專利名稱：：來源于膽汁的治療免疫系統(tǒng)紊亂的免疫調(diào)節(jié)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫調(diào)節(jié)組合物，包含這種組合物的藥物組合物和所說的組合物在治療哺乳動(dòng)物上的用途。具體地說，這種組合物直接針對(duì)治療與免疫系統(tǒng)紊亂相關(guān)的疾病。
背景技術(shù)：
：預(yù)防和治療癌癥和自身免疫、感染和炎癥疾病的療法一直在發(fā)展，所有這些疾病都是不足的免疫系統(tǒng)應(yīng)答的直接結(jié)果。一些治療方法試圖在治療上利用免疫系統(tǒng)。一種方法基于免疫系統(tǒng)的抗原特異性因子，即抗體和T細(xì)胞。例如，研究已經(jīng)集中在針對(duì)外來物或針對(duì)某些內(nèi)源化學(xué)信使(白細(xì)胞介素)的疫苗，以便控制和誘導(dǎo)某些抗體反應(yīng)。第二種方法基于來源于免疫系統(tǒng)非抗原特異性部分的肽和蛋白質(zhì)的分離、克隆、表達(dá)和產(chǎn)生。例如，包含由白血細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素的蛋白質(zhì)(如細(xì)胞因子)和刺激淋巴細(xì)胞和消化外來抗原的清除細(xì)胞的干擾素賦予這種治療的可能性。例如，如果能夠增加對(duì)腫瘤的早期免疫應(yīng)答，以便腫瘤不會(huì)達(dá)到關(guān)鍵的大小，癌癥的治療則能大大的改進(jìn)。已經(jīng)提出的增加腫瘤免疫應(yīng)答的策略包括腫瘤相關(guān)抗原的特異性疫苗；針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原(如針對(duì)IL-2受體)的單克隆抗體的用途；包含抗腫瘤抗體和超級(jí)抗原的雙特異性分子。最近，研究了生理活性多肽(被認(rèn)為是腫瘤壞死因子(TNF))的作用。已表明TNF誘導(dǎo)腫瘤的壞死，對(duì)活體的正常組織沒有影響。在美國(guó)專利4,879,226已經(jīng)公開了TNF的氨基酸序列和編碼TNF的DNA的堿基序列。由于，已表明TNF具有誘導(dǎo)腫瘤壞死的作用，所以任何在體內(nèi)能刺激TNF產(chǎn)生和生物可利用的試劑都具有治療各種癌癥病癥的潛在的用途。此外，任何在體外能刺激人類單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF的試劑，作為一種用于提供治療給藥目的以及用于分析和診斷目的的TNF源的手段都是有用的。其它的疾病也具有或和削弱的免疫系統(tǒng)應(yīng)答有關(guān)。例如，自身免疫疾病是這些紊亂，其中免疫系統(tǒng)產(chǎn)生機(jī)體的非外來物質(zhì)的抗體，結(jié)果導(dǎo)致炎癥，并進(jìn)一步引起組織損壞。例如，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫疾病，其中機(jī)體的免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤地將關(guān)節(jié)襯料的正常細(xì)胞(稱為滑膜)識(shí)別為外來物質(zhì)。自身免疫的發(fā)作可以完全破壞襯料。在最一種的情況下，關(guān)節(jié)停止功能，經(jīng)外科手術(shù)由人造關(guān)節(jié)代替。在RA中，TNF是破壞的介體。從溫和的癥狀到嚴(yán)重的損形的進(jìn)程是非常迅速的。并且對(duì)RA患者，沒有有效的治療。其它實(shí)質(zhì)上無法治療的自身免疫疾病包括狼瘡紅斑、多發(fā)性硬化和肌萎縮性側(cè)索硬化。只通過避免或者使機(jī)體免疫系統(tǒng)無效，傳染性疾病(如由細(xì)菌、病毒和其它機(jī)會(huì)致病菌引起的那些疾病)就能繼續(xù)。免疫系統(tǒng)增加或引起對(duì)抗所說的病原體的非特異性免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答因子之一或全部。非特異性免疫應(yīng)答集中在細(xì)胞因子的產(chǎn)生上，主要是有巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的因子，并且作為特異性抗體反應(yīng)的前奏。炎癥性細(xì)胞因子包括TNF-α，并且介導(dǎo)直接針對(duì)傷害或感染部位的急性反應(yīng)，增加的血液供應(yīng)表明傷害或者感染的部位。嗜中性和巨噬細(xì)胞吞噬病原菌或者病毒，以試圖將感染保持在最小的組織范圍內(nèi)。并且，巨噬細(xì)胞在抵御傳染病方面具有如下的關(guān)鍵作用(1)抗原的加工和呈遞到淋巴細(xì)胞，以便抗體介導(dǎo)的和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能發(fā)生；(2)免疫應(yīng)答中樞的細(xì)胞因子的分泌；和(3)抗體包衣的細(xì)菌、腫瘤或宿主細(xì)胞的破壞。巨噬細(xì)胞能吞噬和殺死各種各樣的病原體，如細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物(寄生蟲)。當(dāng)“激活”巨噬細(xì)胞時(shí)，這種能力增強(qiáng)。激活的巨噬細(xì)胞的分泌產(chǎn)物比其它任何免疫細(xì)胞的分泌產(chǎn)物都更多樣化。這些免疫產(chǎn)物調(diào)節(jié)促炎和抗炎作用，并調(diào)節(jié)其它細(xì)胞類型。這些產(chǎn)物包括TNF-α、IL-1β、IL-6、水解酶，而主要通過所說的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫過程除去的氧化代謝細(xì)菌的產(chǎn)物包括肺結(jié)核和其它相關(guān)的分枝桿菌感染(如非典型的分枝桿菌感染(在一半以上的AID患者中可見這種感染))和炭疽，潛在的細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)劑。真菌感染在免疫抑制患者(如AID感染的患者或器官移植患者)中是常見的問題。原生動(dòng)物包括有機(jī)體(如瘧疾)。炎癥疾病包括子宮內(nèi)膜異位和炎性腸疾病，所說的炎性腸疾病也是由免疫過程介導(dǎo)的。子宮內(nèi)膜異位是一種不明原因的疑難病癥，并產(chǎn)生影響行經(jīng)婦女的組織發(fā)生。這種疾病的特點(diǎn)是子宮內(nèi)膜細(xì)胞不適當(dāng)?shù)闹踩?、生長(zhǎng)和功能。在月經(jīng)周期通常排出的子宮內(nèi)膜細(xì)胞和片段，由輸卵管運(yùn)輸?shù)礁鼓で恢?，在有些婦女中，這些物質(zhì)嵌入在腹膜腔中，并增值，發(fā)展成子宮內(nèi)膜損害。然而，由于子宮內(nèi)膜細(xì)胞似乎存在于所有的行經(jīng)女性的腹膜腔中，但為什么子宮內(nèi)膜異位只在一些婦女而不是全部婦女中發(fā)生尚不清楚。子宮內(nèi)膜異位抗原導(dǎo)致疼痛的感染增值、不正常的出血、廣泛的瘢痕、排尿或排便疼痛，甚至導(dǎo)致不育。目前沒有治療子宮內(nèi)膜異位的方法，除了懷孕能提供暫時(shí)的減輕，或者利用外科手術(shù)除去子宮內(nèi)膜細(xì)胞源，這種方法也導(dǎo)致不育。最近，大量的報(bào)道指出子宮內(nèi)膜異位和免疫系統(tǒng)的變化有關(guān)。早期的報(bào)道表明在恒河猴中免疫抑制治療和子宮內(nèi)膜異位的增加有關(guān)。自此以后，已經(jīng)觀察了子宮內(nèi)膜異位的人在細(xì)胞介導(dǎo)和激素免疫兩方面的變化。在過去的幾年中，研究集中在巨噬細(xì)胞的子宮內(nèi)膜異位的作用。有關(guān)這些研究的下面的假說是單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)，并在正常的健康的婦女中阻止放錯(cuò)地方的子宮內(nèi)膜細(xì)胞增值。在子宮內(nèi)膜異位的婦女中，使放錯(cuò)地方的子宮內(nèi)膜細(xì)胞嵌入，引起子宮內(nèi)膜異位。子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞和細(xì)胞衍生抗原的自身抗體的產(chǎn)生是一種刺激。然后，這些自身抗體，連同激活的巨噬細(xì)胞的產(chǎn)物一起干擾受影響的婦女的生育和生殖能力。這些研究匯總的結(jié)果表明下列有關(guān)的事實(shí)(1)被認(rèn)為負(fù)責(zé)破壞異位的子宮內(nèi)膜細(xì)胞的腹膜處理系統(tǒng)(主要由巨噬細(xì)胞組成)在大面積子宮內(nèi)膜異位的婦女中是不健全的；(2)在大面積子宮內(nèi)膜異位的婦女中不健全的腹膜巨噬細(xì)胞的活性和，至少是部分的和前列腺素介導(dǎo)的事件有關(guān)。這樣，大面積子宮內(nèi)膜異位的婦女的腹膜巨噬細(xì)胞的響應(yīng)巨噬細(xì)胞激活劑(如γ-干擾素和內(nèi)毒素)的重要刺激作用，只有當(dāng)激活培養(yǎng)物中含有前列腺素抑制劑時(shí)才能完成；(3)子宮內(nèi)膜異位患者的循環(huán)單核細(xì)胞的產(chǎn)物直接和子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。在單一的共培養(yǎng)體系中，在和大多數(shù)子宮內(nèi)膜異位患者的單核細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，觀察到自體子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增加；而在和可育的對(duì)照患者的單核細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，觀察到增值的抑制。(4)子宮內(nèi)膜異位患者的子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增值可以由巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)。目前得到的結(jié)果指出患有局限的病的患者的子宮內(nèi)膜的增值反應(yīng)可以由白細(xì)胞介素-1-β(IL-β)和TNF-α增強(qiáng)。相反，患有大面積疾病的患者的子宮內(nèi)膜的增值反應(yīng)由IL-1β和TNF-α抑制。因此，這些研究結(jié)果指出子宮內(nèi)膜異位患者的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能是對(duì)所說的疾病的病理生理具有作用。并且，一些巨噬細(xì)胞的功能受到該疾病的嚴(yán)重程度影響的不同影響。在患有局限的病的婦女中，巨噬細(xì)胞似乎是在腹膜腔，和可能在循環(huán)系統(tǒng)中表現(xiàn)機(jī)能亢進(jìn)，并且它們的子宮內(nèi)膜細(xì)胞似乎能和巨噬細(xì)胞衍生的不同的生長(zhǎng)因子反應(yīng)。相反，大面積的子宮內(nèi)膜異位的特征在于在腹膜腔中巨噬細(xì)胞的激活的抑制(其中所原因部分是由于免疫調(diào)節(jié)的前列腺素的過度分泌。在大面積子宮內(nèi)膜異位的婦女中巨噬細(xì)胞產(chǎn)物似乎調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的增值；然而，子宮內(nèi)膜和不同單細(xì)胞因子的反應(yīng)的質(zhì)的不同指出在這些婦女中不健全的巨噬細(xì)胞的激活有助于或者控制這種疾病的發(fā)生。炎性腸疾病(IBD)是一組和胃腸道有關(guān)的不明病因的慢性炎性紊亂的通稱。這些紊亂包括非特異性的潰瘍結(jié)腸炎和克羅恩氏病?？赡馨殡S這些紊亂的腸外表現(xiàn)(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膽管周炎)可能代表自身免疫現(xiàn)象，用于治療IBD的治療劑(如皮質(zhì)甾類和咪唑硫嘌呤)可以通過免疫抑制機(jī)制發(fā)揮作用。具有炎性腸疾病的患者可能具有針對(duì)結(jié)腸細(xì)胞、細(xì)菌抗原(如大腸桿菌)、脂多糖類和外源蛋白的激素抗體。通常，這些抗體的存在和效價(jià)和疾病活性無關(guān)；然而，很可能這些抗原接近輔助上皮損害的免疫活性細(xì)胞。此外，已經(jīng)描述了IBD和血γ-球蛋白缺乏以及IgA缺陷有關(guān)。有關(guān)的細(xì)胞介導(dǎo)的異常包括皮的無變應(yīng)性、對(duì)各種致有絲分裂的刺激降低的反應(yīng)性和外圍t-細(xì)胞數(shù)量的減少。為了各種目的，已經(jīng)研究了通過肝臟分泌的并儲(chǔ)存在膽囊中的膽汁，這些目的包括膽汁提取物對(duì)提高經(jīng)正常的肝臟功能容易產(chǎn)生代謝變化的藥物的生物利用率的用途(參見WO90/12583)和抑制哺乳動(dòng)物白細(xì)胞增多的用途(參見Shinoda等，化學(xué)藥物公告，30,4429-4434(1982))。但是，從來沒有認(rèn)為膽汁是腫瘤、炎性和傳染病的治療上有用的源。有趣的是，按照英國(guó)專利337,797，其指出利用膽囊本身作為抗癌劑的有潛力的源，但是，僅在膽汁從膽囊中除去和膽囊徹底洗滌后。發(fā)明概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)膽汁是激活免疫系統(tǒng)細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞)的組合物的重要來源，并且對(duì)治療各種癌癥，特別是胰癌和惡性黑素瘤是有效的。具體地說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物在體外和體內(nèi)都能(例如，通過巨噬細(xì)胞)刺激TNF的產(chǎn)生。這種特性對(duì)治療傳染病是有用的。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)作用(特別是下調(diào)或抑制TNF-α的產(chǎn)生的能力)對(duì)治療其它免疫系統(tǒng)相關(guān)的紊亂(如自身免疫疾病和炎性疾病和機(jī)能障礙)也可以是有用的。另外本發(fā)明的膽汁組合物被認(rèn)為例如作為直接針對(duì)兒科疾病的疫苗的佐劑添加劑和作為與異種移植有關(guān)的排斥現(xiàn)象的保護(hù)劑是有用的。本發(fā)明的膽汁組合物是通過用水溶性的或與水易混合的溶劑提取膽汁獲得的。如此得到的提取物可以進(jìn)一步加工，以從中除去不必要或者不受歡迎的組分。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)下文將進(jìn)一步說明的通過提取膽汁的方法獲得的產(chǎn)物具有刺激TNF的活性，并且其被認(rèn)為對(duì)癌癥、傳染、自身免疫紊亂和炎性紊亂具有活性。具體地說，本發(fā)明的膽汁提取物被認(rèn)為對(duì)胰和其它癌具有特異的活性。很明顯，如此得到的完整的組合物對(duì)獲得這種活性不都是必要的。因此，有必要進(jìn)一步分離、分級(jí)分離或另外加工如此得到的產(chǎn)物，并且仍然保留所期望的刺激TNF產(chǎn)生的能力，例如，抵抗構(gòu)成各種疾病基礎(chǔ)的免疫系統(tǒng)紊亂的能力。并且，已經(jīng)預(yù)見可能通過合成的方法獲得與此相同或具有相似的刺激TNF產(chǎn)生和抵抗免疫系統(tǒng)紊亂的能力的產(chǎn)物。這樣，可以預(yù)見，在其它的生物作用中，可以鑒定和分析所說的產(chǎn)物的組分對(duì)所需要的TNF的刺激特性和抵抗免疫系統(tǒng)紊亂的能力的各自的貢獻(xiàn)。并且，還可以預(yù)見這種鑒定和分析將用于制造合成形式的所說產(chǎn)物。一方面，本發(fā)明涉及用作免疫調(diào)節(jié)劑的組合物，這種組合物包含分子量小于3000道爾頓并且具有一種或多種下列特性的小分子量組分(a)可由動(dòng)物膽汁中提??；(b)能體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；(c)能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；(d)含有不可測(cè)水平的IL-1α，IL-1β，TNF，IL-6，IL-8，IL-4，GM-CSF和IFN-γ；(e)在惡性細(xì)胞系中具有抗增殖作用；(f)對(duì)人類外周血單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞不表現(xiàn)出細(xì)胞毒性；和(g)不是一種內(nèi)毒素。按照優(yōu)選的實(shí)施方案，所說的組合物由牛的膽汁中提取，能夠刺激TNF的釋放。本發(fā)明的組合物可以按照下列方法制備(a)把動(dòng)物的膽汁(優(yōu)選的是牛的膽汁)和溶于水或與水易混溶的溶劑(優(yōu)選的是醇)混合(優(yōu)選的是和等體積的醇混合)；(b)分離這種溶液(其優(yōu)選的是可溶于醇的組分)，并通過除去大部分醇(例如通過采用加熱)將其分離至實(shí)質(zhì)上不含醇；(c)從溶液中除去膽汁色素以獲得澄清的淡黃色液體；(d)處理或不處理澄清的淡黃色液體，以實(shí)質(zhì)上除去任何殘留的醇；(e)除去脂類有機(jī)物質(zhì)(如用醚抽提澄清的淡黃色液體)，并分離水相；和(f)除去或不除去水相中的醚?？梢院?jiǎn)單地將所說的組合物裝入小瓶中并滅菌來利用該組合物而不需要進(jìn)一步的修飾。這種組合物也可以以濃縮的形式利用。優(yōu)選的濃度形式如下制備。在步驟(e)前，可以將澄清的淡黃色液體濃縮至膽汁/醇溶液體積的1/8，和在步驟(f)前，可以濃縮水相，以便其體積達(dá)到膽汁/乙醇溶液體積的1/10。本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物的藥物組合物。本發(fā)明還包括治療患者的方法，這種方法包括向所說的患者施用有效量的本發(fā)明的組合物。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的組合物在預(yù)防和治療需要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的疾病和病癥(優(yōu)選的是傳染病、炎性疾病、自身免疫疾病、接種疫苗、和異種移植有關(guān)的排斥現(xiàn)象和瘤形成)上的用途。參照下列詳細(xì)的描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方法將是顯而易見的。此外，本文參考了各種出版物，因此參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容本文一并參考。附圖簡(jiǎn)要描述下文借助附圖描述的例子進(jìn)一步描述本發(fā)明的細(xì)節(jié)。圖1是本發(fā)明的一種濃縮的組合物的反相高效液相色譜(RP-HPLC)的譜圖；圖2是本發(fā)明的一種濃縮的組合物的RP-HPLC的譜圖；圖3是本發(fā)明的一種濃縮的組合物的RP-HPLC的譜圖；圖4是顯示本發(fā)明的組合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞(PBMNs)的TNF釋放的影響的曲線圖；圖5是顯示本發(fā)明的組合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的PBMNs的TNF釋放的影響的柱形圖；圖6是顯示診斷為胰腺癌的患者在用本發(fā)明的組合物治療后得到的存活情況的曲線圖；圖7是顯示在用本發(fā)明的組合物治療胰腺癌患者后得到的存活情況的曲線圖；圖8是顯示用本發(fā)明的組合物治療所有的黑素瘤患者的存活情況的曲線圖；圖9是顯示用本發(fā)明的組合物治療具有兩個(gè)或多個(gè)腫瘤位點(diǎn)的黑素瘤患者的存活情況的曲線圖；圖10是顯示用本發(fā)明的組合物治療具有三個(gè)或多個(gè)腫瘤位點(diǎn)的黑素瘤患者的存活情況的曲線圖；圖11是本發(fā)明的組合物的SDS凝膠；圖12顯示在親水HPLC中本發(fā)明組合物的洗脫條件和時(shí)間(a)和本發(fā)明組合物的上清液的洗脫圖譜(b)；圖13顯示在親水HPLC中本發(fā)明的組合物的沉淀的洗脫；和圖14是顯示本發(fā)明的組合物在刺激外周血單核細(xì)胞的功能的劑量反應(yīng)曲線圖。發(fā)明詳述指導(dǎo)研究的中心假說是有力的生物刺激質(zhì)的治療功效可能依賴其引起免疫系統(tǒng)合適調(diào)節(jié)的能力(如通過激活巨噬細(xì)胞和/或單核細(xì)胞以產(chǎn)生某些細(xì)胞因子)和提高尋找和除去或破壞引起或誘導(dǎo)疾病的細(xì)胞(如外源或放錯(cuò)位置的細(xì)胞)活性的能力。例如，包含惡性疾病的環(huán)境中的殺癌功能將是抗癌的有用的療法。這種功能可以通過直接刺激腫瘤微環(huán)境中殘留的免疫細(xì)胞而產(chǎn)生。另外，通過刺激循環(huán)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞可以產(chǎn)生這種功能，如果循環(huán)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞然后能定位在惡性疾病位點(diǎn)并在該環(huán)境中行使功能。其它基于免疫系統(tǒng)方面的疾病和病癥通過用合適免疫調(diào)節(jié)劑治療也將被戰(zhàn)勝或改善。所說的疾病或病癥包括子宮內(nèi)膜異位(這種疾病癥狀是正常的子宮內(nèi)膜細(xì)胞在不合適的位點(diǎn)增殖)、各種傳染病和其它疾病(下文將充分描述)。如前面所述，本發(fā)明涉及用作免疫調(diào)節(jié)劑的組合物，這種組合物包含分子量小于3000道爾頓并且具有至少一種下列特性的小分子量組分(a)可由動(dòng)物膽汁中抽提；(b)能體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；(c)能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；(d)含有不可測(cè)水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GM-CSF和IFN-γ；(e)在惡性細(xì)胞系中具有抗增殖作用；(f)對(duì)人類外周血單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞不表現(xiàn)出細(xì)胞毒性；和(g)不是一種內(nèi)毒素。具體地說，研究已表明本發(fā)明的組合物至少一部分能刺激正常的單核細(xì)胞以使其對(duì)Chang肝細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，此試驗(yàn)用于檢測(cè)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活。已表明所說的組合物將激活癌癥患者(包括頸部、卵巢，耳/鼻/喉、肺、子宮內(nèi)膜癌、卡波濟(jì)氏肉瘤和骨髓性白血病)的單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞，使之襲擊和破壞它們本身的特定的腫瘤細(xì)胞。并且，已表明子宮內(nèi)膜異位患者的巨噬細(xì)胞也可由所說的組合物激活(參見實(shí)施例26)。本發(fā)明的組合物可以調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子(TNF)的產(chǎn)生。從牛膽汁分離的本發(fā)明優(yōu)選的組合物能促進(jìn)人類外周血單核細(xì)胞和前單核細(xì)胞系U-937釋放TNF，其中似乎是生理定量的。由于已知TNF能引起炎性和抗腫瘤細(xì)胞因子作用的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，所以優(yōu)選的組合物可以通過刺激人類白細(xì)胞釋放TNF(和可能的其它細(xì)胞因子)而發(fā)揮其抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明也能促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞中。也發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物能夠抑制小鼠雜交瘤細(xì)胞株HYB-6-1的生長(zhǎng)。組合物對(duì)小鼠雜交瘤細(xì)胞的這種抑制作用說明了抗增殖活性。也檢驗(yàn)了這種組合物對(duì)人類外周血單核細(xì)胞(PBMNs)和淋巴細(xì)胞的存活的作用。發(fā)現(xiàn)此組合物對(duì)人類PBMNs和淋巴細(xì)胞無毒性。下文進(jìn)一步列舉了本發(fā)明的組合物，其中本發(fā)明的組合物具有下列特性1)對(duì)PBMNs的TNF釋放有作用的一種或幾種組分很早地從C18RP-HPLC柱中洗脫下來。2)此組合物引起白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的釋放，對(duì)IL-1β釋放起作用的組分很早從RP-HPLC中洗脫下來，表明此組分可能與釋放TNF的物質(zhì)是相同的。3)所說的組合物也引起較少數(shù)量的白細(xì)胞介素-2(IL-2)的釋放。4)所說的組合物引起粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞菌落刺激因子(GM-CSF)的釋放。5)TNF和GM-CSF的釋放比例大約是2∶1。6)可能是組合物中相同的分子(即組分)對(duì)TNF，IL-1β和GM-CSF的釋放起作用?？赡芙M合物的作用是刺激多種不同的細(xì)胞因子的釋放，或者組合物引發(fā)一種細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，接下來這種細(xì)胞因子再刺激其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放。7)通過SDS凝膠電泳和分子篩HPLC對(duì)組合物(包括其沉淀和上清液)進(jìn)行物理化學(xué)分析表明其主要組分的分子量小于2500道爾頓。8)通過親水(多羥已基)的分子篩HPLC進(jìn)一步物理化學(xué)分析確認(rèn)了組合物中小分子量組分的存在。9)酸水解前后的氨基酸分析證明肽鍵的存在，表明肽的存在。如前所述，本發(fā)明的組合物可以通過下列步驟制備(a)把動(dòng)物的膽汁(優(yōu)選的是牛的膽汁)和等體積的醇混合，產(chǎn)生膽汁/醇溶液；(b)分離出可溶于醇的組分，并將溶液分離至實(shí)質(zhì)上不含醇；(c)從溶液中除去膽汁色素，以獲得澄清的淡黃色液體；(d)處理澄清的淡黃色液體，以實(shí)質(zhì)上除去任何殘留的醇；(e)以醚抽提澄清的淡黃色液體，并分離水相；和(f)從水相中除去殘留的醚。從任何產(chǎn)生膽汁的動(dòng)物的膽汁中得到所說的組合物。如果這種組合物從一種動(dòng)物而不是另一種動(dòng)物的膽汁中獲得，則這種組合物可以加工成針對(duì)一種特定疾病的不同活性的物質(zhì)，通常合適的膽汁源來自鯊魚、牛、羊、公山羊、豬?？梢詮耐涝椎慕】档氖秤脛?dòng)物(如牛、羊、公山羊、豬)中獲得膽汁，以便用于制備本發(fā)明的組合物。這樣收集的膽汁應(yīng)該是直接來自屠宰動(dòng)物的膽囊和/或者肝器官(這適合物種的解剖和生理)，并且應(yīng)該是澄清的，因此表明膽汁制劑實(shí)質(zhì)上沒有膿汁和血液。在此方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，利用了牛來源的膽汁。牛的膽汁豐富，這部分是因?yàn)榭梢詮拿恳恢粍?dòng)物中抽提相對(duì)大量的膽汁。在有關(guān)健康狀況規(guī)則指導(dǎo)下，按照常規(guī)屠宰和檢查牛，這樣這種動(dòng)物提供了制備本發(fā)明組合物可靠的來源。并且，人類不可能對(duì)牛來源的物質(zhì)具有過敏反應(yīng)。將膽汁和等體積的醇混合，以產(chǎn)生膽汁/醇溶液，所說的醇是50％的醇。這種醇可以是脂肪族醇，優(yōu)選的是甲醇、乙醇、或丙醇，最優(yōu)選的是乙醇。可以通過離心的方法分離實(shí)質(zhì)上除去了不溶于50％的醇的物質(zhì)的溶液。所述離心優(yōu)選的是，在15-25℃下3000-5000rpm，最優(yōu)選的是4200rpm下離心膽汁/醇混合物至少2小時(shí)。然后可以利用醇和水的不同揮發(fā)性通過常規(guī)的方法，即將所說的組分加熱到合適的溫度(如80-85℃)，保持一段合適的時(shí)間(如大約為10小時(shí))除去包含在膽汁/可溶于醇的組分中的醇?？梢岳没钚蕴?、聚酰胺微顆粒體或過濾的方法從溶液中除去膽汁色素，以獲得澄清的淡黃色液體，優(yōu)選的是利用活性碳處理。為了使溶液滿足光密度和傳導(dǎo)率標(biāo)準(zhǔn)，可以重復(fù)進(jìn)行以上過程。利用常規(guī)的方法處理澄清的淡黃色液體，實(shí)質(zhì)上澄清任何殘留的醇。優(yōu)選的是利用具有1.0-3.5μm保留(retention)，最優(yōu)選的是2.5μm保留的濾器過濾澄清的淡黃色液體。然后利用醚抽提澄清的淡黃色液體，并分離水相。在此步驟中所使用的醚優(yōu)選的是二甲基醚、已醚、正丙醚、異丙醚或正丁醚，最優(yōu)選的是已醚。可以通過，例如，將溶液加熱到高達(dá)55℃，優(yōu)選的是高達(dá)40℃，持續(xù)大約5-15小時(shí)，最優(yōu)選的是10小時(shí)的方法，從水相中除去殘留的醚?？梢院?jiǎn)單地將所說的組合物裝入小瓶中并滅菌來利用該組合物而不需要進(jìn)一步的修飾。這種組合物也可以以濃縮的形式利用。優(yōu)選的濃度形式如下制備。在上文描述的步驟(c)前，可選擇性地通過，例如，將澄清的淡黃色液體加熱到低于大約85℃，優(yōu)選的是大約60-70℃，而將其濃縮至膽汁/醇溶液體積的1/8。在步驟(f)前，通過，例如加熱到大約80-85℃，可以濃縮水相，以便其體積達(dá)到膽汁/乙醇溶液體積的1/10。在制備本發(fā)明組合物優(yōu)選的方法中，將收集到的膽汁和等體積的乙醇混合。然后在大約20±2℃，大約4200rpm下，將膽汁/醇混合物離心至少21/2小時(shí)。倒出上清液，并檢查其pH和乙醇濃度。然后檢測(cè)處理過的膽汁/乙醇溶液的光密度(O.D.)和傳導(dǎo)率。O.D.水平或傳導(dǎo)率水平超出可接受的說明書限定的范圍時(shí)，需要對(duì)膽汁/乙醇溶液進(jìn)行額外的處理，以除去膽汁色素，例如，再次用活性碳處理，以使讀數(shù)在說明書限定的范圍內(nèi)。在活性碳處理之后，將溶液通過具有2.5μm保留的濾器過濾，加熱到低于85℃蒸發(fā)掉乙醇，并將溶液濃縮到大約原來膽汁/乙醇溶液體積的1/8。濃縮的溶液冷卻到20-25℃之間。然后將溶液和乙醚混合，并棄掉醚相。優(yōu)選的是使用相對(duì)小體積的醚和強(qiáng)烈的攪動(dòng)，如0.1到1倍體積，優(yōu)選的是0.2到0.5倍體積。此步驟可以再重復(fù)一次。通過將水相加熱到55℃大約10小時(shí)，以除去殘留的醚，并通過加熱到80-85℃，進(jìn)一步減少水相的體積至原來膽汁/乙醇體積的1/10。然后檢測(cè)溶液的外觀、生物學(xué)活性、乙醇和醚的濃度。可以利用鹽酸(1％)溶液和氫氧化鈉(1％溶液)將組合物的濃度調(diào)到生理pH，即7.4-7.5，并且可以利用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉作為緩沖物通過常規(guī)的方法制備緩沖液?？梢詫⒔M合物簡(jiǎn)單地裝入小瓶中并滅菌來利用組合物而不需要進(jìn)一步的修飾。優(yōu)選的滅菌方法是將組合物經(jīng)高壓滅菌，接著溫育，進(jìn)行三次滅菌循環(huán)?？梢砸詽饪s的形式利用組合物。濃縮形式的制備方法如上所述。組合物也可以是冷凍干燥的。組合物和濃縮組合物是澄清的淡黃色溶液，實(shí)質(zhì)上不含有外來物質(zhì)，包含不到10ppm的乙醇和不到5ppm的乙醚。所說的組合物激活PBMNs以使之在體外釋放TNF，這一點(diǎn)是通過實(shí)施例2所描述的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞激活分析方法(TNF-釋放)測(cè)量的。并且，組合物激活，例如癌癥患者的PBMNs形式，然后這種PBMNs形式介導(dǎo)針對(duì)來源于同一患者的癌細(xì)胞的殺細(xì)胞的活性。確實(shí)，有關(guān)動(dòng)物和人的臨床研究已表明本發(fā)明的組合物在抗腫瘤治療方法的效用。同樣，已表明所說的組合物激活的PBMNs作用于子宮內(nèi)膜細(xì)胞，這樣本發(fā)明提供了所說的組合物用于治療子宮內(nèi)膜異位和其它炎性疾病的用途?？梢岳蒙衔耐ǔＣ枋龅姆椒ㄒ砸恢碌目稍偕问疆a(chǎn)生本發(fā)明的組合物，已證明各批組合物都具有一致性、有效性和純凈性。利用反相高壓液相色譜確定一致性和純凈性。(參見實(shí)施例1)。本發(fā)明的組合物在反相HPLC上具有一致的可再生模式。三份本發(fā)明濃縮的組合物的HPLC讀數(shù)如圖1-3所示。這種組合物也具有下文提到的特性，例如，體內(nèi)和體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的能力，等等?？紤]到來源，可能存在于本發(fā)明組合物中的化合物包括磺化的膽汁酸、氧化的膽汁酸、和其它的氨基酸(特別是甘氨酸和?；撬?綴合物和甾醇。因此，應(yīng)該相信本發(fā)明的組合物包含至少一種具有下列化學(xué)式的化合物其中所說的分子可以是或可以不是完全飽和的，這樣例如A和B，B和C，C和D之間的鍵可以是單鍵或雙鍵，并且其中X是H、OH、＝O或OSO3；Y是其中R是氨基酸殘基，例如，如甘氨?；?、谷氨?；?Glutamyl)或牛磺?；?，因此形成了甘氨酸、谷氨?；蚺；撬峋Y合物。具體地說，已經(jīng)分析了本發(fā)明組合物的組成化合物，包括有機(jī)和無機(jī)的組分。利用分析化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的方法(包括質(zhì)譜法(MS))獲得這些信息。這些研究的結(jié)果包括，例如，鑒定認(rèn)為存在特定的膽汁酸，包括膽酸、甘氨膽酸、去氧甘氨膽酸、熊去氧膽酸、硫酸膽甾醇、去氧膽酸、鵝去氧膽酸和?；悄懰帷Ｓ蒑S無法辨別是否一些化合物的OH和H2的失去發(fā)生在MS上或是否這些化合物的脫氧、雙脫氧或不飽和的類似物也與之同時(shí)存在。這些化合物都可以以銨鹽、烷基銨和無機(jī)陽離子的形式存在。MS分析也支持有關(guān)存在磷脂、鞘脂類和能形成混雜(miscell)的相關(guān)試劑的組合物的鑒定結(jié)果。被認(rèn)為存在的特定化合物包括硬脂酸CH3(CH2)16COOH棕櫚酸CH3(CH2)14COOH油酸Z-9硬脂酸CH3(CH2)2CH2CH＝CHCH2(CH2)6COOH氧化的或氫氧化的/不飽和的短鏈脂肪酸C6H8O3(如CH3CH＝CHCOCH2COOH或帶有2個(gè)雙鍵的C6酸和氫氧化物)乙酸硬脂酸甘油二酸酯棕櫚酸甘油二酸酯硬脂酸，棕櫚酸甘油二酸酯硬脂酸-單酸甘油酯-磷酸膽鹼(溶血卵磷脂)硬脂酸單酸甘油酯硬脂酸甘油三酸酯棕櫚酸單酸甘油酯磷酸膽鹼磷酸絲氨酸磷酸鞘氨醇鞘髓磷脂磷酸甘油甘油硬脂酸-鞘氨醇鞘氨醇硬脂酸酰胺硬脂酸甲酰胺膽堿甘油磷酸膽鹼硬脂酸，油酸甘油二酸酯棕櫚酸酰胺卵磷脂唾液酸-甘油二聚物此外，已獲得的初步HPLC和滴定結(jié)果表明也存在較短的脂肪酸，如具有1至大約10個(gè)碳原子的那些脂肪酸。考慮到來源，也很可能存在磷脂、鞘脂類和相關(guān)的水解產(chǎn)物化合物，由MS和HPLC分析得到的信息說明包括至少一種具有下列化學(xué)式的化合物其中，R1，R2，R3可以不同或相同，為H、COR4、CH＝CH-R5、X、-P(O)(OH)O-、或-S(O)2O-；X選自由膽堿、乙醇胺、N-烷基化的乙醇胺、絲氨酸、肌醇、帶有游離羥基的糖、氨基-糖、磺化的糖、和唾液酸組成的組；R4是飽和或不飽和的，氧化的或羥基化的C1-C30的烷基；R5是烷基基團(tuán)或氧化的和/或其羥基化的類似物。脂肪酸和它們的綴合物可以以鹽的形式存在于前述的水抽提物中?；旌衔镏械钠渌衔镆蔡岣吡诉@些化合物的溶解性。認(rèn)為也存在包含在羧酸中的酰胺，RCONR1R2(其中的R1和R2相司或不同，為H或烷基)?？紤]到所說的化合物的來源和其前述的MS分析，也可能存在第三種化合物，即粘蛋白和蛋白聚糖水解產(chǎn)物。這些化合物包括膽汁和膽囊壁的粘蛋白的水解產(chǎn)物，如軟骨素4-和6-硫酸酯、硫酸軟骨素B、肝素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸和這些粘蛋白的水解產(chǎn)物(如單體、雙體、寡聚體、多聚體)。殼多糖和其它粘蛋白可以被相似地水解，其水解產(chǎn)物包括N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-D-半乳糖胺-4-硫酸酯、半乳糖-6-硫酸酯、N-乙酰-D-氨基葡萄糖-6-硫酸酯、氨基葡萄糖-6-硫酸酯、D-氨基葡萄糖-2-硫酸酯、D-氨基葡萄糖-2，3-二硫酸酯、D-半乳糖-6-硫酸酯、葡萄糖醛酸2-硫酸酯、N-乙酰神經(jīng)氨酸、唾液酸、N-乙酰軟骨膠素、軟骨素4-硫酸酯、軟骨素6-硫酸酯、D-氨基葡萄糖、D-半乳糖胺、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、艾杜糖醛酸、己糖、己糖胺、硫酸酯、葡萄糖醛酸、軟骨糖胺、2-氨基-2-脫氧D-半乳糖、絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、丙氨酸甘氨酸?；撬?、谷氨酸、天門冬氨酸、組氨酸和小肽?？梢酝ㄟ^粘蛋白的水解獲得相似的產(chǎn)物，如角蛋白硫酸酯、硫酸軟骨素B，二聚體、寡聚體和多聚體形式的天然糖-糖連接鍵可以由糖單體或鄰近的糖鏈間的-O-Si(OH)2-O-橋代替。特別是，被認(rèn)為存在的特定粘蛋白和蛋白聚糖的水解產(chǎn)物包括唾液酸和它們的單和二乙?；暮鸵覂?nèi)酰化的(glycolylated)單體；N-乙酰神經(jīng)氨酸；己糖胺，如氨基葡萄糖；L-巖藻糖；己糖胺-己糖醛酸(雙體)重硫酸鹽，單乙?；模黄咸烟侨┧?；葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸的重硫酸鹽，單乙?；模煌僖核?甘油(雙體)；和上述乙?；土蛩狨バ问降膯误w的雙體、三體、寡聚體和多聚體考慮到來源和前述的MS分析，可能存在的第四類化合物，即脂溶性維生素，包括維生素A、D和K(例如，A2、D1、D3、D4、K1、K2、K5、K6、K7、K-S(II)和乙酸維生素E)。具體地說，認(rèn)為存在的特定脂溶性維生素化合物包括由維生素A2、維生素D1、發(fā)甾醇(存在于其維生素D1復(fù)合物中)、維生素E、氧化型維K1和維生素K5組成的組的至少一種?？紤]利來源和前述的MS分析，可能存在各種混雜的有機(jī)化合物，這些化合物包括尿素；烷基胺，包括甲基胺，二甲胺，乙胺，甲乙胺，二乙胺，二丙胺，和/或丁乙胺；氨基酸，包括牛磺酸，谷氨酸，甘氨酸，丙氨酸，N-亮氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸乙醇胺，天冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，肌氨酸，α-氨基脂肪酸，瓜氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，羥基賴氨酸，鳥氨酸，和賴氨酸；膽紅素和其gluconuride綴合物(conjugate)；膽綠素和其gluconuride綴合物；2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)；聚乙烯二醇；混雜的食用脂類；和谷胱甘肽和它的水解產(chǎn)物。具體地說，認(rèn)為存在于此組合物中的特定的混雜的有機(jī)組合物包含至少一種由尿素、甲基胺、二甲胺、乙胺、甲乙胺、二乙胺、二丙胺、丁乙胺、氨、膽堿、?；撬帷⒐劝彼?、甘氨酸、丙氨酸、p-ser、p-eu、p-ea、aspthrsersar、a-aba、cit、val、ile、leu、B-ala、G-aba、OH-lys、orn、lys、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)和聚乙烯乙二醇組成的組中的成員。存在于本發(fā)明組合物中的胺，特別是次生胺，可以包括空氣中的氮氧化物，然后這些氮氧化物形成亞硝基化合物。組合物中也可以包含N-氧化物和N-碳化物。上面的這一系列胺應(yīng)該擴(kuò)展到包括所有的伯、仲、叔酰氨。已經(jīng)鑒定了某些無機(jī)元素，其定量結(jié)果(mg/l)如下</tables>本發(fā)明的組合物具有有價(jià)值的藥物特性。具體地說，本發(fā)明的化合物影響致瘤性生長(zhǎng)、影響仲瘤壞死因子、激活巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞。已表明此化合物不會(huì)引起明顯的毒性，只有短暫的不利的副作用(例如，輕度發(fā)燒、煩渴、注射位點(diǎn)的疼痛)。也發(fā)現(xiàn)組合物中不含有能檢測(cè)到的高分子量物質(zhì)組分(即大于5,000道爾頓)，這種物質(zhì)能引起不利的免疫反應(yīng)。此組合物可以用作預(yù)防和治療需要改善免疫反應(yīng)的病癥的試劑，具體地說是傳染病(包括細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和其它機(jī)會(huì)感染)、炎癥(包括子宮內(nèi)膜異位和炎性腸疾病)、接種(包括作為HIV的佐劑；常規(guī)的兒童和成年人免疫法(如白喉、百日咳、破傷風(fēng)、脊髓灰質(zhì)炎、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、病毒性感冒和嗜血桿菌屬)、旅行者疫苗(如傷寒、霍亂、鼠疫、細(xì)菌性腦膜炎和瘧疾)、瘤形成和自身免疫疾病。這些疫病和不足的免疫系統(tǒng)反應(yīng)有關(guān)，并且可能是不足的免疫系統(tǒng)反應(yīng)的直接結(jié)果。如在上面的背景部分所示，可以包括激素和細(xì)胞的缺陷?？紤]到所列舉的組合物激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的能力，本發(fā)明能提高免疫反應(yīng)的這兩個(gè)方面。此外，可以利用本發(fā)明的組合物改善或阻止和無論種內(nèi)或種間的器官移植有關(guān)的排斥現(xiàn)象。也可以利用本發(fā)明的組合物治療放射疾病。因此，本發(fā)明的組合物的治療各種形式的腫瘤(白血病、淋巴組織瘤、黑素瘤、腺瘤、肉瘤、癌)方面，特別有用。具體地說，本發(fā)明可用作治療惡性黑素瘤、胰癌、子宮頸-子宮癌、腎癌、胃癌、肺癌、直腸癌、卵巢癌、乳房癌、腸癌、胃癌、肝癌、甲狀腺癌、頸癌、子宮頸癌、唾液腺癌、腿癌、舌癌、唇癌、膽管癌、骨盆癌、縱隔癌、尿道癌、支氣管原癌、膀胱食管癌、結(jié)腸癌和卡波濟(jì)氏肉瘤(這種肉瘤是和HIV感染所獲得性免疫缺損綜合征(AIDS)有關(guān)的一種癌癥)。此組合物也可用作治療由缺陷的免疫反應(yīng)引起或促進(jìn)的其它癥狀，如關(guān)節(jié)硬化和機(jī)會(huì)或其它感染，特別是AIDS。此組合物也可以用于治療自身免疫疾病，包括多種硬化、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、全身狼瘡紅斑、I型糖尿病、重癥肌無力、阿狄森氏病、自免疫溶血性貧血、克羅恩氏病和其它炎性腸疾病、古德帕斯徹氏疾病、格雷夫斯氏病、橋本氏病、自發(fā)的血小板減少紫癜、惡性的貧血、鏈球菌引起的腎小球性腎炎、牛皮癬、硬皮馬勃屬、斯耶格倫氏綜合征、自發(fā)的不育癥、尋常天皰瘡。此組合物還可以用于治療癥性病病，如子宮內(nèi)膜異位和炎性腸疾病?？梢岳贸Ｒ?guī)的方法將本發(fā)明的組合物轉(zhuǎn)成藥物組合物，所說的藥物組合物含有本發(fā)明的組合物，其或者單獨(dú)存在，或者和其它的活性物質(zhì)共同存在。這種組合物可以經(jīng)口、局部(topical)、直腸、非腸道、局部(local)、吸入、或大腦皮層內(nèi)施用。因此，它們以固體或半固體的形成存在，如丸、片、乳油、明膠膠囊、膠囊、栓劑、軟明膠膠囊、凝膠、薄膜和小管(tubelet)。對(duì)于非腸道和大腦皮層內(nèi)使用，可以使用用于肌肉內(nèi)或皮下給藥的那些形式，或者使用用于浸漬或靜脈內(nèi)或大腦皮層內(nèi)注射的那些形式，因此，可以將其制備成所說的組合物的溶液或活性組合物的粉沫，并將這些溶液或粉沫和一種或幾種藥學(xué)上可接受的，適合前述用途的賦形劑或稀釋劑及與生理液相溶的滲透液混合。對(duì)于局部使用，可以考慮那些用于局部使用的以乳油或軟膏形式存在的制劑或以噴霧形式存在的制劑；對(duì)于吸入使用，可以考慮以噴霧(例如鼻噴霧)形式存在的制劑。優(yōu)選的是，此組合物通過肌肉內(nèi)施用?？梢酝ㄟ^已知用于制備藥學(xué)上可接受的組合物的方法本身制備藥物組合物，可以將這種藥學(xué)上可接受的組合物施用給患者，這樣，在混合物中，有效量的活性物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體組合在一起。例如在Remington的藥物科學(xué)(Kack出版公司，Easton，Pa，美國(guó)1985)上描述了合適的載體。在此基礎(chǔ)上，所說的藥物組合物包括(盡管不是唯一的)和一種或幾種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合的本發(fā)明的組合物，并且包含在具有合適的pH及與生理液體等滲的緩沖溶液中。此組合物或單獨(dú)作為治療劑，或和其它治療劑或是它治療形式聯(lián)合作用。例如，對(duì)于惡性腫瘤，這種治療方法使以前不能施行外科治療的腫瘤能適于外科切除。另外，這種治療方法可以和化學(xué)療法和/或放射療法有價(jià)值地結(jié)合。本發(fā)明的組合物或試劑目的是施用給人類或動(dòng)物。通常，預(yù)期的此組合物用于人類的劑量范圍為每日使用大約0.01至20mg/kg，優(yōu)選的是0.1至10mg/kg，最優(yōu)選的是0.1至1mg/kg體重的藥物。在靜脈內(nèi)施用的時(shí)，劑量為每日大約0.1至5mg/kg體重；在經(jīng)口施用的時(shí)，劑量為每日大約1至5mg/kg體重。如果使用濃縮的組合物，可以使用大約上述劑量的一半。例如，對(duì)肌肉給藥，可以每日使用大約0.2至1.0mg/kg體重，優(yōu)選的是每日使用0.215至0.75mg/kg體重。醫(yī)生會(huì)理解有必要不遵守上述的劑量標(biāo)準(zhǔn)，這是因?yàn)轶w重功能、接受治療的動(dòng)物的病癥、治療的特定疾病、給藥路線和所需要的療法的特性的不同。此外，動(dòng)物的類型、其對(duì)藥物或藥物制劑特性的個(gè)體行為和給藥的時(shí)間和間隔也可能要求使用不同于于前述的劑量。這樣，在某些情況下，應(yīng)該使用小于上述最小量的劑量；而在其它情況下，需要超過上述的最高限量。當(dāng)大量給藥時(shí)，將這些藥分幾次在一天中施用的方法是可取的。這樣，本發(fā)明包括制備免疫調(diào)節(jié)組合物的方法，這種方法包括(a)將動(dòng)物的膽汁和水溶性溶劑混合，以產(chǎn)生膽汁/溶劑溶液；(b)分離水溶液，實(shí)質(zhì)上是從膽汁/溶劑溶液中除去溶劑；和(c)從實(shí)質(zhì)上不含溶劑的溶液中除去膽汁色素，獲得澄清的淡黃色液體，優(yōu)選的水溶性溶劑是醇，并且將動(dòng)物的膽汁和等體積的醇混合。前述方法的理想方面也包括進(jìn)一步濃縮澄清的淡黃色液體至原來膽汁/溶劑溶液體積的1/8或1/10。很明顯，通過上述方法產(chǎn)生組合物構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選方面。本發(fā)明也包括用作免疫調(diào)節(jié)劑的組合物，這種組合物包含至少一種分子量小于3000道爾頓的組分，其對(duì)人類外周血單核細(xì)胞無細(xì)胞毒性，并且具有下列特性(a)能體內(nèi)或體外刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、以產(chǎn)生一種或幾種細(xì)胞因子；或(b)能刺激單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，以使體內(nèi)或體外產(chǎn)生細(xì)胞因子；或(c)在惡性細(xì)胞系中，具有抗增值作用。其中所說的組分不是內(nèi)毒素、IL-1α、IL-1β、TNF、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF或IFN-γ?？梢詮膭?dòng)物的膽汁(優(yōu)選的是牛)或從上文提到的其它來源獲得這些組合物。在所說的組合物的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種組合物在沒有外源1α、IL-1β、TNF、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和IFN-γ存在的情況下，體外或體內(nèi)刺激腫瘤壞死因子的產(chǎn)生，優(yōu)選的是人類的。本發(fā)明的組合物也具有可由柱層析定性的組分，因此，將所說的組分干燥，以獲得固體殘?jiān)?，?克這樣的殘?jiān)芙庠?0ml10％濃縮的氫氧化銨的甲醇溶液中，除去不溶的物質(zhì)之后，將其在甲醇柱上進(jìn)行柱層析，這種柱的大小為5cm×12.5cm，并含102克的60A閃爍硅凝膠，在每平方英寸10鎊的壓力下和10％濃縮的氫氧化銨的甲醇溶液的流速為11毫升/分鐘的情況下操作，當(dāng)整個(gè)洗脫體積在大約180和大約220ml之間，在大約220ml和大約260ml之間，或在大約260ml和大約300ml之間收集到的組分中含有從柱中洗脫下來的所說的組分。也可以通過離子交換層析進(jìn)行組分特征的分析，這樣在含有Bio-RadAG-1氫氧化物的樹脂(其量足以結(jié)合存在于以上所說的10ml組分中實(shí)際所有的離子)利用重碳酸氫銨緩沖液階梯梯度柱洗脫所說的組分，緩沖液的濃度從大約0.1M至大約1.5M，優(yōu)選的緩沖液的濃度從大約0.2M至大約0.4M，最優(yōu)選的緩沖液的濃度大約為0.2M。也可以利用反相(C18)HPLC進(jìn)行組分特征的分析。也可以使用其它合適的柱、洗脫液、梯度、流速、操作溫度和檢測(cè)系統(tǒng)。也可以通過TLC來分析組合物的特性。這樣所說的組合物在一種合適的溶解系統(tǒng)的硅膠平板上進(jìn)行薄層色譜。例如，濃縮的10％氫氧化銨的甲醇溶液。用合適的噴霧觀察，如茚三酮。利用茚三酮在大約0.80至0大約0.90Rf值發(fā)生陽性反應(yīng)。本發(fā)明也包括產(chǎn)生刺激人類腫瘤壞死因子的方法，其包括施用有效量的組合物，此組合物至少包括以下化合物中的一種(a)具有下列結(jié)構(gòu)的化合物其中的A-B、B-C、C-D之間的鍵可以是單鍵或雙鍵，其中的X＝H、OH或OSO3H；Y＝其中的R是一種氨基酸殘基。(b)具有下列結(jié)構(gòu)的化合物其中R1、R2和R3是H、COR4、CH＝CH-R、X、P(O)(OH)O-或-S(O)2O-；X是膽堿、乙醇胺、N-烷基化乙醇胺、氨基乙醇、絲氨酸、肌醇、帶有自由羥基的糖、氨基糖、磺酸糖、唾液酸；和R4是一種具有從大約C1-C10碳鏈的飽和或不飽和烷基或者它的羥基化的類似物；和R5是一種烷基或它的氧化或羥基化類似物。(c)粘蛋白水解產(chǎn)物或蛋白多糖水解產(chǎn)物；或(d)一種脂溶性維生素優(yōu)選地，本發(fā)明方法的組合物至少包括一種從由以下物質(zhì)組成的組中選擇出來的化合物，這些物質(zhì)是牛磺膽酸和它的芳香硫酸鹽衍生物、羥基乙酸和它的芳香硫酸衍生物、鞘氨醇、二酰甘油、卵磷脂、磷酸膽堿、磷酸甘油、磷酸甘油膽堿、磷酸膽堿氯化物、少于10個(gè)糖單元的低聚糖(其中的低聚糖包含唾液酸)、巖藻糖、氨基己糖、硫酸氨基己糖、維生素A、視黃醇酸的衍生物、視黃醇衍生物、?；撬帷⒐劝彼岷退能椇衔?。另外，所述組合物至少包括一種從由以下物質(zhì)組成的組中選擇出來的化合物，這些物質(zhì)是氨、烷基伯胺、烷基仲胺、烷基叔胺、羧基、R6CO2H(其中的R6是飽和或不飽和的C1-C30烷基和它的氧化的或羥基化的衍生物)。更優(yōu)選地，這樣一種組合物至少包括一種由以下物質(zhì)組成的組的化合物，這些物質(zhì)是磷酸膽堿、磷酸甘油膽堿、3-硫酸葡糖胺、磷酸膽堿氯化物。更優(yōu)選地，所述組合物至少包括以下化合物中的一種磷酸膽堿、磷酸甘油膽堿、3-硫酸葡糖胺。本發(fā)明的方法也包括通過施用一種組合物刺激TNF的產(chǎn)生，此組合物至少包括一種由以下物質(zhì)組成的組的化合物中選出的化合物，這些物質(zhì)是?；悄懰岷退姆枷懔蛩猁}衍生物、羥基乙酸和它的芳香硫酸衍生物、鞘氨醇、二酰甘油、卵磷脂、少于10個(gè)糖單元的低聚糖(其中的低聚糖包含唾液酸)、巖藻糖、氨基己糖、硫酸氨基己糖、維生素A、視黃醇酸的衍生物、視黃醇衍生物、牛磺酸、谷氨酸和它的軛合物。本發(fā)明也提供了治療以下癌癥的方法，這些癌癥包括胰腺癌、耳/鼻/喉癌、卵巢癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌、慢性骨髓性白血病和卡波西肉瘤。其中所說的方法包括給癌癥患者施用治療有效量的本發(fā)明的組合物。本發(fā)明也提供了治療紊亂的方法，這些紊亂是損害免疫應(yīng)答反應(yīng)的疾病，包括炎癥性疾病、子宮內(nèi)膜異位、炎癥性腸疾??；自身免疫性疾病(包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、多發(fā)性硬化和ALS)；感染性疾病(包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和其它機(jī)會(huì)感染)，其中所說的方法包括為患有以上所提及的疾病的患者施用有效量的本發(fā)明組合物。此外，本發(fā)明也提供了預(yù)防HIV、多種兒童性疾病和其它疾病的疫苗，并把本發(fā)明所說的組合物加入到這種疫苗中作為佐劑。包含下列成分的組合物也是本發(fā)明的組成部分(1)鞘氨醇的分子團(tuán)或與鹽結(jié)合的鞘氨醇或(2)視黃酸或其衍生物的分子團(tuán)，這些組合物至少具有以下性質(zhì)之一(a)能夠刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞體外產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子。(b)能夠刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞體外或體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤壞死因子。(c)在惡性細(xì)胞系中具有抗增殖效果。分子團(tuán)可以包含二酰基甘油酯或卵磷脂，也還可以包含膽汁酸鹽、氨或烷基銨離子。最后，本發(fā)明也涉及包含(1)鞘氨醇、膽汁酸鹽、氨或烷基銨離子；(2)鞘氨醇、膽汁酸鹽、二?；视汀被蛲榛@離子、視黃醇衍生物；(3)二?；视王?、卵磷脂、膽汁酸鹽；或(4)(a)二?；视王ズ?b)卵磷脂和(c)粘蛋白水解產(chǎn)物或蛋白聚糖水解產(chǎn)物的組合物。這些組合物至少具有以下性質(zhì)之一(a)能夠刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞體外產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子。(b)能夠刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞體外或體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤壞死因子。(c)在惡性細(xì)胞系中具有抗增殖效果。下面以非限制性的實(shí)施例說明本發(fā)明。實(shí)施例1此實(shí)施例描述和說明了本發(fā)明組合物的制備方法。從至少1至1年半健康牛(雄性和雌性)的膽囊中收集得到膽汁。這些牛在許可和檢查過的屠宰場(chǎng)屠宰以作為食物。這些屠宰的動(dòng)物在屠宰之前已經(jīng)檢查并評(píng)價(jià)其是否健康，把膽囊和肝臟分離并且由獸醫(yī)檢查確認(rèn)膽囊沒有寄生物和受到感染。因此適合作為本發(fā)明的膽汁源。將通過檢查的膽囊經(jīng)歷下面的過程用70％的乙醇溶液清洗膽囊，以給膽囊的外部消毒，并用注射器從膽囊中除去膽汁。由獸醫(yī)肉眼檢查注射器中移出的膽汁，以確保其不含血或膿，另外也是滿意的。健康牛蟲獲得的膽汁是淡綠色的液體，實(shí)質(zhì)上不含有血和膿，令人滿意。從收集了膽汁的動(dòng)物中也收集肝臟、脾和淋巴結(jié)的組分，并檢驗(yàn)所說的組分中是否存在寄生蟲和其它疫病指征。對(duì)于沒有特定膽囊的物種(如鯊魚)，直接從肝器官中獲得膽汁。將發(fā)現(xiàn)令人滿意的膽汁轉(zhuǎn)移到含有乙醇的刻度琥珀瓶中，得到50％膽汁/50％乙醇溶液(用體積汁量)。這種膽汁/乙醇溶液是淡綠色的液體，實(shí)質(zhì)上不含外源物質(zhì)，按照美國(guó)藥典XXII，B部分(1994)應(yīng)用的方法檢測(cè)乙醇的陽性。這些瓶用標(biāo)簽號(hào)標(biāo)記。將最少從50只動(dòng)物中收集到的膽汁收集在每一個(gè)標(biāo)記的瓶中。然后將膽汁/乙醇溶液在202℃下，以4200rpm離心至少2-1/2小時(shí)。傾析上清液，經(jīng)具有，例如2.5μm保留的濾器過濾，并檢測(cè)pH和乙醇濃度。然后對(duì)傾析液進(jìn)行活性碳處理。然后在280nm下檢測(cè)處理過的溶液的光密度(OD)和傳導(dǎo)率。超出特定范圍的OD水平和/或傳導(dǎo)率，有必要對(duì)液體進(jìn)行另外的活性碳處理，以獲得特定范圍內(nèi)的OD和傳導(dǎo)率。在活性碳處理及處理過的液體經(jīng)具有，例如2.5nm保留的濾器過濾后，將乙醇蒸發(fā)掉(例如，通過加熱到大約85℃)，并將處理過的液體濃縮到膽汁/乙醇液原來體積的大約1/8。然后將濃縮的液體冷卻到20-25℃，經(jīng)具有，例如2.5μm保留的濾器過濾，并和乙醚混合，并去醚相。此步驟可以再重復(fù)一次。加熱水相以除去殘留的醚(例如，加熱到大約55℃10小時(shí))，并通過加熱到大約80-85℃進(jìn)一步減少體積，以達(dá)到膽汁/乙醇原來體積的1/10。然后檢驗(yàn)得到的組合物的外觀、生物學(xué)活性、乙醇及乙醚濃度。所說的組合物是澄清的淡黃色溶液，實(shí)質(zhì)上不含外源物質(zhì)，含有不到10ppm的乙醇和不到5ppm的乙醚。表3，分別裝有實(shí)施例7-9制備的凈化功能材料的測(cè)試結(jié)果因此，利用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室方法可以由容易得到的膽汁源制備本發(fā)明的組合物，結(jié)果產(chǎn)生出符合標(biāo)準(zhǔn)的最終產(chǎn)物。實(shí)施例2此實(shí)施例描述了實(shí)施例1的組合物的生物學(xué)活性。進(jìn)行此研究是為了評(píng)價(jià)實(shí)施例1的組合物對(duì)外周血單核細(xì)胞(PBMN)和/或前單核細(xì)胞的穩(wěn)定系的U937細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，馬里蘭)的細(xì)胞因子釋放的影響。進(jìn)行了TNF-α、IL-1α、IL-2、IL-4、ZL-6、IL-8、GM-CSF和IFN的ELISA分析。這些研究提供了定量評(píng)價(jià)按照實(shí)施例1制備的一批給定的膽汁抽提物的效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，此實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)所說的膽汁抽提物或其一種或幾種組分在PBMN或U937細(xì)胞中刺激TNF-α產(chǎn)生的能力。從5個(gè)健康的接受檢驗(yàn)的人中抽提全血，注入到肝素化的真空管中(BecktonDickson，加拿大)。在Ficoll-Hypaque(Pharmacia)上經(jīng)梯度離心分離PBMNs。用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌PBMNs兩次，計(jì)數(shù)并以106個(gè)細(xì)胞/0.5ml的濃度懸浮在RPMI1640培養(yǎng)基中(Gibco實(shí)驗(yàn)室)。將這些細(xì)胞培養(yǎng)在24孔，平底的組織培養(yǎng)平板上(Falcon，Becton，Dickinson)。將0.5mlPBMN的等份懸浮液加入到每個(gè)孔中，每份懸浮液中含有50ng脂多糖(LPS)(來源于大腸肝菌)10μl胎牛血清和10-300μl的實(shí)施例1的組合物(如下表所示)。通過向培養(yǎng)孔中加入體積為所用的。組合物體積的10％的蒸餾水，而中和了此組合物的高滲透作用。然后用RPMI將總體積補(bǔ)充到1毫升/孔。以PBS作為對(duì)照。將所說的細(xì)胞在潮濕的5％CO2保溫箱中37℃下培養(yǎng)2，6，24，48和72小時(shí)。在每一個(gè)周期末，收獲細(xì)胞，并通過在9000rpm下離心10分鐘獲得無細(xì)胞的培養(yǎng)液。然后將樣品在-70℃下貯存2周，而進(jìn)行免疫測(cè)定(如ELISA)，以定量存在的細(xì)胞因子。在用每孔100和200μl體積的實(shí)施例1的組合物刺激人類PBMN后，測(cè)量上清液中的細(xì)胞因子的合成。此組合物的最初制劑顯示對(duì)細(xì)胞因子的產(chǎn)生無直接(即LPS)刺激作用(參見表II)。如果有任何作用，當(dāng)PBMN在培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞因子的產(chǎn)生量低于基本水平。表II</tables>18個(gè)受檢驗(yàn)者雙份樣品的平均值27個(gè)受檢驗(yàn)者雙份樣品的平均值3ng/ml在用實(shí)施例1的組合物和LPS(或者LPS單獨(dú)使用作為陽性對(duì)照，所使用的實(shí)施例1組合物的體積為每孔100μl)刺激PBMNs后24小時(shí)，在37℃下檢測(cè)上清液中細(xì)胞因子的合成。由TNF-αELISA試劑盒(Endogeo，公司)檢測(cè)TNF，這種試劑盒能栓測(cè)到的最低水平是5pg/ml的細(xì)胞因子。所用的其它ELISA免疫測(cè)定試劑盒包括IL-1α(Endogen公司)；GM-CSF(Endogen公司)；RFN-α(Endogen公司)；IL-2(AdvancedMagenetics，公司)；IL-6(AdvancedMagenetics，公司)；IL-1(AdvancedMagenetics，公司)；IL-4(R&amp;D系統(tǒng))；和IL-8(R&amp;D系統(tǒng))。結(jié)果表明TNF是上清液中存在的主要細(xì)胞因子，同時(shí)還有較少量的IL-1β和GM-CSF。例如，40μl劑量的實(shí)施例1的組合物(B0222批)刺激產(chǎn)生并釋放178pg/ml的TNF-α，136pg/ml的GM-CSF和142pg/ml的IL-1β。檢驗(yàn)了不同批的實(shí)施例1的組合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF釋放的影響?？傊?，以相同的方式與從同一動(dòng)物中產(chǎn)生的各批組合物誘導(dǎo)相同的作用。然而，由不同動(dòng)物物種制備的組合物的制備方法和用途的改變則具有不同的作用。例如，B29/3006，B0213，BC0241，BC0241-01，BC0242(B＝牛)和C0203(山羊)各批誘導(dǎo)強(qiáng)烈的，高于由LPS單獨(dú)誘導(dǎo)的TNF釋放(如表III所示)，而013/2109(綿羊)批則在所有試驗(yàn)的劑量都最小限度地刺激TNF釋放。相反，R0201(鯊魚)批在大多數(shù)試驗(yàn)劑量都抑制工作的釋放。表III中所示的TNF值計(jì)算成為TNF-α釋放的差值，即由LPS和實(shí)施例1的組合物組合在一起產(chǎn)生的刺激減去由LPS單獨(dú)產(chǎn)生的刺激。表III實(shí)施例1的組合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的PBMNs的TNF釋放的影響</tables>已知實(shí)施例1的組合物影響LPS誘導(dǎo)的人類PBMNs的TNF釋放，因此進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)此組合物在隨時(shí)間對(duì)LPS誘導(dǎo)的PBMNs的TNF釋放的影響。表IV實(shí)施例1的組合物(B0213批)隨時(shí)間對(duì)LPS誘導(dǎo)的PBMNs的TNF釋放(pg/ml)的影響</tables>表IV顯示到2小時(shí)時(shí)，LPS誘導(dǎo)的PBMNs的TNF釋放水平已升為697pg/ml；到6小時(shí)，達(dá)到最高峰，約為2006pg/ml。在24、48和72小時(shí)時(shí)，TNF的釋放漸次降低。事實(shí)上，到48和72小時(shí)時(shí)，LPS誘導(dǎo)的PBMNs的TNF釋放剛剛高于其基本產(chǎn)生水平。相反，LPS和B0213批的組合物(其是TNF釋放的強(qiáng)烈的刺激物)組合在一起使用，在24小時(shí)時(shí)誘導(dǎo)出TNF釋放的峰值，此時(shí)LPS的刺激作用已開始下降。和LPS單獨(dú)使用不同，LPS和B0213批的組合物組合在一起使用，在48小和72小時(shí)時(shí)能繼續(xù)刺激TNF的釋放，其水平恰好高于基本產(chǎn)生水平。這些數(shù)據(jù)表明實(shí)施例1的B0213批組合物在全部時(shí)間內(nèi)對(duì)刺激TNF的產(chǎn)生都是有效的。來源于鯊魚的且為TNF釋放的抑制物的R0201批組合物在2、6和24小時(shí)時(shí)，顯著地抑TNF制釋放。在48和72小時(shí)時(shí)，R0201批組合物具有最小限度的正或負(fù)作用。簡(jiǎn)言之，上述結(jié)果表明一些批的組合物(如來源于鯊魚的)抑制LPS誘導(dǎo)的PBMNs的TNF釋放，而另外一些批的組合物(如來源于牛、山羊、錦羊)則刺激LPS誘導(dǎo)的TNF釋放。總之，本發(fā)明的組合物能以正和負(fù)兩種方式調(diào)節(jié)TNF的產(chǎn)生。圖5和表V顯示了這些數(shù)據(jù)的總結(jié)結(jié)果。表V實(shí)施例1的組合物的刺激和抑制作用的總結(jié)利用100μl實(shí)施例1的組合物和50ng的LPS使上文描述的PBMN-TNF測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化。如以上所述從3個(gè)不同的受檢驗(yàn)的人中獲得PBMNs并在當(dāng)天使用。將各個(gè)3次測(cè)定(利用個(gè)體接受檢驗(yàn)的細(xì)胞)的結(jié)果平均，以補(bǔ)償不同受檢驗(yàn)人之間產(chǎn)生的變異。此分析涉及確定在只有RPMI培養(yǎng)器和在50ngLPS存在的情況下釋放的TNF-α量。也確定了在100μl實(shí)施例1的組合物連同50mgLPS在的情況下釋放的TNF-α。從LPS值中減去培養(yǎng)基中釋放的TNF-α，以得到在LPS單獨(dú)存在時(shí)釋放的TNF-α。從組合的組合物和LPS值中減去培養(yǎng)基和LPS的值，以得到在所說的組合物單獨(dú)存在的情況下釋放的TNF-α(以pg/ml報(bào)道)。因此，TNF釋放測(cè)定有助于定量膽汁抽提物的效價(jià)。也發(fā)現(xiàn)這種組合物刺激U937細(xì)胞的TNF-α釋放，這種細(xì)胞本來來源于一個(gè)具有組織細(xì)胞淋巴組織瘤的患者，并表現(xiàn)出許多單核細(xì)胞的特性。U937細(xì)胞可以從ATCC獲得。通常，在37℃，5％CO2中，將它們保存在添加了10％熱天活的胎牛血清(FCS、GIBCO)，2mML-谷酰胺(ICN生物醫(yī)學(xué)公司，CostaMesa，CA)和10μg/ml慶大霉素硫酸酯(SIGMA，Mississauga，Ontario，加拿大)的RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO，GrandIsland，NY)中。每3-4天進(jìn)行U937細(xì)胞的傳代，以最初5×105個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度接種。通過將U937細(xì)胞暴露在佛波醇12-肉豆蔻酸鹽13-乙酸鹽(PMA；SigmaChemical公司，St.Louis，MO)中，可以刺激其分化成單核細(xì)胞。得到的單核細(xì)胞在刺激物(如實(shí)施例1的組合物單獨(dú)使用或和LPS組合在一起使用)的作用下，具有釋放TNF的能力。首先將PMA以10mM的濃度溶解在二甲基亞砜(DMSO，SIGMA)中，然后用PBS稀釋1000倍，到10uM的貯存物溶液濃度，并在-20℃下保存。將U937細(xì)胞懸浮液在室溫下以350×g離心10分鐘，并在新鮮的完全RPMI-1640培養(yǎng)基中以2×106個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度重新組成U937細(xì)胞。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)排斥法確定細(xì)胞的生存能力，通常高于95％。再用完全培養(yǎng)基將PMA釋釋500倍，以獲得20nM濃度。在0.5mlPMA(20nM)存在或不存在下，在24孔，平底組織培養(yǎng)平板(BectonDickinSon，LincolnPark，NJ)上培養(yǎng)0.5ml，U937細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞/毫升)的等量樣品，在37℃下，5％CO2中培養(yǎng)72小時(shí)。每孔的最終濃度是5×105個(gè)細(xì)胞和10nMPMA。在培養(yǎng)72小時(shí)后，除去120μl的培養(yǎng)基，代替以100μl的實(shí)施例1的組合物和10μl的無菌的去離子蒸餾水，其中含有或不含有10μl的LPS(5ng/μl)。培養(yǎng)24小時(shí)后，通過以350×g離心10分鐘沉淀所有的細(xì)胞和顆粒，將得到的上清液在分析TNF-α之前貯存在-20℃下。所有這些Virulizin樣品均在兩個(gè)分開的地點(diǎn)實(shí)驗(yàn)。利用從Endogen公司買到的TNF-αELISA試驗(yàn)盒(Cedarlane實(shí)驗(yàn)室，Hornby，Ontario)進(jìn)行兩個(gè)位點(diǎn)的夾層ELISAs，以定量U937細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中TNF-α。利用生產(chǎn)者推薦的主案。簡(jiǎn)言之，將100μl的TNF-α標(biāo)準(zhǔn)物和試驗(yàn)樣品加入到抗人TNF-α預(yù)包被的96孔平板上，并在37℃下，5％CO2培養(yǎng)3小時(shí)。在用洗滌緩沖液廣泛洗滌后，將和堿性磷酸酶綴合的100μl抗人TNF-α加入到平板中，并在37℃下，5％CO2中培養(yǎng)2小時(shí)。培養(yǎng)后，按如上所述洗滌平板，并將100μl預(yù)混合的TMB底物加入到每個(gè)孔中，使酶的顏色反應(yīng)在室溫下黑暗中進(jìn)行30分鐘。然后將100μl終止溶液加入到每一個(gè)孔中以終止反應(yīng)，利用SLT實(shí)驗(yàn)儀器ELISA讀出器在450nm下測(cè)定平板。此測(cè)定的檢測(cè)限是5pg/ml。按照描述的用于PBMN細(xì)胞的方法確定U937細(xì)胞的TNF值。和50ngLPS一起試驗(yàn)的組合物的結(jié)果列于表III。表VI</tables>實(shí)施例3此實(shí)施例描述了實(shí)施例1組合物的物理、化學(xué)和生物化學(xué)特性。確定了按照實(shí)施例1制備的三批人工組合物的物理化學(xué)特性，如傳導(dǎo)率、滲透性和全固體。列于表I中的結(jié)果表明此制造的產(chǎn)物的無菌性、效價(jià)和再觀性，進(jìn)而提供了產(chǎn)品說明。乙醇和乙醚實(shí)驗(yàn)只是正在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。如實(shí)施例2所述確定效價(jià)(即TNF釋放)。用于確定這些特性的方法列于下表。表VII作為人工產(chǎn)品的實(shí)施例1的組合物的特性</tables></tables>上文描述的物理和化學(xué)特性(如傳導(dǎo)率、滲透性和全固體)和一種多于99％鹽的組合物一致。組合物中不到1％的固體是有機(jī)物質(zhì)，大約一半的固體是碳水化合物，剩余部分是氨基酸、脂類脂類和磷脂。也存在蛋白質(zhì)和肽。SDS凝膠電泳確認(rèn)存在多于組合物中蛋白質(zhì)的肽。沒有發(fā)現(xiàn)高分子量的分子。在本發(fā)明的組合物中使用了HPLC和生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法，以描述作為緩沖液體和濃縮形式的產(chǎn)物的性質(zhì)。下文描述的HPLC結(jié)果表明在其所有的描述中所說的產(chǎn)物都是相同的。利用串聯(lián)柱反相HPLC方法描述實(shí)施例1的組合物的性質(zhì)。為了使用這種方法，將樣品凍干，然后在緩沖液A(0.1％三氟乙酸(TFA))中重新組成，并通過和Prime-SphereHC-C18柱(250×4.6mm；Phenomenex)串聯(lián)的WP60009-C18柱(W-PoreC18，250×4.6mm；加利福尼亞的phnomenex)。利用緩沖液A和緩沖液B(0.1％TFA的10％乙晴溶液)，以0.9毫升/分鐘的流速過柱。在第一個(gè)柱中加入150μl樣品，并使緩沖液A通過此系統(tǒng)20分鐘。接下來，使第一個(gè)線性梯度，0-80％緩沖液B通過30分鐘，隨后，第二個(gè)系統(tǒng)梯度，80-0％緩沖液B通過5分鐘。通過190至284nm的光吸吸收檢測(cè)洗脫下來的化合物，大部分洗脫物在210和235處檢測(cè)。實(shí)施例1的組合物在能見到峰的反相HPLC中具有一貫可再現(xiàn)的模式。三份本發(fā)明組合物的反相HPLC讀數(shù)如圖1-3所示。在以生理方式操作的LKB451Alphaplus氨基酸分析儀上分析實(shí)施例1制備的并標(biāo)記為A-F的六批膽汁抽提物的氨基酸分布圖，同時(shí)用水合茚三酮進(jìn)行后柱栓測(cè)。以納摩爾/100μl表示的結(jié)果列于表VIII中。表VIII實(shí)施例1組合物的氨基酸和尿素分布圖也評(píng)定了樣品A-F中是否存在牛DNA。利用由?；蚪MDNA中產(chǎn)生的32P標(biāo)記的牛DNA探針檢測(cè)樣品。此測(cè)定包括所說的樣品，摻加示蹤劑(峰形)的樣品、陰性和陽性對(duì)照及標(biāo)準(zhǔn)物。按照GLP規(guī)則進(jìn)行了此研究。此測(cè)定檢測(cè)到了3.9pg的參照標(biāo)準(zhǔn)DNA。計(jì)算每一個(gè)樣品，都含有不到4pg/ml的DNA。也檢驗(yàn)了樣品A-F中是否存在各種電解質(zhì)。Toronto大學(xué)臨床生物化學(xué)系的生物技術(shù)服務(wù)中心提供了此分析。以毫摩爾/升表示的結(jié)果列于表IX中。表IX實(shí)施例1組合物中電解質(zhì)的含量將樣品A-F在標(biāo)準(zhǔn)條件下經(jīng)感應(yīng)偶聯(lián)質(zhì)譜(inductivelycoupledmassspectrometry)(ICP-MS)進(jìn)行半定量多元素分析。表X描述了以每百萬個(gè)單位中的含量(ppm)表示的結(jié)果。表X實(shí)施例1組合物的元素分析注術(shù)語“＜det”意思是低于檢出水平在樣品A-F中也進(jìn)行了陰離子和陽離子分析。為了進(jìn)行此項(xiàng)分析，按照“水和廢水檢測(cè)的APHA方法”第16版，1985或“環(huán)境樣品分析方法的MOE手冊(cè)，1983”推薦的方法制備所說的樣品。用于陰離子/陽離子分析的測(cè)試設(shè)備有(1)用于金屬測(cè)定的，Jarrell灰61EICAP釋放，PerkinElmer3030Zeeman石墨爐，和PerkinElmer2380冷蒸汽AA；(2)用于陰離子測(cè)定的，Dionex2000i離子色譜；和用于常規(guī)測(cè)量的，SkslsrSA5區(qū)段流分析儀。以mg/l表示的結(jié)果，列于表XI中。表XI由于幾種硫酸酯參與很多細(xì)胞過程(如細(xì)胞增值和分化)的調(diào)節(jié)，因此在酸水解之前和之后分析了樣品D的硫酸根離子。利用完全的樣品D(即沒有分級(jí)分離的)，非水解的樣品產(chǎn)生了1000μm硫酸鹽而水解的樣品產(chǎn)生了1200μm硫酸鹽。既然硫酸根離子的濃度在酸水解后增加，這些結(jié)果表明存在全部硫酸根離子的20％是硫酸酯。已經(jīng)鑒定了實(shí)施例1組合物的物理化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，其和實(shí)施例4描述的早期研究實(shí)質(zhì)上是一致的。這些標(biāo)準(zhǔn)表明可以重復(fù)獲得相同的產(chǎn)物。實(shí)施例4此實(shí)施例描述了較早的幾批實(shí)施例1組合物的物理、化學(xué)、和生物學(xué)特性。按照實(shí)施例1描述的方法制備了幾批膽汁抽提物。另外，利用實(shí)施例1公開的方法確定了這幾批組合物的化學(xué)組成，并對(duì)其進(jìn)行了氨基酸分析。所得的結(jié)果例于下表中。表XII</tables>注ND意思是不可檢測(cè)，即含有不到0.5μg/ml的脂類和/或含有不到1.0μg/ml的高分子量多肽。NA意思是沒有測(cè)定。表XIII</tables>注釋1.向B0106和B0706兩批中加入了完全等滲的PBS固體。2.將B1306、B2006和B2306三批濃縮了兩倍，同時(shí)沒有調(diào)pH值。表XIV</tables>實(shí)施例5此實(shí)施例描述了實(shí)施例1組合物的各組分的生物學(xué)活性。研究了實(shí)施例1組合物各組分的生物學(xué)活性。分析結(jié)果和具有小分子量(即小于3000道爾頓)的組合物的生物學(xué)活性一致。此項(xiàng)結(jié)論通過一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)(在此實(shí)驗(yàn)中，組合物通過產(chǎn)施例3描述的反相HPLC)和洗脫下來的組分(分離了此組分，并經(jīng)實(shí)施例2描述的PBMN-TNF測(cè)定方法分析了其效價(jià))而確定。明顯的活性只在早期洗脫下來的峰(F1)(即5.6至6.2分鐘)處檢測(cè)到，這種活性和分子量小于3000道爾頓的小分子量物質(zhì)一致(參見表XV)。表XV反相HPLC洗脫下來的實(shí)施例1組合物的各組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的PBMns的TNF釋放的影響</tables>注1.檢測(cè)的患者的數(shù)目32.全部釋放的TNF-α修正為RPMI培養(yǎng)基的釋放(13±4pg/ml，306mOsm)3.HPLC1-2組分在水中重新組成；3-15組分在PBS緩沖液中重新組成。4.串聯(lián)的柱是W-PorexC18和PrimeSphere。兩個(gè)都來源于Phenomenex，250×4.6mm。5.每孔中的LPS體積10μl6.每孔的總體積1000μl7.樣品體積是相等的。以下進(jìn)行了另外的實(shí)驗(yàn)以表明活性(釋放TNF)組分具有小于3500道爾頓和小于1000道爾頓的分子量。按照Tamari等，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，40(10)，2057-2062(1977)，進(jìn)行Folch抽提，而使BC0241批組合物分級(jí)分離。水層在rotovap上干燥，以獲得淡褐色的，顆粒狀固體。以5mg/ml的濃度制備此固體的貯存物溶液。將一部分貯存物溶液裝入到具有3500或1000道爾頓分子量截?cái)嗄さ腃entri/por離心濃縮器(Spectrum產(chǎn)品，Houston，TX)中。以大約1500×g離心濃縮器，直到此物質(zhì)的一部分通過膜。以PBMN-TNF測(cè)定法評(píng)價(jià)通過膜的溶液的效價(jià)。結(jié)果列于表XVI。表XVI實(shí)施例1組合物各活性組分的分子量</tables>因此，不同分子量組分的生物學(xué)活性分析表明，釋放TNF的組分分子量小于1000道爾頓。實(shí)施例6此實(shí)施例具體描述了在培養(yǎng)中實(shí)施例1的組合物對(duì)T和B淋巴細(xì)胞的作用。在嚴(yán)格控制的條件下，分別在實(shí)施例1組合物存在和不存在的情況下，檢驗(yàn)了人類淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)。將標(biāo)準(zhǔn)濃度的淋巴細(xì)胞在含有所說的各種濃度的組合物的孔中培養(yǎng)。當(dāng)正常的T和B人類淋巴細(xì)胞和臨床使用的相似濃度的此組合物一起培養(yǎng)，通過臺(tái)胎藍(lán)染色排斥法判定無不利的影響。因此，本發(fā)明的組合物在培養(yǎng)中對(duì)正常的T和B淋巴細(xì)胞無毒性。也檢測(cè)了此組合物對(duì)人類PBMN存活的影響。用各種體積的此組合物和組織培養(yǎng)基在塑料微孔平板上培養(yǎng)PBMNs24和48小時(shí)。在培養(yǎng)末期，通過臺(tái)胎藍(lán)染色排斥法估算存活細(xì)胞的數(shù)目。表XVII和實(shí)施例1的組合物一起培養(yǎng)后生存的PBMNs的濃度1在三次重復(fù)中，平板接種的細(xì)胞大約為1×106個(gè)/孔。2計(jì)算的實(shí)際細(xì)胞數(shù)目/孔(×106)。上述的數(shù)據(jù)表明存活細(xì)胞的數(shù)目在24小時(shí)時(shí)下降，在48小時(shí)時(shí)再次下降；然而，所說的組合物存在或不存在時(shí)存活細(xì)胞的數(shù)目沒有不同。并且，不斷增加此組合物的體積對(duì)存活無影響。因此，所說的組合物對(duì)人類PBMN無細(xì)胞毒性。以下列3個(gè)指示系統(tǒng)評(píng)價(jià)此組合物刺激淋巴細(xì)胞的能力1)對(duì)淋巴細(xì)胞DNA合成的刺激作用；2)對(duì)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性功能的誘導(dǎo)作用；和3)對(duì)單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的功能的誘導(dǎo)作用。因?yàn)檫@些實(shí)驗(yàn)?zāi)軠y(cè)量免疫功能，已表明這些免疫功能和惡性疾病患者的不同臨床參數(shù)有關(guān)，所以選擇這些實(shí)驗(yàn)。也可以在用不同的生物反應(yīng)改良劑(如IFN或IL-Z)治療的癌癥患者身上調(diào)節(jié)免疫功能的這些指示劑。初篩選程序的結(jié)果如下1.對(duì)淋巴細(xì)胞DNA合成的刺激作用；和植物凝集素(PHA)的最佳刺激濃度比較；和原型促細(xì)胞分裂原PHA不同，已知實(shí)施例1的組合物不能刺激淋巴細(xì)胞的芽生和細(xì)胞分裂，此結(jié)果和組合物很少刺激或不刺激DNA合成的結(jié)果是一致的。2.對(duì)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性功能的刺激作用，并和IL-2的最佳刺激濃度比較；和淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能的原型刺激物IL-2不同，此組合物不引起淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性。由此組合物刺激的裂解單位的數(shù)目實(shí)際上和陰性對(duì)照(即培養(yǎng)基)引起的數(shù)目相同。3.此組合物對(duì)單核細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性功能的刺激作用；與IFN-γ和LPS(IFN+LPS)比較。</tables>實(shí)施例1的組合物能夠以劑量依賴性方式刺激外周血單核細(xì)胞表達(dá)殺癌細(xì)胞(tumoricidal)功能。此刺激量和原型巨噬細(xì)胞激活物、組合在一起的IFN-γ和LPS所引起的刺激量相當(dāng)。在體外測(cè)定中，此組合物的活動(dòng)不需要加入內(nèi)毒素，而任何其巨噬細(xì)胞激活物也是如此，認(rèn)識(shí)到這一點(diǎn)是很重要的。實(shí)施例7此實(shí)施例具體說明了為研究實(shí)施例1的組合物中存在何種細(xì)胞因子(如果有的話)而進(jìn)行的測(cè)定的結(jié)果。試驗(yàn)了按照實(shí)施例1制備的膽汁抽提物樣品(每個(gè)試驗(yàn)為50μl和100μl的等份樣品)，看其中是否含有下列細(xì)胞因子(所用的ELISA免疫測(cè)定試劑盒的來源和檢測(cè)限在括號(hào)中注明)TNF-α(Endogen，公司(5pg/ml))；IL-1α(Endogen，公司(50pg/ml))；IL-1β(4.3pg/ml)；GM-CSF(Endogen，公司)；RFN-α(Endogen，公司)；IL-2(AdvancedMagnetics，公司)；IL-6(AdvancedMagnetics，公司)(7pg/ml)；IFN-γ(5pg/ml)(原)；IL-1(AdvancedMagnetics，公司)(需要限制)；IL-4(R&amp;D系統(tǒng)(3pg/ml))；和IL-8(R&amp;D系統(tǒng)(4.7ng/ml))。所用的方法按照各個(gè)試劑盒的說明，一般技術(shù)人員員可以很容易地操作。已確定，本發(fā)明的組合物不含有能夠測(cè)量到的任何所試驗(yàn)的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子是表XVIII所描述的TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF和IFN-γ。表XVIII組合物中細(xì)胞因子的Elisa確定</tables></tables>實(shí)施例8此實(shí)施例描述了實(shí)施例1的組合物在小鼠上的藥效研究，包括VirulizinTM的內(nèi)外直接作用和體內(nèi)施用在小鼠腹膜巨噬細(xì)胞中的VirulizinTM的作用。在腹膜內(nèi)注射1.5ml4％的蛋白酶胨72小時(shí)后，從C57BL/6小鼠中收獲腹膜巨噬細(xì)胞。然后在體外單獨(dú)使用培養(yǎng)基、50ngLPS或VIRULIZINTMTM刺激巨噬細(xì)胞。然后在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行有關(guān)TNF(通過ELISA)和NO(利用Greiss試劑由分光光度計(jì)測(cè)定)水平的刺激作用的測(cè)量。重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差小于10％。如表XIX所示，VTM相對(duì)于背景(培養(yǎng)基)水平(120gp/ml)誘導(dǎo)TNF的產(chǎn)生輕微地增加(60-232pg/ml)，而和LPS(2225pg/ml)相比，VIRULIZINTM不是巨噬細(xì)胞TNF-α釋放的強(qiáng)有力的刺激物。氧化氮產(chǎn)生量為零。表XIX對(duì)蛋白酶胨巨細(xì)胞的體外刺激</tables>也給出了VIRULIZINTM和LPS對(duì)TNF-α釋放的協(xié)同作用。在前述同樣的處理后，從C57BL/6小鼠中收獲腹膜巨噬細(xì)胞。然后單獨(dú)用50ngLPS或LPS和不同稀釋液的VIRULIZINTM一起刺激巨噬細(xì)胞。如上文所述，通過ELISA方法確定TNF。如表XX所示，LPS在體外單獨(dú)誘導(dǎo)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生2900pg/ml的TNF-α釋放，而培養(yǎng)基則誘導(dǎo)262pg/ml的釋放。當(dāng)LPS和VIRULIZINTM組合在一起時(shí)，在1∶5和1∶6的VIRULIZINTM稀釋液中TNF-α釋放量有800pg/ml的增加量，直到至少1∶40的稀釋液時(shí)，釋放量仍有增加。表XXVIRULIZINTM和IFN-α或LPS的協(xié)同組合作用</tables>以上述同樣的方法給出了VIRULIZINTM和LPS對(duì)氧化氮(NO)的協(xié)同作用，只是NO的確定是在處理的巨噬細(xì)胞的上清液中進(jìn)行。如上所述，NO的測(cè)定是在處理的巨噬細(xì)胞的上清液中進(jìn)行了。如上所述，NO的測(cè)定是通過分光光度計(jì)進(jìn)行的，并使用了Greiss試劑。如上表所示，LPS引起一些NO的釋放(9μm)。VIRULIZINTM和LPS協(xié)同作用誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生顯著增加(13-27μm)，直到1∶40的稀釋液仍起作用。VIRULIZINTM本身不誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的NO釋放。也體外研究了VIRULIZINTM和IFN-γ對(duì)TNF-α釋放的協(xié)同作用，利用了如上處理的C57BL/6小鼠同樣的腹膜小鼠巨噬細(xì)胞。有關(guān)“協(xié)同組合作用”的數(shù)據(jù)包括在上表中。如表所示，腹膜小鼠巨噬細(xì)胞在體外培養(yǎng)24小時(shí)后，顯示出TNF-α的基線釋放。用LPS或IFN-γ刺激的同樣巨噬細(xì)胞釋放大約3000pg/ml的TNF-α。當(dāng)VIRULIZINTM和IFN-γ一起加入時(shí)，TNF-α的釋放減少。通過比較。LPS和IFN-γ組合物對(duì)TNF-α釋放具有加性作用。利用了如上處理的C57BL/6小鼠的同樣的腹膜小鼠巨噬細(xì)胞，也體外研究了VIRULIZINTM和IFN-γ對(duì)NO釋放的協(xié)同作用。有關(guān)“協(xié)同組合作用”的數(shù)據(jù)包括在上表中。如上所示，單獨(dú)使用LPS和IFN-γ，每一個(gè)都促進(jìn)NO的產(chǎn)生(分別為9和7μM)。加入到IFN-γ中的VIRULIZINTM誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生顯著增加(47-57μm)，其結(jié)果幾乎和LPS和IFN-γ組合作用的結(jié)果相等(74μM)此結(jié)論和VIRULIZINTM和IFN-γ組分促進(jìn)NO的產(chǎn)生但抑TNF-α的釋放的結(jié)論是一致的。研究了由C57BL/6小鼠收獲的巨噬細(xì)胞在72小時(shí)過程中TNF-α的體內(nèi)釋放，這種巨噬細(xì)胞在收獲前沒做任何處理，或者在收獲前72小時(shí)腹膜內(nèi)注射1.5和4％的蛋白酶胨，或者在收獲前72、48或24小時(shí)前注射在PBS中以1∶10稀釋的VIRULIZINTM10ml。單獨(dú)使用IFN-γ(50u/ml)LPS(5ng/ml)或它們組合在一起體外處理單層的巨噬細(xì)胞24小時(shí)。如上文所述確定TNF和NO。所得數(shù)據(jù)列于表XX。表XXI從處理的小鼠收獲的巨噬細(xì)胞的TNF和NO的釋放如下表所描述的，在沒有刺激物存在的情況下或和IFN-γ、LSP或LPS/IFN-γ一起體外培養(yǎng)24小時(shí)后，檢測(cè)巨噬細(xì)胞的TNF-α的釋放。表明VIRULIZINTMTM體內(nèi)刺激后，小鼠腹膜巨噬細(xì)胞釋放很少的TNF-α。當(dāng)把收獲的巨噬細(xì)胞在試驗(yàn)前24小時(shí)和48小時(shí)暴露在IFN-γ中，這些細(xì)胞在TNF-α的產(chǎn)生上顯示出很少的增加。相反，試驗(yàn)前24和48小時(shí)，而不是72小時(shí)用LPS刺激的收獲的巨噬細(xì)胞顯示出的TNF-α釋放的增加。同樣，在試驗(yàn)前，24和48小時(shí)而不是72小時(shí)，刺激的收獲的巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)出LPS和IFN-γ的協(xié)同作用效果。研究了在72小時(shí)的時(shí)間里，巨噬細(xì)胞NO的體內(nèi)產(chǎn)生情況，試驗(yàn)在上文描述的有關(guān)TNF-α產(chǎn)生的同樣的條件下進(jìn)行。在腹膜內(nèi)注射VIRULIZINTM(即下文的IPVIRULIZINTM)24和48小時(shí)后，測(cè)量的NO有減少的自發(fā)釋放。當(dāng)收獲的細(xì)胞和IFN-γ一起培養(yǎng)時(shí)，NO有明顯的釋放，而試驗(yàn)前24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)具有IPVIRULIZINTM的收獲的巨噬細(xì)胞顯示出NO釋放的指數(shù)增加，NO的釋放在72小時(shí)下降到單獨(dú)使用IFN-γ的基線值。當(dāng)收獲的巨噬細(xì)胞用LPS刺激后，NO的釋放顯示出明顯的增加，這種增加在VIRULIZINTM處理巨噬細(xì)胞24和48小時(shí)時(shí)再次出現(xiàn)(和沒有接受到IPVIRULIZINTM的巨噬細(xì)胞相比)。72小時(shí)前接受IPVIRULIZINTM的收獲的巨噬細(xì)胞和沒有進(jìn)行VIRULIZINTM預(yù)處理的巨噬細(xì)胞反應(yīng)相同。最后，當(dāng)將IPVIRULIZINTM預(yù)處理的巨噬細(xì)胞和LPS/IFN-γ一起培養(yǎng)時(shí)，相對(duì)于沒有這樣處理的巨噬細(xì)胞，顯示出增加的NO產(chǎn)生量。最大值反應(yīng)發(fā)生在收獲和試驗(yàn)前48小時(shí)用VIRULIZINTM預(yù)處理的巨噬細(xì)胞上。實(shí)施例9此實(shí)施例闡述了實(shí)施例1的組合物對(duì)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活作用及進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)的方法。研究表明實(shí)施例1的組合物能激活正常的單核細(xì)胞，使之對(duì)用于檢測(cè)單核細(xì)胞毒性的Chang肝癌細(xì)胞系表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，還表明此組合物刺激癌癥患者(如患有子宮頸、卵巢、耳/鼻/喉、子宮內(nèi)膜異位/子宮和慢性骨髓性的白血病的患者)的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使之攻擊和破壞來源于同一患者的腫瘤細(xì)胞。更特別的是，在本發(fā)明組合物存在的情況下檢驗(yàn)了單核細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能，下文簡(jiǎn)要描述了這些實(shí)驗(yàn)的基本方法。此方法已命名為“細(xì)胞系和自腫瘤細(xì)胞的單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞毒性的測(cè)定方法”或簡(jiǎn)稱為“細(xì)胞毒性測(cè)定法”。所述方法需要分離單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，這一分離步驟按以下進(jìn)行收集靜脈血。加入無菌的沒有防腐劑的肝素，使其最后濃度為20單位/毫升。將所說的血在Hanks平衡鹽溶液(HBSS)中以3∶1稀釋，在淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基上鋪層，并離心獲得一層外圍血單核細(xì)胞(PBMNs)。離心后，從界面上回收單核細(xì)胞層，培養(yǎng)基中洗滌兩次(培養(yǎng)基是RosewellParkMemorial研究所(RPMI))的1640培養(yǎng)基，另外添加了10％熱天活的胎牛血清，50單位/毫升的青霉素和50μg/ml的鏈霉素)，通過乳膠攝取計(jì)數(shù)單核細(xì)胞。通過在96孔塑料平板上的吸附來分離單核細(xì)胞(37℃下2小時(shí)，之后用培養(yǎng)基洗滌兩次循環(huán))。估計(jì)吸附的細(xì)胞超過90％的單核細(xì)胞。含有吸附細(xì)胞的孔在VIRULIZINTM(1∶10-1∶200的最終稀釋液)中過夜培養(yǎng)。然后，洗滌吸附細(xì)胞以除去VIRULIZINTM，并和腫細(xì)胞過夜培養(yǎng)。所說的腫瘤細(xì)胞保存在培養(yǎng)基中，其中的內(nèi)毒素濃度由生產(chǎn)者提供，其含量較低，在測(cè)定中刺激作用。在使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的研究中，利用了51Cr(鉻)標(biāo)記的Chang肝癌細(xì)胞，因?yàn)榇思?xì)胞系對(duì)天然殺手細(xì)胞的細(xì)胞毒性不敏感。將這些肝癌靶腫瘤細(xì)胞以效應(yīng)物靶(E∶T)為20∶1至15∶1的比例加入到吸附細(xì)胞的單層上。使用此比率是因?yàn)樵谝?∶1至30∶1變化的E∶T比率所制備的曲線中，其正好落在曲線的平穩(wěn)范圍內(nèi)。24小時(shí)后，收集上清液，并定量51Cr的釋放量。按照下列公式計(jì)算特異細(xì)胞毒性的百分率％特異釋放＝E-S/T-S×％在上面的等式中，E＝在效應(yīng)物細(xì)胞存在的情況下，靶細(xì)胞釋放的CPM；S＝在沒有效應(yīng)物細(xì)胞的情況下，靶細(xì)胞釋放的CPM；T＝在2％十二烷量硫酸鈉處理后，靶細(xì)胞cpm的釋放。在使用自體腫瘤細(xì)胞的研究中，從外科活檢中獲得這些細(xì)胞，用51Cr標(biāo)記，并以同樣的方式用作如上文描述的肝癌細(xì)胞。以Braun等(癌研究，53，3362-3365(1993))描述的方法制備腹膜和肺泡巨噬細(xì)胞。利用此方案，發(fā)現(xiàn)此組合物能引起健康供者的單核細(xì)胞對(duì)Chang肝癌細(xì)胞系產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。接下來，研究了此組合物是否能刺激癌癥患者的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使之攻擊和破壞它們自身特定的腫瘤細(xì)胞。利用已描述的用于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系(Chang肝癌細(xì)胞)的類似的方案，分離了癌癥患者的單核細(xì)胞和/或腹膜巨噬細(xì)胞。從腹腔鏡檢查時(shí)收集到的腹膜液體中分離腹膜巨噬細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)此組合物能激活子宮頸癌患者的腹膜單核細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞，使之產(chǎn)生針對(duì)患者自身腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。此效果相當(dāng)于或好于由IFN和LPS組合而產(chǎn)生的效果。也發(fā)現(xiàn)此組合物刺激卵巢癌患者的腹膜巨噬細(xì)胞，使之攻擊和破壞培養(yǎng)中的卵巢腫瘤細(xì)胞。利用此組合物研究單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞由于篩選方法表明組合物不能刺激淋巴細(xì)胞的功能，但能刺激單核細(xì)胞的功能，接下來的研究的目的是此組合物對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的刺激活性的特質(zhì)描述上。已經(jīng)進(jìn)行了目的在確定組合物在刺激單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞殺癌細(xì)胞功能的劑量反應(yīng)特性的大量對(duì)此研究，并試驗(yàn)了不同批的化合物。此研究主要目的是試驗(yàn)此組合物對(duì)癌癥不同解剖位點(diǎn)的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的刺激殺癌細(xì)胞功能的能力。在這些研究中，使用下列物質(zhì)(1)癌癥患者和對(duì)照者的外圍血單核細(xì)胞；(2)肺癌患者和沒有惡性肺疾病的對(duì)照患者的肺泡巨噬細(xì)胞；和(3)具有婦科惡性腫瘤患者的腹膜巨噬細(xì)胞。完成了全部按實(shí)施例1的方法制備的不同批組合物的劑量反應(yīng)研究。這些研究依靠外周血單核細(xì)胞來試驗(yàn)不同劑量和不同批組合物(批號(hào)為216，219和222)的刺激活性。以沒有稀釋(純凈的)的組合物、1∶10稀釋液和1∶50稀釋液為物質(zhì)，試驗(yàn)了每批組合物。圖14描述了此結(jié)果。結(jié)果表明，批222和216能刺激單核細(xì)胞殺癌細(xì)胞功能，而批219則不能。在這些初步研究中，似乎222優(yōu)于216。批222在沒有稀釋(純的)和1∶10稀釋液兩種情況下表現(xiàn)出刺激殺癌細(xì)胞功能到相等的水平，在1∶50稀釋液的情況下活性減少，但仍能檢測(cè)出。批216在沒有稀釋(純的)和1∶10稀釋液兩種情況下對(duì)刺激殺癌細(xì)胞功能表現(xiàn)出相等的功能；在1∶50稀釋液的情況下活性減少，但仍能檢測(cè)到。批216在沒有稀釋(純的)的濃度下表現(xiàn)出最大殺癌細(xì)胞功能的刺激作用；在1∶10稀釋液時(shí)活性減少；而在1∶50稀試液時(shí)沒有檢測(cè)到活性。如上所述，批219在任何試驗(yàn)的濃度都不引起能檢測(cè)到的單核細(xì)胞殺癌細(xì)胞功能。也評(píng)價(jià)了外周血簡(jiǎn)胞的殺癌細(xì)胞功能。試實(shí)驗(yàn)在對(duì)照者的4種外周血單核細(xì)胞樣品中進(jìn)行。這些實(shí)驗(yàn)利用了此些組合物的最佳刺激濃度(批222的1∶10稀釋液)和IFN-γ加LPS的最佳刺激濃度。這些研究中的靶細(xì)胞是培養(yǎng)的，對(duì)NK不敏感的細(xì)胞系，即chang肝癌。結(jié)果列于下表中。</tables>也進(jìn)行了子宮頸癌患者單核細(xì)胞樣品1的實(shí)驗(yàn)。由于這種患者自體腫瘤細(xì)胞可以用作此測(cè)定中的靶細(xì)胞，所以此實(shí)驗(yàn)是非常重要的。如上所述，此實(shí)驗(yàn)利用了此組合物的最佳刺激濃度和IFN-γ加LPS的最佳刺激濃度。另外，為了保護(hù)腫瘤小步，效應(yīng)物/靶細(xì)胞比率降低到15/1。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于下表。</tables>在對(duì)照者的外周血單核細(xì)胞中，此組合物刺激單核細(xì)胞針對(duì)chang肝癌細(xì)胞的tumi功能，其水平等于或高于由IFN-γ+LPS的最佳刺激濃度所引起的水平。在子宮頸癌患者的外圍血單核細(xì)胞中，此組合物以超過由IFN-γ+LPS所引起的水平30％多的水平刺激針對(duì)患者自身腫瘤細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能。檢驗(yàn)的婦科惡性腫瘤患者腹膜巨噬細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能。這些實(shí)驗(yàn)在子宮頸癌患者1和卵巢癌患者1的Lavage液體中分離到的腹膜巨噬細(xì)胞中進(jìn)行。在此測(cè)定中，以患者自身的腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。如上所述，比較了組合物的最佳刺激濃度(批222的1∶10稀釋液)和IFN-γ+LPS的最佳刺激濃度。另外，為了保護(hù)患者的腫瘤細(xì)胞，把效應(yīng)物/靶細(xì)胞的比率降到15/1。所得到的數(shù)據(jù)為所有這些結(jié)果都突出這樣一個(gè)事實(shí)，即局部的腫瘤環(huán)境可能是免疫細(xì)胞對(duì)免疫激活物發(fā)生反應(yīng)的決定因素。對(duì)于子宮頸癌，在腹腔中沒有惡性疾病的病理癥狀，并且在針對(duì)自體腫瘤的殺癌細(xì)胞功能的發(fā)育(development)上，IFN-γ和LPS組合作用好于所說的組合物。對(duì)于卵巢癌患者，在腹腔中有明顯的腫瘤。針對(duì)患者自身腫瘤，對(duì)IFN-γ和LPS組合在一起的反應(yīng)充其量是最小的，而對(duì)所說的組合物的反應(yīng)則較大。檢驗(yàn)了肺癌患者和對(duì)照者的肺泡巨噬細(xì)胞的T功能。這些實(shí)驗(yàn)是在從一個(gè)具有非小細(xì)胞肺癌患者和3個(gè)具有肺部非惡性疾病患者的支氣管小泡的灌洗液中分離出來的肺泡巨噬細(xì)胞樣品上進(jìn)行的。這些實(shí)驗(yàn)利用了此組合物的最佳刺激濃度(批#2221∶10的稀釋液)和IFN-γ和LPS組合在一起的最佳刺激濃度。這些研究中的靶細(xì)胞是Chang肝癌細(xì)胞，并且效應(yīng)物/靶細(xì)胞比率是20/1。所得的數(shù)據(jù)如下刺激物癌癥患者對(duì)照培養(yǎng)基2.6±219.5±4IFN-γ+LPS10.9±131.2±5組合物5.2±218.6±8此結(jié)果和在肺癌患者的肺泡巨噬細(xì)胞中觀察到的事實(shí)一致，即肺癌患者的肺泡巨噬細(xì)胞響應(yīng)常規(guī)的巨噬細(xì)胞激活物(如IFN-γ+LPS)而在其T功能的發(fā)育上受到破壞。此結(jié)果表明肺癌患者的肺泡巨噬細(xì)胞的T功能相對(duì)于對(duì)照者的大大降低。更早發(fā)表的數(shù)據(jù)表明VIRULIZIN是巨噬細(xì)胞的弱刺激物。實(shí)施例23提供了非小細(xì)胞肺癌患者的肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)一步研究的結(jié)果。肺泡巨噬細(xì)胞的活性似乎隨不同的VIRULIZIN制劑而變化。這樣，實(shí)驗(yàn)的最初幾批組合物(222，219，216)只在2/7肺泡巨噬細(xì)胞制劑中引起肺泡巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性。相反，后來的組合物制劑(233，238)則刺激了3/4的肺泡制劑。此種差異可能和組合物制劑的存放時(shí)間和效價(jià)或患者的變異性有關(guān)。因此，此組合物能激活肺泡巨噬細(xì)胞的T活性。此組合物的初步體外實(shí)驗(yàn)表明其是一種巨噬細(xì)胞激活物。在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞毒性測(cè)定中，提供的物質(zhì)能引起針對(duì)NK不敏感的細(xì)胞系和新分裂的人類腫瘤細(xì)胞的T活性。在這些實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)引起的活性是依賴濃度的。此組合物體外激活巨噬細(xì)胞T功能的能力相對(duì)于目前能得到的最好的巨噬細(xì)胞激活組合劑，即組合在一起的IFN-γ和內(nèi)毒素(即LPS)的能力。如上所述，在不含內(nèi)毒素的情況下，組合物一起此水平的T功能的能力在生物學(xué)上被認(rèn)為是重要的，如果物質(zhì)中沒有內(nèi)毒素污染。當(dāng)美國(guó)藥典(USP)的兔熱原實(shí)驗(yàn)將此組合物用于熱原實(shí)驗(yàn)時(shí)，其不含有內(nèi)毒素。和其它細(xì)胞激活物一樣，此組合物刺激巨噬細(xì)胞T功能的活性隨巨噬細(xì)胞的來源的不同而變化。已表明此組合物是外周血單核細(xì)胞的最佳激活物，相對(duì)于正常供者的IFN-γ+LPS，并優(yōu)于癌癥患者供者的IFN-γ+LPS。惡性疾病明顯地影響依賴于所用的激活物的單核細(xì)胞T功能的發(fā)育(Braun等(1991))。癌癥患者單核細(xì)胞上不同巨噬細(xì)胞激活物的生物學(xué)活性的一個(gè)決定因素是激活物對(duì)花生烯酸代謝和前列腺素細(xì)胞分泌作用的敏感性。此組合物的這些最初的研究表明由該化合物引起的活性對(duì)前列腺素抑制作用不敏感。如果能夠明確的證明由此組合物刺激的癌癥患者單核細(xì)胞對(duì)前列腺素的不敏感性，應(yīng)該認(rèn)為這一點(diǎn)在治療上是重要的，因?yàn)樵S多其它生物激活物的效能由前列腺素限制。2個(gè)樣品的初步研究表明此組合物在腹膜巨噬細(xì)胞中可以有良好的活性，特別是當(dāng)惡性疾病出現(xiàn)在腹腔時(shí)。這些初步的結(jié)果也說明當(dāng)比較不同的激活物在具有不同婦科惡性腫瘤患者的腹膜巨噬細(xì)胞中刺激殺癌細(xì)胞功能的能力時(shí)所得到的發(fā)現(xiàn)。在這些研究中，已發(fā)現(xiàn)腹腔中惡性疾病的存在影響腹膜對(duì)特異的激活物的響應(yīng)。在子宮頸癌的患者中，惡性疾病通常不存在腹腔中，這樣定居的哦對(duì)IFN-γ+LPS的響應(yīng)是正常的。然而，當(dāng)疾病存在于腹腔中，如在卵巢癌的情況下，對(duì)IFN-γ+LPS的響應(yīng)則受到抑制。這部分和惡性疾病存在時(shí)腹膜哦的花生烯酸代謝的變化有關(guān)(Braun等，1993)。組合物激活卵巢癌患者的腹膜巨噬細(xì)胞針對(duì)病人自身的腫瘤細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能的事實(shí)和獨(dú)立于花生烯酸代謝途徑的激活機(jī)制一致。因此，如前面敘述的體外試驗(yàn)所示，部分的組合物能夠激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以增加他們的免疫系統(tǒng)功能。實(shí)施例10此實(shí)施例闡述了在具有婦科疾病的患者的外圍血單核細(xì)胞和腹膜中響應(yīng)本發(fā)明的組合物的殺癌細(xì)胞功能?；颊呷后w由7個(gè)患者組成，其中3個(gè)患有良性疾病，4個(gè)患有惡性疾病(2個(gè)卵巢癌，1個(gè)子宮內(nèi)膜癌，和1個(gè)子宮頸癌)。以外科方法除去樣品。利用Braun等在癌癥免疫學(xué)和免疫治療學(xué)，32，55-61(1990)中公布的方法，從血液樣品中分離含有外圍血單核細(xì)胞的制劑，并利用如Braun等在癌癥研究，53，3361(1993)中所公布的方法分離含有腹膜的制劑。利用Braun等描述的單核細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定方法，評(píng)價(jià)了腫瘤細(xì)胞響應(yīng)本發(fā)明的組合物(貯存物批#222的1∶10稀釋液)和群體的激活物，即IFN-γ(100U/ml)、IL-12(500U/ml)、和單核細(xì)胞-CSF(500U/ml)的細(xì)胞毒性。下表所示的結(jié)果表明本發(fā)明的組合物刺激患有惡性的和非惡性的婦科疾病的患者的外周血單核細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能。在單核細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞比為15∶1時(shí)，將結(jié)果描述為腫瘤細(xì)胞毒性(±S.E.)的百分比。對(duì)外周血單核細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞的刺激作用激活物外圍血單核細(xì)胞腹膜巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基8.6±33.1±1γ-干擾素18.3±29.5±1白細(xì)胞介素-1226.0±48.5±2單核細(xì)胞-CSF16.0±27.0±2本發(fā)明組合物(VIRULIZIN)23.0±612.5±2因此，由本發(fā)明組合物所引起的腫瘤細(xì)胞毒性相等于或高于由其它所實(shí)驗(yàn)的生物刺激物所引起的毒性。實(shí)施例11此實(shí)施例闡述了吲哚美辛(indomethacin)(一種前列腺素合成抑制劑)對(duì)響應(yīng)本發(fā)明的組合物的殺癌細(xì)胞功能的發(fā)育的影響；也研究了其它巨噬細(xì)胞激活物對(duì)癌癥患者的外圍血單核細(xì)胞的影響。利用如實(shí)施例10描述的測(cè)定系統(tǒng)檢測(cè)了實(shí)施例中患有惡性疾病患者電荷樣品，只是在加入本發(fā)明的組合物、IL-12(500U/ml)及單核細(xì)胞-CSF(500U/ml)的同時(shí)，加入了吲哚美辛。如下表顯示的結(jié)果表明吲哚美辛加強(qiáng)響應(yīng)IFN-α、GM-CSF和M-CSF的細(xì)胞毒性。吲哚美辛引起的細(xì)胞毒性的增加激活物情況供者號(hào)％細(xì)胞毒性IFN-γ2311.9±9IFN-γ+吲哚美辛2325.2±17GM-CSF107.8±6GM-CSF+吲哚美辛1017.8±8PMA627.3±14PMA+吲哚美辛622.0±17IL-12324.7±5IL-12+吲哚美辛325.6±6M-CSF314.31±3M-CSF+吲哚美辛319.0±3組合物(Virulizin)418.7±6組合物(Virulizin)+吲哚美辛16.4±6這樣，響應(yīng)IFN-γ、GM-CSF和M-CSF的殺癌細(xì)胞功能的發(fā)育由吲哚美辛敏感功能調(diào)節(jié)。相反，響應(yīng)PhorbolEster(PMA)IL-12和本發(fā)明組合物的殺癌細(xì)胞功能的發(fā)育不由吲哚美辛不敏感的功能調(diào)節(jié)，即吲哚美辛不加強(qiáng)響應(yīng)本發(fā)明的組合物、IL-12和PMA的細(xì)胞毒性。實(shí)施例12此實(shí)施例闡述了前列腺素E2在吲哚美辛存在的情況下，對(duì)響應(yīng)本發(fā)明組合物的殺癌細(xì)胞功能的發(fā)育的影響?；颊呷后w由一個(gè)正常的和九個(gè)患者(一個(gè)健康的，一個(gè)胰腫瘤患者，兩個(gè)頭和頸項(xiàng)腫瘤患者，一個(gè)子宮內(nèi)膜異位，和四個(gè)HIV患者)組成。利用Braun等(1990)公布的方法，從患者的血液樣品中分離含有外周血單核細(xì)胞的制劑。利用Braun等(同上)描述的單核細(xì)胞細(xì)胞毒性測(cè)定方法，在有或沒有PGE2(108M)的情況下，測(cè)量腫瘤細(xì)胞響應(yīng)本發(fā)明的組合物(貯存物批#222的1∶10稀釋液)和吲哚美辛(多至5ng/ml)的細(xì)胞毒性。所得的結(jié)果列于下表，在單核細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞比為15∶1時(shí)，結(jié)果以腫瘤細(xì)胞毒性的百分比表示。PGE2對(duì)響應(yīng)實(shí)施例1的組合物而發(fā)育的殺癌細(xì)胞功能的影響診斷組合物組合物組合物(VIRULIZIN)+吲(VIRULIZIN)(VIRULIZIN)+哚美辛+PGE吲哚美辛健康的192027胰的151422BNSCC9812HNSCC11312子宮內(nèi)膜異位3737n.d.HIV678HIV151219HIV211620HIV2322n.d.下表中的數(shù)據(jù)顯示PGE2(10-8M)的病生理水平不能抑制響應(yīng)本發(fā)明的組合物而發(fā)育的殺癌細(xì)胞功能的水平。此結(jié)論和PGE2抑制由IFN-γ刺激的單核細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能的能力相反(Braun等，(1993))。實(shí)施例13此實(shí)施例闡述了在本發(fā)明的組合物刺激的單核細(xì)胞中，針對(duì)自體腫瘤的殺癌細(xì)胞功能的發(fā)育。利用Braun等(1990)公布的方法，從7個(gè)患者(三個(gè)卵巢癌，一個(gè)子宮內(nèi)膜癌，一個(gè)子宮頸癌和兩個(gè)ENT癌)的血液樣品中分離含有外周血單核細(xì)胞的制劑。利用Braun等描述的單核細(xì)胞細(xì)胞毒性測(cè)定方法，在有或沒有PGE2(10-8M)的情況下，測(cè)量腫瘤細(xì)胞響應(yīng)本發(fā)明的組合物(貯存物批#222的1∶10稀釋液)和吲哚美辛(多至5ng/ml)的細(xì)胞毒性，只是使用了患者的腫瘤細(xì)胞代替Chang肝癌細(xì)胞。利用膠原酶和DNase處理患者的腫瘤細(xì)胞，制備單細(xì)胞制劑，并如Braun等(1990)描述的方法標(biāo)記此細(xì)胞。下表中所顯示的結(jié)果顯示本發(fā)明的組合物有能力激活患者自身的單核細(xì)胞以殺死患者的腫瘤。實(shí)施例1的組合物誘導(dǎo)的單核細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能診斷培養(yǎng)條件％腫瘤細(xì)胞毒性(E/T＝15/1)卵巢癌培養(yǎng)基2組合物(Virulizin)11卵巢癌培養(yǎng)基1γ-干擾素+LPS4組合物(Virulizin)9卵巢癌培養(yǎng)基0γ-干擾素+LPS14組合物(Virulizin)11子宮內(nèi)膜癌培養(yǎng)基6γ-干擾素+LPS14組合物(Virulizin)21子宮頸癌培養(yǎng)基8γ-干擾素+LPS30組合物(Virulizin)13ENT癌培養(yǎng)基11γ-干擾素+LPS12組合物(Virulizin)25ENT癌培養(yǎng)基18γ-干擾素+LPS11IL-1211M-CSF3組合物(Virulizin)35實(shí)施例10至13的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)施例1的組合物能夠激活單核細(xì)胞以表達(dá)殺癌細(xì)胞功能；這種組合物在血液中對(duì)腹膜巨噬細(xì)胞起作用；并且，此結(jié)果和組合物不從屬于前列腺素的抑制作用一致，前列腺素是患者免疫抑制的重要形式。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也支持此組合物在治療腹膜、肺泡和婦科惡性疾病中的利用。實(shí)施例14此實(shí)施例闡述了為評(píng)價(jià)組合物之內(nèi)的蛋白質(zhì)所進(jìn)行的測(cè)定的結(jié)果。利用PierceMicroBCA蛋白質(zhì)測(cè)定技術(shù)完成了組合物中的蛋白質(zhì)評(píng)價(jià)(smith等，生物化學(xué)年報(bào)150，76-85(1995))。用蒸餾水將一批10μl組合物的樣品補(bǔ)充到1ml。配制5中濃度的牛血清清蛋白(0.150μg/ml)，用作標(biāo)準(zhǔn)。0.1N的NaOH用作空白。向所用這些樣品中加入BCA混合物(2％雙辛可酸鈉鹽；Pierce)、4％硫酸銅和微型試劑(溶解在0.2NNaOH中的NaCO3、NaHCO3、酒石酸鈉)。樣品混合物在60℃下培養(yǎng)1小時(shí)，冷卻，利用分光光度計(jì)在562nm測(cè)定吸收讀數(shù)。然后把實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)的量和繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠?jì)數(shù)。發(fā)現(xiàn)組合物中的蛋白質(zhì)濃度較低，估計(jì)為32μg/ml。實(shí)施例15總之，此實(shí)施例證明了下列幾點(diǎn)(1)組合物具有TNF-α釋放活性，并且TNF-α的釋放活性不與任何內(nèi)毒素的污染有關(guān)；(2)巨噬細(xì)胞的引發(fā)提高組合物刺激TNF-α釋放的能力；和(3)組合物的高克分子滲透壓濃度對(duì)TNF-α的釋放的活性沒有作用。為了試驗(yàn)內(nèi)毒素的作用是否和上面所述的實(shí)施例1組合物的生物學(xué)活性有關(guān)，利用加入到反應(yīng)物中的多粘菌素進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。在白細(xì)胞中，多粘菌素抑制內(nèi)毒素活動(dòng)。下表和隨后的注釋說明了所進(jìn)行的組合物實(shí)驗(yàn)。內(nèi)毒素的缺乏對(duì)TNF-2釋放的影響和巨噬細(xì)胞引發(fā)的釋放增加釋放的TNF(pg/ml)實(shí)驗(yàn)的樣品添加劑總量-LPSLPS多粘菌素11±70沒有517±1180組合物(#B0213)多粘菌素1591±4131581沒有5256±25854738注釋1.所釋放的TNF都符合1640培養(yǎng)基的TNF釋放。2.多粘菌素濃度50,000單位/毫升。3.組合物體積200μl。4.使用多粘菌素，試驗(yàn)8個(gè)患者。沒有添加劑，試驗(yàn)3個(gè)患者。5.LPS濃度50ng/10μl。結(jié)果顯示多粘菌素能完全抑制LPS-誘導(dǎo)的TNF-α的釋放。在缺少多粘菌素的情況下，LPS誘導(dǎo)的517pg/ml的TNF-α，而在多粘菌素存在的情況下，釋放11pg/ml的TNF-α。另一方面，在多粘菌素存在的情況下，組合物釋放1591pg/ml的TNF-α。在沒有多粘菌素的情況下，LPS和所說的組合物表現(xiàn)出不僅僅是刺激物的加性效應(yīng)，而是當(dāng)引發(fā)巨噬細(xì)胞時(shí)，組合物以更大的強(qiáng)度發(fā)生作用。高克分子滲透壓濃度對(duì)TNF-2釋放無影響批號(hào)pH克分子滲透壓濃度(mOsm)濃縮的B0222原pH411B0222調(diào)節(jié)的pH581B0216調(diào)節(jié)的pH87280219調(diào)節(jié)的pH886非濃縮的B0221原pH652B0221調(diào)節(jié)的pH533B0213調(diào)節(jié)的pH675B0225調(diào)節(jié)的pH590B0226調(diào)節(jié)的pH540BC11-06調(diào)節(jié)的pH445BC11-09調(diào)節(jié)的pH603利用標(biāo)準(zhǔn)的方法確定了不同批的克分子滲透壓濃度。結(jié)果列于前表中。B0213以675mOsm為中等偏高。B0222(顯示出比B0213具有更好有TNF釋放活性)的高克分子滲透壓濃度較低，為581mOsm。B0226、BC11-06和BC11-09部分的范圍為540至603mOsm。也研究了組合物的高克分子滲透壓濃度對(duì)TNF-α釋放活性的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)調(diào)節(jié)組合物的克分子滲透壓濃度，甚至調(diào)至高克分子滲透壓濃度時(shí)，其繼續(xù)釋放TNF-α。實(shí)施例16此實(shí)施例闡述本發(fā)明組合物的毒性研究。對(duì)下表所列的各種動(dòng)物品種進(jìn)行了初步的毒性研究。在每日臨床觀察的基礎(chǔ)上，在接受本發(fā)明組合物注射的14、21和30天后，對(duì)下表中所列的所有動(dòng)物進(jìn)行了測(cè)量。在開始的30天內(nèi)每3天收集血液學(xué)數(shù)據(jù)，以后每月一次。在整個(gè)施用注射的時(shí)期或隨后的跟蹤期(所有的品種為1個(gè)月，只有狗跟蹤了4個(gè)月)沒有在任何包含在此項(xiàng)研究中的358多種動(dòng)物中觀察到不利的影響。動(dòng)物數(shù)量劑量白鼠1000.2mli.m.3天間隔，共4次雄性Wistar兔1002.0mli.m.3天間隔，共4次金色倉鼠601.5mli.m.4天間隔，共4次天竺鼠603.0ml3天間隔，其4次兔155.0mli.m.3天間隔，共4次貓103.0mli.m.3天間隔，共6次狗122ml/kgi.m.一次給藥，觀察4個(gè)月進(jìn)行了第二種毒性研究以確定單一大劑量肌肉內(nèi)施用所說的組合物的作用。十三只SpragueDawley大鼠接收了組合物大劑量肌肉內(nèi)施用(5ml/kg)。三只大鼠觀察了7天。十只大鼠觀察了14天。其后使它們安樂死并進(jìn)行了尸體剖檢。在任何組中都沒有觀察到毒性癥狀，在尸體剖檢的動(dòng)物中沒有觀察到重大的病理癥狀。基于這些觀察，確定所說的組合物在大鼠中肌肉內(nèi)施用的LD50高于5ml/kg。另一個(gè)毒性實(shí)驗(yàn)是由安大略湖的獸醫(yī)學(xué)院實(shí)施的，將其中所說的組合物施用給雜交品種的狗。下表概括了此品種實(shí)驗(yàn)方案動(dòng)物年齡及重量劑量1劑量2施用間隔雄性混合品種成年5kg5.5mli.m.0.6mli.m.7天雌性混合品種6個(gè)月13kg12.5mli.m.1.3mli.m.7天在每種情況下，一次劑量在右后腿中施用，7天后第二次劑量在左后腿施用。在第一次注射之后，兩種狗都觀察14天。在整個(gè)研究期間，每天監(jiān)測(cè)兩次食欲、活性、溫度、脈搏率和呼吸率。在下列時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行常規(guī)尿分析、血液學(xué)和血清化學(xué)描述預(yù)處理和第一次注射后的24小時(shí)，72小時(shí)，7天和14天。兩種動(dòng)物都沒有表現(xiàn)出和任何注射有關(guān)的疼痛。不存在和第二次注射有關(guān)的過敏反應(yīng)證據(jù)。沒有觀察到可以歸因于藥物的物理或者實(shí)驗(yàn)參數(shù)的變態(tài)或者變化。健康的狗似乎充分忍耐了這種藥物。在安大略湖癌研究所用VIRULIZINTM進(jìn)行了17-天重復(fù)劑量的毒性研究連同動(dòng)物模型研究。模型利用了雌性C57B1小鼠。有如下的4組(IM＝肌肉內(nèi)，IP＝腹膜內(nèi))組號(hào)處理劑量體積數(shù)目/組1鹽水，IM0.05ml102VirulizinTM，IM0.05ml103VirulizinTM，IM0.05mlX2104VirulizinTM，IP0.5ml10在第0天用5×103B16F1黑素瘤細(xì)胞附加中心體注射每組小鼠。在開始的17天，每組小鼠每天接收如上表描述的VirulizinTM或鹽水注射。在第18天，處死小鼠。在處死前，其食物攝入、重量的增加和行為都是正常的。在所檢查的任何器官中沒有引起光學(xué)顯微鏡能觀察到的變化的毒性之證據(jù)，所檢查的器官有大腸、脾、胃、胰、膀胱、肝臟、人腦、腎、小腸和心臟。食品攝入和行為是正常的。重量的獲得是正常的。通過每周施用3次VirulizinTM，共施用13周，在Fischer-344大鼠(總共40個(gè)雄性和40個(gè)雌性)中進(jìn)行了13周重復(fù)劑量的毒性研究。最大的劑量是1.1mg/kg，大約是人類劑量的20X。13周后，將動(dòng)物進(jìn)行充分的組織病理學(xué)檢查。和對(duì)照比較，只有一個(gè)所觀察的相關(guān)發(fā)現(xiàn)處理在20X劑量的組中其獲得的平均體重稍微下降。沒有證明存在毒性。實(shí)施例17此實(shí)施例闡述了本發(fā)明的組合物在治療伴侶動(dòng)物的各種惡性腫瘤方面的臨床用途。用此組合物以周劑量進(jìn)行肌肉內(nèi)施用的方式治療患有高級(jí)致瘤性疾病的十一貓和十只狗(其中每一種對(duì)常規(guī)的療法都物反應(yīng))。下表概括了此研究中的各臨床情況患有惡性瘤的動(dòng)物的概況注M/n指閹割的雄性；F/s指切除卵巢的雌性注射的數(shù)目從2至69，所用的體積多至7.5毫升，在單一的肌肉注射位點(diǎn)給藥。周注射方案使得能夠利用分別確定每一種情況的診斷實(shí)驗(yàn)檢查和認(rèn)真地監(jiān)控個(gè)體的情況。臨床醫(yī)師注意到?jīng)]有局部的刺激作用和嚴(yán)重的變應(yīng)性反應(yīng)，包括過敏反應(yīng)。臨床醫(yī)師和動(dòng)物的主人沒有觀察到任何全身的不良反應(yīng)。研究人員注意到一些臨床改進(jìn)，這些臨床改進(jìn)包括在幾只動(dòng)物中的較小的復(fù)位(reduction)、胃口和活性水平的改善、明顯的重量獲得、以及疼痛和/或者不安的減少。前表中記錄的臨床結(jié)果包括了某些描述由Virulizin治療的動(dòng)物的反應(yīng)的術(shù)語。下表定義了這些術(shù)語反應(yīng)定義完全反應(yīng)活性腫瘤的所有臨床癥狀都消失。在不少于4周的分離后，由兩個(gè)觀察確定的所有已知疾病都從患者身上消失。主要局部反應(yīng)所有可測(cè)量的腫瘤的垂直尺寸的結(jié)果總量有超過50％的減弱，另外沒有可見的新?lián)p傷。次要所有可測(cè)量的腫瘤的垂直直徑的結(jié)果總量有25-50％的收縮；或者主觀反應(yīng)(如表現(xiàn)狀態(tài)的改進(jìn)，良好的胃口和感情)；或者如超聲波，X-放射線所觀察到的腫瘤壞死或者裂解；或者稠度和腫瘤特性的變化；所有這些表明粘連的下降和腫瘤移動(dòng)性的增加。穩(wěn)定的疾病一種或多種沒有腫瘤裂解的可測(cè)量的損傷的大小有不到25％的增加或者減少；或者有新的損傷出現(xiàn)。進(jìn)行性的疾病一種或多種沒有腫瘤裂解的可測(cè)量的損傷的大小有25％的增加；或者有新的損傷出現(xiàn)。6只動(dòng)物(10只犬中的3只和11只貓中的3只)經(jīng)驗(yàn)了完全反應(yīng)。1只動(dòng)物(11只貓中的1個(gè))具有初始的主要局部反應(yīng)。11只動(dòng)物(10只犬中的5個(gè)和11貓中的6只)經(jīng)驗(yàn)了次要局部反應(yīng)。1只動(dòng)物(10犬中的1只)保持不變，1只動(dòng)物(11只貓中的1只)沒有作出反應(yīng)。動(dòng)物的臨床經(jīng)驗(yàn)清楚地證實(shí)了所說的組合物治療惡性瘤的效能的程度。實(shí)施例18此實(shí)施例闡述了在癌患者身上所進(jìn)行的開放II期臨床研究的結(jié)果。1988年，開放II期臨床研究由Thirlwell博士在蒙特利爾總醫(yī)院開始，并在1989年擴(kuò)展到Saskatoon癌中心，由Maksymiuk博士領(lǐng)導(dǎo)。試驗(yàn)仍然針對(duì)具有各種晚期固體腫瘤的患者，這些患者的這些疾病進(jìn)行或沒有進(jìn)行過前治療(不包括放射治療)。用7.5ml的VIRULIZINTM肌肉注射對(duì)患者進(jìn)行或繼續(xù)進(jìn)行治療3次，并進(jìn)行或繼續(xù)進(jìn)行安全性、東方合作腫瘤學(xué)組表現(xiàn)狀態(tài)(“ECOG”)、生命和生存的質(zhì)量跟蹤。到1994年3月31日，已經(jīng)治療了99個(gè)患者。不利的情況一般是溫和的，控制在中等程度。由于不利的情況，5個(gè)患者中止治療。雖然18個(gè)患者的疾病達(dá)到穩(wěn)定，但沒有觀察到完全或局部反應(yīng)。關(guān)于臨床終點(diǎn)，在8周的VIRULIZINTM治療后，在生命質(zhì)量、疼痛和ECOG表現(xiàn)狀態(tài)方面沒有變化或改進(jìn)，對(duì)于能夠得到數(shù)據(jù)的患者，它們分別是51％，78％和56％。用VIRULIZINTM治療晚期的胰癌的患者亞組，從VIRULIZINTM治療日起，顯示出29％的一年生存率，存活中值為160天。從診斷日起，和歷史對(duì)照比較(13.8％)此組顯示出38％的生存率。因此，開放II期臨床研究結(jié)果和體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致Virulizin可用于癌療法的有價(jià)值的擴(kuò)展上。實(shí)施例19此實(shí)施例闡述了胰癌臨床研究的方法和結(jié)果，具體地說是本發(fā)明的組合物用于能測(cè)量的，活組織檢查證明的胰癌患者的II期試驗(yàn)(方案C02-104)。治療由如實(shí)施例制備的組合物0.11ml/kg(最小劑量7.5ml)組成，以單一深肌肉注射的方式施用到臀大肌上，每次給藥在臀部上輪流。在開始的一周中，患者接受3次注射，之后每周2次，直到腫瘤進(jìn)行(progression)。完成反應(yīng)(CR)定義為在治療至少4周時(shí)，疾病的所有癥狀完全消失。局部反應(yīng)(PR)定義為在治療至少4周時(shí)，最大的可測(cè)量的損傷的兩個(gè)最大的直徑結(jié)果有至少50％的減弱，沒有新的損傷和任何損傷進(jìn)展。進(jìn)行性疾病定義為一種或多種可測(cè)量的損傷的大小有25％或更多的增加，或者有新的損傷的出現(xiàn)。不適合反應(yīng)準(zhǔn)則的疾病或進(jìn)行性疾病稱為穩(wěn)定性疾病。此項(xiàng)研究中共有22個(gè)患者，但5個(gè)患者被認(rèn)為沒有評(píng)價(jià)效能的價(jià)值。沒有完全或局部反應(yīng)。在一個(gè)月之內(nèi)3個(gè)患者的疾病發(fā)展了。6個(gè)患者的疾病穩(wěn)定3個(gè)多月(即3.5，3.5，5，8，12+，14個(gè)月)。整組的生存時(shí)間中值，從診斷之日算起是8個(gè)月，從治療之日算起是5個(gè)月。一個(gè)活組織檢查證明患有肝臟轉(zhuǎn)移，并且CEA水平為37ng/ml的患者(正常的不到3ng/ml)，患有絕對(duì)穩(wěn)定性的肝臟轉(zhuǎn)移和CEA水平8個(gè)月。一個(gè)患者患有穩(wěn)定的疾病5個(gè)月。一個(gè)患者在Whipple方法之后4個(gè)月，其胰床上疾病復(fù)發(fā)，并且使用所說的組合物后，穩(wěn)定至少一年，只是CEA緩慢地增加。對(duì)第3個(gè)患者插入了經(jīng)皮斯滕特氏印模，并且持續(xù)使用了總共至少14個(gè)月，沒有腫瘤進(jìn)展的跡象。評(píng)價(jià)了所有22個(gè)患者的毒性，這22個(gè)患者總共接受了500次注射。沒有一個(gè)患者出現(xiàn)和藥物有關(guān)的毒性的臨床或者實(shí)驗(yàn)的證據(jù)。對(duì)生命質(zhì)量沒有有害的影響，一般地生命質(zhì)量和疾病活性平行。在血清免疫球蛋白上沒有見到白血細(xì)胞總數(shù)或者絕對(duì)的淋巴細(xì)胞數(shù)目有明顯的變化。圖6和7分別顯示代表自診斷和治療開始的存活曲線。作為比較，圖6迭合了Gudjonsson(1987)的歷史存活曲線。另一個(gè)可以比較的歷史存活曲線的例子可以在Bakkevold，Petterson，Arnesjo和Espenhaug(1990)中找到。存活分析的結(jié)果總結(jié)如下</tables>用于診斷的平均存活時(shí)間是281天，如圖6所示。存活中值是182天(大約5個(gè)月)。作為比較，Gudjonsson(1987)報(bào)道了他的188個(gè)外科患者的平均生存時(shí)間是208天，存活中值是120天。從治療算起的評(píng)價(jià)存活時(shí)間是166天(參見圖7)。存活中值是133天(是大約4個(gè)月又1周)。存活時(shí)間也可以在一部分可評(píng)價(jià)的患者中估計(jì)，這些患者每一個(gè)接收至少13次注射。22個(gè)患者中有14個(gè)可評(píng)價(jià)。如前表所表明的，這些患者從診斷算起的存活中值是219天(大約7個(gè)月又1周)。從治療算起的存活中值是146天(大約5個(gè)月)?？稍u(píng)價(jià)的患者(n＝17)從VIRULIZINTM治療起始的一年生存率是18％，存活中值為5個(gè)月。從診斷開始的一年生存率為35％，存活中值為7.3個(gè)月。過去具有類似疾病的一群患者，從診斷開始的一年生存率為13.8％，存活中值為120天。生存的質(zhì)量、疼痛和ECOG表現(xiàn)狀態(tài)仍然不變或者經(jīng)過8周的VIRULIZINTM治療，對(duì)于其數(shù)據(jù)已報(bào)道的患者來說，此三項(xiàng)指標(biāo)分別在57％，71％和66％的患者上有提高。穩(wěn)定和下降的CEA水平支持穩(wěn)定疾病的臨床發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例20此實(shí)施例闡述了有關(guān)Virulizin治療惡性黑素瘤的臨床試驗(yàn)。將晚期惡性黑素瘤定義為所有III和IV階段的患者和所有在最初的治療后發(fā)生洛苛草區(qū)或遠(yuǎn)距離的復(fù)發(fā)的患者。標(biāo)準(zhǔn)治療(即所有的其它治療都經(jīng)此判斷)是DTIC(達(dá)卡巴嗪)，其報(bào)道的響應(yīng)率為15％。中值反應(yīng)是3-6個(gè)月，并伴隨嚴(yán)重的惡心和嘔吐，和通過肝靜脈的血栓形成而發(fā)生的急性肝臟壞死(潛在的致死副作用)。此治療不能顯示任何確定的生存優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施此項(xiàng)研究，以便確定本發(fā)明的組合物的安全性和效能，及確定其用于患有晚期惡性黑素瘤的患者時(shí)，對(duì)存活和生命質(zhì)量的影響。此項(xiàng)研究是一種非對(duì)比的，多中心試驗(yàn)。初始利用的劑量進(jìn)度表是每周肌肉內(nèi)注射3此本發(fā)明的組合物，每次7.5ml。在沒有觀察到器官和骨髓的毒性后，加樣進(jìn)度表增加至每日注射，共15天，然后又保持每周3次注射。接下來，加樣給藥增加至30天。治療持續(xù)的時(shí)間為36周，然后在患者可以選擇進(jìn)入繼續(xù)方案時(shí)，減少到16周。33個(gè)晚期黑素瘤患者包括在此研究的群體中(17女性和16個(gè)男性)，年齡范圍從17到85歲。在此研究群體中，64％的人原先已經(jīng)治療過，36％未經(jīng)過治療；33個(gè)患者中有25個(gè)可以評(píng)價(jià)。Karnofsky表現(xiàn)狀態(tài)(基線)是40-100％，中值是80％。研究結(jié)束時(shí)，有11個(gè)患者活著，其中5個(gè)在治療中。在16/33(48％)個(gè)患者中觀察到了次要局部反應(yīng)。一個(gè)患者肺減少了33％，6個(gè)患者疼痛減弱，8個(gè)患者在1個(gè)多月的時(shí)間里獲得了1000多克的體重(范圍為1000-2600克)。在19/33患者(58％)中觀察到了穩(wěn)定的狀態(tài)(從60至170天，中值為77天)。圖8，9和10顯示出和歷史對(duì)照比較，用本發(fā)明的組合物治療的患者的存活情況，以天計(jì)量為自轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)的診斷算起的存活率。連續(xù)線代表本發(fā)明組合物治療的患者的存活曲線，斷線代表歷史存活曲線(Balch等，皮黑素瘤，第2版，1992，14章和39，pp.65-187&amp;499-508，Lippincott公司，Philadelphia，Penn.)。圖8顯示了所有用本發(fā)明的組合物治療的患者的存活率，包括具有一至三個(gè)以上腫瘤位點(diǎn)的患者。圖9和10分別顯示了具有兩個(gè)腫瘤位點(diǎn)和具有三個(gè)或者更多腫瘤位點(diǎn)的患者的存活率。所有用本發(fā)明的組合物治療的患者在一年時(shí)具有39％的存活率(Kaplan-Meier評(píng)價(jià))。在歷史對(duì)照中，所有晚期惡性黑素瘤(AMM)患者的一年存活率為大約11％(和腫瘤位點(diǎn)的數(shù)量匹配)。此組的中值存活率為315天，而歷史對(duì)照為89天。具有兩個(gè)腫瘤位點(diǎn)的患者，在所有用本發(fā)明的組合物治療的患者中，一年的存活率為49％，而歷史對(duì)照為13％。此組的存活中值為360天，而歷史對(duì)照的中值為120天。對(duì)于三個(gè)或更多腫瘤位點(diǎn)的患者，在所有用本發(fā)明的組合物治療的患者中，一年的存活率為31％，而歷史對(duì)照為0％。具有三個(gè)或更多腫瘤位點(diǎn)的組的存活中值為205天，而歷史對(duì)照的中值為60天。通過體重的獲得、表現(xiàn)狀態(tài)(Karnofsky)、生命質(zhì)量系數(shù)(Spitzer)和疼痛尺度(線性模擬)評(píng)價(jià)生命質(zhì)量。下表顯示了在整個(gè)時(shí)間過程中的質(zhì)量獲得。</tables>Karnofsky和Spitzer尺度兩個(gè)都是主觀的，發(fā)現(xiàn)兩者在每一個(gè)體上都大約相同。報(bào)道15個(gè)患者在這些參數(shù)上沒有變化。4個(gè)患者顯示為波動(dòng)，即后來又回到以前的水平。1個(gè)患者發(fā)生減少(范圍為40-20％)。6個(gè)患者的疼痛評(píng)價(jià)結(jié)果顯示至4周時(shí)疼痛從5(最壞的可能)降至2(適中)或0(沒有疼痛)。1個(gè)患者疼痛從3降至0。1個(gè)肝轉(zhuǎn)移患者疼痛降至0比穩(wěn)定了11個(gè)月。9個(gè)列入此研究的疼痛為0患者在整個(gè)研究過程中一直保持此水平。5個(gè)患者疼痛上有中度(2個(gè)單位)的增加。3個(gè)患者在第二個(gè)或者第三個(gè)月期間患有瞬時(shí)的疼痛增加(1至2個(gè)單位)。將1734次注射施用給33個(gè)患者，21患者沒有不利的藥物反應(yīng)。在12個(gè)患者中報(bào)道了14個(gè)不利的藥物反應(yīng)。不利的藥物反應(yīng)通常發(fā)生在第4或者第8周，并且瞬時(shí)發(fā)生時(shí)是溫和的，最經(jīng)常的是低度發(fā)熱。歷史組和本發(fā)明的組合物治療的方案組之間的存活情況的差別表明本發(fā)明的組合物治療的患者的存活情況有所改善。癌癥似乎在19個(gè)患者中穩(wěn)定。所有治療AMM的患者都包括在存活數(shù)據(jù)中(許多臨床試驗(yàn)需要未治療的患者，因?yàn)橐郧盁o效的治療存在不好的預(yù)后)。在這個(gè)群中腫瘤的負(fù)擔(dān)較高(82％的患者具有1個(gè)以上的轉(zhuǎn)移性位點(diǎn))。存活狀況和生命質(zhì)量的數(shù)據(jù)表明大部分患者能從此治療中獲得一些益處。在研究結(jié)束時(shí)，11個(gè)患者仍然活著，這11個(gè)患者中5個(gè)繼續(xù)接受治療。對(duì)33個(gè)患者的初步分析表明，一年的存活率(從復(fù)發(fā)的診斷算起)為39％。根據(jù)此研究的結(jié)論可以得到45個(gè)患者的最后數(shù)據(jù)。這些患者中，41個(gè)具有遠(yuǎn)距離的轉(zhuǎn)移。從遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的診斷算起，這些患者的一年存活率為61％，存活中值為529天(17.6個(gè)月)。此結(jié)果可以和歷史數(shù)據(jù)的13％(中值92天)的生存率比較。從VIRULIZINTM治療開始，所有患者的一年存活率為22％，存活中值為200天(6.7個(gè)月)。生存的質(zhì)量、疼痛和ECOG表現(xiàn)狀態(tài)不變或者在VIRULIZINTM治療的最初的8周內(nèi)，對(duì)于能夠得到數(shù)據(jù)的患者來說，此三項(xiàng)指標(biāo)分別在63％，93％和70％的患者上有提高。在VIRULIZINTM使用前和使用后的腫瘤病理學(xué)證明了一種不尋常的細(xì)胞壞死、纖維變性、脈管血栓形成的模式，這種模式和TNF-α介導(dǎo)的作用一致。實(shí)施例21此實(shí)施例闡述了直接針對(duì)惡性黑素瘤的病理學(xué)方案。下文是有關(guān)一位在硬腭和牙床上患有進(jìn)行性惡性黑素瘤的73歲婦女的報(bào)道。在顯微鏡下見到兩個(gè)惡性黑素瘤的視像。從上到下觀察，可以見到上皮層及與之伴隨的角蛋白，在它們下面惡性細(xì)胞開始變得更明顯?？梢钥匆娺@些黑素瘤細(xì)胞是園形或橢圓形，這些細(xì)胞含有豐富的嗜曙紅細(xì)胞質(zhì)和多形染深色的核。這些細(xì)胞已經(jīng)代替了正常的粘膜下層的組織。見到的血管似乎是正常的，并且存在少量的任何炎癥/免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)由白細(xì)胞(多形核和單核細(xì)胞)的呈遞而代表。這是一個(gè)腫瘤組織興旺的例子，即腫瘤組織的結(jié)構(gòu)是完整的。觀察了同一個(gè)患者(其已經(jīng)由所說的組合物治療了2個(gè)月)的腫瘤組織樣品。從上到下，可以見到上皮的連續(xù)性被壞死過程破壞。很少能夠在外周見到這些壞死部分(通常在任何已經(jīng)達(dá)到了關(guān)鍵質(zhì)量的腫瘤的中心)，特別是在惡性腫瘤上，這種壞死是宿主的免疫應(yīng)答正在提高對(duì)腫瘤的攻擊的征兆。遍布整個(gè)照片的是大量的不同于原來的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。這些是免疫細(xì)胞，包括嗜中性、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，它們對(duì)典型的腫瘤結(jié)構(gòu)的破壞共同起作用(orchestrated)。其血管壁由大量的宿主細(xì)胞濃密地浸潤(rùn)。接下來這種細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致血管的破壞，這種破壞又反過來阻止腫瘤接受營(yíng)養(yǎng)和氧(局部缺血壞死)的供給。這種在患者組織幻燈片中看見的對(duì)腫瘤破壞有作用的免疫應(yīng)答和已知報(bào)道的由TNF(腫瘤壞死因子)引起的變化及前面實(shí)施例描述的工作的結(jié)果是一致的。顯示在用所說的組合物治療后的幻燈片上的免疫應(yīng)答將這種組合物的體外TNF免疫調(diào)節(jié)和已知的體內(nèi)抗腫瘤的TNF作用緊密地聯(lián)系起來。實(shí)施例22此實(shí)施例闡述VirulizinTM對(duì)癌癥患者的外周血單核細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能的影響。從癌癥患者獲得靜脈血液的外周血單核細(xì)胞，將其加工并按照實(shí)施例9的方法分析其針對(duì)Chang肝癌細(xì)胞的殺癌細(xì)胞活性。所得的結(jié)果顯示在下表中，其中利用了下列縮寫″ENTCA″是耳鼻喉癌；″KSHIV″是由人類免疫缺陷病毒傳染的卡波濟(jì)氏肉瘤；″OvarianCA″是卵巢癌；″LungCA″是肺癌；″EndoCA″是子宮的子宮內(nèi)膜癌；″CML″是慢性骨髓性的白血??；表中所用的術(shù)語包括“診斷”指患者所具有的癌癥類型。提供用于實(shí)驗(yàn)的單細(xì)胞的患者的總數(shù)目稱為“實(shí)驗(yàn)的數(shù)量”。其單核細(xì)胞顯示可被VIRULIZINTM刺激的能力的患者占全部實(shí)驗(yàn)的患者的比例稱為“被刺激的數(shù)量/總數(shù)(VirulizinTM)”。其單核細(xì)胞顯示出可被組合在一起的100個(gè)單位/毫升的內(nèi)毒素-γ(IFN-γ)和2ng/ml的大腸桿菌起源的脂多糖(LPS)刺激的能力的患者占全部實(shí)驗(yàn)的患者的比例稱為“被刺激的數(shù)量/總數(shù)(IFN/LPS)”。關(guān)于“被刺激的數(shù)量/總數(shù)(IFN/LPS或VirulizinTM)”，刺激作用定義為比通過用培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)獲得的殺癌細(xì)胞值增加50％以上。“批號(hào)/刺激作用”表明所用Virulizin的批號(hào)或者份號(hào)，之后是括號(hào)中的實(shí)驗(yàn)數(shù)目，此數(shù)目表明在所有用該批/份進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的總數(shù)中，有刺激作用的數(shù)目。VIRULIZIN對(duì)癌癥患者外周血單核細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能的影響</tables>這些結(jié)果表明VIRULIZINTM在癌癥患者單核細(xì)胞引起的殺癌細(xì)胞活性相等于或高于響應(yīng)組合形式的常規(guī)巨噬細(xì)胞激活物(IFN-α和LPS)而產(chǎn)生的活性。VIRULIZINTM也刺激患有卡波濟(jì)氏肉瘤的患者的巨噬細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能，甚至在該疾病的晚期。這樣，VIRULIZINTM的作用似乎是不依賴于和其它免疫細(xì)胞類型(包括輔助性T淋巴細(xì)胞)的合作。實(shí)施例23此實(shí)施例說明了VirulizinTM對(duì)癌癥患者的和腫瘤有關(guān)的巨噬細(xì)胞的作用。通過支氣管小泡的灌洗從11個(gè)患有非小細(xì)胞肺癌的患者獲得肺泡巨噬細(xì)胞，并通過實(shí)施例9中所描述的方法測(cè)定針對(duì)Chang肝癌細(xì)胞的殺癌細(xì)胞活性。從7個(gè)患有婦科癌(2個(gè)子宮內(nèi)膜癌，3個(gè)卵巢癌，2個(gè)子宮頸癌)的患者獲得腹膜巨噬細(xì)胞，并以上面提到的方法測(cè)定針對(duì)Chang肝癌細(xì)胞的殺癌細(xì)胞活性。結(jié)果在下表中顯示，所用的縮寫和術(shù)語定義為如實(shí)施例22所描述的。VirulizinTM對(duì)癌癥患者的與腫瘤有關(guān)的巨噬細(xì)胞的作用</tables>這些結(jié)果表明VIRULIZINTM既能刺激患者的外周血單核細(xì)胞，也能刺激患者的和腫瘤有關(guān)的巨噬細(xì)胞以表達(dá)殺死腫瘤的活性。此結(jié)果在患有婦科惡性疾病的婦女的腹膜巨噬細(xì)胞中和患有肺癌的患者的肺泡巨噬細(xì)胞中觀察到。從這些結(jié)果可以看出，VIRULIZINTM也能刺激對(duì)常規(guī)激活物(如γ-干擾素+內(nèi)毒素)的刺激作用不反應(yīng)的癌癥患者的巨噬細(xì)胞。實(shí)施例24此實(shí)施例說明了在癌癥患者的單核細(xì)胞中，VirulizinTM對(duì)針對(duì)自體腫瘤細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能的發(fā)育的作用。利用實(shí)施例9中所描述的方法，獲得外周血單核細(xì)胞，并測(cè)定其針對(duì)自體腫瘤細(xì)胞的殺癌細(xì)胞活性。這樣，例如，測(cè)定了耳/鼻/喉癌患者的單核細(xì)胞的針對(duì)此患者自己的腫瘤細(xì)胞的殺癌細(xì)胞活性。利用卵巢和子宮內(nèi)膜癌和慢性骨髓性的白血病細(xì)胞也完成了類似的檢驗(yàn)。結(jié)果顯示在下表中，所用的縮寫和術(shù)語如在實(shí)施例22中所描述的。所用的培養(yǎng)基是RoswellParkMemorial研究所[RPMI]的1640培養(yǎng)基，補(bǔ)充了10％的熱滅活的胎牛血清，50單位/毫升的青霉素和50μg/ml的鏈霉素。在癌癥患者的單核細(xì)胞中，Virulizin對(duì)針對(duì)自體腫瘤細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能的發(fā)育的影響</tables>這些結(jié)果表明VIRULIZINTM在癌患者的巨噬細(xì)胞中能刺激針對(duì)由癌患者的活組織檢查制備的自體腫瘤細(xì)胞的殺癌細(xì)胞活性。從這些結(jié)果可以看出，VIRULIZINTM也能刺激對(duì)常規(guī)激活物(如γ-干擾素+內(nèi)毒素)的刺激作用不反應(yīng)的癌癥患者的巨噬細(xì)胞。實(shí)施例24此實(shí)施例描述了在Virulizin刺激的單核細(xì)胞中，細(xì)胞因子特異性抗體對(duì)殺癌細(xì)胞功能發(fā)育的影響。按照實(shí)施例9的方法，獲得肺癌患者和慢性骨髓性白血病(CML)患者的外周血單核細(xì)胞并分析其針對(duì)Chang肝癌細(xì)胞的殺癌細(xì)胞活性。單獨(dú)使用VIRULIZINTM以及使用VIRULIZINTM加抗IL1α，或者抗IL1β，或者抗TNFα或同種型抗體測(cè)定單核細(xì)胞的刺激作用。所用的抗體的數(shù)量為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法通過滴定實(shí)驗(yàn)所確定的測(cè)定條件下的飽和量。結(jié)果顯示在下表中，所用的縮寫和術(shù)語如在實(shí)施例22中所描述的。此外，″抗IL1α″是白細(xì)胞介素1α的抗體；″抗Il1β″是白細(xì)胞介素1β的抗體；″抗TNFα″是腫瘤壞死因子α的抗體；和″同種型對(duì)照″是和上面的細(xì)胞因子無關(guān)的表位抗原的抗體。在Virulizin刺激的單核細(xì)胞中，細(xì)胞因子特異性抗體對(duì)殺癌細(xì)胞功能發(fā)育的影響</tables>這些結(jié)果表明腫瘤壞死因子α的抗體抑制由VIRULIZINTM引起的殺癌細(xì)胞功能。白細(xì)胞介素1α或者白細(xì)胞介素1β的抗體不能降低VIRULIZINTM刺激的單核細(xì)胞的殺癌細(xì)胞功能。這些結(jié)果和這樣的結(jié)論一致，即巨噬細(xì)胞響應(yīng)VIRULIZINTM而發(fā)育的殺癌細(xì)胞功能和單核細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(TNFα)有關(guān)。實(shí)施例25此實(shí)施例說明了在Virulizin刺激的外周血單核細(xì)胞中，細(xì)胞毒素療法對(duì)殺癌細(xì)胞功能發(fā)育的影響。在最初的緩解誘導(dǎo)化療末期，利用實(shí)施例9的方法獲得癌患者的外周血單核細(xì)胞，并分析其針對(duì)Chang肝癌細(xì)胞的殺癌細(xì)胞活性。結(jié)果顯示在下表中，所用的縮寫和術(shù)語如在實(shí)施例22中所描述的。此外，″pt″是順鉑；″5-FU″是5氟尿嘧啶；″RT″是放射療法；″AraC″是胞嘧啶阿糖胞苷。術(shù)語″診斷″是患者患有的癌癥類型。當(dāng)術(shù)語″復(fù)發(fā)″在表中出現(xiàn)時(shí)，所說的癌癥再次發(fā)生，此外，所說的癌癥是新診斷的。術(shù)語″療法″是患者所經(jīng)歷的癌癥化療/放射療法的制度。在Virulizin刺激的外周血單核細(xì)胞中，細(xì)胞毒素療法對(duì)殺癌細(xì)胞功能發(fā)育的影響結(jié)果表明在從經(jīng)歷了細(xì)胞毒性療法的患者獲得的巨噬細(xì)胞中VIRULIZINTM刺激殺癌細(xì)胞功能。因此，可以相信VIRULIZINTM可以和其它的療法良好的地相互作用。事實(shí)表明VIRULIZINTM刺激殺癌細(xì)胞功能較常規(guī)的激活物(如γ-干擾素家內(nèi)毒素)更有效。實(shí)施例26此實(shí)施例說明了Virulizin對(duì)子宮內(nèi)膜異位患者的巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響。以實(shí)施例9的方法獲得子宮內(nèi)膜異位患者的外周血單核細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞，并測(cè)定其針對(duì)Chang肝細(xì)胞的殺癌細(xì)胞活性和針對(duì)由子宮的活組織檢查所制備的自體固有的子宮內(nèi)膜細(xì)胞細(xì)胞毒性。結(jié)果列于下表，其中所說的縮寫和術(shù)語如在25實(shí)施例所用的。此外，″階段″指基于RAFS(修訂美國(guó)人生育力學(xué)會(huì))分類系統(tǒng)的分出的子宮內(nèi)膜的階段。Virulizin對(duì)子宮內(nèi)膜異位患者的巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響這些結(jié)果表明VIRULIZINTM刺激子宮內(nèi)膜異位患者的外周血單核細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞以殺死由子宮的活組織檢查制備的子宮內(nèi)膜細(xì)胞。本發(fā)明的組合物可以為子宮內(nèi)膜異位提供治療。實(shí)施例27此實(shí)施例說明了VirulizinTM各批初步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。通過實(shí)施例9描述的方法獲得靜脈血液的外周血單核細(xì)胞，將其加工，并分析其針對(duì)Chang肝癌細(xì)胞瘤的殺癌細(xì)胞活性。結(jié)果列于下表，其中所說的縮寫和術(shù)語如在實(shí)施例26所描述的。此外，″供者″是從中獲得外周血單核細(xì)胞的疾病狀態(tài)的患者?！逭５摹逯富颊邲]有疾病。″ENTCA″指患者患有頭和頸(耳/鼻喉)癌。VirulizinTM批247，248，249的初步實(shí)驗(yàn)</tables>這些結(jié)果表明VlRIJLIZINTM在正常的和癌癥患者的單核細(xì)胞中引起的殺癌細(xì)胞活性相等于或高于響應(yīng)組合形式的常規(guī)巨噬細(xì)胞激活物(IFN-α和LPS)而產(chǎn)生的活性。實(shí)施例28此實(shí)施例具體描述了活性組分的分離。將300ml的所說的組合物的樣品在rotovap上蒸發(fā)干燥，其中的浴溫不超過40℃。為了保證蒸發(fā)期間溶液仍然是堿性，每半小時(shí)向組合物中加入5滴濃縮的氫氧化銨溶液直到蒸發(fā)完成。所得的殘留物的重量為11.6克。然后將20ml溶解在甲醇溶液中的10％氫氧化銨加入到2克上述的殘留物中。將不溶的物質(zhì)濾出，并將濾液通過101.93克的急聚(flash)硅凝膠的柱(大小為5cm×12.5cm)進(jìn)行層析。所用的溶劑系統(tǒng)是溶解在甲醇溶液中的10％的氫氧化銨。在10p.s.i的壓力下過柱，流速為11毫升/分鐘。在100ml的溶劑通過柱后，收集12份20ml的組分。這些組分的收集物和白色帶的出現(xiàn)有關(guān)，將白色帶很快地從柱中移出。將這些組分在硅凝膠平板上以甲醇的10％濃縮的氫氧化銨溶液進(jìn)行薄層色譜(TLC)，并以茚三酮噴霧顯色。將具有相似TLC圖譜的組分組合在一起，結(jié)果形成了下列的合并物(這些組合物在rotovap上干燥)組分通過柱獲得所產(chǎn)量組分的體積1-4100-18005-6180-2200.11757-8220-2600.19699-10260-3000.015111-12300-3400.0053組分5-6，7-8和9-10在Rr值為0.81處和茚三酮發(fā)生的陽性反應(yīng)。體外測(cè)驗(yàn)了組分5-6和9-10的TNF刺激作用(按照實(shí)施例9)。結(jié)果如下組分活性5-650pg/mg9-101814pg/mg這樣，組分9-10是顯著的活性TNF刺激物。通過電子沖擊質(zhì)譜(EIMS)和電噴霧質(zhì)譜分析組分5-6的樣品，以鑒定可能存在于此組分中的特定化合物。利用5％的醋酸水溶液作為溶質(zhì)，在Perkin-ElmerSciexAPI-III分光計(jì)上進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜。有時(shí)，加入甲醇以增加溶解。在VG分析型ZAB-SE分光儀上利用甘油作為基質(zhì)進(jìn)行使用直接的插入探針的EIMS，在Kratos分析型質(zhì)譜上進(jìn)行使用DCI探針的EIMS?？偨Y(jié)產(chǎn)生的光譜表明下列化合物很可能存在于組分5-6中磷酸膽鹼sphocholine，?；悄懰?，膽堿硬脂酸甘油二酸酯，硬脂酸，硬脂酸甘油二酸酯。棕櫚酸-硬脂酸甘油二酸酯和鞘氨醇-油酸綴合物。實(shí)施例29此實(shí)施例說明了分離活性組分?jǐn)U大的方法。按如下方式，大覿膜重復(fù)實(shí)施例28。將10毫升濃縮的氫氧化銨加入到900毫升所說的組合物中，所得的溶液在rotovap上蒸發(fā)干燥，其中的浴溫不超過40℃。為了保證蒸發(fā)期間溶液仍然是堿性，每半小時(shí)向組合物中加入5滴濃縮的氫氧化銨溶液直到蒸發(fā)完成，留下殘留物。然后將20ml10％氫氧化銨的甲醇溶液加入到全部的殘留物中。將溶液用聲波處理(sonicate)15分鐘，將不溶的物質(zhì)濾出。將濾液通過1695克的急聚(flash)硅凝膠的柱(大小為5cm×12.5cm)進(jìn)行層析。所用的溶劑系統(tǒng)是10％的氫氧化銨的甲醇溶液。在6p.s.i的壓力下過柱，流速為30毫升/分鐘。下表總結(jié)了過柱的結(jié)果。組分號(hào)每種組分的體積觀察結(jié)果1550清晰，淡黃色的2450澄清的，淡黃色的3400澄清的，淡黃色的4150澄清的，淡黃色的5100澄清的，淡黃色6-775澄清的，淡黃色的8-1350澄清的，淡黃色的1450黃褐色溶液開始洗脫15-3550黃褐色溶液36-4050澄清的，淡黃色的將這些組分在硅凝膠平板上以甲醇的10％濃縮的氫氧化銨溶液進(jìn)行薄層色譜，并以茚三酮噴霧顯色。將具有相似TLC圖譜的組分組合在一起，結(jié)果形成了下列的組合物(這些組合物在rotovap上干燥)組分號(hào)通過柱獲得的產(chǎn)量(克)備注組分體積31000-14000.0504白色粉沫固體4-51400-16500.0855白色粉沫固體6-81650-18500.1555白色粉沫固體9-121850-20500.3014白色粉沫固體13-142050-21500.3595白色粉沫固體15-162150-22500.6914淡褐色固體，發(fā)粘17-182250-23501.0284黃褐色固體，成塊的192350-24000.3432黃褐色固體，成塊的20-232400-26001.1531褐色固體，成塊的24-302600-29500.8517褐色固體，成塊的31-342950-31500.0813褐色油所有組分合并物從15-16到組分31-34在Rf值為0.87處和茚三酮發(fā)生的陽性反應(yīng)，此值和實(shí)施例28的活性組分的Rf值十分相似。組分31-34在Rf值為0.85處和茚三酮有加性的陽性反應(yīng)。體外測(cè)定組分4-5，15-16和17-18的TNF活性(按照實(shí)施例9的方法)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有TNF刺激活性。上述組分的元件分析表明其中含有較高的NH4Cl，已知NH4Cl抑制TNF的產(chǎn)生。將組分15-16和17-18的樣品進(jìn)行透析，然后利用實(shí)施例28描述的方法進(jìn)行質(zhì)譜分析。也分析組分17-18和24-30的樣品?？偨Y(jié)得到的光譜表明可能存在下列化合物甘氨膽酸，己三糖胺三聚物，?；悄懰?組分15-16)；硬脂酸和己糖胺二聚物；和甘氨膽酸(組分24-30)。實(shí)施例30此實(shí)施例具體說明應(yīng)用另外的方法分級(jí)分離和分析本發(fā)明組合物的活性組分。已經(jīng)鑒定TNF，IL-1βHGM-CSF的釋放活性組分可以由80％的乙腈部分沉淀，并且大量的釋放活性組分可以從C18RP-HPLC的早期洗脫液中得到，所以已經(jīng)研究了沉淀組分的物理化學(xué)性質(zhì)，并和整個(gè)組合物及組合物的上清液比較。圖11顯示整個(gè)組合物和組合物的沉淀及上清液的SDS凝膠電泳。在所有這三種情況下，組合物都跑到了SDS的近前緣，表明它們是低分子量的物質(zhì)。所用的最小標(biāo)準(zhǔn)是14,400道爾頓。也通過確定組合物從分子篩HPLC柱中洗脫下來的時(shí)間，測(cè)定了其分子的大小。將整個(gè)組合物、沉淀和上清液的洗脫時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)物比較。三個(gè)都在胰島素(其在24.5分鐘時(shí)洗脫下來)后洗脫下來。再次的物理化學(xué)分析表明分子量小于2,400道爾頓。TNF-釋放組分洗脫較早。這樣，選擇了具有相反影響的柱(含有有機(jī)溶劑的親水柱)。多羥乙基的理想洗脫條件是80％的乙腈。但是，如前面的例子所表明，制劑中的一些物質(zhì)在此濃度下沉淀。因此，在較低的乙腈濃度下分析所說的組合物，此時(shí)，柱的功能主要是分子篩柱。圖12和13顯示整個(gè)上清液和沉淀的圖譜。前面的表總結(jié)了不同峰的洗脫時(shí)間。洗脫時(shí)間表明組合物的活性組分具有低分子量。利用離子交換HPLC分離組合物和其沉淀及上清液。通過AX300(陰離子交換)層析和CMX300(陽離子交換)層析，各組分沒有得到明顯的分離。疏水反相層析沒有分離到峰。在另外的系列實(shí)驗(yàn)中，將10毫升的VIRULIZLNTM裝入陰離子交換層析柱上(Bio-RadAG-1，氫氧化物形式，所有樹脂的濕體積是10毫升，用Millipore去離子水平衡)。計(jì)算樹脂的體積，使之足以結(jié)合存在于抽提物中的陰離子。收集未結(jié)合的組分，并重新上柱，以使之最大限度地結(jié)合在樹脂上。收集第二次過柱未結(jié)合的組分并貯存起來。通過用去離子水洗滌(2×20ml)除去留在柱中無效體積上的未結(jié)合物質(zhì)。利用分步的梯度重碳酸銨洗脫結(jié)合的分子，20ml/步驟。通過低壓凍干法除去自由的重碳酸銨。以單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞激活測(cè)定方法檢驗(yàn)所有組分樣品的TNF釋放活性。在未結(jié)合的組分(流出物)中，沒有發(fā)現(xiàn)TNF活性，但在0.2M重碳酸銨洗脫下來的洗脫液中發(fā)現(xiàn)大量的活性。這些結(jié)果表明活性組分本質(zhì)上是極性的，陰離子，酸性的。按照實(shí)施例2的方法，分析所有組分樣品的TNF刺激活性。結(jié)果如下TNFα釋放誘導(dǎo)活性-LPS樣品(pg/ml)0M-4960.1M-1560.2M16380.3M-360.4M2560.5M-270.6M-1751.0M-2461.5M-346VIRULIZINTM對(duì)照1961活性測(cè)定的結(jié)果表明在0.2M和0.4M的組分中發(fā)現(xiàn)TNF產(chǎn)生的刺激作用。安如下過程將組合物透析，并干燥透析液將100ml的組合物放置在Spectra/PorCE管中，此管的分子量截?cái)酁?00。管的末端用小夾密封，并放置在10ml蒸餾水的振蕩浴液中。每天通過從透析管中取出1ml溶液，并向其中加入3-4滴1/10N的硝酸銀溶液來檢測(cè)透析液。氯化物的存在表明透析不完全。如果透析不完全，將浴液用新鮮的蒸餾水代替。3-4天之后透析完全。完全透析后，將透析物質(zhì)在rotoVap上干燥，以便每毫升原體積溶液平均生產(chǎn)0.3毫克的固體。然后將固體物質(zhì)的樣品溶解在HPLC分級(jí)水中，并在硅凝膠平板上以甲醇的10％濃縮的氫氧化銨溶液進(jìn)行薄層色譜，并以茚三酮噴霧顯色。在Rf值為0.83處具有和茚三酮的陽性反應(yīng)。也通過質(zhì)譜法利用實(shí)施例28描述的方法分析固體物質(zhì)的樣品?？偨Y(jié)所得到的光譜表明可能存在下列組分鞘氨醇-油酸綴合物、二乙酰唾液酸、巖藻糖-己糖胺二聚物、脫氧甘氨膽酸、牛磺膽酸、唾液酸-巖藻糖二聚物、二(巖藻糖)-己糖胺二聚物。實(shí)施例31此實(shí)施例具體說明了利用反相-HPLC分析本發(fā)明的組合物。將樣品凍干并在0.1％的三氟乙酸(TFA)水溶液(緩沖液A)中重建，接下來在下列柱中和條件下過柱柱WP60009-C18柱(W-PoreC18，250×4.6mm，Phenomenex，California)和prime-sphereHC-C18柱(250×4.6mm，Phenomenex，California)串聯(lián)。洗脫液緩沖液A溶解在水中的0.1％TFA緩沖液B溶解在乙腈中的0.1％TFA梯度過程將150樣品上柱過緩沖液A20分鐘開始線性梯度，0-80％的緩沖液B，過35分鐘過80-0％的緩沖液B5分鐘流速0.9毫升/分鐘溫度環(huán)境溫度檢測(cè)290至284nm的吸收率，大部分在210-235處檢測(cè)在下表所列的從注射算起的大約時(shí)間內(nèi)，收集了15種組分。此外，如實(shí)施例2所描述的，對(duì)每一種組分進(jìn)行了TNF釋放分析，結(jié)果如下</tables>因此，VIRULIZINTM的大部分活性成分在組分1中洗脫下來。在組分4-5，8-9，11-12和14也發(fā)現(xiàn)了活性。按照實(shí)施例28的方法經(jīng)質(zhì)譜分析了所有RP-HPLC的樣品?？偨Y(jié)所得到的各組分光譜表明很可能存在下列化合物?；悄懰帷⑼僖核?甘油二聚物、NaCl、三甲胺、甲乙胺。實(shí)施例32此實(shí)施例描述了在本發(fā)明組合物中已經(jīng)鑒定的化合物。按照實(shí)施例1的制備本發(fā)明的組合物，并將其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)方法的分級(jí)分離，此方法包括(1)在100MWCO透析膜中透析；(2)標(biāo)準(zhǔn)的有機(jī)抽提(包括Folch抽提)，(Tamari等，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，40(10)，2057-2062(1976))；(3)硅石柱層析；(4)離子交換色譜；和(5)利用在“薄層和紙層析的干燥劑”(E.Merck，Darmstadt，Germany，1971)中公開的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行制備性的硅石TLC分級(jí)分離，利用丁醇∶乙酸水(6∶2∶2)作為洗脫液，茚三酮作為顯色劑?；衔锏蔫b定以下列儀器和技術(shù)為基礎(chǔ)，這些儀器和技術(shù)單獨(dú)使用或結(jié)合使用利用70-2505分光計(jì)獲得EI-MS，CI-MS(OH-)和FAB-MS(在甘油或硫代甘油作為基質(zhì))。使用VG分析型ZAB-SE儀器獲得EI-MS，F(xiàn)AB-MS(在甘油或硫代甘油作為基質(zhì))和GC-MS(OH-)。結(jié)合此儀器所使用的氣相色譜是HewlettPackard型5890。利用Kratos光譜分光計(jì)獲得EI-MS，LSIM-MS(在甘油和NPOE基質(zhì)中)和GC-MS質(zhì)譜中。和此儀器結(jié)合使用的GC也是HewlettPackard型5890。在perkin-ElmerSciexAPI-III分光計(jì)上進(jìn)行了MS-MS，利用水或水醇(甲醇或異丙醇)混合物作為溶質(zhì)的電噴霧，EI-MS，及在甘油和硫代甘油中的FAB-MS。按要求，通過利用乙酐/吡啶的乙酰和利用重氮甲烷的甲基化制備各組分的衍生物，以用于MS分析。通過項(xiàng)電噴霧溶質(zhì)中加入醋酸鈉而完成分子向sodiated類型的轉(zhuǎn)換。利用乙酸或三氟乙酸完成電噴霧MS所分子的質(zhì)子化。在硅石TLC板上進(jìn)行抽提物和標(biāo)準(zhǔn)物的TLC，利用丁醇∶乙酸∶水(6∶2∶2)或前述的洗脫液作為流動(dòng)相和幾種試劑噴霧顯色。結(jié)合前述前述的儀器使用標(biāo)準(zhǔn)方法，這些儀器還在下列參考文獻(xiàn)中引用Rigler等，色譜學(xué)雜志，277，321-327(1983)；Sundaram，等，ClinicaChimicaActa，34425-429(1971)；Bandurski等，生物化學(xué)雜志，193405-410(1951)；andLarsen等，色譜學(xué)雜志，226484-487(1981)。VIRULIZINTM的化學(xué)成分的典型的硅石板TLC圖譜(利用丁醇∶乙酸∶水(6∶2∶2)作為洗脫液)列于下表顯色劑TLC圖譜*硫酸Rf＝0-0.25，白色斑點(diǎn)高鈰硫酸銨Rf＝0.05-0.42，黃色斑點(diǎn)鉬酸鹽Rf＝0-0.3，淡藍(lán)綠至帶有藍(lán)綠邊緣的白色斑點(diǎn)茴香醛Rf＝0.03-0.25，白色斑點(diǎn)8-苯胺1-naptalene磺Rf＝0-0.25，黃色斑點(diǎn)(肉眼所見)酸茚三酮Rf＝0-0.13，淡粉色斑點(diǎn)Rf＝0.12-0.3，紫色矛頭形斑點(diǎn)Rf＝0.15-0.3，紅色(burgundy)斑點(diǎn)Rf＝0.3-0.45，淡黃色斑點(diǎn)Rf＝0.35-0.5，深黃色斑點(diǎn)Rf＝0.4-0.5，紅色斑點(diǎn)Rf＝0.5-0.6，紅色斑點(diǎn)*Rf值依據(jù)硅膠包覆的板的活性程度和洗脫液溶解的精確的組合物而發(fā)生輕微的變化。利用前述的儀器和方法分析本發(fā)明的組合物，揭示出其中含有下列化合物1)膽汁酸膽酸；甘氨膽酸；脫氧甘氨膽酸；膽甾醇硫酸鹽；脫氧膽酸；鵝膽酸；和?；悄懰帷Ｗ⑹欠?OH和-H2在MS上發(fā)生，或者是否開始時(shí)也存在脫氧、雙脫氧和不飽和的類似物，這些從MS上無法辨別。這些化合物可能都以銨鹽、烷基銨和無機(jī)陽離子的形式存在。2)磷脂，鞘脂類，和相關(guān)的(水解)產(chǎn)物硬脂酸CH3(CH2)16COOH棕櫚酸CH3(CH2)14COOH油酸Z-9硬脂酸CH3(CH2)2CH2CH＝CHCH2(CH2)6COOH氧化的或氫氧化的/不飽和的短鏈脂肪酸C6H8O3(如CH3CH＝CHCOCH2COOH或帶有2個(gè)雙鍵的C6酸和氫氧化物)乙酸；硬脂酸甘油二酸酯；棕櫚酸甘油二酸酯；硬脂酸，棕櫚酸甘油二酸酯；硬脂酸-單酸甘油酯-磷酸膽鹼(溶血卵磷脂)；硬脂酸單酸甘油酯；硬脂酸甘油三酸酯；磷酸膽鹼；磷酸絲氨酸；磷酸鞘氨醇；鞘髓磷脂；卵磷脂；硬脂酸-鞘氨醇；鞘氨醇；磷酸甘油；甘油；甘油磷酸膽鹼；硬脂酸，油酸甘油二酸酯；硬脂酸，油酸磷酸甘油；硬脂酸酰胺；硬脂酸甲酰胺；和棕櫚酸酰胺此外，獲得的初步的HPLC和滴定證據(jù)表明也存在短鏈脂肪酸(范圍為C1-C30的酸)。3)粘蛋白水解產(chǎn)物唾液酸和它們的二乙酰單體；乙酰神經(jīng)氨酸；己糖胺，如葡糖胺；巖藻糖；己糖胺-己糖醛酸(二體)重硫酸鹽；葡萄糖醛酸；單乙酰代葡萄糖醛酸或者艾杜糖醛酸重硫酸鹽；唾液酸-甘油(二體)；和二聚體，三體，低聚物和乙酰化和硫酸鹽形式的上述單體的聚合物4)脂溶性維生素維生素A2；維生素D1；發(fā)甾醇(存在與其維生素D1的復(fù)合物中)；維生素E；維生素K1氧化物；和維生素K5。5)各種有機(jī)物尿素；烷基胺，包括甲基胺，二甲胺，乙胺，甲乙胺，二乙胺，二丙胺，丁乙胺；氨基酸，包括?；撬?，谷氨酸，甘氨酸，丙氨酸，N-亮氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸乙醇胺，天冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，肌氨酸，α-氨基脂肪酸，瓜氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，羥基賴氨酸，鳥氨酸，和賴氨酸；丁基化羥基甲苯(BHT)；和聚乙烯二醇。實(shí)施例33此實(shí)施例描述了本發(fā)明的糖類成分。在水解之前和之后，測(cè)定了樣品中的單糖組分。所用的所用分析單糖的試劑都是分析等級(jí)的。在去離子水稀釋后，使用THF(三氟乙酸)水解樣品。購買自FisherScientific的50％的(W/W)NaOH溶液(碳酸鹽含量低)。購買自Fluka-Gerantie，紐約的醋酸鈉。利用4M的三氟乙酸在100℃下處理樣品4小時(shí)以便釋放單糖。將樣品低壓凍干，并利用用于碳水化物的帶有CarbopackPal分離柱(250×4mmi.d.)的DionexBio-LC系統(tǒng)和裝有25μl樣品環(huán)的HPLC-AG6防護(hù)柱(50×4mmi.d.)經(jīng)高效液相色譜-陰離子交換方法分析樣品。利用PAD(即脈沖電流檢測(cè)器)完成洗脫的單糖的檢測(cè)。所用的條件如下水解前為了檢測(cè)肌醇，利用唾液酸和葡萄糖醛酸、等度洗脫洗脫液(100mMNaOH+150mMNaOAc混合物)。利用氦組件脫氣裝置除去洗脫液中的空氣。通過柱的流速為1毫升/分鐘。通過等度洗脫、洗脫液(15mMNaOH)和及后柱300mMNaOH，以1毫升/分鐘的流速完成單糖(包括巖藻糖、半乳糖胺、乳糖、葡萄糖和甘露糖)的檢測(cè)。檢測(cè)器設(shè)置為E1＝0.05V，E2＝0.60V，E3＝0.60t1＝120ms，t2＝120ms，t3＝300ms；黃金工作電極；銀-氯化銀參考電極；輸出范圍為充足規(guī)模的1-3KnAmp；表速0.5cm/分鐘。糖醛酸和單糖的測(cè)量是通過此檢測(cè)器進(jìn)行的。通過標(biāo)準(zhǔn)混合物的進(jìn)行性稀釋獲得在0.5-2.5μg/ml范圍內(nèi)變化的濃度的線性響應(yīng)。水解后在梯度洗脫(洗脫液A(50mMNaOH)和洗脫液B(50mMNaOH/150mMNaOAc混合物))的樣品水解后，檢測(cè)單糖。利用氦組件脫氣裝置除去洗脫液中的空氣。利用Spectra-Physics(SP-4270)整合器分析結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)梯度是100％洗脫液A的注射，之后是80％A20％B的線性進(jìn)行性洗脫液，20分鐘，然后再回到100％A，5分鐘，之后是平衡至少10分鐘，再注射下一個(gè)樣品。如所描述的單糖分析結(jié)果列于下表</tables>如表中所示，只有綠色膽汁(批MU100CB)的乙酸乙酯抽提物在水解前，顯示出包含任何單糖，它們是唾液酸和葡萄糖醛酸，以每毫升微克級(jí)的水平存在。水解后，沒有檢測(cè)到唾液酸，而葡萄糖醛酸以原來大約20％的濃度存在。水解后，本發(fā)明組合物的其它制劑顯示出含有唾液酸、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖和肌醇。從上文的描述應(yīng)該理解，盡管本文已經(jīng)描述了本發(fā)明的特定的具體實(shí)施方案以便具體說明本發(fā)明，但在不脫離本發(fā)明宗旨和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種改良。因此，除了如附加的權(quán)利要求所限定的外，本發(fā)明不受限制。權(quán)利要求1.用于治療癌癥的組合物的用途，所說的癌癥選自由胰腺癌、惡性黑素瘤、卵巢癌、ENT癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、和卡波濟(jì)氏肉瘤組成的組，其中所說的組合物包含分子量小于3000道爾頓并且具有下列特性的小分子量組分(a)可由動(dòng)物膽汁中提??；(b)能體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；(c)能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；(d)含有不可測(cè)水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GM-CSF和IFN-γ；(e)對(duì)人類外周血單核細(xì)胞不表現(xiàn)出細(xì)胞毒性；和(f)不是一種內(nèi)毒素。2.用于治療子宮內(nèi)膜異位的組合物的用途，其中所說的組合物包含分子量小于3000道爾頓并且具有下列特性的小分子量組分(a)可由動(dòng)物膽汁中提?。?b)能體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；(c)能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；(d)含有不可測(cè)水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GM-CSF和IFN-γ；(e)對(duì)人類外周血單核細(xì)胞不表現(xiàn)出細(xì)胞毒性；和(f)不是一種內(nèi)毒素。3.用于制造治療癌癥之藥物的組合物的用途，所說的癌癥選自由胰腺癌、惡性黑素瘤、卵巢癌、ENT癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、和Kaposi肉瘤組成的組，其中所說的組合物包含分子量小于3000道爾頓并且具有下列特性的小分子量組分(a)可由動(dòng)物膽汁中提取；(b)能體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；(c)能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；(d)含有不可測(cè)水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GM-CSF和IFN-γ；(e)對(duì)人類外周血單核細(xì)胞不表現(xiàn)出細(xì)胞毒性；和(f)不是一種內(nèi)毒素。4.用于制造治療子宮內(nèi)膜異位之藥物的組合物的用途，其中所說的組合物包含分子量小于3000道爾頓并且具有下列特性的小分子量組分(a)可由動(dòng)物膽汁中提取；(b)能體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；(c)能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生；(d)含有不可測(cè)水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GM-CSF和IFN-γ；(e)對(duì)人類外周血單核細(xì)胞不表現(xiàn)出細(xì)胞毒性；和(f)不是一種內(nèi)毒素。5.權(quán)利要求1的用途，其中所說的組合物是通過肌肉內(nèi)注射的。6.權(quán)利要求2的用途，其中所說的組合物是通過肌肉內(nèi)注射的。全文摘要本發(fā)明涉及作為免疫調(diào)節(jié)劑的組合物,該組合物包含分子量小于3000道爾頓并且具有下列特性的小分子量組分:(a)可由動(dòng)物膽汁中提取;(b)能體外或體內(nèi)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞;(c)能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生;(d)含有不可測(cè)的IL－1α、IL－1β、TNF、IL－6、IL－8、IL－4、GM－CSF和IFN－γ;(e)在惡性小鼠雜交瘤細(xì)胞系中具有抗增值作用;(f)對(duì)人類外周血單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞不表現(xiàn)出細(xì)胞毒性;(g)不是一種內(nèi)毒素。本發(fā)明也涉及制備所說的組合物的方法,其作為免疫調(diào)節(jié)劑的用途和其在治療具有免疫學(xué)問題(如癌癥或子宮內(nèi)膜異位)的疾病和病癥方面的用途。文檔編號(hào)A61P15/00GK1182368SQ96193454公開日1998年5月20日申請(qǐng)日期1996年3月13日優(yōu)先權(quán)日1995年3月16日發(fā)明者R·蘭杰,P·B·帕切森申請(qǐng)人:伊姆特克藥物公司