專利名稱：一次注射疫苗的配制品的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微粒，其顆粒大小為0.5至300μm，相繼用水溶性物質和生物降解性聚合物包裹抗原或抗原混合物即可制備之；本發(fā)明還涉及疫苗的配制品，它是通過將微粒分散到注射介質中制備的，由于它可在一段時間內(nèi)，如幾個月內(nèi)延緩釋放抗原，因此僅僅施予一次注射即可完成抗傳染病的免疫接種作用(“一次注射疫苗的配制品”)。
迄今為止開發(fā)了大量能有效防治多種傳染病的疫苗，然而大多數(shù)目前使用的疫苗都需要多次接種，這種需要給疫苗使用者帶來了經(jīng)濟上的負擔和不方便(M.T.Agoado and P.H.Lambert，Immunobiol.，184，113(1992)；Aryward，B.，et al.，Vaccine.12.1155(1994)).尤其是已發(fā)現(xiàn)那些接受第一次接種的人當中僅有約30％返回接受第二次接種。因此當規(guī)定要接種三次時，經(jīng)統(tǒng)計100個人當中僅有9人完成了免疫接種過程，這可清楚地闡明對通過一次注射接種即可完成免疫接種的疫苗的需要。
一次注射疫苗開發(fā)的現(xiàn)有技術方法基本上集中于使用微粒的思路，其中所需抗原被可生物降解的聚合物質包裹，此微粒在規(guī)定的時間期間內(nèi)緩慢釋放抗原以完成接種(R.Langer and J.Folkman，Nature.263.797(1976))。
在多種可生物降解的聚合物中，通常已知聚交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、和聚(交酯一共-乙交酯)(PLGA)是安全的，因為它們在活體內(nèi)經(jīng)水解可成為無毒的乳酸和乙醇酸。已將那些聚合物用于制備縫線，手術后無需將之除去；也可用于配制經(jīng)包裹的Leuprolide乙酸鹽，其是一種促黃體素釋放激素(LHRH)類似物，經(jīng)食品與藥品管理署(FDA)的允許可將它們供人使用(R.Langer and M.Mose. Science.249.1527(1990)；D.K.Gilding and A.M.Reed.Polymer，20.1459(1979)；and William Morris.et al.，Vaccine.12.5(1994)).這些聚合物降解速率隨乙交酯/交酯的比率及其分子量的不同而不同，因此通過調節(jié)聚合物的分子量和乙交酯/交酯的比率以及顆粒的大小、膠囊配制品的包裹厚度即可使藥物的釋放在幾個月內(nèi)得以維持(S.J.Holland，et al.，J.Control.Rel.，4.155(1986))。
1988年以來，世界衛(wèi)生組織(WHO)已發(fā)起大量研究以開發(fā)使用上述可生物降解的聚合物的破傷風類毒素的一次注射疫苗(M.T.Aguado，Vaccine，11，596(1993)；Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.2lst.Controlled ReleaseSociety，Inc.，Y.Men.etal.，Paper No.126(1994)；20th.B.Gander.et al.，Paper No.135(1993)；19th.A.M.Hazrati.et al.，Paper No.220(1992)；21st. M.Gilley.et al.，Paper No.218(1992)；21st.ManmohanSingh.et al.，Paper No.1476(1994)；21st.C.Yan.et al.，Paper No.127(1994)).
然而盡管作出這些努力，仍沒有將一次注射疫苗的配制品投入實際應用，這主要是由于以包裹的配制品所形成的抗體的量僅約為經(jīng)常規(guī)明礬配制所產(chǎn)生抗體量的1/10，而且結果不能再現(xiàn)(R.E.Spier.Vaccine.11.1450(1993)；M.T.Aguado and P.H.，Lambert.Immunobiol.，184.113(1992))。已觀察到這些問題的起因是首先，用于溶解可生物降解的聚合物的有機溶劑通過使抗原變性而使抗原的抗原性降低或喪失；第二，當與水接觸時，抗原形成了抗原性有所降低的凝聚體；第三，由于抗原和疏水的可生物降解的聚合物之間不必要的相互作用使得抗原性降低或喪失。
Alonso等人通過用PLA和PLGA包裹破傷風類毒素制備了一次注射疫苗，但由于在包裹過程中不可避免地將類毒素與有機溶劑相接觸，因此發(fā)現(xiàn)在疫苗顆粒中保持的破傷風類毒素的抗原性僅為原始抗原性的0.5至20％(Maria.J.Alonso.et al.，Vaccine.12.229(1994))。在使用大鼠的實驗中，這種疫苗的配制品顯示了比使用明礬作佐劑不加強免疫的對照要低很多的抗體形成能力，這表明這種疫苗配制品作為一次注射疫苗是不可行的。Schwendeman等人通過對破傷風類毒素進行化學修飾，即通過將抗原的巰基S-烷基化來努力解決上述問題，但結果并不令人滿意(S.P.Schwendeman.et al.，Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.，21st.Paper No.128.1994)。
Nellore等人報道了乙肝病毒一次注射疫苗的配制品，其包括微粒，此微粒是通過使用包括有機溶劑抽提或蒸發(fā)的方法用PGA包裹乙肝表面抗原(HBsAg)來制備的(R.V.Nellore.et al.，J.Parenteral Science & Technology.46.176(1992))。使用豚鼠的動物實驗表明含有大小為1至10μm的較小顆粒的配制品顯示出的抗體形成能力比使用明礬作佐劑不經(jīng)加強免疫的對照要低很多，而顆粒大小為20至60μm和1至60μm的其它配制品基本上沒有活性。在這些配制品中，包裹過程中使用的有機溶劑使HBsAg變性。
因此，為了通過用可生物降解的聚合物包裹抗原來制備有效的一次注射疫苗，人們必須使用在包裹步驟中不需要使用有機溶劑的可生物降解的聚合物，或者在包裹過程中必須防止抗原與有機溶劑接觸。然而，還沒有已知的不需要使用有機溶劑的可生物降解的聚合物。
典型地，已通過用可生物降解的聚合物包裹有機的、肽或蛋白質藥物制備微粒。特別地，通過將藥物溶解或分散于其中溶解了可生物降解的聚合物的有機溶劑中，并在表面活性劑的存在下將油相分散于水相中制備油-水(“O/W”)乳濁液即可制備油相。然后，使用如蒸發(fā)或抽提的常規(guī)方法除去有機溶劑，使生物可降解的聚合物固化即可得到微粒。在此過程結束時，藥物分散于聚合物基質中而存在，所得微粒以于溶解有表面活性劑的水相中的分散相而存在。然而，此常規(guī)方法的缺點是大多數(shù)可生物降解的聚合物易于被水水解；通常表面活性劑不適于注射，因此必須通過洗滌過程除去；洗滌過程之后此顆粒必須經(jīng)受干燥過程以防止聚合物降解。
在此O/W乳濁液方法中，藥物直接與有機溶劑接觸，因此此方法不能被用來制備含接觸有機溶劑后抗原性會降低的抗原的疫苗配制品。另外，此方法還有其它局限性，即不能用于水溶性藥物。隨后，開發(fā)的努力就轉移到發(fā)現(xiàn)一種使用W/O/W乳濁液以克服上述困難的方法上。
例如，歐洲專利申請No.87309286.0公開了口服疫苗的配制品，它包含10μm或更小的顆粒，此顆粒是通過用PLA、PGA、PLGA等包裹多種抗原而制備，已知它可穿過Peyer氏小膜片。
另外，歐洲專利申請No.88302940.7公開了一種注射配制品，其通過用如PLGA的可生物降解的聚合物包裹如LHRH類似物的肽或蛋白質藥物可使其在6個月的期間內(nèi)保持其功效。更特別地，可如此制備微粒將藥物溶解或分散于水相；將水相與溶解有可生物降解聚合物和表面活性劑的有機溶劑混合以得到W/O乳濁液；將W/O乳濁液分散到含有表面活性劑的水相中以得到W/O/W乳濁液；然后除去有機溶劑即可制備得到含有藥物的微粒。
根據(jù)此方法，藥物與有機溶劑的接觸相對于O/W乳濁液法而言有所降低。然而，不能防止內(nèi)部水相和外部水相之間某種程度的混合，它可導致疫苗抗原性的降低。此外，除去表面活性劑的洗滌過程之后，通常要使用如凍干法的常規(guī)方法除去內(nèi)部水相中的水。在此除去水的過程中，在生物聚合物層中會形成許多大孔，如果是包裹疫苗，這些孔在人體中會成為水通道，促進了抗原凝聚體的形成，與之相隨的是抗原性的損失。
為了克服上述缺點，國際專利申請公開No.WO93/07861中公開了制備多相顆粒的方法，它包括使用高度粘稠的食用油制備W/O/W乳濁液；用如PGA、PLA和PLGA的可生物降解的聚合物的乙腈溶液代替外部水相；將得到的乳濁液分散于礦物油；除去乙腈即可得到多相顆粒，其中W/O微乳被包裹在固體聚合物外殼內(nèi)。然而，此方法的缺點是它不可能從制備好的多相顆粒中除去如單硬脂酸鋁和Spam80的表面活性劑，該表面活性劑是用來增加食用油的粘性和分散穩(wěn)定性以防止藥物從內(nèi)部水相釋放到外部水相中；在溫度升至140℃以促進乳濁液分散的過程中藥物會損失其抗原性。
相分離法(J.C.Wu et al.，J.Microencapsulation.11(3).297-308(1994))。包括將聚合物溶解到第一溶劑中；在其中加入不會溶解聚合物但可與第一溶劑混合的第二溶劑；因此得到核心-外殼型微粒，此微粒是因為聚合物溶解性降低，藥物周圍的聚合物固化而形成的。然而此方法與O/W乳濁液法一樣不能防止抗原與第二有機溶劑接觸。
另一個與使用乳濁液的上述方法相關的問題是蛋白質藥物的活性可能會損失。正如在高能量的分散過程中一樣機械外力使蛋白質易于變性?？紤]到大多數(shù)抗原是蛋白質這就是一個嚴重的問題。
另一方面，噴霧干燥法(B.Gander et al.，J. Microencapsulation.12(1).83-97(1995))包括將藥物溶解或分散于溶有可生物降解的聚合物的有機溶劑中，噴霧干燥此混合物以得到微粒。然而此方法也不能避免藥物與有機溶劑的直接接觸。
國際專利申請公開No.WO 94/12158和美國專利No.5,019,400建議用冷凍-和-抽提法制備經(jīng)包裹的蛋白質藥物(生長激素)顆粒。在此方法中，藥物被分散于溶有可生物降解的聚合物的有機溶劑中(如二氯甲烷)，將溶液噴射進低溫液氣中可形成冷凍顆粒。這些顆粒被收集到冷凍乙醇的表面，當冷凍乙醇熔化時，冷凍顆粒也在融化，顆粒中的有機溶劑被乙醇抽提，因而形成了被固化聚合物包裝的微粒。此方法也使得抗原與有機溶劑直接接觸，藥物的釋放期間僅為幾天。因此，此方法不適于制備應在更長期間內(nèi)釋放抗原的一次注射疫苗。
國際專利申請公開No.WO 92/14449中公開了制備含有蛋白質藥物的顆粒的方法，它包括將粉末狀蛋白質藥物分散到熔化的脂肪酸酸酐中，冷卻混合物以使混合物固化，粉碎此混合物以得到顆粒。脂肪酸酸酐在45至75℃的溫度下熔化，這不象常規(guī)的有機溶劑會使蛋白質變性。然而在此過程中使用脂肪酸酸酐作為包裹材料難以得到顆粒大小適于注射的微粒。另外脂肪酸酸酐自身不能在長時間內(nèi)釋放藥物，因此不適于用來制備一次注射疫苗配方。
歐洲專利申請No.88113933.1教導了包裹顆粒的配制，它是為蛋白質藥物，除莠劑或肥料釋放的零級或二相模式設計的，它是按下述方法制備的用有吸收性的聚合物包裹藥物、除莠劑或肥料，用聚合物再次包裹所得顆粒，此聚合物不能溶于水中但可穿過藥物、除莠劑或肥料。然而在第二次包裹中所用的不溶于水的聚合物，即纖維素不是可生物降解的聚合物，它以不可控制的方式在僅一天的期間內(nèi)釋放藥物。另外，此顆粒以水快速滲透進人體，因此，如果藥物是抗原，通過形成凝聚體會損失其抗原性。而且，此方法不適于制備用于注射的微粒，因為第一次包裹的顆粒大小為125至10000μm，第二次包裹不得不厚到足以可防止因第一次包裹所用的吸水性聚合物的膨脹而引起的顆粒破裂。
如上所述，已有很多開發(fā)制備一次注射疫苗方法的嘗試，此方法可避免蛋白質藥物與有機溶劑，可生物降解的聚合物以及人體中水之間不必要的相互作用。除了這些努力之外仍未發(fā)現(xiàn)在包裹抗原的過程中能充分保護抗原之抗原性的方法；因此對開發(fā)一次注射疫苗配制品的需要持續(xù)存在(William Morris.et al.，Vaccine.12.5(1994))。
因此，本發(fā)明的目的是提供含有被聚合物包裹的完整抗原或抗原混合物的微粒。
本發(fā)明的另一目的是提供由微粒分散到注射介質中制備的一次注射疫苗配制品。
根據(jù)本發(fā)明，提供了平均顆粒大小為0.5至300μm的微粒，它是通過相繼用水溶性物質和可生物降解的聚合物包裹抗原或抗原混合物而制備的；將微粒分散到注射介質中可制備一次注射疫苗配制品，僅注射一次該配制品即可完成抗傳染病的免疫接種。
當結合

圖1理解，從本發(fā)明下列描述中可明顯看出本發(fā)明的上述和其它的目的和特征，圖1顯示了顆粒特性和抗體形成之間的關系，其中根據(jù)本發(fā)明制備的三個疫苗配制品與常規(guī)的明礬配制品進行了比較。
本文提及的所有參考文獻全都列入?yún)⒖嘉墨I中。
通過使用水溶性物質覆蓋抗原以得到粉末狀顆粒(“核心顆粒”)，再用疏水的可生物降解的聚合物覆蓋核心顆粒以得到最終的微粒即可制備本發(fā)明的微粒。微粒呈大小為0.5至300μm的球形或橢球形。僅通過一次注射即可完成接種的一次注射疫苗配制品可經(jīng)過將微粒分散到注射介質中制備。
可用于本發(fā)明的合適抗原是減毒、滅活或重組抗原，它可被用作一種疾病的疫苗(“單一抗原”)或同時用作兩種或多種疾病的疫苗(“混合抗原”)?；旌峡乖梢允莾煞N或多種抗原的混合物，或者是同時具有兩種或多種疾病的抗原性的抗原，例如重組蛋白質。作為抗原，可以使用整個生物體，如完整的病毒或細菌細胞，或者使用生物體的一部分，如具有抗原性的某個蛋白質。
本發(fā)明舉例說明的抗原包括肝炎、白喉、水痘、傷寒、百日咳、破傷風、結核、沙門菌病、霍亂、HIV、皰疹、黃熱病、麻疹、脊髓灰質炎、風疹、流行性腮腺炎、狂犬病、蝕斑、血吸蟲病、流感、腫瘤、錐蟲病、利什曼病、麻風病、腦膜炎和瘧疾的抗原。更特別地，它們包括乙肝表面抗原、破傷風類毒素、葡萄球菌腸毒素B類毒素、蓖麻蛋白類毒素和減毒的流感病毒。
在適當?shù)乃匀軇┤缢蚓彌_液中溶解水溶性物質得到溶液，將抗原溶解或分散到此溶液中，通過噴霧干燥或冷凍干燥法使混合物干燥即可制備核心顆粒。如有必要可在溶液中加入適當佐劑，其例子包括明礬；胞壁酰二肽、胞壁酰三肽和其衍生物；tymosin alpha；單磷?；愔珹；皂苷；免疫刺激性的復合物；多聚電解質，如聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚合物；以及它們的混合物。
用于制備核心顆粒的水溶性物質不會造成與蛋白質抗原之間不必要的相互作用，在實際操作中，它不會溶于第二次包裹步驟中使用的有機溶劑。水溶性物質的例子包括水溶性糖類，如葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、藻酸鹽、葡聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素和水溶性纖維素衍生物，如羥丙甲基纖維素、羥丙基纖維素(HPC)、羧甲基纖維素(CMC)和羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)；蛋白質，如白蛋白和明膠；氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸及其鹽類；及其混合物；優(yōu)選為HPC、CMC、CMC-Na、明膠及它們的混合物。
所使用的水溶性物質的量是抗原總重量的1至50倍，優(yōu)選為5至15倍。
如此制備的核心顆粒其大小為0.1至200μm，優(yōu)選為0.5至20μm。為了制備最終的微粒，可通過使用適當?shù)难b置，如磁力攪拌器，均化器，微量流體儀和超聲發(fā)生器將核心顆粒分散于其中溶有疏水性可生物降解的聚合物的有機溶劑中。
所使用的可生物降解的聚合物的量為核心顆粒重量的1至100倍，優(yōu)選為5至30倍。核心顆粒的包裹層由不溶于有機溶劑的水溶性物質制成，因此，通過阻止抗原與有機溶劑接觸即可防止抗原之抗原性的降低或喪失。
用于本發(fā)明的疏水、可生物降解的聚合物的例子包括聚(交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚乙交酯(PGA)、聚交酯(PLA)、共聚草酸鹽、聚已內(nèi)酯、聚(交酯-共-已內(nèi)酯)、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚(β-羥丁酸)和聚酐；而優(yōu)選PLGA和PLA。
本技術熟知的任何有機溶劑都可用于溶解生物降解性的聚合物，它們包括四氯化碳、二氯甲烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯和乙腈。
本發(fā)明的微粒由經(jīng)可生物降解的聚合物包裹的核心顆粒組成，它得自有機懸浮液中，其中核心顆粒均勻分散于可生物降解聚合物的有機溶液中(“核心顆粒分散系統(tǒng)”)。核心顆粒分散系統(tǒng)是有利的，根據(jù)常規(guī)方法從中可制備微粒，同時可避免抗原與有機溶劑或可生物降解的聚合物接觸。另外，與有機溶劑接觸的核心顆粒表面積足夠低以致抗原與有機溶劑的物理接觸不會發(fā)生。
尤其是可根據(jù)下列常規(guī)方法中的任何一種從核心顆粒分散系統(tǒng)中制備本發(fā)明的微粒。
1)溶劑蒸發(fā)法眾所周知此方法可用以制備微粒，但本發(fā)明與現(xiàn)有技術的不同在于使用了可防止抗原與有機溶劑接觸的核心顆粒分散系統(tǒng)以替代其中溶解或分散了抗原的水溶液。
尤其是微?？扇缦轮苽鋵⒑诵念w粒分散系統(tǒng)分散到含有表面活性劑的水溶液中以得到O/W乳濁液，然后從核心顆粒分散系統(tǒng)中除去有機溶劑，或者將核心顆粒分散系統(tǒng)分散到溶劑中(此溶劑與核心顆粒分散系統(tǒng)不能互溶，對于可生物降解的聚合物而言是非溶劑)以制備O/O乳濁液，從核心顆粒分散系統(tǒng)中除去有機溶劑。當使用乙腈作為核心顆粒分散系統(tǒng)的有機溶劑時，可使用礦物油作為溶劑，它與核心顆粒分散系統(tǒng)不能互溶，對于可生物降解的聚合物而言是非溶劑。
2)溶劑抽提法眾所同知此方法也可用以制備微粒，但本發(fā)明與現(xiàn)有技術的不同在于使用了核心顆粒分散系統(tǒng)。尤其是通過使用溶劑(此溶劑與核心顆粒分散系統(tǒng)不能溶和，對于可生物降解的聚合物而言是非溶劑)，如礦物油和石蠟油抽提核心顆粒分散系統(tǒng)中的有機溶劑即可制備微粒。
3)快速冷凍和溶劑抽提法本發(fā)明與現(xiàn)有技術的不同在于使用了核心顆粒分散系統(tǒng)。尤其是使用超聲裝置將核心顆粒分散系統(tǒng)噴射進低溫液氣相中可形成冷凍顆粒。此顆粒被收集到冷凍乙醇的表面，當冷凍乙醇熔化時，冷凍顆粒也在融化，顆粒中的有機溶劑被抽提到乙醇相中，同時形成了被可生物降解的聚合物包裹的微粒。
4)噴霧干燥法最優(yōu)選將此方法用于本發(fā)明，尤其是使用噴霧干燥器噴射核心顆粒分散系統(tǒng)即可制備微粒。由于其產(chǎn)量高速度快，此方法是有利的。另外，此方法的有利之處還在于無需除去水，因為此方法中不使用水；此方法也無需表面活性劑；洗滌和干燥的過程可以省略。
由此制備的微粒其顆粒大小為0.5至300μm，優(yōu)選為1至180μm。顆粒大小小于180μm的那些微?？煞稚⒌阶⑸浣橘|中以制備注射配制品供皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)注射。顆粒大小大于180μm的那些顆粒可用于制備口服施用的配制品。
因此，本發(fā)明進一步提供了一注射疫苗的配制品，它是通過將微粒分散到適當?shù)淖⑸浣橘|中而制備的。此疫苗配制品可僅含有一種抗原，或同時含有兩種或多種抗原。使用含有兩種或多種抗原混合物的核心顆粒，或者使用每種含有的抗原不相同的兩種或多種核心顆粒的混合物即可制備含有兩種或多種抗原的疫苗配制品。
本發(fā)明的一次注射疫苗的配制品僅通過一次注射即可完成抗其中所含抗原的免疫接種，此疫苗配制品中抗原的量相同于或少于需要幾次注射以完成免疫接種的常規(guī)明礬配制品中抗原的量。
可用于本發(fā)明的注射介質的例子包括有或無分散劑和/或防腐劑的緩沖液、食用油、礦物油、魚肝油、角鯊烯、角鯊烷、一、二-或三甘油酯及其混合物；所說的食用油是谷物油、芝麻油、橄欖油、黃豆油、紅花油、棉籽油、花生油、或其混合物。
下列實施例旨在進一步闡明本發(fā)明而不會限制其范圍。
另外，除非另有說明，以下給出的固體混合物中的固體，液體混合物中的液體以及液固混合物中的固體百分數(shù)分別根據(jù)的是wt/wt、vol/vol和wt/wt。
實施例中所用的材料和方法如下所述.抗原重組的乙肝表面抗原(HBsAg)，它溶于磷酸鹽緩沖的鹽水中(PBS)，此抗原是根據(jù)韓國專利申請No.93-2735(
公開日1994年4月9日)的方法制備的。.可生物降解的聚合物美國BPI生產(chǎn)的PLGA(50/50).抗原的量由Lowry法測定。.抗原性使用AUZYME試驗試劑盒(Abbot.U.S.A.)測定。.抗體效價使用AUSAB試驗試劑盒(Abbott.U.S.A)從11只豚鼠的血清中得到效價的幾何平均數(shù)。.豚鼠重300-400g，在施用樣品2天前確證其血中沒有抗體。使用心臟穿刺技術從豚鼠心臟中收集血液。
實施例1使用冷凍干燥法制備核心顆粒將重組HBsAg溶于10mM PBS中至濃度為300μg/ml，在其中加入羥丙基纖維素以使?jié)舛确謩e為0.3mg/ml(樣品1)，1.5mg/ml(樣品2)和3.0mg/ml(樣品3)。使用干冰和丙酮將每種溶液在-70℃下冷凍30分鐘，然后使用壓力為0.05毫米汞柱，冷凝器溫度為-80℃的EYELA FD-81冷凍干燥器(Tokyo Rikakikai.Japan)凍干24小時以得一被羥丙基纖維素包裹的核心顆粒。由此得到的核心顆粒其平均顆粒大小分別為1.0、1.2和1.5μm。
實施例2使用噴霧干燥法制備核心顆粒將重組HBsAg溶于10mM PBS中至濃度為300μg/ml，在其中各加入羥丙基纖維素(樣品4)、羧甲基纖維素鈉(樣品5)和明膠(樣品6)中的每一種至濃度為3.0mg/ml。將每種溶液以3ml/分鐘的流速提供給噴霧干燥器(Buchi190)以得到分別被羥丙基纖維素、羧甲基纖維素鈉和明膠包裹的核心顆粒。在此步驟中，推進劑氮氣的流速為6001/分鐘，流入空氣的溫度為70℃。由此制備的核心顆粒其平均顆粒大小分別為4.6、6.3和4.9μm。
試驗實施例1核心顆粒中抗原的保護為了確證被水溶性物質包裹的核心顆粒是否可保護抗原的抗原性以使之不與有機溶劑接觸，將實施例1和2中制備的核心顆粒分散到可溶解PLGA但不能溶解羥丙基纖維素的乙酸乙酯或乙腈中，使用磁力攪拌器混合所得溶液以使核心顆粒與有機溶劑接觸。分離核心顆粒并干燥之以除去有機溶劑。將干燥的核心顆粒溶解于緩沖液中(10mM磷酸鹽、PH7.5)，用AUZYME試劑盒測定抗原性并與韓國專利公開No.93-2735中于低溫狀態(tài)下保存的重組HBsAg溶液相比較。
另外，如下所述使用末被水溶性物質包裹的HBsAg作為對照。將重組HBsAg溶于10mM PBS中至濃度為300μg/ml，在此溶液中加入相同體積的表1所列多種有機溶劑中的每一種。使用磁力攪拌器將所得溶液混合10分鐘，從溶液中分離出水相，根據(jù)與上述相同的方法測定其抗原性，分離沉淀，干燥并加入PBS以檢測抗原性。然而由于沉淀變性為不可溶形式，因而它不能溶解于PBS中。
結果，經(jīng)羥丙基纖維素包裹的核心顆粒中的抗原與有機溶劑接觸之后仍可保持其抗原性，而未被聚合物包裹的抗原與有機溶劑接觸之后完全失去了其抗原性。
表1
*1)痕量被重新溶解實施例3微粒的制備將PLGA(50/50)溶解于乙酸乙酯中至濃度為1％，將實施例1中制備的樣品3的核心顆粒分散于其中至濃度為1mg/ml。以3ml/分鐘的流速速將所得溶液提供給噴霧干燥器(Buchi 190)即可得到又經(jīng)PLGA包裹的最終微粒。在此步驟中，氮氣的流速是6001/分鐘，流入空氣的溫度為60C。
由此制備的微粒其平均顆粒大小為7μm，PLGA/核心顆粒的重量比為10。由Lowry法測定的抗原量是6μg蛋白質/mg顆粒。
實施例4微粒的制備根據(jù)與實施例3中所述相同的方法，使用實施例2的樣品4作為核心顆粒可制備經(jīng)PLGA包裹的微粒。PLGA/核心顆粒的重量比為10。
由此制備的微粒其平均顆粒大小為9μm，抗原的量為3μg蛋白質/mg顆粒。
實施例5微粒的制備將實施例2的樣品4分散到乙酸乙酯中至濃度為2mg/ml，根據(jù)與實施例3所述相同的方法制備經(jīng)PLGA包裹的微粒，PLGA/核心顆粒的重量比為5。
由此制得的微粒其平均顆粒大小為7μm，抗原的量為6μg蛋白質/mg顆粒。
實施例6微粒的制備將實施例2的樣品4分散到乙酸乙酯中至濃度為0.5mg/ml，根據(jù)與實施例3所述相同的方法制備經(jīng)PLGA包裹的微粒，PLGA/核心顆粒的重量比為20。
由此制得的微粒其平均顆粒大小為10μm，抗原的量為1.5μg蛋白質/mg顆粒。
實施例7微粒的制備使用超聲發(fā)生器將實施例2中制備的5mg樣品4(核心顆粒)分散于其中溶解有200mg PLGA的1ml乙酸乙酯中。使用磁力攪拌器將核心顆粒分散系統(tǒng)與1ml 1％聚乙烯醇(PVA)水溶液相混合，將所得混合物分散于100ml 0.3％的PVA水溶液中可得到O/W乳濁液。持續(xù)混合乳濁液5小時以蒸發(fā)乙酸乙酯，使用0.5μm的濾器分離由此形成的微粒，洗滌，再干燥。
平均顆粒大小為110μm。
試驗實施例2水溶性物質的活體內(nèi)作用將實施例3中制備的微粒分散于PBS中(樣品7)，給豚鼠腹膜內(nèi)注射樣品7一次，所用抗原的量為40μg蛋白質/頭。注射后2個月內(nèi)以15天為間隔抽取豚鼠的血樣，檢測每份樣品中所形成抗體的濃度(mIU/ml)。作為對照，可按下述制備僅由PLGA包裹而未經(jīng)水溶性物質包裹核心的顆粒。根據(jù)實施例1的方法，冷凍不使用水溶性物質作為核心包被的原始的HBsAg溶液，根據(jù)實施例3的方法從中制備僅由PLGA直接包裹的HBsAg顆粒(比較樣品)。根據(jù)與上述相同的方法將比較樣品施用給豚鼠，然后測定所形成的抗體濃度。結果樣品7顯示出的抗體濃度比比較樣品要高，這一點可從表2中看出。此結果表明未經(jīng)水溶性物質包裹核心的抗原因其與有機溶劑和可生物降解的聚合物之間不必要的相互作用會使其喪失抗原性。
表2
試驗實施例3一次注射疫苗配制品的活體內(nèi)作用進行下列實驗是為了確證本發(fā)明的疫苗配制品作為一次注射疫苗配制品是否有較高的作用。
將實施例5中制備的微粒分散在1.0ml注射介質中(含有0.02％(重量)吐溫80的PBS)以形成疫苗配制品(樣品8)，使用26G注射器，以抗原量為20μg蛋白質/頭的量皮下注射豚鼠一次。注射后5個月內(nèi)以15天或一個月為間隔抽取豚鼠血樣，測定每份樣品中所形成的抗體的濃度(mI U/ml)。
如下制備使用明礬為佐劑的比較配制品。將含有HBsAg的PBS與明礬分散溶液(SuperfosBialsector，Vedbaek，Denmark)相混合以制備所含HBsAg的量為10μg蛋白質/1.5mg明礬的疫苗配制品。
使用26G注射器，以抗原量為10μg蛋白質/ml/注射的量將疫苗配制品給兩組豚鼠各注射一次(初次注射)。此后，即初次注射后15天使用相同量的抗原使一組豚鼠經(jīng)受第一次加強免疫(比較例1)。根據(jù)與上述相同的方法使另一組豚鼠在接受第一次加強免疫后1.5個月再經(jīng)受第二次加強免疫(比較例2)。
另外，使用明礬配制品和與上述相同的方法使第三組豚鼠僅僅接受初次注射，所用抗原的量為20μg蛋白質/ml/注射(比較例3，樣品9)。
如上所述測定比較例1，2和3中所形成的抗體的濃度(mI U/ml)，并與樣品8的結果相比較。
結果示于表3，從中可以看出通過注射樣品8所形成抗體的濃度比通過三次注射明礬配制品所形成抗體的濃度要高。此結果表明本發(fā)明的疫苗配制品作為一次注射疫苗配制品具有較高的作用，也即一次注射使用20μg蛋白質的有創(chuàng)造性的疫苗配制品比三次注射使用30μg蛋白質的明礬配制品顯示出更高的免疫接種作用。
表3
試驗實施例4疫苗配制品的顆粒特性和抗體形成之間的關系為了研究是否可根據(jù)可生物降解的聚合物和核心顆粒的重量比來控制抗體形成的時間和量，可進行下列試驗。
將實施例4、5和6中制備的每種微粒懸浮于PBS中以制備一次注射疫苗配制品(樣品10、8和11)，以抗原量為20μg蛋白質/頭的量皮下注射豚鼠一次，注射后5個月內(nèi)以15天為間隔抽取豚鼠血樣，測定每份樣品中所形成抗體的濃度(mI U/ml)。
另外，以抗原量為20μg蛋白質/頭(樣品9)的量將試驗實施例3中制備的明礬配制品給豚鼠注射一次，根據(jù)與上述相同的方法測定所形成抗體的濃度(mIU/ml)。
圖1顯示出注射后抗體濃度隨時間而變化，其中PLGA/核心顆粒的重量比為5的樣品8顯示出最高的抗體濃度增加速率。因此，這證實了通過調節(jié)可生物降解的聚合物包裹的厚度即可控制抗體形成的速率。因此，通過使用具有不同特性的多種顆?？芍苽浜谢旌峡乖囊淮巫⑸湟呙缁蛘呖梢圆煌绞结尫趴乖囊淮巫⑸湟呙?。
如上述實施例所述，本發(fā)明的一次注射疫苗配制品僅通過一次注射施用即可完成免疫接種，并比常規(guī)的疫苗配制品具有更高的抗體形成能力。
著眼于上述特定的實施方案描述了本發(fā)明，應理解本技術熟練人員所作的多種修飾和改變也落入附加的權利要求書所限定的發(fā)明范圍中。
權利要求
1.一種微粒，其顆粒大小為0.5至300μm，它是通過用水溶性物質包裹抗原或抗原混合物以得到核心顆粒，再用可生物降解的聚合物包裹核心顆粒而制備的。
2.如權利要求1的微粒，其中抗原是減毒、滅活或重組抗原。
3.如權利要求1的微粒，其中核心顆粒進一步包括佐劑或無機鹽。
4.如權利要求1的微粒，其中抗原是選自包含下列疾病組的一種或多種疾病的抗原，這些疾病是肝炎、白喉、水痘、傷寒、百日咳、破傷風、結核、沙門菌病、霍亂、HIV、皰疹、黃熱病、麻疹、脊髓灰質炎、風疹、流行性腮腺炎、狂犬病、蝕斑、血吸蟲病、流感、腫瘤、錐蟲病、利什曼病、麻風病、腦膜炎和瘧疾。
5.如權利要求3的微粒，其中佐劑是明礬；胞壁酰二肽、胞壁酰三肽及其衍生物；tymosin alpha；單磷?；愔珹；皂苷；免疫刺激性的復合物；多聚電解質；或它們的混合物。
6.如權利要求1的微粒，其中水溶性物質所使用的量是抗原重量的1至50倍。
7.如權利要求1的微粒，其中水溶性物質是糖類、蛋白質、氨基酸或其混合物。
8.如權利要求7的微粒，其中糖類是纖維素聚合物、葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、藻酸鹽、葡聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素或其混合物。
9.如權利要求8的微粒，其中纖維素聚合物是羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或其混合物。
10.如權利要求7的微粒，其中蛋白質是明膠，白蛋白或其混合物。
11.如權利要求7的微粒，其中氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、或鹽類或其混合物。
12.如權利要求1的微粒，其中核心顆粒的顆粒大小為0.1至200μm。
13.如權利要求1的微粒，其中所使用的可生物降解的聚合物的量是核心顆粒重量的1至100倍。
14.如權利要求1的微粒，其中可生物降解的聚合物是聚乙交酯、聚交酯、聚(交酯-共-乙交酯)或其混合物。
15.如權利要求1的微粒，其中可生物降解的聚合物是共聚草酸鹽、聚已內(nèi)酯、聚(交酯-共-已內(nèi)酯)、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚(β-羥丁酸)、聚酐或其混合物。
16.一次注射疫苗配制品，它是通過將權利要求1至15中提到的任何一個微粒分散到注射介質中而制備的。
17.如權利要求16的一次注射疫苗配制品，其中注射介質是任選含有分散劑和/或防腐劑的緩沖液。
18.如權利要求17的一次注射疫苗配制品，其中注射介質是食用油、礦物油、魚肝油、角鯊烯、角鯊烷、一、二、或三甘油酯或其混合物。
19.如權利要求18的一次注射疫苗配制品，其中食用油是谷物油、芝麻油、橄欖油、黃豆油、紅花油、棉籽油、花生油或其混合物。
全文摘要
一種微粒，其顆粒大小為0.5至300μm，它是通過用水溶性物質包裹抗原或抗原混合物以得到核心顆粒，再用可生物降解的聚合物包裹核心顆粒而制備的；一種一次注射疫苗配制品，它是通過將微粒分散到注射介質中制備的。
文檔編號A61K9/52GK1136918SQ96102728
公開日1996年12月4日 申請日期1996年3月15日 優(yōu)先權日1995年3月16日
發(fā)明者李鉉國, 樸廷煥, 崔湳錫, 金明珍, 金秀憲 申請人:株式會社Lg化學