一種黃萱益肝片的制備方法及其在制備抑制黑色素瘤細(xì)胞b16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種黃萱益肝片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的黃萱益肝片的制備方法，由土大黃291g、萱草103g、千里光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥制成，采用超臨界萃取、微波萃取和大孔樹脂吸附制備而成，使得大黃素含量有很大提高。本發(fā)明還提供了黃萱益肝片在制備抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】-種黃萱益肝片的制備方法及其在制備抑制黑色素瘤細(xì)胞 B16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種黃萱益肝片的制備方法及其在制備抑制 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃萱益肝散標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS-10465(ZD-0465)-2002,記載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科肝 膽分冊(cè)。由土大黃291g、萱草103g、千里光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐 芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥制成，具有清熱解毒，疏肝利膽的功效。用 于肝膽濕熱所致的慢性乙型肝炎。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有黃萱益肝散在提取制備方面采用CO2超臨界萃取、微波技術(shù)和 大孔樹脂吸附技術(shù)提取的報(bào)道，而中藥直接打粉取的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患 者用量過大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種黃萱益肝片的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種黃萱益肝片在制備抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16 細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過如下的方案實(shí)現(xiàn)的： 一種黃萱益肝片的制備方法，由土大黃291g、萱草103g、千里光92g、稱猴桃92g、紅土 茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥制成，所述的制備 方法由下列步驟組成：取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細(xì)粉，加入到C02超臨界萃取器 中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力20-30MPa，溫度 30-50°C，CO 2流量l-3ml/g生藥·π?η，萃取時(shí)間130-170min，得超臨界萃取物，備用；萃取 后的野薔薇、騷羊古、南五味子殘?jiān)c其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃 取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮， 加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮 并干燥，得微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制顆粒，干燥， 壓片，制成200片，每片重0. 5g。
[0007] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為5%。
[0008] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25 MPa。
[0009] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
[0010] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中CCV流量2ml/g生 藥· min〇
[0011] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時(shí)間為150min。
[0012] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0013] 上述的黃萱益肝片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
[0014] 上述的黃萱益肝片在制備抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)中，黃萱益肝散口服，成人一次9g，一日3次。黃萱益肝散服藥量大。米 用本發(fā)明方法制備成的黃萱益肝片每片重〇. 5g，每次僅需2片，一日服用3次。在具有更多 活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗(yàn)證明。
[0016] 試驗(yàn)一、不同方法制備的黃萱益肝片中大黃素含量的比較 1、儀器及試藥本發(fā)明黃萱益肝片：按實(shí)施例1方法制備，使用918g原料藥，經(jīng)提取制成 200片，每片重0. 5g。原黃萱益肝散，按照WS-10465 (ZD-0465) -2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備，作為 對(duì)照。Agilentl200高效液相色譜儀；AE240電子分析天平；大黃素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物 制品檢定所)。
[0017] 2、方法 照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄VI D)測(cè)定。
[0018] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0. 25% 磷酸溶液（80 : 20)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為436nm。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于 3000。
[0019] 對(duì)照品溶液的制備取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的大黃素對(duì)照品適量，精密稱 定，加甲醇制成每Iml含0. 05mg的溶液，即得。
[0020] 本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液的制備取本發(fā)明的黃萱益肝片，研細(xì)，取〇.4g，精密稱 定，置索氏提取器中，加乙醇適量，加熱回流提取至無色，提取液濃縮至約5ml，放冷，加入稀 鹽酸5ml，氯仿30ml，加熱回流30分鐘，放冷，分取氯仿液，水液用氯仿振搖提取2次（20ml、 15ml)，合并氯仿液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⒁浦罥Oml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖 勻，離心，取上清液，即得。
[0021] 對(duì)照品供試品溶液的制備取本對(duì)照的黃萱益肝散，研細(xì)，混勻，取2g，精密稱定， 置索氏提取器中，加乙醇適量，加熱回流提取至無色，提取液濃縮至約5ml，放冷，加入稀鹽 酸5ml，氯仿30ml，加熱回流30分鐘，放冷，分取氯仿液，水液用氯仿振搖提取2次（20ml、 15ml)，合并氯仿液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⒁浦罥Oml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖 勻，離心，取上清液，即得。
[0022] 測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液、本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液與對(duì)照品供試品溶液 各1〇μ1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
[0023] 3、結(jié)果 結(jié)果表明，本發(fā)明黃萱益肝片中大黃素的含量為2-4mg/片；而原黃萱益肝散中大黃素 的含量為〇. 21mg/粒，每片大黃素含量相當(dāng)于散劑每g散劑含量的10-20倍，在服用量減少 的情況下，大黃素含量有很大提高。
[0024] 上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的黃萱益肝片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 WS-10465 (ZD-0465) -2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的黃萱益肝散。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解 本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述 內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0026] 實(shí)施例1 取土大黃291g、萱草103g、千里光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜 62g、騷羊古62g、南五味子62g :取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa， 溫度40°C，CO 2流量2ml/g生藥· min，萃取時(shí)間150min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的 野薔薇、騷羊古、南五味子殘?jiān)c其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取裝 置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大 孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得 微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成 200片，每片重0. 5g。
[0027] 經(jīng)檢測(cè)，成品中大黃素的含量為4. 02mg/片。
[0028] 實(shí)施例2 取土大黃291g、萱草103g、千里光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜 62g、騷羊古62g、南五味子62g :取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa， 溫度50°C，CO 2流量3ml/g生藥· min，萃取時(shí)間130min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的 野薔薇、騷羊古、南五味子殘?jiān)c其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取裝 置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大 孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得 微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成 200片，每片重0. 5g。
[0029] 經(jīng)檢測(cè)，成品中大黃素的含量為2. 03mg/片。
[0030] 實(shí)施例3 取土大黃291g、萱草103g、千里光92g、獼猴桃92g、紅土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜 62g、騷羊古62g、南五味子62g :取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力20MPa， 溫度30°C，CO 2流量lml/g生藥· min，萃取時(shí)間170min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的 野薔薇、騷羊古、南五味子殘?jiān)c其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙醇，投入微波萃取裝 置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大 孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得 微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成 200片，每片重0. 5g。
[0031] 經(jīng)檢測(cè)，成品中大黃素的含量為3. 17mg/片。
[0032] 實(shí)施例4 :黃萱益肝片抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料 1.實(shí)驗(yàn)材料 1. 1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0033] I. 2實(shí)驗(yàn)藥物 研究藥物：本發(fā)明黃萱益肝片：按實(shí)施例1方法制備。
[0034] 藥液儲(chǔ)液：稱取IOOmg黃萱益肝片，溶于5ml無水乙醇中，0. 2Mm濾器過濾， 50(^ldoff管分裝，-20°C存儲(chǔ)，同時(shí)0. 2Mm濾器過濾無水乙醇以備對(duì)照組之用。
[0035] 1. 3實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM ( GIBCO公司Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot. No. 100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387) Jrypsin (AMRESC0 公司）;EDTA (AMRESC0 公司）;Penicillin G Sodium Salt (AMRESC0公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇（溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公 司）；MTT (Biosharp 批號(hào)：0793) :PBS (實(shí)驗(yàn)室自配）； 1. 4實(shí)驗(yàn)器材 萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào)：DMIL);可見-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司型 號(hào)：SPECTRAMX 190);C02培養(yǎng)箱（FORMA型號(hào)：3111);超凈臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào)： SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào)：S/N 020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型 號(hào)：P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào)：BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本SANYO 公司型號(hào)：MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào)：DHG9123A);冰 箱（西門子公司型號(hào)：KG18V21TI);液氮罐（CBS型號(hào)：2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀 器廠型號(hào)：KA-1000) ;0.2Mm 濾器（MILLIP0RE 型號(hào)：SLGP033RB) ;lcm 培養(yǎng)皿（NEST 公司）、 96孔培養(yǎng)板（NEST公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0036] 2.實(shí)驗(yàn)方法 1)B16細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（10cm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng) 至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0. 25%胰蛋白酶-0. 04%EDTA， 37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中， IOOOrpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3 X IO4個(gè)/ml。
[0037] 2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液18〇μ1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱 中（37°C，5%C0 2)常規(guī)培養(yǎng)。
[0038] 3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50%_70%，加入黃萱益肝片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0039] 4) 24h 后加入 2〇μ1 MTT 溶液（5mg/ml，即 0· 5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0040] 5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入20〇μ1二甲基亞砜，置搖床 上低速振蕩l〇min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0041] 6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0042] 7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示：細(xì)胞增值抑制率（%)=(對(duì)照孔OD值-給藥 孔OD值)、對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0043] 3.統(tǒng)計(jì)處理 采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean土S. D .表不。
[0044] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)B16細(xì)胞增殖抑 制有差異（P〈〇. 05)，劑量在lOmg/ml時(shí)該差異具有顯著性（P〈0. 01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ ml時(shí)有極顯著性差異（P〈0. 001)。
[0045] 表1黃萱益肝片對(duì)B16細(xì)胞增殖抑制影響研究（X土 SD)

【權(quán)利要求】
1. 一種黃萱益肝片的制備方法，由土大黃291g、萱草103g、千里光92g、稱猴桃92g、紅 土茯苓92g、野薔薇62g、獐芽菜62g、騷羊古62g、南五味子62g作為原料藥制成，其特征在 于，所述的制備方法由下列步驟組成：取野薔薇、騷羊古、南五味子，粉碎成細(xì)粉，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力 20-30MPa，溫度30-50°C，C02流量l-3ml/g生藥萃取時(shí)間130-170min，得超臨界萃取 物，備用；萃取后的野薔薇、騷羊古、南五味子殘?jiān)c其他六味藥材，粉碎，加入5L的60%乙 醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并 萃取液，濃縮，加到D101大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓 回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙 醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 5g。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取中 夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取中 萃取壓力為25MPa。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取中 萃取溫度為60°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取中 C02 流量 2ml/g 生藥? min。
6. 據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取中萃 取時(shí)間為150min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率為 700W。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次萃 取時(shí)間為8分鐘。
9. 權(quán)利要求1所述的黃萱益肝片在制備抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖藥物中 的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104435569SQ201410638326
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】權(quán)棟棟, 王洪濤, 劉艷輝, 權(quán)威宇, 胡乃合 申請(qǐng)人:山東中大藥業(yè)有限公司