一種穩(wěn)定型維生素K₂亞微乳及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】一種維生素K2亞微乳，包括具有按所述維生素K2亞微乳的總重量計(jì)的重量百分?jǐn)?shù)的如下各組分：維生素K2 0.0005％～1％，油1.0％～10％，磷脂0.1％～1.2％，乳化劑0.5％～2.3％，防凍劑0.5％～3.0％及水，其中乳化劑為磷脂以外的其他乳化劑。所述維生素K2亞微乳滅菌穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性良好，且具有甚至高達(dá)2年以上的預(yù)期有效期。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種穩(wěn)定型維生素 K2亞微乳及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本申請(qǐng)涉及藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種穩(wěn)定型維生素1(2亞微乳及其制備方法以 及上述亞微乳的制藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松是一種慢性、漸進(jìn)性的骨代謝障礙疾病，其主要疾病反應(yīng)為部分甚至全 部骨骼的骨質(zhì)量降低，并伴隨更大的骨折風(fēng)險(xiǎn)。絕大多數(shù)老年人、絕經(jīng)后婦女都會(huì)患有骨質(zhì) 疏松癥，面臨慢性疼痛、骨折甚至殘疾的威脅，導(dǎo)致生活質(zhì)量降低，同時(shí)也需要承擔(dān)巨大的 花銷(xiāo)。
[0003] 鈣是骨質(zhì)的重要組成物質(zhì)，為了能夠預(yù)防骨質(zhì)疏松，越來(lái)越多的人開(kāi)始重視補(bǔ)鈣。 然而，歐美國(guó)家的科研機(jī)構(gòu)曾經(jīng)進(jìn)行過(guò)多次補(bǔ)鈣與健康的大型臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)單純補(bǔ)鈣并 不能降低骨質(zhì)疏松和骨折的發(fā)生率，反而會(huì)造成便秘、結(jié)石、關(guān)節(jié)軟骨鈣化、骨刺增生、骨性 關(guān)節(jié)炎和心腦血管阻塞等不良反應(yīng)。
[0004] 已有研究表明，鈣離子進(jìn)入體內(nèi)后有兩種不同的去向：一是沉積在正確的部位，比 如骨骼、牙齒等;二是沉積在錯(cuò)誤的部位，如關(guān)節(jié)軟骨、心腦動(dòng)脈血管、膽囊和腎臟等。錯(cuò)誤 沉積的鈣質(zhì)會(huì)進(jìn)一步造成所在部位組織和器官的鈣化。關(guān)節(jié)軟骨的鈣化會(huì)造成脊椎、腰椎、 肘、膝等大小關(guān)節(jié)的損傷，引起嚴(yán)重的骨性關(guān)節(jié)炎、肩周炎等疾病，嚴(yán)重者可造成骨刺和關(guān) 節(jié)腔的破壞。動(dòng)脈血管的鈣化會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈狹窄、栓塞、心肌梗塞和腦中風(fēng)。膽囊和腎臟的鈣 化則會(huì)影響臟器的正常生理功能，而且還會(huì)引起其他繼發(fā)性疾病。許多老年人往往同時(shí)面 臨骨質(zhì)疏松、動(dòng)脈硬化和老年性骨關(guān)節(jié)炎等多重健康問(wèn)題，需要有一個(gè)理想的治療方法，既 能改善骨質(zhì)疏松癥狀，又不會(huì)導(dǎo)致或加重動(dòng)脈硬化和關(guān)節(jié)炎等疾病，而維生素 K正好可以解 決這些問(wèn)題。
[0005] 多年來(lái)，人類(lèi)一直把維生素 K的作用局限于維持正常的凝血機(jī)制方面，但隨著1960 年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)維生素 K2還參與人體骨代謝的作用，特別是"維生素 K依賴(lài)蛋白"被發(fā)現(xiàn)后，這 種認(rèn)識(shí)才得以改變（以18681：11611，6.1^.，6〖&1.(2000).￥；^&111；[111(-(16卩611(1611七 proteins · Vitamins&Hormones 58:355-389 ·)。維生素 K是γ -谷氨酸羧化酶的輔酶，能將凝 血酶原等蛋白的谷氨酸殘基羧化成T -羧化谷氨酸（T -carboxyglutamate，Gla)，生成Gla 包含蛋白，即維生素 K依賴(lài)蛋白。機(jī)體中有多種Gla包含蛋白，它們分布在不同的器官、組織， 目前已發(fā)現(xiàn)的有以下幾種：
[0006] (1)凝固因子(II，VII，IX，X)以及抗凝血蛋白（C，S，Z)，它們由肝臟合成，在血液凝 固過(guò)程中起著重要作用。
[0007] (2)骨鈣素 (Osteocalcin)，是由成骨細(xì)胞分泌的非膠原蛋白，并在骨形成過(guò)程中 發(fā)揮重要作用。
[0008] (3)基質(zhì)GLA蛋白（Matrix Gla protein，MGP)，這種蛋白存在于多種身體組織中， 主要發(fā)揮抑制鈣化的作用，這種作用在軟骨和在動(dòng)脈血管壁尤為明顯。
[0009] (4)生長(zhǎng)抑制特異性蛋白6(Growth-arrest-specific gene-6 protein，GAS6)，由 白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷響應(yīng)而分泌，能夠幫助細(xì)胞存活、增殖、迀移和粘附。
[0010] (5)除此之外還有富含脯氨酸的Gla蛋白（PRGP)，跨膜Gla蛋白（TMG)等，它們的確 切功能仍然未知。
[0011]由于維生素 K和機(jī)體的Gla包含蛋白息息相關(guān)，而這些蛋白質(zhì)都發(fā)揮著重要的生理 功能，因此維生素 K具有多種藥理作用。
[0012]預(yù)防和治療出血性疾病
[0013] 肝臟最初合成的凝血因子為無(wú)活性的前體，必須經(jīng)過(guò)翻譯和加工修飾才具有活 性。此過(guò)程需要維生素 K家族成員作為輔助因子。當(dāng)人體或動(dòng)物缺乏維生素 K或攝入維生素 K 拮抗劑如香豆素或華法林時(shí)，血漿中凝血因子會(huì)相應(yīng)減少，促進(jìn)凝血的能力大幅度下降，凝 血時(shí)間就會(huì)明顯延長(zhǎng)，甚至出現(xiàn)出血癥狀。雖然維生素 K會(huì)促進(jìn)凝血，但是并不會(huì)影響血液 的正常流動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，維生素 K的凝血機(jī)制作用只是在人體發(fā)生出血的狀況下才會(huì)發(fā)揮， 即當(dāng)損傷的組織或被刺激的細(xì)胞所包含的細(xì)胞因子暴露于血漿時(shí)，才開(kāi)始進(jìn)入正常的凝血 過(guò)程，發(fā)揮止血作用。
[0014] 可以改善兒童的"生長(zhǎng)痛"
[0015] 兒童在生長(zhǎng)發(fā)育期有時(shí)會(huì)出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的雙下肢間歇性疼痛，稱(chēng)為"生長(zhǎng)痛"。日 本兒童因?yàn)閺男∈秤酶缓S生素 K2的納豆，遭受"生長(zhǎng)痛"的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其他國(guó)家的兒 童。研究表明，"生長(zhǎng)痛"兒童疼痛部位的骨密度顯著低于正常兒童，補(bǔ)充維生素心可以使兒 童的骨密度更高，骨骼更強(qiáng)壯，從而防止"生長(zhǎng)痛"的出現(xiàn)。
[0016] 預(yù)防動(dòng)脈硬化、器官鈣化和關(guān)節(jié)炎
[0017] 食物中的鈣進(jìn)入人體后不會(huì)完全沉積到骨骼和牙齒，會(huì)有一部分沉積到動(dòng)脈血 管、心臟瓣膜、關(guān)節(jié)軟骨或其他部位的軟組織，導(dǎo)致動(dòng)脈血管硬化、器官鈣化、關(guān)節(jié)炎等疾 病。補(bǔ)充維生素1( 2后，它可以提高骨鈣素的含量，增強(qiáng)其與Ca2+的結(jié)合能力，降低在血管、關(guān) 節(jié)腔等錯(cuò)誤部位沉積的鈣質(zhì)含量，防止血管、關(guān)節(jié)和其他器官鈣化，預(yù)防動(dòng)脈硬化、器官鈣 化和關(guān)節(jié)炎。
[0018]輔助治療及預(yù)防癌癥
[0019] 體外研究均表明，維生素 K能表現(xiàn)出抗癌作用(KjPK2均是），細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示，維 生素 K對(duì)多種癌細(xì)胞具有抑制作用，而且維生素1(2的1050低于K1，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用更 強(qiáng)，但對(duì)正常的骨髓細(xì)胞幾乎沒(méi)有作用。研究者給肝癌患者服用維生素 K2,顯著提高了生存 率，相比于對(duì)照組，服用維生素 K2組的癌癥轉(zhuǎn)移率更低。另外，患有早幼粒細(xì)胞性白血病的 患者服用維生素 Κ2,結(jié)合其他治療，兩個(gè)月后早幼粒細(xì)胞完全消失；患有骨髓增生異常綜合 征(MDS，易演變?yōu)榧毙运柘蛋籽。┑牟∪朔镁S生素心后髓原始細(xì)胞數(shù)目減少，血小板數(shù) 量增加，在停止骨髓抑制治療后仍表現(xiàn)出很好的療效。
[0020] 現(xiàn)已有發(fā)明將維生素 K和其他維生素添加至飲料中（CN 1073826)或制備成粉狀組 合物(CN 1212080C)用于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充，但這些發(fā)明僅能給人體補(bǔ)充維生素 Κ，并不能起到治療 骨質(zhì)疏松癥的作用。塞斯?弗美爾等公開(kāi)了一種用于治療和預(yù)防骨、軟骨和心血管系統(tǒng)相 關(guān)疾病的維生素1( 2藥品和類(lèi)藥劑營(yíng)養(yǎng)品，但其設(shè)計(jì)的劑型為片劑或膠囊劑（CN 101534807Α)。由于維生素 心比維生素1^的治療效果更好，且機(jī)體攝取的維生素1^需轉(zhuǎn)化為 Κ2 后才能發(fā)揮作用（Okano T，Shimomura Y，Yamane M，et al.Conversion of phylloquinone(vitamin Kl) into menaquinone-4(vitamin K2)in mice: two possible routes for menaquinone_4accumulation incerebra of mice.J Biol Chem.2008；283: 11270-11279)，因此直接使用維生素 K2可以有更快更好的治療效果。目前，國(guó)內(nèi)外已有用于 預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松的維生素1(2藥品(Gkkay?，四烯甲萘醌軟膠囊)及保健品上市，劑型 均為軟膠囊或片劑。
[0021 ]由于維生素 K2是脂溶性藥物，其在水中的溶解度很小，口服給藥后胃腸道吸收較 差，生物利用度低。因此，即使維生素 K2有很好的藥理作用，其在臨床上的療效也很難達(dá)到 期望值。此外，維生素心主要是從納豆中提取或由微生物發(fā)酵制得的，人工合成非常困難。 因此亟需開(kāi)發(fā)一種生物利用度更高的劑型，既能保證藥物在體內(nèi)能夠達(dá)到所需濃度，又能 節(jié)約原料，降低成本。
[0022] 為了增加親脂性化合物的臨床療效，研究者們嘗試了多種增加胃腸道吸收和提高 生物利用度的方法。亞微乳(submicron emulsion)可以從以下幾個(gè)方面提高藥物的口服生 物利用度：
[0023] (1)將難溶于水的藥物溶解或增溶于油相中然后制備成0/W型亞微乳，可以提高藥 物的溶解度，增加藥物的分散度，更有利于藥物的吸收(Araya，H.，et al.( 2005). "The novel formulation design of 0/ff mi cro emu Is i on for improving the gastrointestinal absorption of poorly water soluble compounds·''International journal of pharmaceutics 305(1):61-74.)；
[0024] (2)將藥物包封于亞微乳中給藥，可以避免對(duì)消化道中的酶敏感的藥物降解，提高 藥物的胃腸道穩(wěn)定性（Crauste_Manciet，S.，et al.，Cefpodoxime_proxetil protection from intestinal lumen hydrolysis by oil-in-water submicron emulsions. International journal of pharmaceutics，1998·165(I):p·97-106·)〇
[0025] (3)亞微乳表面具有親水性，使其更易于進(jìn)入腸腔粘膜的水化層，藥物可直接與胃 腸道上皮細(xì)胞接觸，從而有利于藥物的吸收(張正全，陸彬.微乳給藥系統(tǒng)研究概況.中國(guó)醫(yī) 藥工業(yè)雜志，2001.32(3) :p. 139-142);
[0026] (4)微乳中的脂質(zhì)在胰酶和膽汁作用下可發(fā)生脂質(zhì)降解，重組裝成粒徑更小的乳 滴，從而增大了藥物與小腸上皮細(xì)胞的接觸面積，增加了藥物在胃腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物跨膜 吸收車(chē)專(zhuān)運(yùn)效率（Zangenberg，N.H.，et al. , A dynamic in vitro lipolysis model: II: Evaluation of the model.European Journal of Pharmaceutical Sciences，2001·14 (3):p.237-244.)；
[0027] (5)微乳中的某些表面活性劑能抑制胃腸粘膜中P-糖蛋白對(duì)藥物的外排作用，增 加藥物的吸收（Cornaire，G.，et al. ,Impact of excipients on the absorption of P-glycoprotein substrates in vitro and in vivo. International journal of pharmaceutics，2004.278(I):p.119-131.)。
[0028] (6)亞微乳被吸收后直接進(jìn)入淋巴循環(huán)，可以避免肝臟的首過(guò)效應(yīng)(Araya，H.，et al·(2005)·"The novel formulation design of 0/ff microemulsion for improving the gastrointestinal absorption of poorly water soluble compounds·〃 International journal of pharmaceutics 305(1):61-74.)
[0029] 因此，將維生素 K2開(kāi)發(fā)為亞微乳，可以提高其口服生物利用度，相比于其它劑型有 更好的預(yù)防或治療效果。
[0030] 此外，從病人順應(yīng)性角度來(lái)看，相比于片劑或者膠囊劑，口服亞微乳服用更加方 便，尤其適用于兒童、老人及吞咽困難的人群。制備乳劑的設(shè)備有高壓均質(zhì)機(jī)、微射流儀、膠 體磨等，采用上述設(shè)備均可得到粒徑較小、粒徑分布較窄、外觀品質(zhì)優(yōu)良、穩(wěn)定性好的乳劑 產(chǎn)品。適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0031] 總的來(lái)說(shuō)，口服亞微乳具有片劑、膠囊劑不可替代的優(yōu)勢(shì)，但將維生素心開(kāi)發(fā)為口 服亞微乳，尚有兩個(gè)問(wèn)題需要解決：
[0032] (1)提高亞微乳的凍融穩(wěn)定性。脂肪乳注射液或載藥型亞微乳在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程 中冷凍會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)油水分層現(xiàn)象，使其失效，所以亞微乳要求保存溫度不低于0 °c。然而中國(guó)大部分地區(qū)冬季氣溫在(TC以下，制劑的運(yùn)輸和保存條件十分苛刻。雖然凍干 技術(shù)可在一定程度上解決此類(lèi)問(wèn)題，但是凍干工藝復(fù)雜，成本較高。
[0033] (2)藥物氧化降解問(wèn)題。由于維生素 K2的萘醌核上連接有多個(gè)異戊二烯結(jié)構(gòu)，其最 鄰近萘醌核的第一個(gè)異戊二烯結(jié)構(gòu)的雙鍵易被氧化，光照或金屬離子的催化也可促進(jìn)該氧 化反應(yīng)的發(fā)生，將維生素心制備成亞微乳后，其有效期非常短，無(wú)法實(shí)現(xiàn)上市銷(xiāo)售的目的。 [0034] 終上所述，亟需開(kāi)發(fā)一種穩(wěn)定型維生素1(2亞微乳，該亞微乳具有良好的物理穩(wěn)定 性和化學(xué)穩(wěn)定性，能夠耐受凍融，且藥物在一定時(shí)間內(nèi)能夠使其活性成分含量維持在規(guī)定 標(biāo)準(zhǔn)以上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0035]本申請(qǐng)的一個(gè)目的是提供一種維生素心亞微乳。
[0036]本申請(qǐng)的又一目的是提供一種制備上述維生素 K2亞微乳的方法。
[0037]本申請(qǐng)的再一目的是提供上述維生素心亞微乳在制備用于治療出血性疾病、預(yù)防 和治療骨質(zhì)疏松癥、預(yù)防兒童"生長(zhǎng)痛"、預(yù)防老年人血管鈣化、預(yù)防心腦血管疾病、預(yù)防關(guān) 節(jié)病和關(guān)節(jié)炎、或輔助治療和預(yù)防癌癥的藥物中的用途。
[0038]具體地，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N維生素 K2亞微乳，包括按所述維生素 K2亞微乳的總重量計(jì) 的如下重量百分?jǐn)?shù)的各組分：
[0039] 維生素 K2 0.0005%~0.5%，
[0040] 油 1.0% ~10%，
[0041] 磷脂0.1 %~1.2%，
[0042] 乳化劑0.5% ~2.3%
[0043] 防凍劑0.5%~3.0%，
[0044] 及水；
[0045]其中乳化劑為磷脂以外的其他乳化劑。
[0046] 在以上或其他實(shí)施方式中，磷脂的重量百分?jǐn)?shù)可以為0.3%~0.8%。
[0047] 在以上或其他實(shí)施方式中，乳化劑的重量百分?jǐn)?shù)可以為1.0%~1.6%。
[0048] 在以上或其他實(shí)施方式中，防凍劑的重量百分?jǐn)?shù)可以為0.5%~2.0%。
[0049]在以上或其他實(shí)施方式中，所述維生素 K2亞微乳還可以包括按所述維生素 K2亞微 乳的總重量計(jì)的重量百分?jǐn)?shù)為0.02%~5.0%的矯味劑。
[0050]在以上或其他實(shí)施方式中，所述維生素 K2亞微乳還可以包括按所述亞微乳的總重 量計(jì)的重量百分?jǐn)?shù)為〇. 〇〇 1 %~1 %，優(yōu)選〇. 〇〇 1 %~〇. 〇 15%的穩(wěn)定劑。
[0051 ] 在以上或其他實(shí)施方式中，所述維生素 K2可以選自歷-4、1?(-5、11(-6、11(-7、11(-8和 ΜΚ-9中的一種或更多種，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是數(shù)字4-9表示維生素 Κ2的側(cè)鏈異戊二烯 基團(tuán)的數(shù)量。其中，本申請(qǐng)所用的維生素 Κ2為從納豆中提取所得的系列化合物且能夠市購(gòu) 獲得或自行制備，例如，可由挪威的Kappa Bioscience、臺(tái)灣金穎生物科技有限公司等購(gòu) 得;如果自行制備，所述納豆發(fā)酵中提取方法可參見(jiàn)例如文獻(xiàn):吳元鋒等，微生物法生產(chǎn)維 生素 K2(MK)，科技通報(bào)，2004,20(5) :428-433)。
[0052]在以上或其他實(shí)施方式中，所述油可以選自大豆油、玉米油、茶油、橄欖油、椰子 油、魚(yú)油、紅花油、芝麻油和中鏈甘油三酯中的一種或更多種，優(yōu)選地，所述油可以為大豆油 和中鏈甘油三酯的混合物，更優(yōu)選地，所述油可以是重量比為1:0.8~1:1.5的大豆油和中 鏈甘油三酯的混合物。優(yōu)選地，藥物維生素 K2與油的比例為1:1~1:20000 (w/w)，優(yōu)選1: 50 ~1:5000 (w/w)。其中，本申請(qǐng)所用到的油均為市購(gòu)產(chǎn)品。
[0053]在以上或其他實(shí)施方式中，所述磷脂可以選自大豆卵磷脂（SPC)、蛋黃卵磷脂 (EPC)、氫化大豆磷脂(HSPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕 櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二硬 脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二 肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE)、二月桂酰磷脂酰膽堿（DLPC)和二月桂酰磷脂酰乙醇胺 (DLPE)中的一種或更多種。其中，本申請(qǐng)所用到的磷脂均為市購(gòu)產(chǎn)品。其中，在本申請(qǐng)中，磷 脂能夠作為兩性乳化劑，具有很強(qiáng)的乳化作用，生物相容性好，易于和腸上皮細(xì)胞融合，然 后被攝取，具有很好的營(yíng)養(yǎng)作用。
[0054] 在以上或其他實(shí)施方式中，所述乳化劑可以選自普郎尼克F87、普朗尼克F108、普 朗尼克F127、普朗尼克P124、泊洛沙姆188(Pluronic F68)、泊洛沙姆237(Pluronic F-87)、 泊洛沙姆338(Pluronic F-108)、泊洛沙姆407(Pluronic F-127)、聚氧乙稀35蓖麻油 (Cremophor EL)、聚氧乙稀40氫化蓖麻油（Cremophor RH 40)、聚氧乙稀60氫化蓖麻油 (Cremophor RH60)、聚山梨酯20(Tween 20)、聚山梨酯40(Tween 40)、聚山梨酯60 (Tween60)、聚山梨酯80(Tween 80)、聚乙二醇12羥基硬脂酸酯（solutol HS 15)和聚乙二 醇1000維生素 E琥珀酸酯(TPGS)中的一種或更多種。其中，本申請(qǐng)所用到的乳化劑均為市購(gòu) 產(chǎn)品。
[0055] 發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，上述乳化劑和磷脂的聯(lián)合使用獲得了非常好的乳化效果，且 上述乳化劑大多具有抑制P-糖蛋白的作用，能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞對(duì)亞微乳的吸收。
[0056] 在以上或其他實(shí)施方式中，所述防凍劑可以選自葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、麥芽 糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、甘露醇、木糖醇、麥芽醇、丙二醇、甘油、PEG200、PEG300、PEG400、 PEG600、PEG1000、PEG2000、PEG4000和PEG6000中的一種或更多種。
[0057] 發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，添加防凍劑的亞微乳經(jīng)歷凍融后仍能恢復(fù)凍融前的狀態(tài)，粒 徑變化小于5 %。
[0058]在以上或其他實(shí)施方式中，所述可以水為純化水。
[0059]在以上或其他實(shí)施方式中，所述矯味劑可以選自甜味劑和香精中的一種或更多 種;優(yōu)選地，所述甜味劑選自蔗糖、葡萄糖、甜菊苷、糖精鈉、阿斯巴甜和木糖醇中的一種或 更多種;所述香精選自藍(lán)莓味、甜橙味、朽 1檬味、蜜桃味、櫻桃味、草莓味、菠蘿味、蒸枝味、芒 果味、甜瓜味、混合漿果味、牛奶、咖啡和可可味的香精。因此，顧客可根據(jù)自己的喜好自行 選擇喜歡口味的亞微乳。優(yōu)選地，所述甜味劑按所述維生素 K2亞微乳的總重量計(jì)的重量百 分?jǐn)?shù)可以為0.02 %~3 %，更優(yōu)選0.025 %~O . 5 %。優(yōu)選地，所述香精按所述維生素 K2亞微 乳的總重量計(jì)的重量百分?jǐn)?shù)可以為0.05 %~1 %，更優(yōu)選0.1~0.5 %。
[0060] 在以上或其他實(shí)施方式中，所述穩(wěn)定劑可以選自抗氧化劑和金屬離子螯合劑中的 一種或更多種，優(yōu)選地，所述穩(wěn)定劑可以為抗氧化劑和金屬離子螯合劑的組合物。
[0061] 在以上或其他實(shí)施方式中，所述抗氧化劑可以選自生育酚及其酯、維生素 C及其 鹽、維生素 C棕櫚酸酯、叔丁基對(duì)羥基茴香醚、二丁甲苯酚、沒(méi)食子酸丙酯、組氨酸、半胱氨 酸、亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽和亞硫酸氫鹽中的一種或更多種;所述金屬離子螯合劑選自乙二 胺四乙酸二鈉和乙二胺四乙酸鈣鈉中的一種或兩種。
[0062] 其中，生育酚的酯是指本領(lǐng)域常用的且市場(chǎng)上能夠購(gòu)買(mǎi)得到的相應(yīng)的酯類(lèi)，比如 生育酚乙酸酯、生育酚煙酸酯、生育酚琥珀酸酯等。
[0063] 并且，維生素 C的鹽是指本領(lǐng)域常用的且市場(chǎng)上能夠購(gòu)買(mǎi)得到的相應(yīng)的鹽，比如鈣 鹽、鈉鹽等。
[0064] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，由于工業(yè)化生產(chǎn)中各項(xiàng)參數(shù)并不能進(jìn)行完全精密 控制，所以允許處方中各組分含量在其上下限出現(xiàn)的± 10 %的范圍內(nèi)波動(dòng)，例如處方中油 的含量為1 %~10 %，在實(shí)際生產(chǎn)中，油含量為〇. 9 %~11 % (w/v)均可認(rèn)為能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明 的目的，也認(rèn)為在本專(zhuān)利申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0065]另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于制備如上所述的維生素 K2亞微乳的方法，包括如 下步驟：
[0066] 稱(chēng)取配方量的維生素 K2、油、磷脂和乳化劑組成油相；
[0067] 稱(chēng)取配方量的防凍劑溶于適量的水中組成水相;其中，如果存在穩(wěn)定劑，如果穩(wěn)定 劑是脂溶性的，將配方量的穩(wěn)定劑添加到油相中，如果穩(wěn)定劑是水溶性的，則將穩(wěn)定劑添加 到水相中；
[0068] 如果存在甜味劑，將配方量的甜味劑添加到水相中；
[0069] 將油相和水相分別抽真空，充入保護(hù)氣體，優(yōu)選地充入保護(hù)氣體的次數(shù)為3次;加 熱油相和水相以使兩相中的物質(zhì)均完全溶解，優(yōu)選地加熱至60~65°C，然后在攪拌下將水 相緩慢加入到油相中，繼續(xù)攪拌，優(yōu)選地繼續(xù)攪拌10~40分鐘，變成均勻牛乳狀，制得初乳；
[0070] 對(duì)所述初乳進(jìn)行均質(zhì)，以得到粒徑為80~200nm的亞微級(jí)別的乳劑，如果存在香 精，將配方量的香精用剩余的水稀釋后加入，如果不存在香精，直接加入剩余的水，至所述 乳劑的總重量達(dá)到100%，攪拌均勻，并過(guò)微孔濾膜，優(yōu)選地過(guò)0.45μπι微孔濾膜，制得終乳；
[0071] 將終乳分裝，充入保護(hù)氣體后滅菌。
[0072] 在以上或其他實(shí)施方式中，可以用微射流儀、高壓乳勻機(jī)、膠體磨、球磨機(jī)和超聲 波細(xì)胞破碎機(jī)中的一種或更多種設(shè)備來(lái)對(duì)所述初乳進(jìn)行均質(zhì)。
[0073]本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，均質(zhì)可以采用本領(lǐng)域已知的且常用的操作來(lái)進(jìn) 行，比如使用高壓乳勻機(jī)，第一步調(diào)節(jié)壓力至400~600巴，第二步調(diào)節(jié)至1000~1400巴；使 用微射流儀，第一步調(diào)節(jié)勾化壓力至4000~8000psi，第二步再調(diào)節(jié)至10000~16000psi ;使 用球磨機(jī)，200~400rpm工作IOmin，暫停2~5min，循環(huán)3~6次;或使用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)， 200WX2min，400WX6min。
[0074]在以上或其他實(shí)施方式中，所述保護(hù)氣體可以選自氮?dú)?、氬氣或氦氣。并且，保護(hù) 氣體的量以充滿容器剩余空間為宜。
[0075] 其中，使用上述工藝制備得到的維生素 K2口服亞微乳，外觀呈乳白色，有淡藍(lán)色乳 光，無(wú)油滴，未見(jiàn)分層;平均粒徑為90~130nm，且分布均勻；在經(jīng)受100°C的流通蒸氣滅菌 30min和3個(gè)-25~40 °C的凍融循環(huán)后外觀和粒徑未發(fā)生顯著性變化。
[0076] 因此，本申請(qǐng)的維生素1(2亞微乳具有良好的滅菌穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性，且易被氧 化的藥物得到了保護(hù)，室溫貯存的預(yù)期有效期甚至可達(dá)到2年以上。
[0077]本申請(qǐng)的維生素1(2亞微乳可以直接服用，也可添加至牛奶、酸奶等飲品中進(jìn)行使 用。
[0078]此外，發(fā)明人在對(duì)本申請(qǐng)的維生素1(2亞微乳進(jìn)行大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)， 通過(guò)測(cè)定血藥濃度和計(jì)算相關(guān)參數(shù)，與市售軟膠囊（即油溶液)相比，本申請(qǐng)的維生素心亞 微乳的相對(duì)生物利用度高達(dá)256.27%。
[0079]并且，與現(xiàn)有技術(shù)相比，相比于上市的軟膠囊和片劑，本申請(qǐng)的維生素心亞微乳便 于吞咽困難的患者用藥，能夠提高患者用藥順應(yīng)性，而且能明顯提高藥物的生物利用度;本 申請(qǐng)的維生素 K2亞微乳能夠耐受凍融，降低了對(duì)運(yùn)輸和儲(chǔ)存的條件要求;合適的制備條件 和配方組合提高了維生素心的穩(wěn)定性，使得有效期符合規(guī)定。
[0080] 此外，本申請(qǐng)的維生素 K2亞微乳顯著提高了維生素心的療效和穩(wěn)定性，為廣大患者 提供了更安全、有效、穩(wěn)定的制劑，并且工藝簡(jiǎn)便成熟，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0081] 圖1是維生素 K的結(jié)構(gòu)示意圖，其中A為維生素 K1;B為維生素 K2,其中η為7。
[0082]圖2是本申請(qǐng)的維生素 K2亞微乳26的外觀圖。
[0083]圖3是本申請(qǐng)的維生素 K2亞微乳26的粒度分布圖。
[0084]圖4是分別將本申請(qǐng)的維生素 K2亞微乳26和油溶液灌胃給予大鼠后的藥時(shí)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0085] 下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)描述本申請(qǐng)的實(shí)施方式，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，這些 具體的實(shí)施例僅表明為了達(dá)到本申請(qǐng)的目的而選擇的實(shí)施技術(shù)方案，并不是對(duì)技術(shù)方案的 限制。根據(jù)本申請(qǐng)的教導(dǎo)，結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)對(duì)本申請(qǐng)技術(shù)方案的改進(jìn)是顯然的，均屬于本申請(qǐng) 保護(hù)的范圍。
[0086] 在以下實(shí)施例中，所用到的原料均為市購(gòu)獲得的產(chǎn)品。
[0087]實(shí)施例1維生素 K2亞微乳1和2(不含防凍劑和穩(wěn)定劑）
[0088] 維生素 K2亞微乳1和2的組成如表1所示。
[0089]表1
[0091] 制備方法：
[0092] 稱(chēng)取配方量的維生素 K2、MCT(中鏈脂肪酸甘油三酯）、SPC(大豆卵磷脂）、RH4Q(聚氧 乙烯氫化蓖麻油)或F68(普朗尼克F68)組成油相；
[0093] 移取配方量的蔗糖加入適量的純化水中作為水相;兩相分別抽真空、充氮?dú)猓磸?fù) 3次，將兩相加熱至60°C，待兩相中物質(zhì)完全溶解后，在磁力攪拌的條件下，將水相緩慢加入 到油相中，繼續(xù)攪拌20min，變成均勻牛乳狀，制得初乳；用微射流儀HOOOpsi均質(zhì)4次，以得 到粒徑為80~200nm的亞微級(jí)別的乳劑，加入配方量的混合漿果味香精，用純化水補(bǔ)充至 100%，攪拌均勻，過(guò)0.45μπι的微孔濾膜，制得終乳；
[0094] 將終乳分裝于棕色西林瓶中，充氮?dú)?，加塞，鋁蓋密封，于100°C流通蒸汽下滅菌 30min，冷水噴淋使制劑迅速降至室溫，即得維生素 K2亞微乳1或2。
[0095]其中，維生素 K2購(gòu)自廣東雙駿生物科技有限公司，MCT購(gòu)自遼寧鐵嶺北亞藥用油有 限公司，SPC購(gòu)自江蘇曼氏生物科技有限公司，RH40購(gòu)自上海運(yùn)宏化工制劑輔料技術(shù)有限公 司，F(xiàn)68購(gòu)自海花化工，蔗糖購(gòu)自鄭州明欣化工產(chǎn)品有限公司，混合漿果味香精購(gòu)自上?？?倫娜香精香料有限公司。
[0096] 實(shí)施例2維生素 K2亞微乳3和4(含防凍劑但不含穩(wěn)定劑）
[0097] 維生素 K2亞微乳3和4的組成如表2所示。
[0098]表 2
[0100]制備方法：
[0101] 稱(chēng)取配方量的維生素 K2、MCT、SPC、RH4〇或F68組成油相；
[0102] 移取配方量的甘油、蔗糖加入適量的純化水中作為水相；兩相分別抽真空、充氮 氣，反復(fù)3次，且加熱至60°C。待兩相中物質(zhì)完全溶解后，在磁力攪拌的條件下，將水相緩慢 加入到油相中，繼續(xù)攪拌20min，變成均勻牛乳狀，制得初乳；用微射流儀HOOOpsi均質(zhì)4次 后，以得到粒徑為80~200nm的亞微級(jí)別的乳劑，加入配方量的混合漿果味香精，用純化水 補(bǔ)充至100%，攪拌均勻，過(guò)0.45μπι的微孔濾膜，制得終乳；
[0103] 將終乳分裝于棕色西林瓶中，充氮?dú)?，加塞，鋁蓋密封，于100°C流通蒸汽下滅菌 30min，冷水噴淋使制劑迅速降至室溫，即得維生素心亞微乳。
[0104] 其中，維生素1(2、10'、5?(：、腿(^68、蔗糖、混合漿果味香精與實(shí)施例1相同，且甘油 購(gòu)自浙江遂昌甘油廠。
[0105] 實(shí)施例3維生素 K2亞微乳1-4的滅菌穩(wěn)定性考察和凍融穩(wěn)定性考察
[0106] 如實(shí)施例1或2所述地于100°C流通蒸汽下滅菌30min且冷水噴淋使制劑迅速降至 室溫以測(cè)試亞微乳的滅菌穩(wěn)定性，維生素心亞微乳1-4的滅菌前后的粒徑變化如表3所示：
[0107] 表3
[0109] 其中，M. D.表示平均粒徑，P. I.表示粒度分布。
[0110]由表3可以看出，維生素心亞微乳1-4滅菌前后的粒徑基本保持不變，說(shuō)明其滅菌 穩(wěn)定性良好。
[0111] 取制備好的維生素 K2亞微乳1-4若干瓶，在-20 °C條件下冷凍48h，然后在40 °C加速 條件下放置48h作為一個(gè)循環(huán)，共循環(huán)3次，每完成一個(gè)循環(huán)測(cè)一次粒徑，結(jié)果如表4所示。
[0112] 表4
[0114] 凍融試驗(yàn)結(jié)果表明，不加防凍劑的維生素心亞微乳1-2經(jīng)歷一次凍融循環(huán)后便分 層，而加了防凍劑的維生素 K2亞微乳3-4能夠經(jīng)受得住凍融試驗(yàn)，經(jīng)歷3次凍融循環(huán)后粒徑 變化小于5%，說(shuō)明維生素 K2亞微乳3-4的凍融穩(wěn)定性良好。
[0115] 此外，除了將維生素1(2亞微乳3中的乳化劑分別換成0.1 %的泊洛沙姆237 (Pluronic F-87)、泊洛沙姆338(Pluronic F-108)、泊洛沙姆407(Pluronic F-127)、聚氧 乙稀35蓖麻油（Cremophor EL)和聚氧乙稀60氫化蓖麻油(Cremophor RH 60)中的每一個(gè)及 1.2%的聚山梨酯20(Tween 20)、聚山梨酯40(Tween 40)、聚山梨酯60(Tween 60)、聚山梨 酯80( (Tween 80)、聚乙二醇12羥基硬脂酸酯（solutol HS 15)和聚乙二醇1000維生素 E琥 珀酸酯(TPGS)中的每一個(gè)以外，按照實(shí)施例2中的維生素 K2亞微乳3的配方和制備方法制得 相應(yīng)的維生素 K2亞微乳，進(jìn)行如上所示的測(cè)試，得到基本一致的試驗(yàn)結(jié)果，即滅菌穩(wěn)定性和 凍融穩(wěn)定性良好。
[0116] 除了將維生素 K2亞微乳3中的防凍劑換成具有0.5%或2%的重量百分?jǐn)?shù)的葡萄 糖、木糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、甘露醇、木糖醇、麥芽醇、丙二醇、 PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG1000、PEG2000、PEG4000和PEG6000中的一個(gè)或更多個(gè) 以外，按照實(shí)施例2中的維生素 K2亞微乳3的配方和制備方法制得相應(yīng)的維生素心亞微乳，進(jìn) 行如上所示的測(cè)試，得到基本一致的試驗(yàn)結(jié)果，即滅菌穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性良好。
[0117] 實(shí)施例4維生素 K2亞微乳5_7(含單一脂溶性抗氧劑）
[0?18] 維生素 K2亞微乳5-7的組成如表5所不。
[0119]表5
[0121] 制備方法：
[0122] 稱(chēng)取配方量的維生素 K2、MCT、SPC、RH4()、維生素 E或維生素 C棕櫚酸酯或沒(méi)食子酸丙 酯組成油相；
[0123] 稱(chēng)取配方量的甘油、蔗糖加適量的純化水組成水相；
[0124] 兩相分別抽真空、充氮?dú)猓磸?fù)3次，且加熱至60°C。待兩相中物質(zhì)完全溶解后，在 磁力攪拌的條件下，將水相緩慢加入到油相中，繼續(xù)攪拌20min，變成均勾牛乳狀，制得初 乳；用微射流儀HOOOpsi均質(zhì)4次后，以得到粒徑為80~200nm的亞微級(jí)別的乳劑，加入配方 量的混合漿果味香精，用純化水補(bǔ)充至100%，攪拌均勻，過(guò)0.45μπι的微孔濾膜，制得終乳；
[0125] 將終乳分裝于棕色西林瓶中，充氮?dú)?，加塞，鋁蓋密封，于100 °C流通蒸汽下滅菌 30min，冷水噴淋使制劑迅速降至室溫，即得維生素心亞微乳。
[0126] 其中，維生素1(2、10\5?(：、1^4()、？68、蔗糖、混合漿果味香精、甘油與實(shí)施例2相同， 且維生素 E購(gòu)自巴斯夫維生素有限公司，維生素 C棕櫚酸酯購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公 司，且沒(méi)食子酸丙酯購(gòu)自湖南爾康藥業(yè)有限公司。
[0127] 實(shí)施例5維生素 K2亞微乳8-10(含單一水溶性抗氧劑）
[0128] 維生素 K2亞微乳8-10的組成如表6所示。
[0129]表6
[0131] 制備方法：
[0132] 稱(chēng)取配方量的維生素 K2、MCT、SPC、RH4Q組成油相；
[0133] 稱(chēng)取配方量的甘油、蔗糖、焦亞硫酸鈉或組氨酸或維生素 C加適量的純化水組成水 相；
[0134] 兩相分別抽真空、充氮?dú)?，反?fù)3次，且加熱至60°C。待兩相中物質(zhì)完全溶解后，在 磁力攪拌的條件下，將水相緩慢加入到油相中，繼續(xù)攪拌20min，變成均勾牛乳狀，制得初 乳；用微射流儀HOOOpsi均質(zhì)4次后，以得到粒徑為80~200nm的亞微級(jí)別的乳劑，加入配方 量的混合漿果味香精，用純化水補(bǔ)充至100%，攪拌均勻，過(guò)0.45μπι的微孔濾膜，制得終乳；
[0135] 將終乳分裝于棕色西林瓶中，充氮?dú)猓尤?，鋁蓋密封，于100 °C流通蒸汽下滅菌 30min，冷水噴淋使制劑迅速降至室溫，即得維生素心亞微乳。
[0136] 其中，維生素1(2、10\5?(：、1^4()、蔗糖、混合漿果味香精、甘油與實(shí)施例2相同，且焦 亞硫酸鈉購(gòu)自湖南爾康藥業(yè)有限公司，組氨酸和維生素 C購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0137] 實(shí)施例6維生素 K2亞微乳11-12(添加單一金屬離子螯合劑）
[0138] 維生素 K2亞微乳11-12的組成如表7所示。
[0139] 表7
[0141] 制備方法：
[0142] 稱(chēng)取配方量的維生素 K2、MCT、SPC、RH4Q組成油相；
[0143] 稱(chēng)取配方量的甘油、蔗糖、CaNa2EDTA或Na2EDTA加適量的純化水組成水相；
[0144] 兩相分別抽真空、充氮?dú)?，反?fù)3次，且加熱至60°C。待兩相中物質(zhì)完全溶解后，在 磁力攪拌的條件下，將水相緩慢加入到油相中，繼續(xù)攪拌20min，變成均勾牛乳狀，制得初 乳；用微射流儀HOOOpsi均質(zhì)4次后，以得到粒徑為80~200nm的亞微級(jí)別的乳劑，加入配方 量的混合漿果味香精，用純化水補(bǔ)充至100%，攪拌均勻，過(guò)0.45μπι的微孔濾膜，制得終乳；
[0145] 將終乳分裝于棕色西林瓶中，充氮?dú)猓尤?，鋁蓋密封，于100°C流通蒸汽下滅菌 30min，冷水噴淋使制劑迅速降至室溫，即得維生素心亞微乳。
[0146] 其中，維生素1(2、1(：1'、5?(：、1^4()、蔗糖、混合漿果味香精、甘油與實(shí)施例2相同，且 CaNa2EDTA和Na2EDTA購(gòu)自四川科倫藥業(yè)有限公司。
[0147] 實(shí)施例7維生素 K2亞微乳13-17(添加穩(wěn)定劑組合）
[0148] 維生素 K2亞微乳13-17的組成如表8所示。
[0149] 表8
[0151] 制備方法：
[0152] 稱(chēng)取配方量的維生素 K2、MCT、SPC、RH4()及維生素 E或維生素 C棕櫚酸酯（如果存在） 組成油相；
[0153]稱(chēng)取配方量的甘油、蔗糖、CaNa2EDTA及焦亞硫酸鈉或半胱氨酸或維生素 C(如果存 在)加適量的純化水組成水相；
[0154]兩相分別抽真空、充氮?dú)?，反?fù)3次，且加熱至60°C。待兩相中物質(zhì)完全溶解后，在 磁力攪拌的條件下，將水相緩慢加入到油相中，繼續(xù)攪拌20min，變成均勾牛乳狀，制得初 乳；用微射流儀HOOOpsi均質(zhì)4次后，以得到粒徑為80~200nm的亞微級(jí)別的乳劑，加入配方 量的混合漿果味香精，用純化水補(bǔ)充至100%，攪拌均勻，過(guò)0.45μπι的微孔濾膜，制得終乳；
[0155] 將終乳分裝于棕色西林瓶中，充氮?dú)?，加塞，鋁蓋密封，于100 °C流通蒸汽下滅菌 30min，冷水噴淋使制劑迅速降至室溫，即得維生素心亞微乳。
[0156] 其中，本實(shí)施例所用到的物質(zhì)與實(shí)施例5-8中的相同物質(zhì)的來(lái)源相同。
[0157] 實(shí)施例8維生素 K2亞微乳5-17的滅菌穩(wěn)定性考察和凍融穩(wěn)定性考察
[0158] 如實(shí)施例3所述地考察維生素 K2亞微乳5-17的滅菌前后的粒徑變化，結(jié)果如表9所 不。
[0159] 表9
[0161] 如實(shí)施例4所述地考察維生素 K2亞微乳5-17的凍融穩(wěn)定性，結(jié)果如表10所示。
[0162] 表1〇
[0165]結(jié)果表明，維生素1(2亞微乳5-17的滅菌穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性良好。
[0166] 實(shí)施例9經(jīng)典恒溫法預(yù)測(cè)維生素心亞微乳3-17的有效期
[0167] 將分裝后的維生素 K2亞微乳3-17分別置于70、80、90、100°(：的恒溫烘箱中，按照設(shè) 定的時(shí)間點(diǎn)下取樣，測(cè)定各溫度下的藥物濃度隨時(shí)間的變化，求得藥物降解反應(yīng)級(jí)數(shù)及在 各試驗(yàn)溫度下的反應(yīng)速率常數(shù)K，然后依據(jù)Arrhenius方程，以IgK對(duì)1/T作圖，外推求得藥物 在室溫下的速率常數(shù)K298,由此算出在室溫下藥物含量降低至合格(90% )限所需的時(shí)間， 即室溫貯存有效期，預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表11:
[0168] 表11
[0171] 由表11可知，使用單一的抗氧劑或金屬離子螯合劑能夠提高藥物的化學(xué)穩(wěn)定性， 且能夠?qū)單⑷榈挠行谘娱L(zhǎng)至空白組(未加任何抗氧劑的實(shí)驗(yàn)組）的1.5-3倍;聯(lián)合使用 抗氧化劑和金屬離子螯合劑能夠?qū)崿F(xiàn)更好的抗氧化效果，且能夠?qū)單⑷榈挠行谘娱L(zhǎng)至 2年以上，即為空白組的20倍以上，從而可以實(shí)現(xiàn)該亞微乳的產(chǎn)業(yè)化。
[0172] 實(shí)施例10維生素 K2亞微乳18-23(使用其他油溶液、磷脂、附加乳化劑）
[0173] 維生素 K2亞微乳18-23的組成如表12所示。
[0174] 表12
[0176] 制備方法：
[0177] 稱(chēng)取配方量的維生素 K2、MCT/大豆油/玉米油（如果存在）、SPC/HSPC/DSPC(如果存 在）、RH4〇/F68/TPGS(如果存在）、維生素 E組成油相；
[0178] 稱(chēng)取配方量的甘油、蔗糖、CaNa2EDTA加適量的純化水組成水相；
[0179] 兩相分別抽真空、充氮?dú)猓磸?fù)3次，且加熱至60°C。待兩相中物質(zhì)完全溶解后，在 磁力攪拌的條件下，將水相緩慢加入到油相中，繼續(xù)攪拌20min，變成均勾牛乳狀，制得初 乳；用微射流儀HOOOpsi均質(zhì)4次后，以得到粒徑為80~200nm的亞微級(jí)別的乳劑，加入配方 量的混合漿果味香精，用純化水補(bǔ)充至100%，攪拌均勻，過(guò)0.45μπι的微孔濾膜，制得終乳；
[0180] 將終乳分裝于棕色西林瓶中，充氮?dú)?，加塞，鋁蓋密封，于100 °C流通蒸汽下滅菌 30min，冷水噴淋使制劑迅速降至室溫，即得維生素1(2亞微乳。
[0181] 其中，維生素 K2、MCT、SPC、RH40、F68、蔗糖、混合漿果味香精、甘油、維生素 E、 CaNa2EDTA與前面的實(shí)施例的相同物質(zhì)的來(lái)源相同，且大豆油、玉米油購(gòu)自益海(泰州)糧油 工業(yè)有限公司，HSPC、DSPC、和TPGS購(gòu)自德國(guó)BASF公司。
[0182] 如實(shí)施例3所述地測(cè)試維生素 K2亞微乳18-23滅菌前后的粒徑變化，結(jié)果如表13所 不。
[0183] 表13
[0185] 如實(shí)施例4所述地測(cè)試維生素 K2亞微乳18-23的凍融穩(wěn)定性，結(jié)果如表14所示。
[0186] 表14
[0189] 結(jié)果表明，維生素心亞微乳18-23的滅菌穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性良好。
[0190]如實(shí)施例9所述地測(cè)試維生素 K2亞微乳18-23的預(yù)測(cè)有效期，結(jié)果如表15所示。 [0191]表15
[0193] 此外，發(fā)明人在另外的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用具有1%或10%重量百分?jǐn)?shù)的MCT和大豆 油的混合物（比如重量比為1:0.8和1:1.5的大豆油和MCT的混合物），或其他油如茶油、橄欖 油、椰子油、魚(yú)油、紅花油、芝麻油等或其組合作為維生素 K2亞微乳18的油相，可得到了基本 一致的試驗(yàn)結(jié)果，即滅菌穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性良好，預(yù)測(cè)有效期>2年。
[0194] 使用具有0.1%、0.3%、0.8%或1.2%的重量百分?jǐn)?shù)的其他磷脂如蛋黃卵磷脂 (EPC)、二油酰磷脂酰膽堿（DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿 (DPPC)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰磷脂酰甘 油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰磷脂 酰膽堿(DLPC)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)等中的一種或其任意混合物作為維生素 K2亞 微乳18的磷脂，可得到基本一致的試驗(yàn)結(jié)果，即滅菌穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性良好，預(yù)測(cè)有效期 >2年。
[0195] 使用具有0.5%、1%、1.6%或2.3%的重量百分?jǐn)?shù)其他乳化劑如普郎尼克F87、普 朗尼克F108、普朗尼克F127、普朗尼克P124、泊洛沙姆188(Pluronic F-68)、泊洛沙姆237 (Pluronic F-87)、泊洛沙姆338(Pluronic F-108)、泊洛沙姆407(Pluronic F-127)、聚氧 乙稀35蓖麻油（Cremophor EL)、聚氧乙稀60氫化蓖麻油（Cremophor RH 60)、聚山梨酯20 (Tween 20)、聚山梨酯40(Tween 40)、聚山梨酯60(Tween 60)、聚山梨酯80((Tween 80)、聚 乙二醇12羥基硬脂酸酯（solutol HS 15)中的一種或者兩種代替RH40或TPGS作為該維生素 K2亞微乳18的乳化劑，也可得到基本一致的試驗(yàn)結(jié)果，即滅菌穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性良好，預(yù) 測(cè)有效期>2年。
[0196] 實(shí)施例11維生素 K2亞微乳24-26 (其他載藥濃度）
[0197] 維生素 K2亞微乳24-26的組成如表16所示。
[0198] 表16
[0200]制備方法：
[0201] 稱(chēng)取配方量的維生素 K2、MCT、SPC、RH4()、維生素 E組成油相；
[0202]稱(chēng)取配方量的甘油、蔗糖、CaNa2EDTA加適量的純化水組成水相；
[0203]兩相分別抽真空、充氮?dú)?，反?fù)3次，且加熱至60°C。待兩相中物質(zhì)完全溶解后，在 磁力攪拌的條件下，將水相緩慢加入到油相中，繼續(xù)攪拌20min，變成均勾牛乳狀，制得初 乳；用微射流儀HOOOpsi均質(zhì)4次后，以得到粒徑為80~200nm的亞微級(jí)別的乳劑，加入配方 量的混合漿果味香精，用純化水補(bǔ)充至100%，攪拌均勻，過(guò)0.45μπι的微孔濾膜，制得終乳；
[0204] 將終乳分裝于棕色西林瓶中，充氮?dú)猓尤?，鋁蓋密封，于100 °C流通蒸汽下滅菌 30min，冷水噴淋使制劑迅速降至室溫，即得維生素心亞微乳。
[0205] 其中，維生素 K2、MCT、SPC、RH4()、F68、蔗糖、混合漿果味香精、甘油、維生素 E、 CaNa2EDTA與前面的實(shí)施例的相同物質(zhì)的來(lái)源相同。
[0206]如實(shí)施例3所述地測(cè)試維生素 K2亞微乳24-26滅菌前后的粒徑變化，結(jié)果如表17所 不。
[0207]表17
[0212] 結(jié)果表明，維生素心亞微乳24-26的滅菌穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性良好。
[0213] 如實(shí)施例9所述地測(cè)試維生素 K2亞微乳24-26的預(yù)測(cè)有效期，結(jié)果如表19所示。
[0214] 表19
[0216] 由結(jié)果可知，不同的載藥濃度對(duì)亞微乳的物理穩(wěn)定性無(wú)影響，在研究涉及的濃度 范圍內(nèi)，藥物濃度越大亞微乳的化學(xué)穩(wěn)定性越好，預(yù)測(cè)的有效期越長(zhǎng)。
[0217] 實(shí)施例12維生素 K2亞微乳13-16的穩(wěn)定性研究(加速試驗(yàn)）
[0218] 根據(jù)《化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，加速試驗(yàn)是在超常條件下進(jìn)行的，目 的是通過(guò)加快市售包裝中藥品的化學(xué)物理變化速度來(lái)考察藥品穩(wěn)定性，對(duì)藥品在運(yùn)輸、保 存過(guò)程中可能會(huì)遇到的短暫的超常條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行模擬考察，并初步預(yù)測(cè)樣品在規(guī)定 的貯存條件下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
[0219] 取維生素 K2亞微乳13-16樣品，置于40°C±2°C的人工氣候箱中，分別于0、3、6、9、 12、18、24個(gè)月末取樣，對(duì)外觀、含量和粒徑進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如表20所示。
[0220]表20

[0223] 結(jié)果表明，維生素心亞微乳13-16的長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好。
[0224] 實(shí)施例12維生素 K2亞微乳26的藥動(dòng)學(xué)研究
[0225] 亞微乳:如上制備的維生素 K2亞微乳26,其中維生素 K2亞微乳26的外觀如圖2所示， 且粒度分布圖如圖3所示。
[0226] 維生素 K2 口服油溶液的制備:稱(chēng)取維生素 K2 5. Omg，加入大豆油5g，室溫下攪拌溶 解。
[0227] 給藥方案和樣品采集方法:6只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組，禁食12h后，按照 lmg/kg的給藥劑量灌胃給藥，A組灌胃維生素 K2亞微乳16，B組灌胃維生素 K2 口服油溶液。于 給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、8、1211眼眶取血于肝素抗凝管中，4500印111離心 I Omin分離血漿，所得血漿樣品于-20°C冷凍避光保存待用。
[0228] 血漿樣品處理方法:將冷凍避光保存的大鼠血漿取出，室溫融化。精密移取IOOyL 血漿于1.5mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液(TN，10.0yg/mL)50yL，甲醇IOOyL及正己烷600yL，渦 旋5min混合提取后于1000 Orpm離心10min，移取正己燒層500yL，氮?dú)鈸]干溶劑。殘留物用50 yL流動(dòng)相溶解，禍旋Imin混勾，于1000 Orpm離心10min，取20yL進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)全程避光操作。
[0229] 色譜條件:使用Hypersil BDS C18(200mmX4.6mm，5ym，大連依利特)色譜柱，流動(dòng) 相為甲醇-異丙醇(80:20，￥八），柱溫為35 <€，流速為1.〇11117111；[11，檢測(cè)波長(zhǎng)為24911111，進(jìn)樣量 為20yL。
[0230] 測(cè)得受試制劑的平均血藥濃度如附圖4所示，由結(jié)果可知，維生素心亞微乳26的生 物利用度遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于口服油溶液，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表21:
[0231] 表21維生素 K2亞微乳26與維生素 K2 口服油溶液吸收的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果(n = 3)
[0233] 藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明，維生素1(2亞微乳26的生物利用度明顯優(yōu)于油溶液，相對(duì)生 物利用度為256.27%。
[0234] 本申請(qǐng)包括但不限于以上實(shí)施例，凡是在本申請(qǐng)精神的原則下進(jìn)行的任何等同替 代或局部改進(jìn)，都將視為在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種維生素 κ2亞微乳，包括按所述維生素 K2亞微乳的總重量計(jì)的如下重量百分?jǐn)?shù)的 各組分： 維生素 Κ2 0.0005%~1%， 油 1.0%~10% 磷脂0.1%~1.2%， 乳化劑0.5%~2.3%， 防凍劑0.5%~3.0%， 及水； 其中乳化劑為磷脂以外的其他乳化劑； 優(yōu)選地，按所述維生素心亞微乳的總重量計(jì)，磷脂的重量百分?jǐn)?shù)為0.3 %~0.8 %，乳化 劑的重量百分?jǐn)?shù)為1. 〇 %~1.6 %，防凍劑的重量百分?jǐn)?shù)為0.5 %~2.0 %。2. 如權(quán)利要求1所述的維生素 Κ2亞微乳，還包括按所述維生素心亞微乳的總重量計(jì)的重 量百分?jǐn)?shù)為〇. 02 %~5.0 %的矯味劑。3. 如權(quán)利要求1或2所述的維生素 Κ2亞微乳，還包括按所述維生素心亞微乳的總重量計(jì) 的重量百分?jǐn)?shù)為〇. 〇〇 1 %~1 %，優(yōu)選〇. 〇〇 1 %~〇. 〇 15%的穩(wěn)定劑。4. 如權(quán)利要求1所述的維生素 Κ2亞微乳，其中，所述維生素 Κ2選自ΜΚ-4、ΜΚ-5、ΜΚ-6、ΜΚ- 7、ΜΚ-8和ΜΚ-9中的一種或更多種； 所述油選自大豆油、玉米油、茶油、橄欖油、椰子油、魚(yú)油、紅花油、芝麻油和中鏈甘油三 酯中的一種或更多種，優(yōu)選地，所述油為大豆油和中鏈甘油三酯的混合物，更優(yōu)選地，所述 油是重量比為1:0.8~1:1.5的大豆油和中鏈甘油三酯的混合物； 所述磷脂選自大豆卵磷脂(SPC)、蛋黃卵磷脂(EPC)、氫化大豆磷脂(HSPC)、二油酰磷脂 酰膽堿(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二棕櫚酰磷脂酰 乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰磷脂 酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰 磷脂酰膽堿(DLPC)和二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)中的一種或更多種； 所述乳化劑選自普郎尼克F87、普朗尼克F108、普朗尼克F127、普朗尼克P124、泊洛沙姆 188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338、泊洛沙姆407、聚氧乙烯35蓖麻油、聚氧乙烯40氫化蓖麻 油、聚氧乙烯60氫化蓖麻油、聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80、聚乙二醇 12羥基硬脂酸酯和聚乙二醇1000維生素 E琥珀酸酯中的一種或更多種； 所述防凍劑選自葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、甘露醇、木糖 醇、麥芽醇、丙二醇、甘油、PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG1000、PEG2000、PEG400(^P PEG6000中的一種或更多種;且 所述水為純化水。5. 如權(quán)利要求2所述的維生素 K2亞微乳，其中，所述矯味劑選自甜味劑和香精中的一種 或更多種;優(yōu)選地，所述甜味劑選自蔗糖、葡萄糖、甜菊苷、糖精鈉、阿斯巴甜和木糖醇中的 一種或更多種;所述香精選自藍(lán)莓味、甜橙味、朽 1檬味、蜜桃味、櫻桃味、草莓味、菠蘿味、蒸 枝味、芒果味、甜瓜味、混合衆(zhòng)果味、牛奶、咖啡和可可味的香精。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的維生素 Κ2亞微乳，其中，所述穩(wěn)定劑選自抗氧化劑和金屬離子 螯合劑中的一種或更多種，優(yōu)選地，所述穩(wěn)定劑為抗氧化劑和金屬離子螯合劑的組合物； 優(yōu)選地，所述抗氧化劑選自生育酚及其酯、維生素 C及其鹽、維生素 C棕櫚酸酯、叔丁基 對(duì)羥基茴香醚、二丁甲苯酚、沒(méi)食子酸丙酯、組氨酸、半胱氨酸、亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽和亞 硫酸氫鹽中的一種或更多種;所述金屬離子螯合劑選自乙二胺四乙酸二鈉和乙二胺四乙酸 鈣鈉中的一種或兩種。7. -種用于制備如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的維生素1(2亞微乳的方法，包括如下步 驟： 稱(chēng)取配方量的維生素 K2、油、磷脂和乳化劑組成油相； 稱(chēng)取配方量的防凍劑溶于適量的水中組成水相； 其中，如果存在穩(wěn)定劑，如果穩(wěn)定劑是脂溶性的，將配方量的穩(wěn)定劑添加到油相中，如 果穩(wěn)定劑是水溶性的，則將穩(wěn)定劑添加到水相中； 如果存在甜味劑，將配方量的甜味劑添加到水相中； 將油相和水相分別抽真空，充入保護(hù)氣體，優(yōu)選地充入保護(hù)氣體的次數(shù)為3次;加熱油 相和水相以使兩相中的物質(zhì)均完全溶解，優(yōu)選地加熱至60~65°C，然后在攪拌下將水相緩 慢加入到油相中，繼續(xù)攪拌，優(yōu)選地繼續(xù)攪拌10~40分鐘，變成均勻牛乳狀，制得初乳； 對(duì)所述初乳進(jìn)行均質(zhì)，以得到粒徑為80~200nm的亞微級(jí)別的乳劑，如果存在香精，將 配方量的香精用剩余的水稀釋后加入，如果不存在香精，直接加入剩余的水，至所述乳劑的 總重量達(dá)到100 %，攪拌均勻，并過(guò)微孔濾膜，優(yōu)選地過(guò)0.45μπι微孔濾膜，制得終乳； 將終乳分裝，充入保護(hù)氣體后滅菌。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，用微射流儀、高壓乳勻機(jī)、膠體磨、球磨機(jī)和超聲波 細(xì)胞破碎機(jī)中的一種或更多種設(shè)備來(lái)對(duì)所述初乳進(jìn)行均質(zhì)。9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述保護(hù)氣體選自氮?dú)?、氬氣或氦氣?0. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的維生素心亞微乳或者如權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述 的方法制得的維生素 Κ2亞微乳在制備用于治療出血性疾病、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥、預(yù)防 兒童"生長(zhǎng)痛"、預(yù)防老年人血管鈣化、預(yù)防心腦血管疾病、預(yù)防關(guān)節(jié)病和關(guān)節(jié)炎、或輔助治 療和預(yù)防癌癥的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61P19/10GK106074377SQ201610489774
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】陳杰鵬, 段麗麗, 邱雪蓮, 洪琳, 陳鴻銳, 紀(jì)燁瑜, 蔡桂珠, 陳煜藩, 胡留松, 許志鍇, 葉紅林, 黃曉瑩
【申請(qǐng)人】廣東雙駿生物科技有限公司