補體相關(guān)眼疾的預(yù)防和治療的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明關(guān)注通過施用因子D拮抗劑來預(yù)防和治療補體相關(guān)眼疾，諸如脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)和年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)。
【專利說明】補體相關(guān)眼疾的預(yù)防和治療
[0001] 本申請是基于申請日為2008年5月22日， 優(yōu)先權(quán)日:為2007年5月23日，申請?zhí)?為200880100137. 7 (PCT/US2008/064526)，發(fā)明名稱為："補體相關(guān)眼疾的預(yù)防和治療"的 專利申請的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明關(guān)注補體相關(guān)眼疾（complement-associated eye conditions)(諸如脈絡(luò) 膜新血管形成（choroidal neovascularization, CNV)和年齡相關(guān)黃斑變性（age-related macular degeneration, AMD))的預(yù)防和治療。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 補體系統(tǒng)是由正常情況下以無活性的酶原形式存在的一系列血清糖蛋白構(gòu)成的 一個復(fù)雜酶級聯(lián)。兩種主要途徑（即經(jīng)典途徑和旁路途徑）能活化補體，它們在C3水平合 并，在那里兩種相似的C3轉(zhuǎn)化酶將C3切割成C3a和C3b。
[0005] 巨噬細胞是已經(jīng)發(fā)展出如下先天能力的專門細胞，即識別細胞表面 表達的鑒定標簽（所謂的分子樣式）的結(jié)構(gòu)中的微小差異（Taylor等，Eur J Immunol33, 2090-2097 (2003) Jaylor 等，Annu Rev Immunol 23,901-944(2005))。雖然 這些表面結(jié)構(gòu)的直接識別是先天免疫的一個基礎(chǔ)方面，但是調(diào)理容許通用巨噬細胞受體介 導(dǎo)吞食，如此提高效率和使吞噬細胞的識別全集多樣化（Stuart和Ezekowitz, Immunity 22, 539-550 (2005))。吞食過程涉及多種配體-受體相互作用，而且現(xiàn)在清楚了多種調(diào)理 素（包括免疫球蛋白、膠原凝集素、和補體成分）經(jīng)由與巨噬細胞細胞表面受體的相互作 用來引導(dǎo)病原體內(nèi)化所需要的細胞活性（綜述見Aderem和Underhill, Annu Rev Immunol 17,593-623(1999) ;Underhill 和 Ozinsky, Annu Rev Immunol 20,825-852(2002))。雖然 由種系基因編碼的天然免疫球蛋白能識別極其多種病原體，但是大多數(shù)調(diào)理性IgG是經(jīng)由 適應(yīng)性免疫生成的，而且因此經(jīng)由Fc受體的高效清除不是立即的（Carroll, Nat Immunol 5, 981-986(2004))。另一方面，補體快速識別病原體表面分子并使微粒準備好被補體受體 攝?。˙rown, Infect Agents Dis 1,63-70(1991))。
[0006] 補體由30種以上的血清蛋白質(zhì)組成，它們調(diào)理極其多種病原體，用以被補體 受體識別。取決于級聯(lián)的初始觸發(fā)物，可區(qū)別三種途徑（綜述見Walport, NEngl J Med 344, 1058-1066(2001))。所有這三種途徑共享活化中樞成分C3的共同步驟，但是它們依據(jù) 識別的本質(zhì)和導(dǎo)致C3活化的初始生化步驟而不同。經(jīng)典途徑如下活化，抗體結(jié)合至病原體 表面，其繼而結(jié)合Clq補體成分，引起一系列蛋白酶級聯(lián)，最終將C3切割成其活性形式C3b。 凝集素途徑在碳水化合物基序受到凝集素蛋白質(zhì)識別后被活化。至今，已經(jīng)鑒定了此途徑 的三個成員：結(jié)合甘露糖的凝集素（MBL)，SIGN-Rl凝集素家族和ficolin (Pyz等，Ann Med 38, 242-251 (2006)) JBL和ficolin都與絲氨酸蛋白酶有關(guān)，其像經(jīng)典途徑中的Cl那樣起作 用，即活化成分C2和C4,導(dǎo)致中樞C3步驟。旁路途徑與經(jīng)典途徑和凝集素途徑二者形成對 照，即它是由于內(nèi)部C3酯與病原體表面上的識別基序的直接反應(yīng)而被活化的。經(jīng)由旁路途 徑蛋白酶因子B和因子D的作用，初始C3結(jié)合活化性表面導(dǎo)致C3b沉積的快速擴大。重要 的是，經(jīng)由因子B和D的作用，通過經(jīng)典途徑或凝集素途徑任一沉積的C3b也能導(dǎo)致C3b沉 積的擴大。在補體活化的所有三種途徑中，調(diào)理中的關(guān)鍵步驟是成分C3轉(zhuǎn)化成C3b。補體級 聯(lián)的酶對C3的切割將硫酯暴露于親核攻擊，容許C3b經(jīng)由硫酯域共價附著到抗原表面上。 這是補體調(diào)理中的初始步驟。對所結(jié)合的C3b的后續(xù)蛋白水解生成iC3b、C3c和C3dg，即 受到不同受體識別的片段（Ross和Medof，Adv Immunol 37,217-267(1985))。此切割消除 了 C3b進一步擴大C3b沉積和活化補體級聯(lián)晚期成分（包括能夠指導(dǎo)膜破壞的膜攻擊復(fù)合 物）的能力。然而，巨噬細胞吞噬細胞受體優(yōu)先識別C3b及其片段；由于酯鍵形成的多能性， C3介導(dǎo)的調(diào)理對于病原體識別是重要的（Holers等，Immunol Today 13,231-236(1992))， 而且各種C3降解產(chǎn)物的受體因此在宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。
[0007] C3自身是由13個獨特結(jié)構(gòu)域組成的一種復(fù)雜的且柔性的蛋白質(zhì)。該分子的核心 由8個所謂的巨球蛋白（MG)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，它們構(gòu)成了 C3的壓緊的α和β鏈。插入此結(jié)構(gòu) 的是CUB (Clr/Cls、Uegf和骨形態(tài)生成蛋白-1)和TED結(jié)構(gòu)域，后者含有容許C3b與病原體 表面共價結(jié)合的硫酯鍵。剩余結(jié)構(gòu)域含有C3a，或者起核心結(jié)構(gòu)域的接頭和間隔物的作用。 C3b和C3c結(jié)構(gòu)與C3的比較證明了該分子在每次蛋白水解時經(jīng)歷重大構(gòu)象重排，這不僅暴 露TED，而且暴露了該分子的能與細胞受體相互作用的別的新的表面（Janssen和Gros，Mol Immunol 44,3-10(2007))。
[0008] 年齡相關(guān)黃斑變性（AMD)是全世界老年人失明的首要原因。AMD的特征在于中心 視力的逐漸損失，其可歸于黃斑的變性性和新血管性變化，黃斑是眼視網(wǎng)膜中負責細微視 敏度的高度專門區(qū)域。最新的估算指示1400萬人因 AMD而失明或視力嚴重受損。該病對 老齡人群及其家庭的生理和心理健康具有巨大影響，而且正在成為重大公眾健康負擔。
[0009] 然而，新的發(fā)現(xiàn)開始提供關(guān)于與早期AMD有關(guān)的重要細胞事件、遺傳因子、和生物 化學(xué)過程的更清楚圖像。補體因子H基因是在多項獨立的研究中被鑒定為賦予發(fā)生AMD 的重大遺傳風險的第一種基因。如此，三個分開的小組報告了位于因子H氨基酸402處的 酪氨酸-組氨酸多態(tài)性與AMD發(fā)生有關(guān)（Klein等，Science 308,385-389(2005) ;Haines 等，Science 308, 419-421 (2005);及 Edwards 等，Science 308,421-424(2005))。已經(jīng)提 出，由疾病相關(guān)因子H等位基因所致的受損旁路途徑抑制或是引起或是大力促成AMD發(fā)生 (Thurman 和 Holers, J Immunol 176,1305-1310(2006))。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 一方面，本發(fā)明關(guān)注用于預(yù)防或治療補體相關(guān)眼疾的方法，包括給有需要的受試 者施用有效量的因子D拮抗劑。
[0012] 在各種實施方案中，所述有需要的受試者是哺乳動物，諸如人，而所述因子D拮抗 劑選自下組：抗因子D抗體及其片段、結(jié)合性多肽、肽、和非肽小分子。
[0013] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述因子D拮抗劑是抗體或抗體片段。在各種實施方 案中，所述抗體可結(jié)合因子D的活性位點，或者可結(jié)合包含因子D活性位點殘基的表位。
[0014] 本發(fā)明范圍內(nèi)的具體抗體包括但不限于抗體20D12、31A9、25A1和32H12,及其變 體。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體或抗體片段本質(zhì)上（essentially)與抗體20D12 結(jié)合相同表位，或者包含抗體20D12的重鏈和/或輕鏈CDR序列（SEQ ID NO :1和2)，或者 是抗體20D12或其片段。
[0015] 所述抗因子D抗體包括人的、人源化的或嵌合的抗體。
[0016] 所述抗體片段可以是例如Fab、Fab'、F(ab'）2、scFv、（scFv)2、dAb、互補決定區(qū) (CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體（minibodies)、雙抗體、或自抗體片段形成 的多特異性抗體。
[0017] 補體相關(guān)眼疾包括例如年齡相關(guān)黃斑變性（age-relared macular degeneration) (AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成（choroidal neovascularization) (CNV)、葡 萄膜炎（uveitis)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變（diabetic and other ischemia-related retinopathies)、糖尿病性黃斑水月中（diabetic macular edema)、病理性近視（pathological myopia)、von Hippel-Lindau 病、眼的組織胞楽菌病 (histoplasmosis of the eye)、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞（Central Retinal Vein Occlusion) (CRVO)、角膜新血管形成（corneal neovascularization)、和視網(wǎng)膜新血管形成（retinal neovascularization)〇
[0018] 另一方面，本發(fā)明關(guān)注試劑盒，其包含因子D拮抗劑和關(guān)于施用所述拮抗劑來治 療補體相關(guān)眼疾的指令。
[0019] 又一方面，本發(fā)明關(guān)注因子D拮抗劑在制備用于治療補體相關(guān)眼疾的藥物中的用 途。
[0020] 再一方面，本發(fā)明關(guān)注因子D拮抗劑，其用于補體相關(guān)眼疾的治療。
[0021] 附圖簡述
[0022] 圖IA :自正常和AMD供體眼獲得的玻璃體和布魯赫（Bruch)(膜）中的因子D水 平。因子D水平是如所述的通過因子D特異性ELISA而測量的。圖IB :通過計算布魯赫膜 中表達的因子D的總貢獻和玻璃體中找到的因子D的總量，測定眼中的因子D的總水平。
[0023] 圖2 :來自AMD供體眼的布魯赫膜的橫切片的因子D免疫組織化學(xué)。插圖顯示了 在布魯赫膜之上成層的玻璃疣中的因子D染色。在玻璃疣之外，布魯赫膜和脈絡(luò)膜也呈因 子D陽性。
[0024] 圖3 :對補體旁路途徑選擇性的溶血測定法中12D20的表征。在下方指出了 IC50 值，而且該測定法是如方法部分中所述實施的。
[0025] 圖4 :鼠單克隆抗體12D20的重鏈和輕鏈可變域序列（SEQ ID NO :1和2)。
[0026] 圖5 :多種抗因子D抗體的表位作圖。指出了它們在溶血測定法中的相對效力。
[0027] 圖6 :天然人因子D多肽的氨基酸序列（SEQ ID NO :3)。
[0028] 表I :AMD中補體成分的分析。
[0029] 表2 :研究中使用的供體組織。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] I.定義
[0032] 術(shù)語"因子D"和"補體因子D"可互換使用，指天然序列和變異因子D多肽。
[0033] "天然序列"因子D指與自自然界衍生的因子D多肽具有相同氨基酸序列的多肽， 無論其制備模式。如此，天然序列因子D可以從自然界分離，或者可以通過重組和/或合成 手段生成。在成熟因子D蛋白諸如成熟人因子D蛋白（NM_001928;SEQ ID N0:3)之外，術(shù) 語"天然序列因子D"明確涵蓋因子D的天然存在前體形式（例如無活性的前蛋白，其受到 蛋白水解切割而生成活性形式）、因子D的天然存在變體形式（例如可變剪接形式）和天然 存在等位變體，以及因子D分子的與自自然界衍生的因子D多肽具有相同氨基酸序列的結(jié) 構(gòu)構(gòu)象變體。非人動物（包括高等靈長類和非人哺乳類）的因子D多肽被明確包括在此定 義內(nèi)。
[0034] "因子D變體"或"補體因子D變體"意指與天然序列因子D多肽，諸如SEQ ID NO : 3的天然序列人因子D多肽具有至少約80%氨基酸序列同一性的如下文中所定義的活性因 子D多肽。通常，因子D變體與SEQ ID NO :3的成熟人氨基酸序列會具有至少約80 %的氨基 酸序列同一性，或至少約85 %的氨基酸序列同一性，或至少約90 %的氨基酸序列同一性， 或至少約95%的氨基酸序列同一性，或至少約98%的氨基酸序列同一性，或至少約99%的 氨基酸序列同一性。優(yōu)選的是，在因子D的活性位點內(nèi)存在最高程度的序列同一性。
[0035] 因子D的"活性位點"由人因子D序列中的His-57、Asp-102、和Ser-195 (胰 凝乳蛋白酶原編號方式）來定義。因子D在主要特異性袋的底部具有Asp-189(胰凝乳 蛋白酶原編號方式），而且切割A(yù)rg肽鍵。催化性三聯(lián)體由His-57、Asp-102和Ser-195 組成。Asp-102和His-57展示與其它絲氨酸蛋白酶相比非典型的構(gòu)象（Narayana, J. Mol. Biol. 235(1994)695-708)。在位于 SI 袋底部的 Asp-189 和 Arg-218 之間觀 察到一個獨特的鹽橋，其提起環(huán)214-218并生成深且窄的Sl袋（Jing等，J. Mol. Biol. 282(1998) 1061-1081)。突變分析顯示了此環(huán)和位于活性位點周圍的數(shù)個其它殘基是 因子D的酯水解活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)決定子（Kim等，J. Biol. Chem. 270 (1995) 24399-24405)。 基于這些結(jié)果提出，因子D在結(jié)合結(jié)合了 C3b的因子B時可能經(jīng)歷構(gòu)象變化，導(dǎo)致蛋白水解 活性的表達（Volanakis 和 Narayana, Protein Sci. 5 (1996) 553-564)。
[0036] "百分比（％)氨基酸序列同一性"定義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最 大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與 參照因子D序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同 一性目的的對比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟 件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能決定用于 測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然后計算相 對于較長序列的序列同一性，即即使較短序列顯示與較長序列一部分的100%序列同一性， 總體序列同一性也會小于100%。
[0037] "百分比（％)核酸序列同一性"定義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大 百分比序列同一性后，候選序列中與參照因子D編碼序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分 率。為測定百分比核酸序列同一性目的的對比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進行，例 如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。 本領(lǐng)域技術(shù)人員能決定用于測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較序列全長獲得最大對比所 需的任何算法。然后計算相對于較長序列的序列同一性，即即使較短序列顯示與較長序列 一部分的100%序列同一性，總體序列同一性也會小于100%。
[0038] "分離的"核酸分子指已經(jīng)鑒定且與核酸的天然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種 污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背 景。分離的核酸分子因此與存在于天然細胞中時的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分 子包括通常表達所編碼多肽的細胞中包含的核酸分子，例如當所述核酸分子在所述細胞中 的染色體定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。
[0039] "分離的"因子D多肽編碼核酸分子指已經(jīng)鑒定且與因子D編碼核酸的天然來源中 通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分尚的因子D多肽編碼核酸分 子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背景。分離的因子D多肽編碼核酸分子因此與存在 于天然細胞中時的編碼核酸分子有區(qū)別。然而，分離的因子D編碼核酸分子包括通常表達 因子D的細胞中包含的因子D編碼核酸分子，例如當所述核酸分子在所述細胞中的染色體 定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。
[0040] 術(shù)語"拮抗劑"以最廣義使用，包括能夠中和、阻斷、部分或完全抑制、消除、降低或 干擾因子D生物學(xué)活性的任何分子。因子D拮抗劑包括但不限于抗因子D抗體及其抗原結(jié) 合片段，結(jié)合因子D且能夠中和、阻斷、部分或完全抑制、消除、降低或干擾因子D活性（諸 如因子D參與補體相關(guān)眼疾的病理學(xué)的能力）的其它結(jié)合性多肽、肽、和非肽小分子。
[0041] "小分子"在本文中定義為具有低于約600,優(yōu)選低于約1000道爾頓的分子量。
[0042] "有活性的"或"活性"或"生物學(xué)活性"在本發(fā)明因子D拮抗劑的語境中指拮抗（部 分或完全抑制）因子D生物學(xué)活性的能力。因子D拮抗劑的一種優(yōu)選生物學(xué)活性是在因子 D相關(guān)疾病或疾患（諸如例如補體相關(guān)眼疾）的狀態(tài)（例如病理學(xué)）中實現(xiàn)可測量的改善 的能力。所述活性可在體外或在體內(nèi)測試中測定，包括結(jié)合測定法，使用有關(guān)動物模型，或 人體臨床試驗。
[0043] 術(shù)語"補體相關(guān)眼疾"以最廣義使用，包括病理學(xué)涉及補體（包括經(jīng)典途徑和旁路 途徑，特別是補體旁路途徑）的所有眼疾。補體相關(guān)眼疾包括但不限于黃斑變性性疾病，諸 如所有階段的年齡相關(guān)黃斑變性（AMD)(包括干性和濕性（非滲出性和滲出性））形式，脈 絡(luò)膜新血管形成（CNV)，葡萄膜炎，糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變，和其 它眼內(nèi)新血管疾病，諸如糖尿病性黃斑水腫，病理性近視，von Hippel-Lindau病，眼的組織 胞漿菌病，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞（CRVO)，角膜新血管形成，和視網(wǎng)膜新血管形成。一組優(yōu)選 的補體相關(guān)眼疾包括年齡相關(guān)黃斑變性（AMD)(包括非滲出性（濕性）和滲出性（干性或 萎縮性）AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成（CNV)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變（DR)、和眼內(nèi)炎。
[0044] "治療"或"處理"指旨在預(yù)防病癥發(fā)展或改變病癥病理而實施的干預(yù)。因而，"治 療"或"處理"指治療性處理及預(yù)防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括早就患有 病癥的受試者以及要預(yù)防病癥的受試者。在免疫相關(guān)疾病的治療中，治療劑可直接改變免 疫應(yīng)答的一種成分的應(yīng)答程度，或者使得疾病對其它治療劑（例如抗生素、抗真菌劑、抗炎 齊U、化療劑等）的治療更敏感。
[0045] 疾?。ㄖT如補體相關(guān)眼疾）的"病理"或"病理學(xué)"包括所有危及患者康樂的現(xiàn)象。 這包括但不限于異常的或不可控的細胞生長（嗜中性細胞、嗜酸性細胞、單核細胞、淋巴細 胞）、抗體生成、自身抗體生成、補體生成、對鄰近細胞正常機能的干擾、細胞因子或其它分 泌產(chǎn)物的異常水平釋放、任何炎性或免疫學(xué)應(yīng)答的抑制或惡化、炎癥細胞（嗜中性細胞、嗜 酸性細胞、單核細胞、淋巴細胞）浸潤入細胞間隙（cellular spaces)等。
[0046] 如本文中所使用的，術(shù)語"哺乳動物"指歸為哺乳類的任何動物，包括但不限于人， 高等靈長類，家畜和牲畜，及動物園、運動或?qū)櫸飫游?，諸如馬、豬、牛、犬、貓和雪貂等。在一 個優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物指人。
[0047] 與一種或多種其它治療劑"聯(lián)合/組合"施用包括同時（共同）施用和任何次序 的序貫施用。
[0048] "治療有效量"指在目標疾病或疾患（諸如例如補體相關(guān)眼疾）的狀態(tài)（例如病理 學(xué)）中實現(xiàn)可測量的改善所需要的"因子D拮抗劑"量。
[0049] 術(shù)語"控制序列"指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA 序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位 點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。
[0050] 若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是"可操作連接的"。 例如，若前序列（presequence)或分泌前導(dǎo)（secretory leader)的DNA表達成參與多肽分 泌的前蛋白質(zhì)（preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編 碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點的位置促進翻譯，則它 與編碼序列可操作連接。一般而言，"可操作連接的"意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且 在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必相鄰。連接可以通過 在方便的限制性位點處的連接來實現(xiàn)。若沒有此類位點，則依照常規(guī)實踐使用合成的寡核 昔Ife銜接頭或接頭。
[0051] 雜交反應(yīng)的"嚴格性"可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易的確定，而且通常根據(jù)探 針長度、洗滌溫度、和鹽濃度憑經(jīng)驗計算。一般而言，較長的探針要求較高的溫度以正確退 火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當互補鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán) 境中時變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同源性程度越高，可使用 的相對溫度也越高。結(jié)果是，推斷出較高相對溫度會趨向于使反應(yīng)條件更為嚴格，而較低 溫度也就較不嚴格。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴格性的其它細節(jié)和解釋，參見Ausubel等，《Current Protocols in Molecular Biology)), Wiley Interscience Publishers, 1995。
[0052] "嚴格條件"或"高嚴格性條件"，如本文中所定義的，可如下鑒定：（1)采用低離 子強度和高溫進行清洗，例如〇. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 1 %十二烷基硫酸鈉， 于50°C ; (2)在雜交過程中采用變性劑，諸如甲酰胺，例如50% (v/v)甲酰胺及0.1%牛血 清清蛋白/〇. 1% Ficoll/0. 1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5及750mM氯 化鈉，75禮檸檬酸鈉，于421：;或（3)采用50%甲酰胺，5155(：(0.751恥(：1，0.0751檸檬 酸鈉），50mM磷酸鈉 （pH 6. 8)，0. 1 %焦磷酸鈉，5x Denhardt氏溶液，超聲處理的鮭魚精 0嫩(5(^8/!111)，0.1%505，和10%硫酸右旋糖苷，于421：，及于421：在0.2155(：(氯化鈉 /檸檬酸鈉）和50%甲酰胺中清洗，于55°C，接著于55°C在含EDTA的0. Ix SSC中進行高 嚴格性清洗。
[0053] "中等嚴格條件"可以如 Sambrook 等，《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》，New York，Cold Spring Harbor Press，1989中所述鑒定，包括使用比上文所述 較不嚴格的清洗溶液和雜交條件（例如溫度、離子強度和％ SDS)。中等嚴格條件的一個 例子是于371：在含20%甲酰胺，51330(15〇1111似(：1，151111檸檬酸三鈉），5〇1111磷酸鈉（?!1 7. 6)，5x Denhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性的經(jīng)剪切的鮭魚精DNA的 溶液中溫育過夜，接著于約37-50°C在lx SSC中清洗濾膜。技術(shù)人員會認識到如何在必要 時調(diào)整溫度、離子強度等以適應(yīng)諸如探針長度等因素。
[0054] 術(shù)語"表位標記的"或"帶表位標簽的"在用于本文時指包含本發(fā)明多肽且其與"標 簽多肽"融合的嵌合多肽。標簽多肽具有足夠殘基以提供表位而可制備針對其的抗體，但又 足夠短使得其不干擾與其融合的多肽的活性。標簽多肽還優(yōu)選是相當獨特的，使得其抗體 基本上不與其它表位發(fā)生交叉反應(yīng)。合適的標簽多肽通常具有至少6個氨基酸殘基，通常 在約8個和約50個氨基酸殘基之間（優(yōu)選在約10個和約20個氨基酸殘基之間）。
[0055] 術(shù)語"抗體"以最廣義使用，明確覆蓋但不限于單一抗因子D單克隆抗體（包括激 動性、拮抗性、和中和性抗體）和具有多表位特異性的抗因子D抗體組合物。術(shù)語"單克隆 抗體"在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同， 除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。
[0056] 術(shù)語"單克隆抗體"在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成 群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。單克隆抗體 是高度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與典型的包含針對不同決定簇（表位）的不 同抗體的常規(guī)（多克?。┛贵w制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修 飾語"單克隆"指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特 定方法來生成抗體。例如，有待依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過首次由Kohler等 (1975) Nature 256:495記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法來制備（參 見例如美國專利No. 4, 816, 567)。"單克隆抗體"也可以使用例如Clackson等（1991)Nature 352:624-628及Marks等（1991) J. Mol. Biol. 222:581-597中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫分 離。
[0057] 單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體（免疫球蛋白），其中重鏈和/或輕鏈的 一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而 鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或 同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性（美國專利No. 4, 816, 567 ; 及 Morrison 等（1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855)。
[0058] 非人（例如鼠）抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序 列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白（受體抗體）中的高變區(qū)殘基 用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種（供體抗體）諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長 類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)（FR)殘 基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的 殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。通常，人源化抗體會包含至少一個、通 常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的 高變環(huán)，且所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體任選還包含 至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)（Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見Jones等 (1986) Nature 321:522-525 ;Riechmann 等（1988) Nature 332:323-329;及 Presta (1992) Curr. 0ρ· Struct. Biol. 2:593-596。
[0059] "物種依賴性抗體"指對來自第一哺乳動物物種的抗原具有強于對該抗原來自第 二哺乳動物物種的同系物的結(jié)合親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體"特異性結(jié)合"人類 抗原（即具有不超過約I X 1(Γ7Μ、優(yōu)選不超過約I X 1(Γ8Μ、和最優(yōu)選不超過約I X KT9M的 結(jié)合親和力（Kd))，但是對該抗原來自第二非人哺乳動物物種的同系物具有比其對人類抗 原的結(jié)合親和力弱至少約50倍、或至少約500倍、或至少約1000倍的結(jié)合親和力。物種依 賴性抗體可以是上文定義的各種類型抗體，但是優(yōu)選人源化抗體或人抗體。
[0060] 在用于本文時，"抗體突變體"或"抗體變體"指物種依賴性抗體的氨基酸序列變 體，其中物種依賴性抗體的一個或多個氨基酸殘基發(fā)生了修飾。此類突變體與物種依賴性 抗體必然具有小于100%的序列同一性或相似性。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體突變體所 具有的氨基酸序列與物種依賴性抗體的重鏈或輕鏈可變域的氨基酸序列具有至少75%、更 優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%的氨基酸序列同一'丨生 或相似性。關(guān)于此序列的同一性或相似性在本文中定義為在比對序列并在必要時引入缺口 以實現(xiàn)最大百分比序列同一性后，候選序列中與物種依賴性抗體殘基相同（即相同殘基） 或相似（即根據(jù)共同側(cè)鏈特性來自同一組的氨基酸殘基，見下文）的氨基酸殘基的百分比。 N-末端、C-末端、或內(nèi)部的延伸、刪除、或插入可變域以外的抗體序列都不應(yīng)視為影響序列 同一'I"生或相似性。
[0061] "分離的"抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其 天然環(huán)境的污染性成分指會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它 蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至（1)根據(jù)Lowry 法的測定，抗體重量超過95%，最優(yōu)選重量超過99%，（2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得 至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或（3)根據(jù)還原性或非還原性條件下 的SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優(yōu)選的銀染色，達到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成 分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常會通過至 少一個純化步驟來制備。
[0062] 在用于本文時，"抗體可變域"指抗體分子的輕鏈和重鏈中包含互補決定區(qū) (⑶R ;即⑶R1、⑶R2、和⑶R3)和框架區(qū)（FR)氨基酸序列的那部分。重鏈可變域。 八指輕鏈可變域。依照本發(fā)明所使用的方法，歸為CDR和FR的氨基酸位置可以依照 Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991))來限定。抗體或抗原結(jié)合片段的氨基酸編號方式也 依照Kabat。
[0063] 在用于本文時，術(shù)語"互補決定區(qū)（⑶R ;即⑶R1、⑶R2、和⑶R3)指抗體可變域 中其存在是抗原結(jié)合所必需的氨基酸殘基。每個可變域通常具有三個CDR，鑒定為CDR1、 ⑶R2和⑶R3。每個互補決定區(qū)可以包含來自如Kabat定義的"互補決定區(qū)"的氨基酸 殘基（即大約是輕鏈可變域的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變域 的殘基 31-35(HI)、50_65(H2)和 95-102(H3) ;Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))和/或來自"高變環(huán)"的殘基（即大約是輕鏈可變域的殘 基 26-32 (LI)、50-52 (L2)和 91-96 (L3)及重鏈可變域的殘基 26-32 (HI)、53-55 (H2)和 96-101 (H3) ;Chothia 和 Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)。在有些情況中，互補決定 區(qū)可以包含來自依照Kabat定義的⑶R和來自高變環(huán)二者的氨基酸。例如，抗體4D5重鏈 的CDRHl包含氨基酸26-35。
[0064] "框架區(qū)"（以下的FR)指可變域中CDR殘基以外的殘基。每個可變域通常具有四 個FR，鑒定為FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是依照Kabat定義的，那么輕鏈FR殘基位于 大約輕鏈殘基 1-23 (LCFRl)、35-49 (LCFR2)、57-88 (LCFR3)、和 98-107 (LCFR4)，而重鏈 FR 殘 基位于大約重鏈殘基 1-30 (HCFRl)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)、和 103-113 (HCFR4)。如 果⑶R包含來自高變環(huán)的氨基酸殘基，那么輕鏈FR殘基位于大約輕鏈殘基1-25 (LCFRl)、 33-49 (LCFR2)、53-90 (LCFR3)、和97-107 (LCFR4)，而重鏈FR殘基位于大約重鏈殘基 1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)、和 102-113(HCFR4)。在有些情況中，在 CDR 包 含來自依照Kabat定義的CDR和來自高變環(huán)二者的氨基酸時，F(xiàn)R殘基會做相應(yīng)的調(diào)整。例 如，當CDRHl包含氨基酸H26-H35時，重鏈FRl殘基位于第1-25位，而FR2殘基位于第36-49 位。
[0065] 在用于本文時，"密碼子集"指用于編碼期望變異氨基酸的一套不同核苷酸三聯(lián) 體序列?？梢酝ㄟ^例如固相合成來合成一套寡核苷酸，其包括呈現(xiàn)由密碼子集提供的核苷 酸三聯(lián)體的所有可能組合并編碼期望氨基酸組的序列。一種標準形式的密碼子命名是IUB 代碼，其是本領(lǐng)域已知的且在本文中有記載。密碼子集通常以3個斜體大寫字母表示，例 如NNK、NNS、XYZ、DVK等等。如此，"非隨機密碼子集"在用于本文時指編碼部分、優(yōu)選完全 滿足本文所述氨基酸選擇標準的選定氨基酸的密碼子集。在某些位置具有選定核苷酸"簡 并性"的寡核苷酸的合成是本領(lǐng)域眾所周知的，例如TRIM法（Knappek等（1999) J. Mol. Biol. 296:57-86 ;Garrard 和 Henner (1993)Gene 128:103)。此類具有某些密碼子集的寡 核苷酸集可以使用商品化核酸合成儀來合成（可購自例如Applied Biosystems, Foster (^七7,04)，或者可以通過商業(yè)途徑獲得（例如購自1^€6 16(31111〇1〇8丨68，1?〇〇1^；[116，]\?)。因 此，一套具有特定密碼子集的合成寡核苷酸通常會包括具有不同序列（在整個序列中由密 碼子集建立的差異）的多種寡核苷酸。寡核苷酸，在依照本發(fā)明使用時，具有容許與可變域 核酸模板雜交的序列，而且還可以但非必須包含可用于例如克隆目的的限制酶位點。
[0066] 術(shù)語"抗體片段"在本文中以最廣義使用，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab'）2、scFv、 (scFv)2、dAb、和互補決定區(qū)（CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體、雙抗體、和自 抗體片段形成的多特異性抗體。
[0067] "Fv"片段是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的抗體片段。該區(qū)域由緊密結(jié)合（該結(jié) 合的本質(zhì)可以是共價的，例如在scFv中）的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組 成。正是在這種構(gòu)造中，每個可變域的三個⑶R相互作用而在V h-'二聚體表面上限定了一 個抗原結(jié)合位點。六個CDR或其子集一起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個 可變域（或是只包含對抗原特異性的三個CDR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力， 只是通常親和力低于完整結(jié)合位點。
[0068] "Fab"片段包含輕鏈的可變域和恒定域及重鏈的可變域和第一恒定域（CHl)。 F(ab'）2抗體片段包含一對Fab片段，它們一般在它們羧基末端附近通過它們之間的鉸鏈半 胱氨酸共價連接。本領(lǐng)域還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)形式。
[0069] "單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的Vh和八結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于 單一多肽鏈中。一般而言，F(xiàn)v多肽在Vh與 '結(jié)構(gòu)域之間進一步包含多肽接頭，其使得scFv 能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun,于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag, New York, 第 269-315 頁，1994。
[0070] 術(shù)語"雙抗體"指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈 (Vh及VJ中包含相連接的重鏈可變域（Vh)和輕鏈可變域（VJ。通過使用過短的接頭使得 同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對， 從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更完整的記載于例如EP 404, 097 ;W0 93/11161;及 Hollinger 等（1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448。
[0071] 表述"線性抗體"指 Zapata 等（1995) Protein Eng, 8 (10) :1057-1062 中所描述的 抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段（Vh-ChI-V h-ChI),該區(qū)段與互補的輕鏈多 肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的，或者是單特異性的。
[0072] 在用于本文時，"文庫"或"庫"指眾多抗體或抗體片段序列（例如本發(fā)明的多肽）， 或者編碼這些序列的核酸，即根據(jù)本發(fā)明方法導(dǎo)入這些序列中的、變異氨基酸組合方面不 同的序列。
[0073] "噬菌體展示"是一種將變異多肽作為與外殼蛋白至少一部分的融合蛋白展示在 噬菌體（例如絲狀噬菌體）顆粒表面上的技術(shù)。噬菌體展示的效用在于能對隨機化蛋白質(zhì) 變體的大型文庫快速且高效分選那些以高親和力與靶抗原結(jié)合的序列的實情。肽和蛋白 質(zhì)文庫在噬菌體上的展示已經(jīng)用于對數(shù)以百萬計的多肽篩選那些具有特異性結(jié)合特性的 多肽。多價噬菌體展示法已經(jīng)用于展示小隨機肽和小蛋白質(zhì)，其通過與絲狀噬菌體的基因 III 或基因 VIII 融合來實現(xiàn)。Wells 和 Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362， 及其中引用的參考文獻。在單價噬菌體展示中，將蛋白質(zhì)或肽文庫與基因 III或其一部分 融合，并在存在野生型基因 III蛋白時以低水平表達，使得噬菌體顆粒展示一個拷貝的融 合蛋白或者不展示融合蛋白。親合效應(yīng)（avidity effect)相對于多價噬菌體得到了降 低，使得分選基于內(nèi)在的配體親和力，而且使用噬菌粒載體，這簡化了 DNA操作。Lowman和 Wells(1991)Methods:A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216〇
[0074] "噬菌粒"是具有細菌復(fù)制起點（例如ColEl)和一個拷貝的噬菌體基因區(qū)間的質(zhì) 粒載體。噬菌?？衫萌魏我阎删w，包括絲狀噬菌體和λ類噬菌體。質(zhì)粒一般也會包 含抗生素抗性的選擇標志?？寺∪脒@些載體的DNA區(qū)段可以像質(zhì)粒一起而擴增。在給攜 帶這些載體的細胞提供生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時，質(zhì)粒的復(fù)制模式變成滾環(huán)復(fù) 制，以生成質(zhì)粒DNA的一條鏈的拷貝，并包裝噬菌體顆粒。噬菌?？尚纬筛腥拘曰蚍歉腥拘?噬菌體顆粒。此術(shù)語包括如下的噬菌粒，它們包含與異源多肽基因連接成基因融合物的噬 菌體外殼蛋白基因或其片段，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒的表面上。
[0075] 術(shù)語"噬菌體載體"指包含異源基因且能夠復(fù)制的雙鏈復(fù)制型噬菌體。噬菌體載 體具有容許噬菌體復(fù)制和噬菌體顆粒形成的噬菌體復(fù)制起點。噬菌體優(yōu)選是絲狀噬菌體， 諸如組3汀1、^、？丨3噬菌體或其衍生物，或者是入類噬菌體，諸如入、21、(()80、981、82、 424、434等或其衍生物。
[0076] 在用于本文時，"溶劑可及位置"指源抗體或抗原結(jié)合片段重鏈和輕鏈可變區(qū)中根 據(jù)抗體或抗原結(jié)合片段的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)系綜（ensemble)和/或建模結(jié)構(gòu)確定為潛在地可被溶 劑觸及和/或與分子（諸如抗體特異性抗原）接觸的氨基酸殘基位置。這些位置通常發(fā)現(xiàn) 于CDR中和蛋白質(zhì)外部上。如本文所定義的抗體或抗原結(jié)合片段的溶劑可及位置可使用本 領(lǐng)域已知的多種算法之任一種來確定。優(yōu)選的是，溶劑可及位置是使用來自抗體三維模型 的坐標而確定的，優(yōu)選使用計算法程序，諸如InsightII程序（Accelrys, San Diego, CA)。 溶劑可及位置還可以使用本領(lǐng)域已知的算法來確定（例如Lee和Richards (1971) J. Mol. Biol. 55, 379 及 Connolly(1983) J. Appl. Cryst. 16, 548)。溶劑可及位置的確定可使用適 于蛋白質(zhì)建模的軟件和自抗體得到的三維結(jié)構(gòu)信息來進行。可用于這些目的的軟件包括 SYBYL Biopolymer Module 軟件（Tripos Associates)。一般和優(yōu)選的是，若算法（程序） 要求用戶輸入大小參數(shù)，計算中所使用的探針的"大小"設(shè)為半徑大約1. 4埃或更小。另外， Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4) :377-386記載了使用供個人計算機用的軟件確定溶劑可 及區(qū)域和面積的方法。
[0077] II.詳述
[0078] 補體在身體的防御中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，而且與免疫系統(tǒng)的其它成分一起保護 個體免于病原體侵入身體。然而，如果沒有受到正確的活化或控制，那么補體也能引起對宿 主組織的損傷。補體的不當活化涉及多種疾病（稱作補體相關(guān)疾病或病癥，諸如免疫復(fù)合 物和自身免疫性疾病）和多種炎癥狀況（包括補體介導(dǎo)的炎性組織損傷）的發(fā)病機理。各 種補體相關(guān)疾病的病理有所不同，而且可涉及時間或長或短的補體活化，整個級聯(lián)、只有級 聯(lián)之一（例如經(jīng)典途徑或旁路途徑）、只有級聯(lián)的一些成分、等的活化。在有些疾病中，補 體片段的補體生物學(xué)活性導(dǎo)致組織損傷和疾病。因而，補體的抑制劑具有高度的治療潛力。 旁路途徑的選擇性抑制劑會是特別有用的，因為經(jīng)由經(jīng)典路徑自血液中清除病原體和其它 生物體會保持完整。
[0079] 本發(fā)明的因子D拮抗劑對于補體相關(guān)眼疾（病理牽涉補體（包括經(jīng)典途徑和旁路 途徑，特別是補體旁路途徑）的所有眼疾和眼病）的預(yù)防和治療是有用的，諸如例如黃斑 變性性疾病，諸如所有階段的年齡相關(guān)黃斑變性（AMD)(包括干性和濕性（非滲出性和滲 出性）形式），脈絡(luò)膜新血管形成（CNV)，葡萄膜炎，糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變， 眼內(nèi)炎，和其它眼內(nèi)新血管疾病，諸如糖尿病性黃斑水腫，病理性近視，von Hippel-Lindau 病，眼的組織胞漿菌病，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞（CRVO)，角膜新血管形成，和視網(wǎng)膜新血管形 成。一組優(yōu)選的補體相關(guān)眼疾包括年齡相關(guān)黃斑變性（AMD)(包括非滲出性（濕性）和滲 出性（干性或萎縮性）AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成（CNV)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變（DR)、和眼內(nèi) 炎。
[0080] AMD，即年齡相關(guān)黃斑變性，是60歲以上個體中不可逆的視功能障礙的首要原因。 有兩類AMD，即非滲出性（干性）和滲出性（濕性）AMD。干性或滲出性形式涉及中央視網(wǎng)膜 (黃斑）下面的視網(wǎng)膜色素上皮（RPE)的萎縮性和肥大性變化，以及RPE上的沉積物（玻璃 疣）。非滲出性AMD患者可發(fā)展成濕性或滲出性AMD，其中稱作脈絡(luò)膜新血管膜（CNVM)的 異常血管在視網(wǎng)膜下面形成，滲漏液體和血液，并最終在視網(wǎng)膜中和在視網(wǎng)膜下引起失明 性盤狀瘢痕。非滲出性AMD(通常是滲出性AMD的前身）更加常見。非滲出性AMD的表現(xiàn) 有所不同；可存在硬玻璃疣、軟玻璃疣、RPE地理性萎縮、和色素聚團。補體成分在AMD早期 在RPE上沉積，而且是玻璃疣的主要組分。
[0081] 本發(fā)明具體關(guān)注高危（high risk) AMD的治療，包括第3類和第4類AMD。第3類 AMD的特征在于雙眼都不存在晚期AMD，至少一只眼具有20/32或更好的視力及至少一粒大 的玻璃疣（例如125um)、廣泛的（通過玻璃疣面積來測量）中間體玻璃疣、或不牽涉黃斑中 心的地理性萎縮（GA)、或這些的任意組合。第3類AMD (仍視為"干性" AMD)有高風險轉(zhuǎn)化 成脈絡(luò)膜新血管形成（CNV)。
[0082] 第4類高危AMD (分類為"濕性"AMD)的特征在于視力為20/32或更好及指標眼中 沒有晚期AMD (牽涉黃斑中心的GA或脈絡(luò)膜新血管形成的特征）。對側(cè)眼的特征在于晚期 AMD，或視力低于20/32，這可歸于AMD黃斑病變。典型的是，如果不治療的話，高危AMD迅速 進展成脈絡(luò)膜新血管形成（CNV)，其速率比第1類或第2類（非高危）AMD的進展速率高大 約10-30倍。
[0083] 因子D拮抗劑特別可用于預(yù)防AMD (特別是第3類或第4類AMD)進展成CNV，和/ 或在未受影響的或受影響較小的對側(cè)眼中預(yù)防AMD或CNV的發(fā)生/進展。在此語境中，術(shù) 語"預(yù)防"以最廣義使用，包括完全或部分阻斷和減緩疾病的進展，以及延遲疾病更嚴重形 式的發(fā)作。處于發(fā)生或進展成高危（第4類）AMD或CMV高風險的患者尤其受益于本發(fā)明 的這個方面。
[0084] 已知補體因子H(CFH)多態(tài)性與個體發(fā)生AMD和/或CNV的風險有關(guān)。CFH中 的突變能活化補體，繼而可導(dǎo)致AMD/CNV。最近有報告，補體因子H(CFH)多態(tài)性占到AMD 可歸因風險的 50 % (Klein et al·，Science 308:385-9(2005))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CFH 中的 一種常見單體型（HF1/CFH)使個體易患年齡相關(guān)黃斑變性（Hageman，Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 102(2) :7227-7232(2005))。已經(jīng)將AMD分離成常染色體顯性性狀，疾病基因 座定位至染色體Iq25_q31，在標志物D1S466與D1S413之間，最大優(yōu)勢對數(shù)計分為約 3. 20 (Klein et al.,Arch Opthalmol. 116 (8) : 1082-9 (1998) ；Majewski et a I. , Am. J. Hum. Genet. 73 (3) : 540-50 (2003) ；Seddon et al. , Am. J. Hum. Genet. 73 (4) : 780-90 (2003)； Weeks et al. , Am. J. Ophthalmol. 132 (5) : 682-92 (2001) ；Iyengar et al. , Am. J. Hum. Genet. 74(1) :20-39(2004));染色體 2q3/2q32,在標志物 D12S1391 與 D2S1384 之間，最大 優(yōu)勢對數(shù)計分為 2.32/2.03(56(1(1〇116七31.，8即四）；3口13，在標志物01251300與01251763 之間，最大優(yōu)勢對數(shù)計分為 2. 19(Majewskietal. ,supra ;Schicketal. ,Am. J. Hum-Genet. 72(6) : 1412-24(2003)) ;6ql4, 在標志物 D6S1056 與 DS249 之間，最大優(yōu)勢對數(shù)計 分為 3. 59/3. 17 (Kniazeva et al·，Am. J. Ophthlmol. 130(2):197-202(2000)) ;9q33，在 標志物D9S934處，最大優(yōu)勢對數(shù)計分為2. 06(Mejwski et al.，supra) ;10q26,在標志物 D10S1230 處，最大優(yōu)勢對數(shù)計分為3. 06(Majewski et al·，supra ;Iyengar et al·，supra; Kenealy et al·，Mol. Vis. 10:57-61 (2004)) ;17q25,在標志物D17S928處，最大優(yōu)勢對數(shù)計 分為3. 16 (Weeks et al.，supra);和22ql2,在標志物D22S1045處，最大優(yōu)勢對數(shù)計分為 2.0 (Seddon et al.，supra)。因而，遺傳篩選是鑒定對于預(yù)防性處理（包括預(yù)防疾病進展 成更嚴重的形式，諸如從AMD進展成CNV)而言是特別好的候選者的患者的一個重要部分。
[0085] 1.抗閔子D抗體
[0086] 本發(fā)明包括抗因子D抗體的生產(chǎn)和應(yīng)用。產(chǎn)生抗體的示例性方法在以下章節(jié)中有 更詳細的描述。
[0087] 用衍生自哺乳動物物種的因子D抗原選出抗因子D抗體?？乖瓋?yōu)選是人因子D。 然而，來自其它物種的因子D，諸如鼠因子D，也可用作靶抗原。來自各種哺乳動物物種的因 子D抗原可分離自天然來源。在其它實施方案中，抗原是重組生產(chǎn)的或者是利用本領(lǐng)域已 知的其它合成方法而制備的。
[0088] 所選的抗體通常會具有足夠強的針對因子D抗原的結(jié)合親和力。例如，抗體結(jié)合 人因子D的Kd值可不超過約5nM，優(yōu)選不超過約2nM，而更優(yōu)選不超過約500pM。例如，抗體 親和力可由基于表面等離振子共振的測定法（如實施例所述的BIAcore測定法）；酶聯(lián)免 疫吸附測定法（ELISA);和競爭測定法（如RIA的）來測定。
[0089] 而且，抗體可進行其它生物學(xué)活性測定法，如，用以評估其作為治療劑的有效性。 此類測定法是本領(lǐng)域已知的，而且依賴于靶抗原和抗體的預(yù)定用途。實例包括HUVEC抑 制測定法（如下文實施例所述的）；腫瘤細胞生長抑制測定法（如例如W089/06692所述 的）；抗體依賴性細胞的細胞毒性（ADCC)和補體介導(dǎo)的細胞毒性（CDC)測定法（美國專利 5, 500, 362);及下文關(guān)于鑒定因子D拮抗劑描述的體外和體內(nèi)測定法。
[0090] 為了篩選結(jié)合感興趣抗原上的特定表位的抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷測定法， 諸如如 Antibodis, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow 和David Lane (1988)所述的。另外，可進行表位作圖，例如如Champe等（1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394所述的，來確定抗體是否結(jié)合感興趣表位。
[0091] 在一個優(yōu)選的實施方案中，利用獨特的噬菌體展示法來選擇抗因子D抗體。該方 法包括產(chǎn)生基于單個框架模板的合成抗體噬菌體文庫，設(shè)計可變域內(nèi)的足夠的多樣性，展 示具有多樣化可變域的多肽，選擇對靶因子D抗原具有高親和力的候選抗體，和分離所選 的抗體。
[0092] 噬菌體展示方法的詳情可在例如2003年12月11日公布的W003/102157中找到。
[0093] 在一個方面，抗體文庫可通過在抗體可變域的至少一個⑶R中突變?nèi)軇┛杉暗暮?/或高度多變的位置來產(chǎn)生。一些或所有⑶R可用本文提供的方法來突變。在一些實施方 案中，優(yōu)選突變⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3中的位置以形成單個文庫或突變⑶RL3和⑶RH3中 的位置以形成單個文庫或突變⑶RL3和⑶RHl、⑶RH2和⑶RH3中的位置以形成單個文庫， 由此產(chǎn)生多樣的抗體文庫。
[0094] 例如，可產(chǎn)生這樣的抗體可變域文庫，其在⑶RHl、⑶RH2和⑶RH3中溶劑可及的和 /或高度多變的位置上有突變?？僧a(chǎn)生這樣的另一種文庫，其在⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3中 有突變。這些文庫也可互相結(jié)合使用以產(chǎn)生具有期望親和力的結(jié)合物。例如，在對重鏈文 庫進行一輪或多輪對靶抗原結(jié)合的選擇后，可將輕鏈文庫替換入重鏈結(jié)合物群中，用以在 其它輪次的選擇中提高結(jié)合物的親和力。
[0095] 文庫優(yōu)選通過用重鏈序列可變區(qū)CDRH3區(qū)中的變異氨基酸替代原始氨基酸來產(chǎn) 生。所得文庫可包含多種抗體序列，其中序列多樣性主要位于重鏈序列的⑶RH3區(qū)中。
[0096] 在一個方面，文庫在人源化抗體4D5序列、或人源化抗體4D5序列的框架氨基酸序 列的背景中產(chǎn)生。文庫優(yōu)選通過用DVK密碼子集編碼的氨基酸至少替代重鏈殘基95-100a 來產(chǎn)生，其中DVK密碼子集用于編碼這些位置中每一個位置的變異氨基酸集?？捎糜诋a(chǎn)生 這些替代的寡核苷酸集的一個例子包含序列（DVK) 7。在一些實施方案中，文庫通過用DVK 和NNK兩種密碼子集編碼的氨基酸替代殘基95-100a來產(chǎn)生?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核 苷酸集的一個例子包含序列（DVK) 6 (NNK)。在另一個實施方案中，文庫通過用DVK和NNK兩 種密碼子集編碼的氨基酸替代殘基95-100a來產(chǎn)生?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的 一個例子包含序列（DVK) 5(NNK)15可用于產(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的另一個例子包含序 列（NNK)6。根據(jù)本文所述標準，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定合適寡核苷酸序列的其它例子。
[0097] 在另一個實施方案中，利用不同的CDRH3設(shè)計來分離高親和力結(jié)合物和分離針對 各種表位的結(jié)合物。該文庫中產(chǎn)生的CDRH3的長度范圍是11至13個氨基酸，盡管也可產(chǎn) 生不同于此的長度。通過使用NNK、DVK和NVK密碼子集能拓展H3多樣性，以及在N和/或 C-末端處的更有限的多樣性。
[0098] ⑶RHl和⑶RH2中也可產(chǎn)生多樣性。⑶R-Hl和H2多樣性的設(shè)計遵循目標為模擬 所述帶有如下修飾的天然抗體全集的策略，所述修飾使多樣性較前述設(shè)計更緊密地與天然 多樣性相匹配。
[0099] 對于CDRH3中的樣性，可分開構(gòu)建多個文庫，它們具有不同長度的H3,然后組合起 來以選擇針對靶抗原的結(jié)合物。合并多個文庫并用前述和本文下述的固體支持物選擇和溶 液分選法來選擇?？刹捎枚喾N分選策略。例如，一種變化涉及在結(jié)合至固相的靶物上分選， 接著分選可能在融合多肽上存在的標簽（例如抗gD標簽），接著再一次在結(jié)合至固相的靶 物上分選?；蛘撸膸炜墒紫仍诮Y(jié)合至固相表面的靶物上選擇，然后用靶抗原濃度逐漸減低 的溶液相結(jié)合來分選所洗脫的結(jié)合物。利用不同分選方法的組合能實現(xiàn)最低限度地只選擇 1?度表達的序列并能實現(xiàn)選擇許多不同的1?未和力克隆。
[0100] 針對靶因子D抗原的高親和力結(jié)合物可自文庫分離。限制H1/H2區(qū)中的多樣性將 簡并性降低約IO4至IO5倍，而且允許更多H3多樣性能得到更多高親和力結(jié)合物。利用在 CDRH3中具有不同類型多樣性（例如利用DVK或NVT)的文庫能實現(xiàn)分離可與靶抗原的不同 表位結(jié)合的結(jié)合物。
[0101] 在另一個實施方案中，產(chǎn)生在⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3區(qū)中具有多樣性的一個或多 個文庫。在該實施方案中，用各種長度的H3區(qū)并主要用密碼子集XYZ和NNK或NNS來產(chǎn)生 CDRH3中的多樣性。用各寡核苷酸形成文庫并合并，或者合并寡核苷酸來形成文庫子集。該 實施方案的文庫可針對結(jié)合至固相的靶物進行分選。分離自多次分選的克隆可利用ELISA 測定法來篩選特異性和親和力。對于特異性，克隆可以針對期望靶抗原以及其它非靶抗原 進行篩選。然后，在溶液結(jié)合競爭ELISA測定法或點競爭測定法中對那些針對靶因子D抗原 的結(jié)合物篩選親和力。可以用如上所述制備的XYZ密碼子集自文庫分離高親和力結(jié)合物。 可容易地在細胞培養(yǎng)中以高產(chǎn)率將這些結(jié)合物制備成抗體或抗原結(jié)合片段。
[0102] 在一些實施方案中，可能希望產(chǎn)生在⑶RH3區(qū)長度方面具有更大多樣性的文庫。 例如，可能希望產(chǎn)生⑶RH3區(qū)的范圍為約7至19個氨基酸的文庫。
[0103] 自這些實施方案的文庫分離的高親和力結(jié)合物可容易地在細菌和真核細胞培養(yǎng) 中以高產(chǎn)率產(chǎn)生?？稍O(shè)計載體以容易地去除如下序列諸如gD標簽、病毒外殼蛋白成分序 列，和/或添加恒定區(qū)序列來實現(xiàn)高產(chǎn)率地產(chǎn)生全長抗體或抗原結(jié)合片段。
[0104] 可以將⑶RH3中有突變的文庫與包含變異型式的其它⑶R(例如⑶RL1、⑶RL2、 ⑶RL3、⑶RHl和/或⑶RH2)的文庫組合。如此，例如，在一個實施方案中，將⑶RH3文庫與 ⑶RL3文庫組合，所述⑶RL3文庫用預(yù)先確定的密碼子集在第28、29、30、31、和/或32位有 變異氨基酸的人源化4D5抗體序列的背景中產(chǎn)生。在另一個實施方案中，將CDRH3有突變 的文庫與包含變異⑶RHl和/或⑶RH2重鏈可變域的文庫組合。在一個實施方案中，⑶RHl 文庫用第28、30、31、32和33位有變異氨基酸的人源化抗體4D5序列產(chǎn)生。⑶RH2文庫可用 預(yù)先確定的密碼子集用第50、52、53、54、56和58位有變異氨基酸的人源化抗體4D5序列產(chǎn) 生。
[0105] 可進一步修飾自噬菌體文庫產(chǎn)生的抗因子D抗體以產(chǎn)生抗體突變體，所述突變體 具有比親本抗體改善了的物理、化學(xué)和/或生物學(xué)特性。若所使用的測定法是生物學(xué)活性 測定法，則優(yōu)選抗體突變體在所選測定法中的生物學(xué)活性比親本抗體在該測定法中的生物 學(xué)活性好至少約10倍，優(yōu)選好至少約20倍，更優(yōu)選好至少約50倍，有時好至少約100倍或 200倍。例如，優(yōu)選抗因子D抗體突變體針對因子D的結(jié)合親和力比親本抗因子D抗體（諸 如圖5中所顯示的任何抗體，特別是抗體20D12)的結(jié)合親和力強至少約10倍，優(yōu)選強至少 約20倍，更優(yōu)選強至少約50倍，有時強至少約100倍或200倍。
[0106] 為了產(chǎn)生抗體突變體，將一處或多處氨基酸改變（例如替代）引入親本抗體的 一個或多個高變區(qū)?；蛘?另外，可將框架區(qū)殘基的一處或多處改變（例如替代）引入 親本抗體，這些改變導(dǎo)致抗體突變體針對來自第二哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力有 所改善。要修飾的框架區(qū)殘基的實例包括那些直接非共價結(jié)合抗原的（Amit等（1986) Science 233:747-753);與 CDR 相互作用的 / 影響 CDR 構(gòu)象的（Chothia 等（1987) J.Mol. Biol. 196:901-917);和/或參與\-VH界面的（EP 239400B1)。在某些實施方案中，對一個 或多個此類框架區(qū)殘基的修飾導(dǎo)致抗體針對來自第二哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力 有所增強。例如，在本發(fā)明的該實施方案中，可改變約1個至約5個框架殘基。有時，這可 足以產(chǎn)生適合在臨床前試驗中使用的抗體突變體，甚至其中沒有高變區(qū)殘基被改變。然而， 通常，抗體突變體會包含別的高變區(qū)改變。
[0107] 所改變的高變區(qū)殘基可以是隨機改變的，尤其是在親本抗體的起始結(jié)合親和力使 得此類隨機產(chǎn)生的抗體突變體能被容易地篩選出來的情況中。
[0108] 用于生成此類抗體突變體的一種有用方法稱作"丙氨酸掃描誘變"（Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081-1085)。這里，一個或多個高變區(qū)殘基用丙氨酸或多丙 氨酸殘基替代，以影響氨基酸與來自第二哺乳動物物種的抗原的相互作用。然后通過在或 對替代位點引入更多或其它突變，推敲那些對替代展現(xiàn)出功能敏感性的高變區(qū)殘基。如此， 雖然引入氨基酸序列變異的位點是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。如 本文所述對如此生成的丙氨酸突變體篩選它們的生物學(xué)活性。
[0109] 通常，從保守替代諸如下文顯示在標題"優(yōu)選替代"下的那些開始。如果此類替代 導(dǎo)致生物學(xué)活性（例如結(jié)合親和力）的改變，那么可以引入下表中稱為"例示替代"的更實 質(zhì)性改變，或如下文中關(guān)于氨基酸種類的進一步描述，并篩選產(chǎn)物。下表中列出了優(yōu)選的替 代。
[0110]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于預(yù)防或治療補體相關(guān)眼疾的方法，包括給有需要的受試者施用有效量的因 子D拮抗劑。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述受試者是人。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述因子D拮抗劑選自下組：抗因子D抗體及其片段、結(jié)合 性多肽、肽、和非肽小分子。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述因子D拮抗劑是抗體或抗體片段。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體結(jié)合因子D的活性位點。
7. 權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體結(jié)合包含因子D活性位點殘基的表位。
8. 權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體選自下組：抗體20D12、31A9、25A1和32H12,及其 變體。
9. 權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體本質(zhì)上與抗體20D12結(jié)合相同表位。
10. 權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體包含抗體20D12的重鏈和/或輕鏈CDR序列（SEQ ID NO : 1 和 2)。
11. 權(quán)利要求5的方法，其是人的、人源化的或嵌合的抗體。
12. 權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體片段選自下組：Fab、Fab'、F(ab'）2、scFv、 (scFv)2、dAb、互補決定區(qū)（CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體、雙抗體、和自抗 體片段形成的多特異性抗體。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體片段是Fab、Fab'、F(ab'）2、scFv、或（scFv)2片 段。
14. 權(quán)利要求3的方法，其中所述補體相關(guān)眼疾選自下組：年齡相關(guān)黃斑變性（AMD)、脈 絡(luò)膜新血管形成（CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變、糖尿 病性黃斑水腫、病理性近視、vonHippel-Lindau病、眼的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻 塞（CRV0)、角膜新血管形成、和視網(wǎng)膜新血管形成。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述AMD是干性AMD。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中所述AMD是濕性AMD。
17. -種試劑盒，其包含因子D拮抗劑和關(guān)于施用所述拮抗劑來治療補體相關(guān)眼疾的 指令。
18. 權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述補體相關(guān)眼疾選自下組：年齡相關(guān)黃斑變性 (AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成（CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病 變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、vonHippe 1-Lindau病、眼的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央 靜脈阻塞（CRV0)、角膜新血管形成、和視網(wǎng)膜新血管形成。
19. 權(quán)利要求18的試劑盒，其中所述補體相關(guān)眼疾是AMD或CNV。
20. 因子D拮抗劑在制備用于治療補體相關(guān)眼疾的藥物中的用途。
21. 因子D拮抗劑，其用于補體相關(guān)眼疾的治療。
【文檔編號】A61P9/10GK104367999SQ201410486706
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2008年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2007年5月23日
【發(fā)明者】菲利普.哈斯, 殷建平, 小肯尼思.卡奇克, 邁卡.斯蒂費克, 克里斯琴.威斯曼, 門諾.范盧克倫坎佩吉 申請人:健泰科生物技術(shù)公司