CO2氣氛，置于37℃的濕度培養(yǎng)箱中。為了進(jìn)行實驗，將25,000個細(xì)胞在60mm塑料皿或96孔板中培養(yǎng)。白血病細(xì)胞實驗與Sigurd Vitols副教授(Department of Pharmacology，KarolinskaHospital，Stockholm，Sweden))合作完成。
方法細(xì)胞生長及存活測定細(xì)胞增殖試劑盒II(Roche Inc.)基于經(jīng)由活力細(xì)胞的呼吸鏈所致的甲基橙染料(orange formazan dye)中黃色四唑鹽XTT色度的變化(Roehm，NW等，J Immunol Methods 142257-265，1991)。將細(xì)胞以5000/孔濃度的接種于每孔含有100μl培養(yǎng)基的96孔板中，然后以既定濃度的藥物處理。將細(xì)胞培養(yǎng)24或48小時后，按照操作規(guī)范，與XTT標(biāo)記混合液孵育。4小時后，以帶有495nm濾器的多孔掃描分光光度計定量甲基橙染料。將吸收度與活力細(xì)胞數(shù)直接相關(guān)。繪制接種濃度為1000～10000細(xì)胞/孔(以1000細(xì)胞/孔的速率遞增)的未處理細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)吸收度曲線。所有標(biāo)準(zhǔn)組及實驗組皆重復(fù)3次。
免疫沉淀及蛋白含量測定將分離的細(xì)胞在10ml包含蛋白酶抑制劑的冰冷PBSTDS中裂解(Carlberg，M.等，J Biol Chem 27117453-17462，1996)。在1m樣品中加入50μl蛋白A或G瓊脂糖，并在定軌搖床4℃溫育15分鐘。以10,000r/分4℃離心10分鐘，保存上清液。使用購自Bio-Rad的試劑染色結(jié)合檢測法測定蛋白含量。將胎牛血清用作標(biāo)準(zhǔn)。加入15μl蛋白G瓊脂糖及5μl抗IGF-1R抗體。在定軌搖床4℃溫育3小時后，以14,000×g微型離心機(jī)脈沖離心10秒鐘收集沉淀。棄去上層液，并將沉淀以PBSTDS洗滌3次。
十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白樣品溶解在2×樣品緩沖液中，該緩沖液包括Laemmli緩沖液及0.5％甲醇，然后96℃煮5分鐘。樣品以SDS-PAGE分離，使用4％濃縮凝膠及7.5％分離凝膠。在所有的實驗中同時運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)分子量物質(zhì)(BioRad，Sweden)。
蛋白質(zhì)印跡SDS-PAGE分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移過夜至硝基纖維素膜(Hybond，Amersham，UK)上，然后，室溫下于包含4％脫脂奶粉及0.02％Tween20的PBS、pH為7.5的溶液中封閉1小時。以一級抗體室溫孵育1小時后，以Tween的PBS洗滌3次，然后，再以二級抗體室溫孵育1小時。洗滌3次后，將膜以鏈親和素標(biāo)記的辣根過氧化酶溫育30分鐘，再以Amersham ECLsystem(Amersham，UK)檢測。膜以Fluor-S(BioRad)掃描。
IGF-1R體外自磷酸化分析IGF-1R酪氨酸自磷酸化以夾心ELISA測定法分析。簡而言之，4℃下，以1μg/ml抗IGF-1Rβ亞基的單克隆抗體Ab-5(LabVision)包被96孔板(Immunolon，Nunc)過夜。將板以1％BSA的PBS Tween溶液封閉1小時，然后按80g/孔加入源于P6細(xì)胞系的總蛋白裂解物。陰性對照組使用源于R-細(xì)胞系的總蛋白裂解物。在以ATP激活激酶之前，室溫向不含ATP的酪氨酸激酶緩沖液中加入考察的化合物孵育30分鐘。激酶分析使用Sigma試劑盒。以分光光度測定法測定后，以統(tǒng)計軟件的回歸函數(shù)確定抑制劑的IC50值。
實驗1.鬼臼毒素及其它生物活性酚類化合物對培養(yǎng)的黑素瘤細(xì)胞的IGF-1R磷酸化影響將FM55黑素瘤細(xì)胞接種于6cm皿中，使在Minimal Essential培養(yǎng)基中的濃度達(dá)10,000細(xì)胞/cm2，該培養(yǎng)基加入10％胎牛血清(FCS)。當(dāng)皿中細(xì)胞濃度達(dá)到65,000細(xì)胞/cm2時，以培養(yǎng)基中終濃度為0、1、15或60μM的染料木黃酮、他莫西芬、櫟精及鬼臼毒素處理1小時。0μM處理表示未經(jīng)處理的對照組。然后將細(xì)胞分離并進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。包含純化的IGF-1R的免疫沉淀物以凝膠電泳分離。IGF-1R的磷酸化采用蛋白質(zhì)印跡的方法，以抗磷酸酪氨酸抗體檢測。獲得信號表示已磷酸化的IGF-1R，并且信號強(qiáng)度表示磷酸化IGF-1R的量。操作的具體方法如上所述。強(qiáng)度以掃描儀定量，可檢測信號的光密度(OD)。將對照組細(xì)胞的光密度設(shè)為100％?？瞻?OD 0％)表示背景。下表1中的結(jié)果是3次實驗的平均值。
表1.完整細(xì)胞中IGF-1R磷酸化的水平

該結(jié)果表明，在所有3個濃度下，鬼臼毒素幾乎完全阻滯IGF-1R磷酸化，而染料木黃酮僅在60μM濃度下具有部分抑制效果，櫟精完全沒有效果。
實驗2.鬼臼毒素衍生物對培養(yǎng)黑素瘤細(xì)胞中IGF-1R磷酸化的影響FM55黑素瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法如實驗1所述。當(dāng)皿中細(xì)胞密度達(dá)到65,000細(xì)胞/cm2時，以0.05μM鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素、乙酰鬼臼毒素、表鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素及鬼臼脂酮處理1小時。然后，收集細(xì)胞進(jìn)行測定，IGF-1R自磷酸化的定量如上所述。表2中的數(shù)值表示3次實驗的平均值。
表2.完整細(xì)胞中相對于鬼臼毒素的IGF-1R自磷酸化抑制效果

該結(jié)果表明乙酰鬼臼毒素、鬼臼毒素及去氧鬼臼毒素皆為IGF-1R磷酸化的強(qiáng)抑制劑。
實驗3.鬼臼毒素及去氧鬼臼毒素對實體瘤細(xì)胞生存力的劑量反應(yīng)作用將5類不同的細(xì)胞系接種于96孔板(培養(yǎng)基體積為每孔100μl)，使其在Minimal Essential培養(yǎng)基中的濃度達(dá)10,000細(xì)胞/cm2，該培養(yǎng)基加入胎牛血清。當(dāng)皿中細(xì)胞密度達(dá)到65,000細(xì)胞/cm2時，以不同劑量鬼臼毒素及去氧鬼臼毒素處理48小時。然后，測定細(xì)胞活力(見上)。將各抑制劑及細(xì)胞系IC50計算為濃度值，該濃度引起細(xì)胞存活率下降50％，如下表所示。結(jié)果基于4組不同的實驗。
表3.細(xì)胞存活力的IC50(μM)

·nd，未檢測這表明鬼臼毒素及去氧鬼臼毒素都為腫瘤細(xì)胞活力的極強(qiáng)抑制劑。
實驗4.不同鬼臼毒素類似物的劑量反應(yīng)效果FM55黑素瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法如實驗3所述，并以實驗3所述的方法使用不同劑量的鬼臼毒素類似物進(jìn)行處理。結(jié)果(IC50值)如下表4。
表4.FM55細(xì)胞活力的IC50(μM)

結(jié)果表明，測試的類似物皆顯強(qiáng)效。
實驗5.鬼臼毒素類似物對人白血病細(xì)胞活力的劑量反應(yīng)效果已經(jīng)證實白血病細(xì)胞系K562/S、K562/VcR30、HL60/0及HL60/Nov都表達(dá)IGF-1R。按照方法及實驗1和2中所述的方法，以蛋白質(zhì)印跡測定。將上述4個細(xì)胞系接種于96-孔板(每孔培養(yǎng)基體積為100ul)的RPMI40培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充胎牛血清。24小時后，加入不同濃度的鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素及其它衍生物，將細(xì)胞培養(yǎng)72小時。然后測定細(xì)胞活力(見上)。每個化合物及細(xì)胞系的IC50值見下表(表5)。該結(jié)果基于3次不同實驗。
表5.白血病細(xì)胞系活力的IC50(nM)

該結(jié)果表明，去氧鬼臼毒素對人白血病細(xì)胞有出乎意料的、異常的強(qiáng)細(xì)胞毒性。該效果不能僅由其對IGF-1R的作用得到解釋。乙酰鬼臼毒素及表鬼臼毒素的效果預(yù)期都可作為IGF-1R抑制劑。
結(jié)論一些環(huán)木脂體類，如鬼臼毒素及其類似物去氧鬼臼毒素，經(jīng)完整細(xì)胞測定證實為高度特異的IGF-1R酪氨酸激酶強(qiáng)抑制劑。當(dāng)對完整細(xì)胞施用時，其EC50值低達(dá)0.02～0.06μM。
鬼臼毒素誘導(dǎo)胰島素樣生長因子-1受體的失活引起惡性細(xì)胞的廣泛死亡，而缺乏胰島素樣生長因子-1受體的細(xì)胞具有抗性。在抑制胰島素樣生長因子-1受體活性及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方面，無毒衍生物苦鬼臼脂素的與鬼臼毒素等效。鬼臼毒素及其衍生物的新機(jī)制可用于治療癌癥及其它IGF-1R依賴性疾病。
權(quán)利要求
1.具有通式I化合物作為胰島素樣生長因子-1受體酪氨酸磷酸化抑制劑的用途， 其中，亞甲基的碳原子與甲氧基碳原子之間的距離為0.85～1.05nm；R為OH、OCH3、OC2H5或C1-5線性或支鏈烴鏈，該烴鏈任選雙鍵、任選包含1～3個氧官能團(tuán)，且任選與苯環(huán)A的碳原子成鍵；R1可相同或不同，為OH或OCH3，且n為0～2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所定義的具有通式I化合物的用途， 其中，R為OH、OCH3、OC2H5、CH3、C2H5或C2H4OH；R1及n如權(quán)利要求1中所定義。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所定義的具有通式II的化合物的用途， 其中，R2、R3及R4可相同或不同，為H、OH、O、OCH3、OC2H5，或R2及R3一起形成亞甲基二氧基，或R3及R4為丙酮化合物、碳酸酯或亞甲基二氧基；R1及n如權(quán)利要求1中所定義。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所定義具有通式III的化合物的用途， 其中，R2、R5及R6可相同或不同，為H、OH、OOCH3、OOCH2CH3、OCH3或OC2H5，或R5及R6共同形成醚或內(nèi)酯；R1及n如權(quán)利要求1中所定義，條件是當(dāng)R2為羥基時，該取代基不能處于α位。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，化合物選自表鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素及乙酰鬼臼毒素。
6.具有通式I的化合物 其中，R為OH、OCH3、OC2H5、CH3、C2H5或C2H4OH；R1及n如權(quán)利要求1中所定義，條件是當(dāng)R1為OCH3時且n為2，R不為OH。
7.具有通式II的化合物 其中，R2、R3及R4可相同或不同，為H、OH、O、OCH3，或R2及R3一起形成亞甲基二氧基，或R3及R4為丙酮化合物、碳酸酯或亞甲基二氧基；R1及n如權(quán)利要求1中所定義。
8.式I、II或III的化合物用作藥物。
9.式I、II或III的化合物在用于治療IGF-1R依賴性疾病，如癌癥、動脈粥樣硬化、銀屑病及肢端肥大癥中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7的化合物在用于治療癌癥的藥物制備中的用途。
11.式III化合物在用于預(yù)防或治療癌癥的藥物的制備中的用途， 其中，R2、R5及R6可相同或不同，為H、OH、OOCH3、OOCH2CH3、OCH3或OC2H5，或R5及R6共同形成醚或內(nèi)酯；R1及n如權(quán)利要求1中所定義，條件是當(dāng)R2為羥基時，該取代基不能處于α位。
12.根據(jù)權(quán)利要求11中所述的選自表鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素及乙酰鬼臼毒素化合物用于預(yù)防或治療白血病的用途。
13.一種藥學(xué)組合物，包含式I、II或III的化合物以及生理上可接受的載體。
14.一種治療哺乳動物癌癥的方法，包括施用藥學(xué)組合物的步驟，該藥物組合物包含式I、II或III化合物及生理上可接受的載體，通過給腫瘤患者恒速輸液，監(jiān)控化合物的血漿水平，并調(diào)整輸液速率以使0.05-5.0μM的血漿濃度對腫瘤被控制或腫瘤消失而言保持足夠的時間。
全文摘要
本發(fā)明涉及新化合物及其用途，以及已知的具有反式構(gòu)型內(nèi)酯環(huán)的環(huán)木脂體的用途，所述用途為胰島素樣生長因子－1受體的抑制劑。所述化合物可用于治療IGF－1R依賴性疾病，特別是癌癥。特別是去氧鬼臼毒素可用于治療人類白血病。
文檔編號C07D317/70GK1659171SQ02816240
公開日2005年8月24日 申請日期2002年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月19日
發(fā)明者奧利·拉森, 馬格努斯·阿克塞爾森 申請人:比奧維特魯姆公司