具有治療老年性癡呆及改善學(xué)習(xí)記憶新用途的14肽化合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于治療老年性癡呆及改善學(xué)習(xí)記憶的14肽，其氨基酸序列為：Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Thr-Ser-Ser-Leu-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ser。該14肽可以通過化學(xué)合成的方法合成，也可以將14肽序列推導(dǎo)成核苷酸序列，然后克隆到表達(dá)載體中進(jìn)行生物合成。通過14肽對(duì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO及NOS的影響試驗(yàn)及14肽對(duì)Aβ所致大鼠老年性癡呆的治療作用的試驗(yàn)的結(jié)果本發(fā)明的14肽用于治療老年性癡呆的活性顯著。14肽對(duì)東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用試驗(yàn)結(jié)果表明14肽用于改善學(xué)習(xí)記憶作用明顯。
【專利說明】具有治療老年性癡呆及改善學(xué)習(xí)記憶新用途的14肽化合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種全合成的14肽，以及該14肽為活性成分在制備治療老年性癡呆與改善學(xué)習(xí)記憶的藥品及保健食品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]老年性癡呆又稱阿爾茨海默病，臨床表現(xiàn)以進(jìn)行性認(rèn)知障礙，智力衰退和人格改變?yōu)樘卣?。流行病學(xué)調(diào)查顯示，AD患病率占老年人的7%-8%左右，患病率成逐年上升趨勢(shì)。目前該病列死亡原因第4位，成為當(dāng)年老年醫(yī)學(xué)所面臨的最為嚴(yán)峻的問題之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，目前，我國(guó)約有老年性癡呆患者600萬人，占世界總病例的四分之一，并且每年平均還有30萬的新增病例。老年性癡呆已嚴(yán)重危及老年人的健康，并且給患者、家庭和社會(huì)帶來了巨大的精神和經(jīng)濟(jì)壓力。
[0003]對(duì)于記憶力減退的癥狀常表現(xiàn)為做事丟三落四，注意力分散，不能集中，常伴有頭疼、頭暈、心悸、健忘、多夢(mèng)等。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其因多由五志過極，勞逸失調(diào)，素質(zhì)不強(qiáng)或病后體虛，飲食不節(jié)所引發(fā)，上述癥狀屬于病癥，目前，該病無明顯治療藥物，雖有些安神、醒腦、鎮(zhèn)靜的藥物具有一定緩解病癥的作用，但療效并不顯著，影響著人們正常生活。
[0004]近年來，國(guó)外對(duì)肽類作為增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力活性成分的研究有一定的進(jìn)展。2010 年 Matharu B.等人(Peptides, 2010, 31,1866-1872 頁)發(fā)現(xiàn)一種妝(retro-1nverspeptides)可作為治療由β _淀粉樣蛋白引起的老年癡呆的藥物。Gozes 1.等人(Neurobiology of Aging, 2000, 21,169頁)選用一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的肽的片段(NAP)，通過鼻內(nèi)途徑給藥的方式治療AD。結(jié)果顯示，用膽堿能阻斷劑ethylcholineaziridium(AF64A)處理過的小鼠，經(jīng)鼻吸入NAP，可顯著提高空間學(xué)習(xí)記憶(水迷宮)能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，該物質(zhì)可通過血腦屏障。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NAP增加cGMP和一氧化氮產(chǎn)物的同時(shí)具有抗氧化作用。其結(jié)果表明，NAP可以作為治療阿爾茨海默病藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物。SnowA.D.等人(Alzheimer，s and Dementia, 2008, 4(4),463-464 頁)在轉(zhuǎn)基因鼠模型中發(fā)現(xiàn)一種新型可改善阿爾茨海默病情的小肽(DP-74)，這種肽具有可穿過血腦屏障降低腦淀粉樣蛋白沉積以及增強(qiáng)APP轉(zhuǎn)基因小鼠記憶的作用，揭示了新型小肽對(duì)AD和其相關(guān)異常疾病的治療與預(yù)防方面的發(fā)展提供了新的希望。Kita Y.等人(Neuropeptides,2006, 40(6)，434頁)發(fā)現(xiàn)一種新型的神經(jīng)保護(hù)性肽Colivelin，它可保護(hù)神經(jīng)免受AD相關(guān)損傷及 Αβ 引起的死亡。Windisch Μ.等人(Alzheimer，s and Dementia, 2006, 2(3),643頁)研究發(fā)現(xiàn)，β-突觸核蛋白衍生的小肽在慢性的和急性的神經(jīng)退行性病變的組織培養(yǎng)中表現(xiàn)出顯著地神經(jīng)保護(hù)作用。此小肽同樣在AD的動(dòng)物模型中進(jìn)行了研究，包括對(duì)認(rèn)知功能的影響和同樣的減少淀粉樣蛋白的相關(guān)病理學(xué)改變，結(jié)果顯示突觸核蛋白衍生肽可能成為不同神經(jīng)退行性病變有效治療策略發(fā)展的基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明通過全合成方法得到了此14肽，細(xì)胞水平與動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明具有較強(qiáng)治療老年性癡呆以及改善學(xué)習(xí)記憶能力的活性作用，因此該14肽可能成為良好的治療老年性癡呆及改善學(xué)習(xí)記憶的藥品及保健食品活性成分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供了一種14肽具有治療老年性癡呆的活性。具體的說是14肽用于治療老年性癡呆的新用途。14肽對(duì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO及NOS的影響試驗(yàn)表明能夠明顯抑制Αβ 25_35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞NO含量增加及NOS活性，提示14肽對(duì)Αβ 25_35致SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷具有較好的保護(hù)作用。大鼠Αβ所致老年性癡呆的試驗(yàn)結(jié)果表明14肽具有改善大鼠老年癡呆作用，且能恢復(fù)到正常大鼠水平。細(xì)胞水平和大鼠整體試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的14肽具有較強(qiáng)的治療老年性癡呆的活性作用。
[0007]本發(fā)明的目的之二是提供了一種14肽具有改善學(xué)習(xí)記憶的活性。具體的說是14肽用于改善學(xué)習(xí)記憶的新用途。東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙試驗(yàn)表明14肽對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用。
[0008]在本發(fā)明之前，尚未見14肽(氨基酸序列為=Lys-Ser-Leu-Thr- Leu-Thr-Ser-Ser-Leu-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ser)在治療老年癡呆及改善學(xué)習(xí)記憶的藥
品及保健食品中的應(yīng)用的報(bào)道。
[0009]本發(fā)明的14肽，是通過以下的方法來制備的:
(1)將0.1 mmol Tenta Gel Amide樹脂放入反應(yīng)器中，加入二氯甲燒溶脹半小時(shí),然后抽掉二氯甲烷，加入序列中第一個(gè)氨基被9-芴甲氧羰基保護(hù)的絲氨酸0.2 mmol, 二異丙基乙胺0.2 mmol，適量的二甲基甲酰胺和二氯甲烷，此處適量是指以可使樹脂充分鼓動(dòng)起來為宜，用氮?dú)夤呐莘磻?yīng)60 min,然后加入約I mmol當(dāng)量甲醇，反應(yīng)半小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，用二甲基甲酰胺、甲醇洗凈；
(2)加入適量20%哌啶和80 % 二甲基甲酰胺去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，露出氨基，洗凈，茚三酮檢測(cè)；
(3)往反應(yīng)器中加入序列中第二個(gè)氨基酸天冬氨酸Immol，0.2 mmol N, N’-二異丙基碳二亞胺及1-羥基苯并三唑，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)半小時(shí)，抽掉液體，用二甲基甲酰胺、甲醇洗凈，茚三酮檢測(cè)；
(4)依步驟1.2,1.3的方式依次加入序列中氨基酸.抽掉液體，用二甲基甲酰胺洗凈，茚三酮檢測(cè)；
(5)將樹脂用氮?dú)獯蹈珊?，從反?yīng)柱中取下并稱取重量，倒入燒瓶中，然后往燒瓶中加一定量的95 %三氟乙酸切割液，震蕩反應(yīng)2小時(shí)；
(6)濾掉樹脂，得到濾液，然后向?yàn)V液中加入大量乙醚，析出粗產(chǎn)物，然后離心，清洗即可得到該序列的粗產(chǎn)物；
(7)分析提純和質(zhì)譜檢測(cè):用電噴霧電離離子源質(zhì)譜儀檢測(cè)該序列分子量的正確性，用凝膠色譜將粗品提純至要求純度；
(8)收集純化好的目標(biāo)多肽溶液放入凍干機(jī)中進(jìn)行濃縮，凍干成白色粉末，收率為
85%。
[0010]本發(fā)明的14肽，除通過上述的化學(xué)方法合成外，也可以將14肽序列推導(dǎo)成核苷酸序列，然后克隆到表達(dá)載體中進(jìn)行生物合成。
[0011]本發(fā)明的14肽，可以根據(jù)需求與其他載體共同制成藥物制劑，這些載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑、香味劑、甜味劑。藥物制劑可以是硬膠囊、軟膠囊、片劑、顆粒劑、散劑、丸劑、袋泡茶、口服液、液體飲料、注射劑中的一種或多種。
[0012]I本發(fā)明的14肽具有治療老年性癡呆及改善學(xué)習(xí)與記憶的用途，是通過以下活性試驗(yàn)得到證實(shí)。
[0013]一、本發(fā)明14肽對(duì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO及NOS的影響 1.實(shí)驗(yàn)方法
本發(fā)明實(shí)例中SH-SY5Y細(xì)胞獲得自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。
[0014]1.1細(xì)胞培養(yǎng)
人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37°C飽和濕度5% C02培養(yǎng)。每周更換培養(yǎng)基2~3次，0.125%胰蛋白酶工作液消化分散細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0015]1.2八運(yùn)25_35老化實(shí)驗(yàn)
將A β 25_35用超純水配制成濃度為500 μ mol/L的溶液，在37°C培養(yǎng)箱中放置7天老化，分裝至EP管中，-20 V保存?zhèn)溆谩?br> 1.3 A β 25_35致SH-SY5Y細(xì)胞損傷濃度的測(cè)定
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1.0Χ105的濃度接種至96孔板，每孔100 μ L，培養(yǎng)24小時(shí)，對(duì)照孔加入培養(yǎng)液100 yL，樣品孔加入Αβ25_35使終濃度為10、20、40、80Mmol/L，每個(gè)濃度設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24小時(shí)，吸取上清，按照試劑盒操作步驟測(cè)定NO、NOS0
[0016]1.4細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、NOS的測(cè)定
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，胰酶消化后稀釋成I X IO5細(xì)胞/mL，接種于96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，對(duì)照孔加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液120 PL，模型孔加入Αβ 25_35(終濃度為20 Mmol/L)，樣品孔分別加入不含血清的培養(yǎng)液配制的 14 肽(終濃度為 12.5、25、50、100、200、400 Pg/mL)及 A β 25_35 (終濃度為 20 Mmol/L),置培養(yǎng)箱中孵育，分別在24、48小時(shí)吸取上清，按照試劑盒操作步驟測(cè)定NO、NOS0
[0017]1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
所列數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(—X 土s)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用組間t-檢驗(yàn)。
[0018]2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 A β 25_35致SH-SY5Y細(xì)胞損傷濃度的確定
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表1)，隨著Αβ25_35濃度的升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量及NOS活性增強(qiáng)，Αβ 25_35 2 0 Mmol/L與SH-SY5Y細(xì)胞共同孵育24小時(shí)，細(xì)胞上清中NO含量已經(jīng)具有極顯著性差異0°〈0.001)，NOS活性與對(duì)照組比較雖沒有顯著性差異，也已經(jīng)有明顯升高，因此選定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中模型藥物Αβ 25_35終濃度為20 Mmol/L。
[0019]表1不同濃度A β25_35作用下細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量及NOS活性G 土 s，n=3)
【權(quán)利要求】
1.一種14肽在制備治療老年性癡呆的藥品、保健食品中的應(yīng)用。
2.—種14肽在制備改善學(xué)習(xí)記憶的藥品、保健食品中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的14肽的氨基酸序列為=Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Thr-Ser-Ser-Leu-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ser0
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的14肽的制備方法為: (1)將0.1 mmol Tenta Gel Amide樹脂放入反應(yīng)器中，加入二氯甲燒溶脹半小時(shí),然后抽掉二氯甲烷，加入序列中第一個(gè)氨基被9-芴甲氧羰基保護(hù)的絲氨酸0.2 mmol，二異丙基乙胺0.2 mmol，適量的二甲基甲酰胺和二氯甲烷，此處適量是指以可使樹脂充分鼓動(dòng)起來為宜，用氮?dú)夤呐莘磻?yīng)60 min,然后加入約I mmol當(dāng)量甲醇，反應(yīng)半小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，用二甲基甲酰胺、甲醇洗凈； (2)加入適量20%哌啶和80 % 二甲基甲酰胺去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，露出氨基，洗凈，茚三酮檢測(cè)； (3)往反應(yīng)器中加入序列中第二個(gè)氨基酸天冬氨酸Immol，0.2 mmol N, N’-二異丙基碳二亞胺及1-羥基苯并三唑，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)半小時(shí)，抽掉液體，用二甲基甲酰胺、甲醇洗凈，茚三酮檢測(cè)； (4)依步驟1.2,1.3的方式依次加入序列中氨基酸.抽掉液體，用二甲基甲酰胺洗凈，茚三酮檢測(cè)； (5)將樹脂用氮?dú)獯蹈珊?，從反?yīng)柱中取下并稱取重量，倒入燒瓶中，然后往燒瓶中加一定量的95 %三氟乙酸切割液，震蕩反應(yīng)2小時(shí)； (6)濾掉樹脂，得到濾液，然后向?yàn)V液中加入大量乙醚，析出粗產(chǎn)物，然后離心，清洗即可得到該序列的粗產(chǎn)物； (7)分析提純和質(zhì)譜檢測(cè):用電噴霧電離離子源質(zhì)譜儀檢測(cè)該序列分子量的正確性，用凝膠色譜將粗品提純至要求純度； (8)收集純化好的目標(biāo)多肽溶液放入凍干機(jī)中進(jìn)行濃縮，凍干成白色粉末，收率為85%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的用途，其特征在于含有有效治療劑量的14肽及一種或多種藥學(xué)上可接受的藥用載體，包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑、香味劑、甜味劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于:它是硬膠囊、軟膠囊、片劑、顆粒劑、散劑、丸劑、袋泡茶、口服液、液體飲料、注射劑中的一種或多種。
【文檔編號(hào)】A61K38/10GK104013953SQ201410282671
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】羅浩銘, 王穎, 陳英紅, 姜瑞芝 申請(qǐng)人:羅浩銘