專利名稱:二聯(lián)手足口病滅活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種新型預(yù)防用病毒性滅活疫苗。背景技術(shù)：
手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD)是一種主要發(fā)生于兒童的病毒性皮膚病，多發(fā)生于嬰幼兒，成人也偶見發(fā)生，又名發(fā)疹性水泡性口腔炎，具有很強(qiáng)的傳染性，常爆發(fā)流行，已有數(shù)十個國家和地區(qū)報(bào)告發(fā)生和流行。亞太地區(qū)HFMD流行伴有較高的死亡率。有報(bào)道HFMD感染部分患兒有不同程度的心肌損害。臺灣1998 2000年兩次爆發(fā)HFMD流行，死亡78例。該病以手、足和口腔粘膜皰疹或破潰成潰瘍?yōu)橹饕R床癥狀，并可發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，如并發(fā)無菌性腦膜炎、腦炎及癱瘓。目前HFMD極強(qiáng)的傳染性越來越被臨床醫(yī)師所重視，且HFMD發(fā)生于夏季，易繼發(fā)皮膚感染，故積極治療，防止繼發(fā)感染，切斷傳播途徑、尤其是預(yù)防爆發(fā)流行顯得尤為重要。
與大部分僅由一種病原體引起的傳染病(如乙肝、麻疹)不同，手足口病由多種病毒感染引起，但絕大部分都是由科薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A 16，CA16)和腸道病毒 7I 型(Enteroviruse EV71)引起。
本發(fā)明的目的就是研制一種可以同時(shí)預(yù)防CA16和EV71病毒引起的手足口病。
發(fā)明內(nèi)容
分離手足口病病原體EV71病毒和CA16病毒，經(jīng)過純化、滅活、抗原性及免疫原性測定，確定了將二者聯(lián)合制成滅活疫苗的方法，用于預(yù)防手足口病流行。
用反應(yīng)器、轉(zhuǎn)瓶或細(xì)胞工廠培養(yǎng)Vero細(xì)胞，成片后感染EV71或者CA16病毒， 于35°C培養(yǎng)48-96小時(shí)后收獲病毒，經(jīng)0. 65-0. 22微米濾膜多級過濾、100麗超濾濃縮、 Sepharose 6 Fast Flow 層析、DEAE Sepharose FF 層析、1 2000 甲酸于 37°C滅活 12 天， 分別制成單價(jià)滅活原液；將兩種滅活原液以1 1體積比混合，加入人白保護(hù)劑后即為二聯(lián)手足口病滅活疫苗。
具體實(shí)施方式
1. EV71和CA16病毒均分離自手足口病患者咽試子。
2.病毒分離和疫苗制備用細(xì)胞為非洲綠猴腎傳代細(xì)胞(Vero)，購自美國ATCC。
3.分別制備EV71和CA16的病毒種子批系統(tǒng)將分離的原始毒種在Vero細(xì)胞上傳代擴(kuò)增，制備EV71和CA16病毒主種子批和工作種子批。
4.病毒種子批鑒定按照2005版《中國藥典》二部中生產(chǎn)人用疫苗用毒種的要求對毒種進(jìn)行全面鑒定，確定無外援因子污染，無菌、無支原體污染，用單抗對兩種病毒進(jìn)行生物學(xué)鑒定。對病毒滴度、免疫原性進(jìn)行檢查。
5.建立細(xì)胞庫將ATCC購來的原始細(xì)胞通過傳代擴(kuò)增，分別凍存主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫。并按照2005版《中國藥典》二部中傳代細(xì)胞作為人用疫苗的細(xì)胞基質(zhì)的質(zhì)量要求進(jìn)行全檢。
6.復(fù)蘇工作庫細(xì)胞并傳代擴(kuò)增至反應(yīng)器規(guī)?；蚣?xì)胞工廠規(guī)?；?L細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
7.細(xì)胞成片后(80%成片)，感染工作種子批EV71或CA16病毒，于35-37°C培養(yǎng) 48-96小時(shí)后收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
8.用0. 65-0. 22微米濾膜進(jìn)行多級過濾，去除細(xì)胞碎片。
9.用100MW截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮50-100倍。
10.用S^harose 6 Fast Flow進(jìn)行分子篩層析，收集第一峰。
11.用DEAE-S印arose FF進(jìn)行陰離子交換層析，收集流穿峰。
12.純化病毒液中加入1 2000-1 4000的福爾馬林搖勻，置33_37°C作用6-12 天。
13.加入穩(wěn)定劑，即為單價(jià)滅活原液。EV71和CA16的單價(jià)原液應(yīng)該分別制備，不可同時(shí)在同一批細(xì)胞上制備。
14.用微量滴定法測定病毒收獲液的病毒滴度，病毒滴度應(yīng)不低于7.0 CCID50/ ml ο
15.分別用EV71和CA16單抗包板，用雙抗體夾心法測定各工藝步驟的抗原含量。
16.用微量中和試驗(yàn)測定滅活抗原的免疫原性和保護(hù)性抗體產(chǎn)生水平。
17.根據(jù)抗原測定結(jié)果和免疫原性測定結(jié)果，將兩種單價(jià)滅活原液按照一定比例混合，制成半成品。
18.分裝成0.5ml/至，即為二聯(lián)手足口病滅活疫苗。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)包含腸道病毒71型(EV71)和科薩奇病毒A組16型(CA16)的二聯(lián)手足口病滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟a)用反應(yīng)器或細(xì)胞工廠或玻璃轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)Vero細(xì)胞復(fù)蘇工作庫細(xì)胞并傳代擴(kuò)增至反應(yīng)器規(guī)?；蚣?xì)胞工廠規(guī)模或3L細(xì)胞培養(yǎng)瓶。b)細(xì)胞成片后感染EV71或CA16病毒，于33-35°C培養(yǎng)48-96小時(shí)。c)收獲培養(yǎng)上清液。d)通過多級過濾去除細(xì)胞碎片。e)超濾濃縮病毒懸液用100MW截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮50-100倍。f)分子篩層析純化病毒懸液。g)離子交換層析病毒懸液。h)通過滅活劑滅活病毒獲得EV71或CA16單價(jià)滅活原液。i)混合EV71和CA16單價(jià)滅活原液配制半成品。 j)分裝成0. 5ml/支，制成二聯(lián)滅活疫苗。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中EV71毒種和CA16毒種為中國境內(nèi)分離的任何同型毒株。
3.權(quán)利要求
1的方法，反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞所用的微載體為cytodexl。
4.權(quán)利要求
1的方法，分子篩層析所用介質(zhì)為kpharose6 Fast Flow。
5.權(quán)利要求
1的方法，分子篩層析所用平衡液為PH6. 8-7. 6的磷酸鹽緩沖溶液。
6.權(quán)利要求
1的方法，離子交換層析所用介質(zhì)為DEAESepharose Fast Flow。
7.權(quán)利要求
1的方法，離子交換層析所用平衡液為pH6. 8-7. 6的磷酸鹽緩沖溶液，洗脫液為含有0. 1-0. 5M氯化鈉，PH為6. 8-7. 6的緩沖鹽溶液。
8.權(quán)利要求
1的方法，其中滅活劑為福爾馬林溶液，反應(yīng)濃度為1 1000至1 4000。
9.權(quán)利要求
1的方法，其中滅活劑作用溫度為35°C 37°C。
10.權(quán)利要求
1的方法，其中滅活劑作用時(shí)間為6 12天。
11.權(quán)利要求
1的方法，其中EV71和CA16單價(jià)滅活原液的混合比例包括任何體積比例。
專利摘要
本發(fā)明屬于一種新型病毒性滅活疫苗。該疫苗用于預(yù)防手足口病。主要技術(shù)毒種EV71和CA16病毒均分離自手足口病患者咽試子。分離及生產(chǎn)用細(xì)胞自美國ATCC，疫苗制備方法用反應(yīng)器、轉(zhuǎn)瓶或細(xì)胞工廠培養(yǎng)Vero細(xì)胞，成片后感染EV71或者CA16病毒，于35℃培養(yǎng)48-96小時(shí)后收獲病毒，經(jīng)0.65-0.22微米濾膜多級過濾、100MW超濾濃縮、Sepharose 6 Fast Flow層析、DEAE Sepharose FF層析、1∶2000甲醛于37℃滅活12天，分別制成單價(jià)滅活原液；將兩種滅活原液以1∶1體積比混合，加入人白保護(hù)劑后即為二聯(lián)手足口病滅活疫苗。
文檔編號C12R1/93GKCN101780278 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200910177426
公開日2012年2月1日 申請日期2009年9月29日
發(fā)明者石慧穎, 賈寶山 申請人:福爾生物制藥股份有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2),