專利名稱：與vegf有關的眼科疾病的治療方法
本申請要求享受美國臨時專利申請系列號60/016,658的優(yōu)先權，優(yōu)先權日為1996年5月1日。發(fā)明背景1．發(fā)明領域本發(fā)明廣義上涉及一種抑制與內皮生長因子(VEGF)有關的內皮細胞生長和毛細血管滲透性的方法，例如用一種蛋白激酶C(PKC)的β同工酶抑制劑來抑制VEGF誘導的細胞生長和滲透性的增加。VEGF誘導產生的這些作用和許多眼血管疾病有關。
具體地說，本發(fā)明涉及使用一種蛋白激酶C(PKC)的β同工酶抑制劑來治療眼血管疾病，包括視網膜變性、視網膜水腫、視網膜血管病、視網膜靜脈閉塞、虹膜的新血管形成、組織胞漿菌病和視網膜局部缺血病。
2．相關技術的描述VPF/VEGF是一種糖基化的多功能細胞活素。VPF/VEGF的過度表達和許多眼血管疾病有關。
VPF/VEGF通過活化囊狀-空泡狀的細胞器介導的傳運、遷移和伴有形狀改變和皺褶的肌動蛋白組織再生來誘導內皮細胞的增殖和過度滲透性。它改變內皮細胞基因的表達，誘導組織因子和幾種蛋白酶生成的增加，包括間質膠原酶以及尿激酶類和組織纖溶酶原激活物。這些相同基因的多數(shù)是由肉豆蔻酰佛波醇醋酸酯(PMA)刺激的PKC活化誘導的。
血管內皮生長因子(VEGF)與成纖維細胞生長因子(FGFs)和轉化生長因子(TGFβ)被認為在介導激活患有視網膜局部缺血癥病人的眼內新血管形成方面起著主要作用(aiello,et al.,New England Jour.Medicine,331(22):1480-1487(1994)；Amin,et al.,InvestOphthalmol Vis Sci.,35:3178-3188(1994))。
與VEGF表達增加有關的眼血管疾病中的一種是視網膜變性。與年齡有關的視網膜變性是導致老年人失明的原因。估計85歲以上超過16％、65到74歲之間超過6％的人患有視網膜變性。超過20％的75歲以上的眼科病人患有視網膜變性。這種病在女性中更加常見(LiebowitzHM,Krueer DE,Maunder LE,et al.,“The Framingham Eye Study:VI視網膜變性，”Surv.Opthalmol.24(supp 10:428-457,1980)；Klein,et al.,“與年齡有關的視網膜病流行情況The Beaver DamStudy,”O(jiān)phthalmology,99(6):933-943,1992)。視網膜變性可分為干型和濕型，干型視網膜變性比濕型多10倍以上，但通常其臨床癥狀要輕一些。濕型或滲出性視網膜黃斑變性的臨床癥狀更嚴重一些，其和脈絡膜血管異常生長(脈絡膜的新血管形成)到視網膜下色素上皮或視網膜下間隙中有關，并經常導致嚴重的視覺損害。
視網膜變性在脈絡膜小疣表面造成初始的病理損傷，表現(xiàn)為在視紫紅質上皮(RPE)層內反常的組織沉積，并被認為繼發(fā)于血管機能不全。新的血管于是穿過位于RPE和脈絡膜血管層之間的布魯赫膜生長以至侵襲到視網膜。對視網膜的侵襲引起光感受器的損害并導致能降低視覺的出血。
治療視網膜變性最常見的方法之一是激光療法。激光治療是處理沒有延伸到視網膜中心區(qū)域(凹區(qū))的新血管形成區(qū)域。然而，激光治療后這種疾病通常會復發(fā)(MPS Group,Arch Ophthalmol.,Vol.109,pp.1232-1241(1991))。而且，激光治療會產生剩余的盲點因此對于視網膜中心區(qū)域的新血管形成不是一種最佳的治療方法。只有有限的病人符合這種治療形式的合適標準，主要是由于通常見到的脈絡膜新血管形成的不清楚的或隱性特性所致(Freund et al.,Amer.Jour.Ophthalmol,115:786-791(1993))。干擾素也已經被試著作為一種治療劑，這是基于所知的生長因子的活性，例如成纖維生長因子能刺激病理性血管形成。然而，沒有觀察到一致的效果(Kirkpatrick et al.,Br.J.Ophthalmol.,77:766-770(1993)；Chan et al.,Ophthalmology,101:289-300(1994))。最近，一種用轉化生長因子(TGF)β-2來治療視網膜變性的試驗沒有成功。Biotechnology Newswatch,January1,1996。
隨著人口的快速老齡化，視網膜變性成為一個實際的公眾健康問題。目前，沒有獲得治愈結果并且比滿意效果要低的激光治療仍是唯一可接受的治療方法，盡管FDA最近批準酞胺哌啶酮用于人體臨床試驗。(“視網膜變性的研究常見的眼病、病因和治療引起了新的注意”，Steven Sternberg,Washington Post Health,1995年10月31日)。人們仍迫切需要研制出能有效治療視網膜變性的藥物。
視網膜水腫和多種眼血管疾病例如視網膜炎色點、糖尿病視網膜病、pars planitis、視網膜靜脈阻塞、老年玻璃體膜炎以及眼內外科手術有關(Henkind,Surv.Ophthalmol.28:431-2(1984)；Bird,Surv.Ophthalmol.28；433-6(1984)；Cunha-Vaz,Surv.Ophthalmol.28；485-92(1984))。囊樣斑點水腫是白內障手術后最常見的并發(fā)癥(Yannuzzi,Surv.Ophthalmol.28；540-53(1984))而且可能是做過晶狀體摘除術病人失明的最常見原因(Jampol,et al.,Surv.Ophthalmol.28；535-9(1984))。囊樣斑點水腫通常是自我限制的，并且甚至慢性病也能自發(fā)改善(Yannuzzi,Surv.Ophthalmol.28:540-53(1984))。然而，少量的病人(1-15％)會發(fā)展成不可逆損傷并造成永久性視覺功能喪失(Yannuzzi,et al.,Opthalmology,88:847-54(1981))。
視網膜水腫也是造成患有Vogt-Koyanagi-Harada(VKH)綜合癥的病人后期失明的原因(Rutzen,et al.,J.Ret.and Vit.Dis.,15(6):475-479(1995))。視網膜水腫也與糖尿病視網膜病人和患有鐮狀細胞性貧血、支狀靜脈閉塞、頸動脈病或嚴重高血壓的非糖尿病人的微動脈瘤有著密切的聯(lián)系(Klein,Med.Clin.N.Am.,72:1415-1437(1989))。微動脈瘤經常滲漏出能形成堅硬滲出物的脂蛋白物質。這些滲出物呈現(xiàn)出分散的、聚集的或環(huán)狀的結構。當滲出物和液體聚集在視網膜的后部時，就會形成視網膜水腫，引起嚴重的視力模糊并導致視敏度喪失。
一種被稱為病灶光致凝固法的激光療法被用來治療與微動脈瘤相鄰近的視網膜腫脹區(qū)域。病灶光致凝固法已經被證明能使患有嚴重視網膜水腫的病人的視敏度衰退減小60％，但是對患有輕度到中度視網膜水腫的病人病灶光致凝固法沒有表現(xiàn)出任何療效(Raskin,et al.,Ann.Int.Med.,117(3):226-233(1992))。玻璃體手術只有在與玻璃體-視網膜病理界面有關糖尿病型視網膜水腫的情況下才能改善視覺預后(Vaneffenterre,et al.,J.Francais D Ophtalmol.,16(11):602-610(1993))。用于視網膜水腫的藥物治療例如口服或局部給予茚甲新(Miwa,Drug Intell.Clin.Pharm.,20:548-550(1986))和紅細胞生成素(Friedman,et al.,Amer.J.Kidney Dis.,26(1):202-208(1995))已經被評價過，但是沒有觀察到顯著的效果。人們需要一種能有效治療視網膜水腫的藥物。
雖然已經知道VEGF在某些眼血管疾病病理中起著一些作用，但仍需要確定是否抑制VEGF的功能能對這些眼血管疾病提供治療作用。本發(fā)明證實了通過抑制VEGF的活性能改善多種眼血管疾病的病理癥狀。
發(fā)明概要本發(fā)明的一個目的是提供治療一種眼血管疾病的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供抑制與哺乳動物視網膜水腫有關的毛細血管滲透性的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種抑制誘導新血管形成的血管內皮生長因子(VEGF)的方法。
下面通過一個或多個具體實施方案提供本發(fā)明的這些和其他目的。
本發(fā)明的一個具體實施方案提供了一種治療眼血管疾病的方法，包括向需要這種治療的哺乳動物給以一定有效治療量的蛋白激酶C的β同工酶的一種抑制劑。
本發(fā)明的另一個具體實施方案提供了一種治療哺乳動物中視網膜變性的方法，包括向所述的哺乳動物給以一定有效治療量的蛋白激酶C的β同工酶的一種抑制劑。
本發(fā)明的再一個具體實施方案提供了一種抑制哺乳動物中與視網膜水腫有關的毛細血管滲透性的方法，包括向所述的哺乳動物體中給以一定毛細血管滲透性抑制量的蛋白激酶C的β同工酶的一種抑制劑。
本發(fā)明的再一個具體實施方案提供了一種抑制血管內皮生長因子(VEGF)的方法，包括向所述的哺乳動物體中給以一定VEGF抑制量的蛋白激酶C的β同工酶的一種抑制劑。
本發(fā)明提供了能有效預防和治療多種眼血管疾病的一類化合物。
附圖的簡要說明

圖1表明了PKC抑制劑(S)-3,4-[N,N＇-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-雙-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-二酮對重組人VEGF刺激的內皮細胞生長的抑制作用。
圖2進一步表明了PKC抑制劑(S)-3,4-[N,N＇-1,1′-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-雙-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-二酮對重組人VEGF刺激的內皮細胞生長的抑制作用。
圖3表明了PKC抑制劑對在低氧條件培養(yǎng)的視網膜周邊細胞上表達內源性VEGF的活性的效果。
圖4進一步表明了PKC抑制劑對重組人VEGF刺激的內皮細胞生長的抑制作用。
圖5A,5B表明了VEGF誘導的視網膜滲透性的時間變化過程。
圖6表明了視網膜熒光素滲透性對VEGF的反應。
圖7表明了玻璃體內PKC對視網膜滲透性的抑制和刺激作用。
圖8A,8B表明了口服蛋白激酶C的β同工酶的抑制劑后對視網膜滲透性對VEGF的反應的抑制作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明是用一類特殊的蛋白激酶C抑制劑，即蛋白激酶C的β同工酶抑制劑，尤其是PKC的β同工酶選擇性抑制劑來對抗VEGF的作用。本發(fā)明尤其是用這類特殊的蛋白激酶C抑制劑對抗內皮細胞生長和毛細血管滲透性，特別是生長因子VEGF刺激的內皮細胞生長和毛細血管滲透性。因此，這類化合物能被用來治療與VEGF有關的疾病，尤其是多種眼血管疾病。
本發(fā)明的方法優(yōu)選使用能有效抑制β同工酶的蛋白激酶C抑制劑。一組合適的化合物在以前的技術中通常被描述為雙-吲哚基馬來酰亞胺或大環(huán)雙-吲哚基馬來酰亞胺。在以前的技術中被很好地認識的雙-吲哚馬來酰亞胺包括在美國專利5621098,5552396,5545636,5481003,5491242和5057614中描述的那些化合物,這些文獻都被列入本發(fā)明參考范圍內。大環(huán)雙-吲哚馬來酰亞胺以通式Ⅰ化合物作為特定代表。這些化合物和它們的制備方法已經在美國專利5,552,396中公開過，此專利也列入本發(fā)明的參考文獻中。這些化合物以有效治療量給哺乳動物給藥來抑制與VEGF有關的內皮細胞生長和毛細血管滲透性，并抑制與眼疾病有關的VEGF作用。這些化合物也可以作為預防劑給受到上述疾病危及的病人給藥。
本發(fā)明優(yōu)選使用的是如通式Ⅰ所示的一類化合物(Ⅰ)插入原文P9中的結構式
其中W代表-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-CO-、C2-C6亞烷基、取代亞烷基、C2-C6鏈烯基、-芳基-、-芳基-(CH2)mO-、-雜環(huán)-、-雜環(huán)-(CH2)mO-、-稠合雙環(huán)-、-稠合雙環(huán)-(CH2)mO-、-NR3-、-NOR3-、-CONH-或-NHCO-；X和Y分別獨立地代表C1-C4亞烷基、取代亞烷基，或X、Y和W結合在一起形成-(CH2)n-AA-；R1代表氫或最多至四個的獨立選自鹵素、C1-C4烷基、羥基、C1-C4烷氧基、鹵代烷基、硝基、NR4R5、或NHCO(C1-C4烷基)中的任選取代基；R2代表氫、CH3CO-、NH2或羥基；R3代表羥基、(CH2)m芳基、C1-C4烷基、-COO(C1-C4烷基)、-CONR4R5、-(C=NH)NH2、-SO(C1-C4烷基)、-SO2(NR4R5)或-SO2(C1-C4烷基)；R4和R5獨立地代表氫、C1-C4烷基、苯基、芐基或結合到N上形成飽和或不飽和的五元或六元環(huán)；AA代表一個氨基酸殘基；m獨立地代表0、1、2或3；和n獨立地代表2、3、4或5，或其藥物可接受鹽、前藥或酯。
本發(fā)明更優(yōu)選的一類化合物如結構Ⅰ所示，其中組成部分-X-W-Y-含有4-8個原子，可能被取代或沒被取代。組成部分-X-W-Y-最優(yōu)選含有6個原子。
本發(fā)明的方法使用的其他優(yōu)選化合物是如通式Ⅰ所示，其中R1和R2代表氫，W代表取代的亞烷基、-O-、-S-、-CONH-、-NHCO-、或-NR3-的化合物。本發(fā)明尤其優(yōu)選的是如通式Ⅰa所示的化合物
其中Z代表-(CH2)p-或-(CH2)p-O-(CH2)p-；R4代表羥基、-SH、C1-C4烷基、(CH2)m芳基、-NH(芳基)、-N(CH3)(CF3)、-NH(CF3)或-NR5R6；R5代表氫或C1-C4烷基；R6代表氫、C1-C4烷基或芐基；p代表0、1或2；m獨立地代表2或3，或其藥物可接受鹽、前藥或酯。最優(yōu)先的式Ⅰa化合物是Z是-CH2那些；及R4是-NH2-,-NH(CF3)，或-N(CH3)2，或藥用鹽，前藥或酯。
本發(fā)明的方法使用的其他優(yōu)選化合物是如通式Ⅰ所示，其中W代表-O-、Y代表取代的亞烷基、X代表亞烷基的化合物。這些優(yōu)選的化合物如通式Ⅰb所示
其中Z代表-(CH2)p-；R4代表-NR5R6、-NH(CF3)或-N(CH3)(CF3)；R5和R6獨立地代表H或C1-C4烷基；p代表0、1或2；m獨立地代表2或3，或其藥物可接受鹽、前藥或酯。最優(yōu)選的化合物是通式Ⅰb中p代表1、R5和R6代表甲基的化合物。
因為它們含有一個基本的組成部分，通式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb化合物也能以其藥物可接受酸加成鹽的形式存在。通常用來形成這類鹽的酸包括無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸和磷酸；和有機酸，例如對甲苯磺酸、甲磺酸、乙二酸、對溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸；以及相關的無機酸和有機酸。這些藥物可接受鹽包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、鹽酸鹽、溴酸鹽、碘酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、乙二酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、延胡索酸鹽、馬來酸鹽、2-丁炔-1,4-二酸鹽、3-己炔-2,5-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、二甲苯磺酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、馬尿酸鹽、β-羥丁酸鹽、羥乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、扁桃酸鹽和類似的鹽。尤其使用鹽酸鹽和甲磺酰鹽。
除了藥物可接受鹽，其他鹽也可以存在。它們可以在化合物純化、其它鹽的制備以及化合物或中間體的和定性過程中充當中間體。
通式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb的化合物的藥物可接受鹽也能以多種溶劑化物形式存在，例如以水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺和乙酸乙酯及類似溶劑的溶劑化物存在。這些溶劑化物的混合物也能制備。這類溶劑化物可能是在溶劑結晶中形成的，是在溶劑的制備或結晶中固有的，或外來的。
通式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb的化合物可能存在多種立體異構形式，W可能在取代的亞烷基部分含有手性碳原子?；衔锿ǔＲ韵w形式制備并能方便地使用。同樣，如果需要的話，兩種單獨的對映體也可以用常規(guī)的技術拆分或合成。這些消旋體和單獨對映體以及它們的混合物構成了本發(fā)明方法使用的化合物的一部分。
本發(fā)明使用的化合物也包括式Ⅰ、Ⅰa和Ⅰb的化合物的藥物可接受前藥。前藥是經過化學修飾并且在其活性位點可能沒有生物活性的藥物，但在體內過程中被一種或多種酶或其它因素降解或修飾變成具有生物活性的母藥形式。與其母藥相比，前藥可能具有不同的藥代動力學特性，穿過上皮粘膜的易化吸收，更好的成鹽或溶解度，和/或改善的全身穩(wěn)定性(例如延長的血液半衰期)。典型的化學修飾如下(1)能被酯酶或脂肪酶裂解的酯或酰胺衍生物；
(2)能被特異性或非特異性蛋白酶識別的肽；或(3)通過膜選擇前藥或修飾的前藥而累積在作用位點的衍生物；或上面1-3的任何組合；選擇和制備合適前藥的常規(guī)方法在例如，H.Bundgaard的前藥的設計(1985)中描述。
在Davis等人的美國專利5,057,614中描述了合成雙-吲哚-N-馬來酰亞胺衍生物的方法，在已授權的美國專利5,552,396和Faul等人的歐洲專利申請公開0657411A1中描述了合成適合本發(fā)明使用的優(yōu)選化合物的方法，這些專利都被列入本發(fā)明的參考文獻中。
前面提到的美國專利5,552,396的實施例5g中描述了本發(fā)明一種特別優(yōu)選使用的蛋白激酶β抑制劑((S)-3,4-[N,N′-1,1′-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-雙-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-雙酮鹽酸鹽)。這個化合物是有效的蛋白激酶C抑制劑。它對于蛋白激酶C選擇性比對其它激酶強并且具有很高的同工酶選擇性，即具有β-1和β-2同工酶選擇性。這些化合物的其他鹽也是合適的，尤其是甲磺酸鹽。
一個優(yōu)選的甲磺酸鹽可通過將結構式Ⅱ的化合物與甲磺酸在惰性有機溶劑中反應來制備
所述惰性有機溶劑優(yōu)選有機溶劑/水混合物，最優(yōu)選水-丙酮混合物。其他溶劑例如甲醇、丙酮、乙酸乙酯和它們的混合物也是可行的。有機溶劑與水的配比不重要并且通常由反應物的溶解性決定。優(yōu)選的有機溶劑與水的配比通常是0.1∶1-100∶1，這是溶劑與水的體積比。優(yōu)選1∶1-20∶1最優(yōu)選5∶1-10∶1。最佳的配比依賴于所選擇的溶劑，丙酮優(yōu)選與水以9∶1的比例混合。
兩種反應物通常以約等摩爾的量反應，雖然其他配比，特別是其中甲磺酸過量的配比也是可行的。甲磺酸的加入速度比對反應不重要并且可以快速加入(＜5分鐘)或用6小時或更長時間慢慢加入。反應在0℃到回流溫度的范圍內進行。反應混合物一直攪拌到完全成鹽，用X-射線粉末衍射來確定并且反應可進行5分鐘-12小時。
本發(fā)明的鹽優(yōu)選并且容易制成結晶形式。鹽的三水合物形式可以通過干燥或暴露在20-60％相對濕度條件下迅速地轉化為一水合物形式。鹽實質上是晶體形式使其具有確定的熔點、雙折射和X-射線衍射圖形。通常，晶體有不超過10％的無定形固體，優(yōu)選有不超過5％，最優(yōu)選不超過1％的無定形固體。
甲磺酰鹽通過過濾或其他本領域已知的分離技術從反應混合物中直接分離，產率為50％-100％。如果需要，可以用重結晶和其他本領域已知的純化技術將鹽進一步純化。
在組織培養(yǎng)中由生長因子例如VEGF刺激的內皮細胞表現(xiàn)出比基底細胞快很多的生長速度。本發(fā)明進行的試驗表明，當以約0.1-100nM濃度體外給藥時，蛋白激酶C抑制劑(S)-3,4-[N,N′-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-雙-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-雙酮酸鹽能顯著地抑制生長因子(例如VEGF)刺激的非基底細胞的生長。
重要的是，其他試驗已經證實，組織培養(yǎng)中正常的細胞生長不被此化合物抑制，表現(xiàn)為在含氧量條件下的培養(yǎng)基中沒有VEGF刺激的內皮細胞生長不被抑制。在低氧條件下的培養(yǎng)基中，由于由低氧細胞產生的內源性生長因子VEGF的增加而使細胞生長速度增加。蛋白激酶C抑制劑(S)-3,4-[N,N＇-1,1′-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-雙-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-雙酮酸鹽又能使這種低氧條件誘導的細胞生長恢復正常。
本發(fā)明提供的試驗證實了毛細血管滲透性也受生長因子例如VEGF的影響。試驗表明在一個動物模型中，VEGF最多能將毛細血管滲透性顯著提高到3倍。這種依賴于VEGF的毛細血管滲透性的增高也與劑量有關。根據動物體內試驗，蛋白激酶C抑制劑以約25mg/kg/天的濃度在VEGF之前給藥能大大抑制VEGF誘導的毛細血管滲透性。特別考慮以1nM-5mM優(yōu)選以1nM-500nM的濃度使用。抑制作用最高能達到80％并且通常對生長因子誘導的毛細血管滲透性具有特異性。毛細血管滲透性能通過血管熒光造影術測定。尤其在視網膜水腫中，血管熒光造影術是將熒光染料注射到血液中來檢測視網膜內的滲透區(qū)域的視網膜造影過程。
雖然不希望受到任何技術說明的限制，本申請人相信，所有由血流下降引起的視網膜灌注變化、視網膜毛細血管缺失、周邊脈管系統(tǒng)發(fā)育不全或閉塞、來自視網膜的脈絡膜血液的供給分離都能導致相對的視網膜局部缺血。這種局部缺血刺激生長因子例如VEGF在視網膜周皮細胞、內皮細胞、視紫紅質上皮細胞、神經膠質細胞和其他可能類型的細胞內進行合成和分泌；隨后導致視網膜新血管的形成和毛細血管滲透性的增加。這些病理狀態(tài)和多種眼血管疾病有關。
本發(fā)明中描述的PKCβ同工酶抑制劑能被用來治療與內皮細胞生長和毛細血管滲透性有關的疾病，尤其是多種眼血管疾病。
適于本發(fā)明化合物治療的眼血管疾病包括但不僅限于視網膜變性、視網膜水腫、視網膜血管病、視網膜靜脈阻塞、虹膜新血管形成、組織胞漿菌病和視網膜局部缺血癥。視網膜變性可能和年齡有關。視網膜水腫和糖尿病或視網膜中心阻塞有關。本發(fā)明中使用的術語視網膜血管病不包括糖尿病視網膜癥，但包括與鐮狀細胞性貧血、早產兒、角狀或柱狀網狀組織的新血管形成有關的視網膜血管病。虹膜的新血管形成可能與糖尿病有關或無關。
本領域普通技術人員能知道本發(fā)明中的PKCβ同工酶抑制劑的有效治療量是能通過抑制VEGF而充分抑制內皮細胞生長或毛細血管滲透性增加的量，并且此劑量特別依賴于受作用的組織的大小、治療制劑中化合物的濃度和病人的體重。通常，作為治療劑來治療眼血管疾病的蛋白激酶Cβ同工酶抑制劑的給藥量由主治醫(yī)師根據不同的病例來決定。作為指導準則，在調整合適的給藥劑量時，要考慮病人新血管形成的程度、體重和年齡。
通常，合適的劑量是能使蛋白激酶Cβ同工酶抑制劑在治療位點的濃度達到0.5nM-200μM，更經常是0.5nM-200nM。預期在大多數(shù)情況下化合物在血清中濃度達到0.5nM-100nM時應該是足夠的。
為了達到治療濃度，需要治療的病人應以約0.001mg-50.0mg/天/kg體重的量給藥。通常，不超過約1.0-10.0mg/天/kg體重的蛋白激酶Cβ同工酶抑制劑應該是需要的。就象上面提過的一樣，所述的劑量也根據不同的病例而變化。
通式Ⅰ和優(yōu)選的通式Ⅰa和Ⅰb的化合物優(yōu)選在給藥前先制成制劑。合適的藥用制劑通過熟知的技術并采用可方便獲得的組分制備。在制備適于本發(fā)明的方法使用的組合物時，活性組分通常和載體混合或用載體稀釋或裝入以膠囊、小藥囊、紙袋或其他容器形式存在的載體中。當載體作為稀釋劑時，可能采用固體、半固體或液體材料作為活性組分的載體、賦形劑或介質。因此，組合物可以制成片劑、丸劑、粉劑、錠劑、小藥囊、扁囊劑、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液、糖漿劑、氣霧劑(固體或在液體介質中)、軟和硬明膠膠囊劑、栓劑、無菌注射液以及口服或局部使用的無菌包裝粉劑。
合適的載體、賦形劑和稀釋劑的實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃芪膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、含水糖漿、甲基纖維素、苯甲酸甲酯和苯甲酸丙基羥酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。此外制劑中還包括潤滑劑、濕潤劑、乳化和懸浮劑、防腐劑、甜味劑或矯味劑。本發(fā)明的組合物可以配制成病人給藥后使活性組分快速、持續(xù)或延遲釋放的劑型。組合物優(yōu)選以一個單位劑量形式制劑，每單位劑量含有約0.05mg-約3g更經常是約750mg的活性組分。然而，需要知道的是給予的治療劑量由主治醫(yī)生根據相關情況包括要治療疾病的嚴重程度、給藥化合物的選擇和給藥途徑的選擇來決定。因此，上面的劑量范圍不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。術語“單位劑量形式”指適于作為受治療的人和其它哺乳動物單位劑量的實際上不連續(xù)的單位，每一單位含有一預定量的預計能產生希望的治療效果的活性組分和合適的藥用載體。
除了上面提到的大多數(shù)是口服給藥的制劑外，本發(fā)明使用的化合物也能局部給藥。局部給藥制劑包括軟膏劑、乳膏劑和凝膠劑。
油膏通常用(1)油脂性基質，即由脂肪油或碳氫化合物組成的基質，例如白凡士林或礦物油，或(2)能吸收基質，即由無水物質或能吸水物質組成的基質，例如無水羊毛脂制備。通常，在基質形成后，無論是油脂性的還是吸收性的，活性組分(化合物)都以能達到所希望的濃度的量加入。
乳膏劑和油/水乳劑。它們由油相(分散相)和水相(連續(xù)相)組成，油相包括典型的脂肪油、碳氫化合物和類似物，例如蠟、凡士林、礦物油和類似物；水相包括水和水溶性物質，例如加成鹽。兩種相用乳化劑穩(wěn)定，乳化劑例如是表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉；親水膠體，如阿拉伯膠態(tài)白土、硅酸鎂鋁以及類似物。在乳劑的制劑過程中，活性組分(化合物)以能達到所希望濃度的量加入。
凝膠含有從油脂性基質、水或乳液-懸浮液基質中選擇的基質。將在基質中形成母質的膠凝劑加入基質中以增加其粘性。膠凝劑的實例有羥丙基纖維素、丙烯酸聚合物以及類似物。通常，在制劑過程中，活性組分(化合物)以所希望的濃度在加入凝膠劑之前加入。
化合物混合到局部給藥制劑中的量不是關鍵的；其濃度應該在一定范圍內，在此范圍內足以能使備用制劑以一定的量作用到待治療組織，此一定量的制劑能使化合物以所希望的量釋放到希望治療的位點。
通常，局部用制劑用于欲治療組織所需的常規(guī)量依賴于需治療組織的大小和制劑中化合物的濃度。通常制劑以約1-約500μg化合物/cm2治療組織的量施用于被作用的組織，化合物優(yōu)選以約30-約300μg/cm2，更優(yōu)選約50-約200μg/cm2，最優(yōu)選約60-約100μg/cm2的量給藥。
下面制劑的具體實例只是作為說明而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
制劑1明膠硬膠囊用下面的組分制備量(mg/膠囊)活性劑 250干燥淀粉200硬脂酸鎂 10總量460mg將上面的組分混合并以460mg的量裝入明膠硬膠囊中。
制劑2片劑用下面的組分制備量
(mg/片)活性劑250微晶纖維素400煅燒的二氧化硅 10硬脂酸 5總量665mg將組分混合并壓制成片重為665mg的片劑。
制劑3每片含60mg活性組分的片劑用下面的組分制備量(mg/片)活性劑60mg淀粉 45mg微晶纖維素35mg聚乙烯吡咯烷酮(10％水溶液) 4mg羧甲基淀粉鈉 4.5mg硬脂酸鎂 0.5mg滑石粉 1mg總量 150mg將活性組分、淀粉和纖維素過美國No.45目篩并充分混合。將聚乙烯吡咯烷酮溶液和得到的粉末混合，過美國No.14目篩。將制得的顆粒在50℃條件下干燥，然后過美國No.18目篩。將羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂和滑石粉先過美國No.60目篩，然后加入到顆粒中，混合后在壓片機上壓制成片，每片重150mg。
實施例這些實施例都是用來證明使用(S)-3,4-[N,N＇-1,1＇-((2″氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-雙-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-雙酮鹽酸鹽能在體外抑制由VEGF刺激的內皮細胞生長和在體內抑制VEGF刺激的毛細血管滲透性增加。實施例1在本實施例中，使用重組人VEGF來驗證上面提到的化合物對由VEGF刺激的內皮細胞生長的抑制效果。
牛視網膜內皮細胞是從新鮮的小牛眼睛中通過均化和一系列過濾步驟提取到的。原代內皮細胞培養(yǎng)物是在粘連蛋白包被的(NYBenReagent，紐約血液中心)的培養(yǎng)皿(Coster)中生長，該培養(yǎng)皿中含有Dulbecco＇s修飾的Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)，以及5.5mM葡萄糖，10％的血漿來源的馬血清(Wheaton,Scientific)。每升有50mg肝素和50單位內皮細胞生長因子(Boehringer Mannheim)。細胞融合后，培養(yǎng)基變?yōu)楹?％胎牛血清(HyClone)。培養(yǎng)基每3天更換一次。內皮細胞的純一性用反因子Ⅷ抗體來確定。
所提及的PKC抑制劑在體外對VEGF作用的抑制效果通過牛視網膜微血管內皮細胞的稀疏涂布培養(yǎng)物來評價，加入VEGF刺激細胞生長。牛視網膜內皮細胞在24-孔培養(yǎng)皿(Coster)中稀疏涂布(每孔中約有2500個細胞)，在含有10％小牛血清(GIBCO)的DMEM中過夜培養(yǎng)。第二天將基質更換。
為了測定所提及的PKC抑制劑對內皮細胞生長影響的效果，進行了一系列的試驗，其中不含任何活性劑的細胞生長作為對照組，然后測定加入所提及的PKC抑制劑在含有VEGF(25ng/ml；Genentech)和不含有VEGF的兩種情況下的效果。在37℃培養(yǎng)4天后，將細胞溶解在0.1％的十二烷基硫酸鈉(SDS)中，用Hoechst 33258染料和熒光計(TK0-100型；Hoefer)測定DNA含量。
所有測定至少平行地進行3次，試驗最少重復3次。所有試驗結果都用±SD表示。體外結果分析通過非成對斯氏T檢驗進行。P值＜0.050被認為具有顯著的統(tǒng)計學差異。
圖1說明了用重組VEGF得到的結果。如圖上最左邊3個柱形所示，把所提及的PKC抑制劑加入內皮細胞培養(yǎng)物對基礎生長速度本質上沒有影響(柱1)。加入VEGF使細胞生長速度有實質性增加(柱4)。加入濃度＞0.5nM的所提及PKC抑制劑時，這種細胞生長速度有實質性的減小(最右邊4個柱)。實施例2本實施例與圖1所報告的工作一樣并進一步闡明了所提及的PKC抑制劑對VEGF刺激的內皮細胞生長的抑制效果，試驗使用重組的人VEGF。
使用實施例1中的技術，分離和生長牛視網膜內皮細胞；隨后制備稀疏涂布的培養(yǎng)物。再使用實施例1中的技術操作，進行試驗以測定加入所提及的PKC抑制劑對含有VEGF(25ng/ml；Genentech)和不含有VEGF的兩種情況下的影響。在37℃培養(yǎng)4天后，將細胞溶解在0.1％的十二烷基硫酸鈉(SDS)中，用Hoechst 33258染料和熒光計(TKO-100型；Hoefer)測定DNA含量。
圖2說明了本實施例的結果。如-VEGF圖上面的柱形所示，把所提及的PKC抑制劑以0.1nM-100nM濃度加入內皮細胞培養(yǎng)物對細胞基礎生長速度都沒有本質影響。用重組人VEGF(25ng/ml)刺激內皮細胞，4天后細胞中DNA含量與沒受刺激的細胞相比有顯著的增加(-VEGF與+VEGF在抑制劑濃度為0時相比)，這表示生長速度的增加。加入所提及的PKC抑制劑使細胞生長速度有實質性減小(+VEGF圖上面最右邊4個柱)。尤其當PKC抑制劑濃度為0.1nM時VEGF的刺激能力輕微下降，當同時加入的PKC抑制劑濃度達到1nM及更大時VEGF的刺激能力完全被消除。實施例3本實施例測定了所提及的PKC抑制劑對在無氧條件下培養(yǎng)的視網膜周皮細胞上表達的內源性VEGF活性的影響。
牛視網膜內皮細胞和視網膜周皮細胞通過均化和一系列過濾步驟從新鮮的小牛眼中提取。內皮細胞用實施例1中的技術來生長并在培養(yǎng)皿中稀疏涂布培養(yǎng)。牛視網膜周皮細胞用相同的技術在含有20％胎牛血清的DMEM/5.5mM葡萄糖中培養(yǎng)。
用來表達內源性VEGF的無氧條件的培養(yǎng)基和正常氧條件的對照培養(yǎng)基各自依據下面的方法制備。用預先裝有計算機控制的水套CO2紅外線恒溫箱的Lab-Line儀器將融合的單層視網膜周皮細胞暴露于2％O2/5％CO2/93％N2條件下24小時，所述的恒溫箱裝有減少O2控制器(480型)。所有細胞維持在37℃，通過用光學顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)細胞沒有任何形態(tài)改變并不含臺盼藍染料(＞98％)，隨后能正常傳代。來自同批同代的細胞在正常氧(95％空氣/5％CO2)條件下培養(yǎng)以作為對照組。隨后培養(yǎng)基在使用前收集并過濾(Nalgene；0.22μm)。
在本實施例中，進行的試驗是測定PKC抑制劑對在有氧條件培養(yǎng)基或無氧條件培養(yǎng)基中的內皮細胞生長的影響。如前面實施例中所做的一樣，在37℃培養(yǎng)4天后，將細胞溶解在0.1％的十二烷基硫酸鈉(SDS)中，用Hoechst 33258染料和熒光計(TKO-100型；Hoefer)測定DNA含量。
在圖3說明的試驗中，所提及的PKC抑制劑使用的濃度是10nM。如圖3所示，視網膜內皮細胞生長受到由在無氧條件下培養(yǎng)的視網膜周皮細胞制備成的條件培養(yǎng)基刺激，這種無氧條件能誘導VEGF表達(比較圖3中柱1到柱3)。當存在PKC抑制劑(S)-3,4-[N,N′-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-雙-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-雙酮鹽酸鹽時，生長刺激被抑制(正?；?(比較數(shù)柱3到柱4)。實施例4本實施例與圖1和2報告的工作相同并進一步說明所提及的PKC抑制劑對VEGF所刺激的內皮細胞生長的抑制效果，試驗使用重組人VEGF。
使用實施例1中的技術分離和生長牛視網膜內皮細胞；制備稀疏涂布的培養(yǎng)物。再使用實施例1中的技術操作，進行試驗以測定所提及的PKC抑制劑的加入在含有(+VEGF)(25ng/ml；Genentech)和不含有VEGF(-VEGF)的兩種情況中的影響。同上，在37℃培養(yǎng)4天后，將細胞溶解在0.1％的十二烷基硫酸鈉(SDS)中，用Hoechst 33258染料和熒光計(TKO-100型；Hoefer)測定DNA含量。
圖4說明了本工作的結果。如-VEGF圖上面的柱形所示，把所提及的PKC抑制劑以10nM濃度加入內皮細胞培養(yǎng)物對細胞基礎生長速度沒有本質影響。重組人VEGF(25ng/ml)對內皮細胞的刺激作用使細胞中DNA的含量同沒有VEGF刺激的細胞相比有了顯著的增加，這表示細胞生長速度的增加(比較-VEGF對照組與+VEGF對照組)。所提及的PKC抑制劑以10nM濃度加入使生長速度被顯著減小。
這些結果證實所披露的一系列PKC抑制劑尤其是(S)-3,4-[N,N＇-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-雙-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-雙酮能在體外阻止由外原的或低氧誘導的VEGF對視網膜內皮細胞生長的刺激。既然VEGF的表達與和視網膜變性有關的新血管形成密切相關，這些結果證實了PKC抑制劑能作為治療劑治療視網膜變性。實施例5
本實施例表明了VEGF誘導視網膜滲透性的時間過程。
在每只大鼠的一只眼睛的玻璃體內注射2.0ngVEGF(估計最終濃度為25ng/ml)。相反一側的眼睛注射同樣體積的對照溶液。10分鐘后，將30微升熒光素溶液通過導管注射到右頸靜脈中。玻璃體的熒光光度測定在熒光素注射后指定時間進行。
如圖5A所示，注射過VEGF的眼睛內，玻璃體對熒光素的滲透性有明顯的增加。在熒光素血管造影注射10分鐘內具有統(tǒng)計學顯著的差異，并且維持至少30分鐘。圖5B表明以對照百分比表示的刺激作用證實了注射過VEGF的眼睛超時后有額外的熒光素滲漏。實施例6本實施例表明了視網膜中熒光素的滲透性對VEGF劑量的反應。
在每只動物的一只眼睛內注射對照溶液，相反一側的眼睛注射不同劑量的VEGF。10分鐘后靜脈注射熒光素，30分鐘后分析玻璃體內熒光素滲透量。如圖6所示，視網膜滲透量的增長依賴于VEGF的劑量。刺激作用在14-20ng/ml時能達到人可以獲得的最大值。實施例7本實施例證實了PKC抑制劑(S)-3,4-[N,N′-1,1′-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-雙-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-雙酮鹽酸鹽在玻璃體中的作用和其對視網膜滲透性的刺激作用。
鼠的兩只眼睛每只注射如圖7所示的2.0ngVEGF、10nMPKCβ抑制劑或1毫克PDBU(一種PKC激動劑)。PKCβ抑制劑在VEGF加入之前15分鐘注射。VEGF注射10分鐘后，靜脈注射熒光素，30分鐘后評價玻璃體中熒光素的量。
如圖7所示，VEGF注射到玻璃體后表現(xiàn)出了預期的視網膜滲透性刺激作用。在VEGF注射之前15分鐘注射PKCβ抑制劑消除了大部分滲透性反應。注射對蛋白激酶C有直接刺激作用的PDBU使?jié)B透性增加，這和注射VEGF的效果非常相似。實施例8本實施例證實了口服給藥蛋白激酶Cβ抑制劑(S)-3,4-[N,N＇-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-雙-(3,3′-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-雙酮鹽酸鹽對VEGF刺激的視網膜滲透性的抑制作用。
給鼠進食混有蛋白激酶Cβ抑制劑的食物，其中抑制劑的劑量如圖8A和8B所示。飼養(yǎng)一周后，用前面討論過的方法測定視網膜滲透性對玻璃體內注射的2.0ng的VEGF的反應。本發(fā)明的PKCβ抑制劑口服給藥一周后降低了視網膜滲透性對VEGF的反應。在較高劑量時效果最顯著。
本發(fā)明的原理、優(yōu)選實施方案和操作方式已經在前面的說明書中描述過了。然而這兒所要保護的發(fā)明不應理解為將其限制于所公開的特定方式，因為它們只是闡述性的而不是限制性的。本領域普通技術人員在不脫離本發(fā)明主題的前提下可以對本發(fā)明做一些變化和改變。
權利要求
1．一種治療眼血管疾病的方法，該方法包括給與需要治療的哺乳動物有效治療量的蛋白激酶Cβ同工酶抑制劑。
2．根據權利要求1的方法，其中所述的蛋白激酶Cβ同工酶抑制劑是雙-吲哚基馬來酰亞胺或大環(huán)雙-吲哚基馬來酰亞胺。
3．根據權利要求1的方法，其中所述的抑制劑是同工酶選擇性的并且同工酶選擇性是選自β-1和β-2同工酶的。
4．根據權利要求3的方法，其中所述的蛋白激酶C抑制劑具有下面的通式
其中W代表-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-CO-、C2-C6亞烷基、取代亞烷基、C2-C6鏈烯基、-芳基-、-芳基-(CH2)mO-、-雜環(huán)-、-雜環(huán)-(CH2)mO-、-稠合雙環(huán)-、-稠合雙環(huán)-(CH2)mO-、-NR3、-NOR-、-CONH-或-NHCO-；X和Y分別獨立地代表C1-C4亞烷基、取代亞烷基，或X、Y和W結合在一起形成-(CH2)n-AA-；R1代表氫或最多至四個獨立地選自鹵素、C1-C4烷基、羥基、C1-C4烷氧基、鹵代烷基、硝基、NR4R5或NHCO(C1-C4烷基)任選性取代基；R2代表氫、CH3CO-、NH2或羥基；R3代表羥基、(CH2)m芳基、C1-C4烷基、-COO(C1-C4烷基)、-CONR4R5、-(C=NH)NH2、-SO(C1-C4烷基)、-SO2(NR4R5)或-SO2(C1-C4烷基)；R4和R5分別獨立地代表氫、C1-C4烷基、苯基、芐基或結合到N上形成飽和的不飽和的五元或六元環(huán)；AA代表一個氨基酸殘基；m獨立地代表0、1、2或3；和n獨立地代表2、3、4或5，或其藥物可接受鹽、前藥或酯。
5．根據權利要求4的方法，其中所述的蛋白激酶C抑制劑具有下面的通式
其中Z代表-(CH2)p-或-O-(CH2)p、-(CH2)p-O-(CH2)p-；R4代表羥基、-SH、C1-C4烷基、(CH2)m芳基、-NH(芳基)、-N(CH3)(CF3)、-NH(CF3)或-NR5R6；R5代表氫或C1-C4烷基；R6代表氫、C1-C4烷基或芐基；p代表0、1或2；m獨立地代表2或3，或其藥物可接受鹽、前藥或酯。
6．根據權利要求4的方法，其中所述的蛋白激酶C抑制劑具有下面的通式
其中其中Z代表-(CH2)p-；R4代表-NR5R6、-NH(CF3)或-N(CH3)(CF3)；R5和R6分別獨立地代表H或C1-C4烷基；p代表0、1或2；m獨立地代表2或3，或其藥物可接受鹽、前藥或酯。
7．根據權利要求4的方法，其中所述的蛋白激酶C包含(S)-3,4-[N,N＇-1,1＇-((2″-乙氧基)-3_(O)-4_-(N,N-二甲胺基)-丁烷)-雙-(3,3＇-吲哚基)]-1(H)-吡咯-2,5-雙酮或其藥物可接受酸鹽。
8．根據權利要求1的方法，其中所述的眼血管疾病是選自視網膜變性、視網膜水腫、視網膜血管病、虹膜的新血管形成、視網膜靜脈阻塞、組織胞漿菌病和視網膜局部缺血病。
9．根據權利要求1的方法，其中所述的眼血管疾病是選自視網膜變性、視網膜水腫和視網膜靜脈阻塞。
10．根據權利要求8的方法，其中所述的視網膜血管病是視網膜早熟病。
11．一種抑制VEGF刺激的內皮細胞生長的方法，該方法包括給與需要治療的哺乳動物有效治療量的蛋白激酶Cβ同工酶抑制劑。
12．一種抑制VEGF刺激的與視網膜水腫有關的毛細血管滲透性的方法，該方法包括給與需要治療的哺乳動物有效治療量的蛋白激酶Cβ同工酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制VEGF刺激的例如與視網膜變性有關的內皮細胞生長和例如與視網膜水腫有關毛細血管滲透性的方法,尤其是使用PKC同工酶選擇性抑制劑(S)－3,4－[N,N′－1,1′－((2″－乙氧基)－3″′(O)－4″′－(N,N－二甲胺基)－丁烷)－雙－(3,3′－吲哚基)]－1(H)－吡咯－2,5－雙酮鹽酸鹽。
文檔編號A61K41/00GK1222850SQ97195699
公開日1999年7月14日 申請日期1997年5月1日 優(yōu)先權日1996年5月1日
發(fā)明者L·P·阿伊羅, M·R·吉羅瑟克, G·L·金, L·維格納蒂, D·K·韋斯 申請人:伊萊利利公司