一種天然組織來(lái)源的肌腱聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種天然組織來(lái)源的肌腱聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的制備方法，本發(fā)明將哺乳動(dòng)物任意大小的跟腱聯(lián)合骨組織經(jīng)含蛋白酶抑制劑的生理鹽水、含蛋白酶抑制劑的PBS、含Triton X的PBS緩沖液、含SDS的PBS緩沖液、含DNA酶的PBS緩沖液處理，獲得肌腱聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料。本發(fā)明能同時(shí)對(duì)肌腱聯(lián)合骨組織上的肌腱細(xì)胞和骨細(xì)胞以及交界面上的軟骨細(xì)胞進(jìn)行完全去細(xì)胞化處理，且條件溫和、無(wú)ECM損害、快速穩(wěn)定，所得肌腱聯(lián)合骨材料具有生物相容性好、可塑性強(qiáng)、生物力學(xué)強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于修復(fù)臨床上各類病因造成的肌腱退行性疾病，肌腱嚴(yán)重撕裂和肌腱聯(lián)合骨再生、修復(fù)障礙。
【專利說(shuō)明】
一種天然組織來(lái)源的肌腱聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明主要涉及用于組織或器官修復(fù)及其再生的生物領(lǐng)域，具體是一種天然組織來(lái)源的肌腱聯(lián)合骨材料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肌腱撕裂是一種常見(jiàn)病，常在高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)中發(fā)生。患者多為年輕人，以運(yùn)動(dòng)員中尤為常見(jiàn)。其會(huì)造成肌腱損傷，從而造成運(yùn)動(dòng)能力下降，嚴(yán)重的甚至?xí)斐蛇\(yùn)動(dòng)功能喪失，對(duì)生活帶來(lái)極大不便。而骨和肌腱間的撕裂則更為嚴(yán)重。現(xiàn)有的手術(shù)治療對(duì)于此類撕裂尚無(wú)有效的方案，常規(guī)縫合后自然機(jī)體修復(fù)往往發(fā)生肌腱和骨之間的纖維軟骨層退化，取之以力學(xué)性能較差的瘢痕組織。術(shù)后再斷的幾率高，患者的正?；顒?dòng)受到較大限制。
[0003]再生醫(yī)學(xué)和組織工程技術(shù)的出現(xiàn)給了肌腱和骨間撕裂的治療帶來(lái)了新的希望。然而由于肌腱和腱之間的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，用傳統(tǒng)的生物材料模擬難度高，且存在生物相容性差的問(wèn)題。
[0004]細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)含有正常組織或器官細(xì)胞所需的各種生化因子，并且具有天然宏觀及超微三維的立體結(jié)構(gòu)。ECM可調(diào)節(jié)生物物理刺激、生物化學(xué)及分子信號(hào)等一系列組織或器官發(fā)育及修復(fù)所需的各種因素，從而實(shí)現(xiàn)組織或器官的恢復(fù)和再生。因此ECM作為一個(gè)新型的天然生物材料正被廣泛的運(yùn)用于心臟瓣膜、氣管、肌肉、肌腱、軟骨等一系列組織或器官的修復(fù)及再生。而目前針對(duì)肌腱聯(lián)合骨的脫細(xì)胞材料均處于研究的起步階段，現(xiàn)有報(bào)道中制備肌腱聯(lián)合骨材料的方法，細(xì)胞去除不徹底，材料免疫反應(yīng)較嚴(yán)重，且對(duì)ECM的破壞大，材料力學(xué)性能均不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種新型的肌腱連骨脫細(xì)胞材料的制備方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有文獻(xiàn)中方法的不足，可用以制備異體細(xì)胞等免疫原性物質(zhì)去除完全，結(jié)構(gòu)完整，生物活性成分和力學(xué)性能保存完好的肌腱聯(lián)合骨細(xì)胞外基質(zhì)。
[0006]含蛋白酶抑制劑的生理鹽水，其中蛋白酶抑制劑濃度為10-50KIU/ml;
[0007]含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液，其中蛋白酶抑制劑濃度為10_50KIU/ml;
[0008]含TritonX的PBS緩沖液，體積濃度為I%_12%的Triton X-200或TritonX-100的PBS緩沖液;
[0009]含SDS的PBS緩沖液，體積濃度為0.5%_8%的SDS的PBS緩沖液；
[0010]含DNA酶的PBS緩沖液中DNA酶濃度為0.5_2mg/ml ；
[0011]混合抗菌液中青霉素和鏈霉素的濃度分別為20KIU/ml、20KIU/ml，青霉素和鏈霉素的比例為I: I。加入的混合抗菌液與原溶液體積比為I: I。
[0012]上述天然組織來(lái)源的肌聯(lián)合骨材料的制備方法，包括以下步驟:
[0013](I)取宰殺12h以內(nèi)任意哺乳動(dòng)物的跟腱連跟骨，用剪刀除去跟腱上的脂肪，用含蛋白酶抑制劑的生理鹽水漂洗3次，每次20min，去除血液，貼附的脂肪碎片和其他雜質(zhì)。
[0014](2)在含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中，低溫?fù)u床150rpm震蕩24-48小時(shí)，溫度為4°C；
[0015](3)在含Triton X的I3BS緩沖液中，加入混合抗菌液，低溫?fù)u床150rpm震蕩24_48小時(shí)，溫度為4 °C;
[0016](4)在含SDS的PBS緩沖液中，低溫?fù)u床150rpm震蕩24_72小時(shí)，溫度為4°C ；
[0017](5)在含Triton X-100的I3BS緩沖液中，加入混合抗菌液，低溫?fù)u床150rpm震蕩7_16天，溫度為4°C ； (6)在含SDS的PBS緩沖液中，低溫?fù)u床150rpm震蕩2_20天，溫度為4°C ；
[0018](7)在含DNA酶的PBS緩沖液中，加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，濃度分別為201(11]/1111，37°(:搖床150印111震蕩12小時(shí)；
[0019]步驟(2)-(6)中，每個(gè)步驟完成后均用生理鹽水沖洗5小時(shí)。
[0020]上述制備方法得到的天然組織來(lái)源的肌腱聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料。
[0021]針對(duì)目前用于肌腱聯(lián)合骨修復(fù)和再生的材料及其制備方法存在的問(wèn)題，發(fā)明人建立了一種天然組織來(lái)源的肌腱聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的制備方法，該法將哺乳動(dòng)物任意大小的跟腱聯(lián)合骨組織經(jīng)含蛋白酶抑制劑的生理鹽水、含蛋白酶抑制劑的I3BS、含Triton X的I3BS緩沖液、含SDS的PBS緩沖液、含DNA酶的PBS緩沖液處理，獲得肌腱聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料。本發(fā)明能同時(shí)對(duì)肌腱聯(lián)合骨組織上的肌腱細(xì)胞和骨細(xì)胞以及交界面上的軟骨細(xì)胞進(jìn)行完全去細(xì)胞化處理，且條件溫和、無(wú)ECM損害、快速穩(wěn)定，所得肌腱聯(lián)合骨材料具有生物相容性好、可塑性強(qiáng)、生物力學(xué)強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于修復(fù)臨床上各類病因造成的肌腱退行性疾病，肌腱嚴(yán)重撕裂和肌腱聯(lián)合骨再生、修復(fù)障礙。
[0022]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的顯著進(jìn)步在于:
[0023](I)本發(fā)明所采用的肌腱連骨材料是天然來(lái)源的生物材料，具有很好的生物相容性和取材廣泛性；
[0024](2)采用脫細(xì)胞技術(shù)獲得的肌腱連骨不含細(xì)胞等抗原物質(zhì)，可使受體的免疫排斥反應(yīng)降到最低限度，同時(shí)可不含細(xì)菌病毒等有害成分生物安全性高；
[0025](3)本新型脫細(xì)胞技術(shù)在去除異種細(xì)胞的同時(shí)，可保留原先ECM的完整性，具有良好的細(xì)胞外微環(huán)境、生化因子和生物力學(xué)性質(zhì)等，可以最大限度的模擬正常肌腱連骨成分和結(jié)構(gòu)；
[0026](4)本發(fā)明材料可以根據(jù)病人的肌腱、骨形態(tài)大小定制相應(yīng)的脫細(xì)胞肌腱連骨材料，可以直接用來(lái)替換人斷裂的肌腱。
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1是本發(fā)明的肌腱連骨脫細(xì)胞材料的大體外觀圖；
[0028]圖2是肌腱連骨處HE染色組織切片圖顯示無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留；
[0029]圖3是肌腱HE染色組織切片圖顯示無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留；
[0030]圖4是骨HE染色組織切片圖顯示無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留；
[0031 ]圖5是肌腱的DNA檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示材料無(wú)DNA殘留；
[0032]圖6是骨的DNA檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示材料無(wú)DNA殘留；
[0033]圖7是肌腱連骨的極限抗張強(qiáng)度(UTS)，顯示材料力學(xué)強(qiáng)度較好；
[0034]圖8是肌腱連骨的楊氏模量(EM)，顯示材料力學(xué)強(qiáng)度較好；
[0035]圖9是肌腱連骨的最大伸長(zhǎng)率(E)，顯示材料延伸性較好。
具體實(shí)施方案
[0036]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0037]實(shí)施例1脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料的制備和研究
[0038]1、制備肌腱連骨脫細(xì)胞基質(zhì)
[0039](I)取材:取成熟家豬的跟腱連骨，機(jī)械剪除跟腱上附著的脂肪，然后把跟腱剪裁成20mm(長(zhǎng))X5mm(寬)X3mm(厚)，跟骨大小為3mm(厚)X7mm(直徑)
[0040](2)在含10KIU/ml蛋白酶抑制劑的生理鹽水中漂洗3次，每次20min;
[0041 ] (3)在含10KIU/ml蛋白酶抑制劑的I3BS緩沖液中，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩24小時(shí)；
[0042](4)在濃度為4%的含Triton X-100的PBS緩沖液中，1:1加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，濃度為20KIU/ml，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩24小時(shí)；
[0043](5)在濃度為0.5%的含SDS的PBS緩沖液中，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩24小時(shí)；
[0044](6)在濃度為6%的含Triton X_100的PBS緩沖液中，1:1加入青霉素和鏈霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩7天；
[0045](7)在濃度為2%的含SDS的PBS緩沖液中，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩2天；
[0046](8)在濃度為0.5mg/ml的含DNA酶的PBS緩沖液中，1:1加入青霉素和鏈霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，37°C搖床150rpm震蕩12小時(shí)，即可得到脫細(xì)胞的肌腱連骨材料(圖1);
[0047]注:完成每一步驟后均用生理鹽水沖洗5小時(shí)。
[0048](3)肌腱連骨脫細(xì)胞支架的組織學(xué)評(píng)價(jià)
[0049]圖2、圖3、圖4分別是本發(fā)明肌腱連骨脫細(xì)胞支架肌腱連骨部分，肌腱部分，骨部分HE染色放大400倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留圖
[0050](4)肌腱連骨脫細(xì)胞支架的抗原成分定量檢測(cè)
[0051]圖5和圖6分別是本發(fā)明肌腱連骨脫細(xì)胞支架肌腱部分和骨部分DNA定量檢測(cè)幾乎不含有DNA成分圖。
[0052](5)肌腱連骨脫細(xì)胞支架的力學(xué)性能測(cè)驗(yàn)
[0053]圖7，圖8，圖9分別是肌腱連骨脫細(xì)胞支架力學(xué)性能三個(gè)重要衡量指標(biāo)極限抗張強(qiáng)度(UTS)，楊氏模量(EM)，最大伸長(zhǎng)率(E)測(cè)驗(yàn)結(jié)果，顯示和未脫細(xì)胞之前沒(méi)有明顯力學(xué)差
B升。
[0054]實(shí)施例2脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料的制備和研究
[0055](I)取材:取成熟家豬的跟腱連骨，機(jī)械剪除跟腱上附著的脂肪，然后把跟腱剪裁成40mm (長(zhǎng))X2Omm (寬)Χδπιπι (厚)，跟骨大小為5mm (厚)X2 5mm (直徑)
[0056](2)在含30KIU/ml蛋白酶抑制劑的生理鹽水中漂洗3次，每次20min;
[0057](3)在含30KIU/ml蛋白酶抑制劑的I3BS緩沖液中，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩48小時(shí)；
[0058](4)在濃度為8%的含Triton X_100的PBS緩沖液中，1:1加入青霉素和鏈霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩30小時(shí)；
[0059](5)在濃度為8 %的含SDS的PBS緩沖液中，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩36小時(shí)；
[0060](6)在濃度為12%的含Triton X-100的PBS緩沖液中，1:1加入青霉素和鏈霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩16天；
[0061 ] (7)在濃度為6%的含SDS的PBS緩沖液中，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩20天；
[0062](8)在濃度為lmg/ml的含DNA酶的PBS緩沖液中，1:1加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，濃度為20KIU/ml ,37 °C搖床150rpm震蕩12小時(shí)
[0063]其余參考實(shí)施例1的方法進(jìn)行，得到脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料。
[0064]實(shí)施例3脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料的制備和研究
[0065](I)取材:取成熟家豬的跟腱連骨，機(jī)械剪除跟腱上附著的脂肪，然后把跟腱剪裁成40mm(長(zhǎng))X2Omm(寬)X3Iiim(厚)，跟骨大小為4mm(厚)Xl5mm(直徑)
[0066](2)在含50KIU/ml蛋白酶抑制劑的生理鹽水中漂洗3次，每次20min;
[0067](3)在含50KIU/ml蛋白酶抑制劑的I3BS緩沖液中，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩36小時(shí)；
[0068](4)在濃度為4%的含Triton X_100的PBS緩沖液中，1:1加入青霉素和鏈霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩48小時(shí)；
[0069](5)在濃度為0.5%的含SDS的PBS緩沖液中，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩72小時(shí)；
[0070](6)在濃度為612%的含Triton X-200的I3BS緩沖液中，1:1加入青霉素和鏈霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低溫(4 °C)搖床150rpm震蕩1天；
[0071](7)在濃度為6%的含SDS的PBS緩沖液中，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩14天；
[0072](8)在濃度為2mg/ml的含DNA酶的PBS緩沖液中，1:1加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，濃度為20KIU/ml ,37 °C搖床150rpm震蕩12小時(shí)
[0073]其余參考實(shí)施例1的方法進(jìn)行，得到脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料。
[0074]實(shí)施例4脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料的制備和研究
[0075]取馬跟腱聯(lián)合骨，步驟(6)在濃度為10%的含Triton X-100的I3BS緩沖液中，1:1加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，濃度為20KIU/ml，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩7天。其余參考實(shí)施例1的方法進(jìn)行，得到脫細(xì)胞跟腱聯(lián)合骨材料。
[0076]實(shí)施例5脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料的制備和研究
[0077]取狗跟腱聯(lián)合骨，步驟(6)步驟(6)在濃度為8%的含Triton X_100的I3BS緩沖液中，1:1加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，濃度為20KIU/ml，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩7天。其余參考實(shí)施例1的方法進(jìn)行，得到脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料。
[0078]對(duì)實(shí)施例2-5所得脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料分別進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)、抗原成分定量檢測(cè)和力學(xué)檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)施例1類似，這表明可通過(guò)上述多種方法制得多種組織來(lái)源，多種組織大小的脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料，并且對(duì)脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)、抗原成分定量檢測(cè)和軟骨修復(fù)能力檢測(cè)均說(shuō)明材料已經(jīng)完全去除細(xì)胞成分，無(wú)明顯抗原成分殘留。脫細(xì)胞肌腱聯(lián)合骨材料可以作為臨床上肌腱嚴(yán)重撕裂，退化以及肌腱-骨聯(lián)合部位損傷等病人的安全可靠、有效、快速的替代材料。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種天然組織來(lái)源的肌腱聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 步驟(I)取宰殺12h以內(nèi)任意哺乳動(dòng)物的跟腱連跟骨，用剪刀除去跟腱上的脂肪，用含蛋白酶抑制劑的生理鹽水漂洗3次，每次20min，去除血液，貼附的脂肪碎片和其他雜質(zhì)；步驟(2)在含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中，低溫?fù)u床150rpm震蕩24-48小時(shí)，溫度為4°C； 步驟(3)在含Triton X的PBS緩沖液中，加入混合抗菌液，低溫?fù)u床150rpm震蕩24-48小時(shí)，溫度為4 °C; 步驟(4)在含SDS的PBS緩沖液中，低溫?fù)u床150rpm震蕩24-72小時(shí)，溫度為4°C ； 步驟(5)在含Triton X-100的I3BS緩沖液中，加入混合抗菌液，低溫?fù)u床150rpm震蕩7-16天，溫度為4°C ； 步驟(6)在含SDS的PBS緩沖液中，低溫?fù)u床150rpm震蕩2-20天，溫度為4°C ； 步驟(7)在含DNA酶的I3BS緩沖液中，加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，37°C搖床150rpm震蕩12小時(shí)； 步驟(2)-(6)中，每個(gè)步驟完成后均用生理鹽水沖洗5小時(shí)； 含蛋白酶抑制劑的生理鹽水，其中蛋白酶抑制劑濃度為10-50KIU/ml; 含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液，其中蛋白酶抑制劑濃度為10-50KIU/ml; 含Triton X的PBS緩沖液，體積濃度為I %_12% 的Triton X-200或Triton X-100的PBS緩沖液； 含SDS的PBS緩沖液，體積濃度為0.5 % -8 %的SDS的PBS緩沖液； 含DNA酶的PBS緩沖液中DNA酶濃度為0.5-2mg/ml ； 混合抗菌液中青霉素和鏈霉素的濃度都為20KIU/ml，青霉素和鏈霉素的比例為1:1;加入的混合抗菌液與原溶液體積比為I: I。
【文檔編號(hào)】A61L27/36GK105879120SQ201610405128
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】林賢豐, 王晟毓, 宋立陽(yáng), 范順武
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)