一種白介素融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種白介素融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。所述白介素融合蛋白包括：(1)白介素IL-24；(2)解離素多肽CN；以及(3)位于所述白介素IL-24和所述解離素多肽CN之間的由0-20個氨基酸構(gòu)成的連接肽。本發(fā)明首次提供且制備出IL-24與CN的融合蛋白，且所述白介素融合蛋白在本發(fā)明中所述宿主細胞中以可溶形式表達；所述白介素融合蛋白與單獨的IL-24和CN相比具有更高的與腫瘤細胞的相互作用力，可顯著誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞的遷移或侵襲，且對正常細胞無毒副作用；本發(fā)明所述的白介素融合蛋白具有比白介素IL-24更顯著更優(yōu)異的抗腫瘤活性，且可用于多種腫瘤的治療。
【專利說明】一種白介素融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)和生物化學(xué)工程領(lǐng)域，更具體地涉及一種白介素融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤，又稱癌癥，已成為人類發(fā)病率和致死率最高的一種疾病，不僅嚴(yán)重地危害人類的生命健康，也給病人、家庭和社會帶來極大的痛苦和負(fù)擔(dān)。世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)顯示，2012年全球約有1400萬人確診患上癌癥，且未來20年癌癥患者人數(shù)將以每年2200萬的速度增長。由于人口增加和老齡化，死于癌癥的人數(shù)也將由每年的820萬增長至每年1300萬。
[0003]腫瘤細胞不僅可通過改變細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑逃避人體免疫殺傷和程序性細胞過程而在體內(nèi)無限增殖，還能夠通過遷移和侵襲過程在組織間發(fā)生轉(zhuǎn)移形成轉(zhuǎn)移灶，進而破壞更多的組織器官功能使癌癥患者致死。研究表明，約有90 %的癌癥病人死于癌轉(zhuǎn)移，癌轉(zhuǎn)移是造成各種腫瘤疾病致死的主要原因。
[0004]白細胞介素-24(Interleukin-24，IL-24)是一種屬于IL-10家族的新型細胞因子，具有選擇性抑制多種腫瘤細胞生長和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用，包括黑色素瘤、多形性膠質(zhì)細胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌、鼻咽癌及前列腺癌等，但對正常細胞沒有生長抑制的影響。IL-24的這一特點使其在治療腫瘤疾病方面有較大的應(yīng)用潛力，成為近年來研究的熱點。
[0005]IL-24原名為黑色素瘤分化相關(guān)基因-7 (melanomadifferentiation-association gene-7, mda_7),是由 P.B.Fisher 等用差不雜交的方法從人干擾素β和瑞香素(mezerein，MEZ)誘導(dǎo)的人類黑色素瘤細胞cDNA文庫中篩選得到的一種新型細胞因子，在正常的黑色素細胞和初期黑色素瘤細胞中均有表達，且在黑色素瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移的進展過程中表達量呈進行性降低，以致檢測不到IL-24的表達，證明具有抑制黑色素瘤增生和促進終末分化的能力。研究表明，腺病毒介導(dǎo)的IL-24在腫瘤細胞的異常表達可誘導(dǎo)多種腫瘤細胞的凋亡。這種誘導(dǎo)凋亡作用可能是通過多種信號途徑調(diào)控的。IL-24的異常表達可激活URP/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)，激活p38MAPK信號途徑，誘導(dǎo)GADD家族蛋白GADD153、GADD45 a、GADD Y和GADD34等的表達，最終導(dǎo)致細胞的凋亡。Pataeret al.研究結(jié)果顯示Ad.1L-24可激活肺癌細胞中PKR的活性，進而激活下游信號分子eIF2 a、TYK2、STAT1/STAT3及ρ38ΜΑΡΚ等的磷酸化，發(fā)揮生長抑制和誘導(dǎo)凋亡的活性。文獻報道，Ad.1L-24可誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS的累積，ROS水平的升高可負(fù)調(diào)控線粒體的功能，促進凋亡的發(fā)生。胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平的提高可促進Ca2+依賴的ROS的生成，促進自分泌信號通路，結(jié)合旁分泌信號最終導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。Bhutia et al.研究發(fā)現(xiàn)IL-24可激活GSK3 β，促進蛋白酶體對β -catenin的降解和抑制Akt的活性降低β -catenin的磷酸化,誘導(dǎo)乳腺癌干細胞的凋亡抑制其生長，但對正常乳腺干細胞的生長沒有影響。另外，有研究證明自噬作用在腫瘤細胞的存活和死亡過程中發(fā)揮重要作用。Sauane et al.研究揭示重組表達的IL-24同樣具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。
[0006]由于腫瘤細胞轉(zhuǎn)移是造成癌癥病人死亡的主要原因，開發(fā)一種既可抑制腫瘤細胞增殖又能抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的藥物顯得尤為重要。有文獻報道一種解離素多肽contortrostatin (CN)是唯一最具潛力用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥的蛇毒素提取物。
[0007]CN是從銅頭蝮蛇毒素中提取的一種同源二聚體解離素，其分子量為13.5kDa。CN的每條鏈由65個氨基酸組成，在柔性環(huán)前端具有RGD序列。CN富含半胱氨酸，每個亞基含有十個半胱氨酸，形成四對鏈內(nèi)二硫鍵橋和兩對鏈間二硫鍵橋，通過復(fù)雜的折疊過程形成穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)。CN可通過二聚體外側(cè)暴露的兩個RGD序列與腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞的高親和力相互作用，抑制腫瘤細胞的粘附和轉(zhuǎn)移與抑制腫瘤誘導(dǎo)的血管生成。因此，將CN應(yīng)用于高效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移具有很大潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種白介素融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中對既可抑制腫瘤細胞增殖又能抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的藥物的缺乏。
[0009]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0010]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種白介素融合蛋白，所述白介素融合蛋白包括: (I)白介素IL-24 ;以及⑵解離素多肽CN。該白介素融合蛋白可以用IL-24-CN進行表示。
[0011]優(yōu)選地，所述白介素融合蛋白IL-24-CN還包括:(3)位于所述白介素IL-24和所述解離素多肽CN之間的由1-20個，較佳的為1-15個，更佳的為1-10個，最佳的為1_4個(如2-3個)氨基酸構(gòu)成的連接肽。
[0012]所述白介素融合蛋白IL-24-CN基本上由⑴、(3)、⑵或⑵、(3)、⑴相連接而構(gòu)成。更佳地，所述的融合蛋白由(1)、(3)、(2)相連接構(gòu)成。優(yōu)選地，所述融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
[0013]所述白介素IL-24是:(a)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白或者SEQ ID NO:3所示的堿基序列編碼的蛋白；(b) SEQ ID NO:2中第2-159位所示氨基酸序列的蛋白；或(c)將(a)或(b)所限定的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)或(b)所限定的蛋白功能的由(a)或(b)衍生的蛋白。
[0014]優(yōu)選地，所述白介素IL-24是:將SEQ ID NO:2中第2-159位所限定的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過1-10個(較佳的1-6個，更佳的1-3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO:2中第2-159位所限定的蛋白功能的由其衍生的蛋白。
[0015]所述解離素多肽CN是:(i)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的蛋白或者是SEQ IDNO:5所示的堿基序列編碼的蛋白；(ii)SEQ ID NO:2中第170-237位所示氨基酸序列的蛋白；或(iii)將(i)或(ii)所限定的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(i)或(ii)所限定的蛋白功能的由(i)或(ii)衍生的蛋白。
[0016]優(yōu)選地，所述解離素多肽CN是:將SEQ ID NO:2中第170-237位所示氨基酸序列經(jīng)過1-10個(較佳的1-6個，更佳的1-3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO:2中第170-237位所限定的蛋白功能的由其衍生的蛋白。
[0017]較佳的，所述的解離素多肽CN位于融合蛋白的羧基端；所述的白介素IL-24位于融合蛋白的氨基端。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，還提供一種核酸分子，所述核酸分子編碼所述的白介素融合蛋白IL-24-CN。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，還提供一種重組表達載體，所述重組表達載體含有所述核酸分子。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，還提供一種基因工程化的細胞，所述細胞含有所述重組表達載體，或所述細胞的基因組中整合有所述核酸分子。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的第五方面，還提供一種白介素融合蛋白IL-24-CN的制備方法，所述制備方法包括:提供白介素IL-24的蛋白編碼基因；采用PCR逐步擴增的方法將CN編碼基因合成至所述白介素IL-24蛋白編碼基因上獲得含有編碼白介素融合蛋白IL-24-CN的DNA序列；將所述DNA序列與經(jīng)過同樣酶切的質(zhì)粒載體連接，并轉(zhuǎn)入宿主細胞中挑選陽性克隆，獲得基因工程化的細胞；以及培養(yǎng)所述基因工程化的細胞，表達和分離出所述白介素融合蛋白 IL-24-CN。
[0022]優(yōu)選將CN編碼基因合成至所述白介素IL-24蛋白編碼基因的3'端。
[0023]所述PCR逐步擴增的方法包括依次采用引物R-l，F(xiàn)-l，F(xiàn)-2，F(xiàn)_3，F(xiàn)_4，F(xiàn)_5將CN編碼基因合成至所述白介素IL-24蛋白編碼基因的3'端；其中，引物R-1具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，F(xiàn)-1具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，F(xiàn)-2具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，F(xiàn)-3具有SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列，F(xiàn)-4具有SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，F(xiàn)-5具有SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。 [0024]根據(jù)本發(fā)明的第六方面，還提供一種白介素融合蛋白IL-24-CN在制備誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞遷移或侵襲的藥物組合物中的應(yīng)用。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的第七方面，還提供一種抗腫瘤的組合物，所述的組合物含有:(A)有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的白介素融合蛋白IL-24-CN ;(B)藥學(xué)上可接受的載體。
[0026]本發(fā)明還提供一種增強白介素IL-24與腫瘤細胞相互作用力的方法，所述方法包括以下步驟:(a)將解離素多肽CN與白介素IL-24融合，獲得融合蛋白；(b)將(a)的融合蛋白與腫瘤細胞共孵育或接觸，從而提高白介素與腫瘤細胞的結(jié)合。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述獲得融合蛋白的方法包括:
[0028](i)提供一構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物中含有一基因表達盒，所述基因表達盒含有以下操作性相連的元件:白介素IL-24編碼基因與解離素多肽CN編碼基因。
[0029](ii)將(i)的構(gòu)建物導(dǎo)入細胞表達系統(tǒng)，從而表達和純化獲得所述融合蛋白。
[0030]本發(fā)明人經(jīng)過長期的文獻研究和試驗驗證，發(fā)現(xiàn)白介素IL-24和解離素多肽CN融合在一起形成的融合蛋白不僅很好地保留了白介素IL-24誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞增殖的活性，又顯著提高了白介素IL-24與腫瘤細胞的相互作用力，從而增強白介素對腫瘤細胞的殺傷作用，另外所述融合蛋白還能夠抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲過程，抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。
[0031]IL-24蛋白是通過與腫瘤細胞表面特異性受體IL-20R1/IL-20R2或IL-22R1/IL-20R2相互作用而激活腫瘤細胞內(nèi)相關(guān)蛋白的活性，進而發(fā)揮調(diào)控腫瘤細胞生長和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。為了增強這種相互作用，本發(fā)明人嘗試了多種方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將白介素IL-24與解離素多肽CN進行融合表達所獲得的融合蛋白效果最好。更佳地，將白介素IL-24與SEQ ID NO:2中第170-237位所示的氨基酸序列的CN蛋白融合，其形成的融合蛋白對白介素IL-24與腫瘤細胞相互作用力的提高效果最好，發(fā)揮抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。
[0032]白介素IL-24
[0033]IL-24是一種新型白介素(關(guān)于白介素IL-24蛋白，具體可參見文獻:于明磊，依莫安等人的“人白介素24(IL-24)的表達與純化及其初步活性評價”，藥物生物技術(shù)，2013年04期)，屬于IL-10家族成員。與IL-10家族其它成員相同，IL-24可以通過與細胞表明受體結(jié)合激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。但是，研究表明IL-24是唯一一個具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞生長作用的細胞因子，體內(nèi)外活性研究均顯示其具有顯著的抗腫瘤作用，且對正常細胞沒有毒性作用。
[0034]本發(fā)明可用IL-24的全長蛋白 或其變構(gòu)體蛋白。任何一種IL-24蛋白的變構(gòu)體蛋白都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，IL-24蛋白的變構(gòu)體蛋白的含義是指:(I) IL-24蛋白的生活活性片段，即作為一種蛋白片段，其仍然能保持完整的IL-24蛋白的全部或部分功能(如至少50%的生物活性，較佳的至少70%的活性，更佳的至少90%的活性)；(2)經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的IL-24的氨基酸序列。所述的IL-24的變構(gòu)體蛋白與CN融合后也具有增強的與腫瘤細胞的相互作用力，且具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞遷移或侵襲的作用。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的IL-24蛋白，比如，可采用為了延長其半衰期、改善其穩(wěn)定性而改良的IL-24蛋白。
[0035]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的IL-24的氨基酸序列可以與SEQ IDNO:4所示的序列基本上相同。更優(yōu)選的IL-24的氨基酸序列可以與SEQ IDNO:2中2-159位所示的序列基本相同。
[0036]解離素多肽CN
[0037]解離素(disintegrin)是一類富含半胱氨酸的小分子多肽，廣泛分布于蛇毒毒液和水蛭毒素中，其解離素樣結(jié)構(gòu)域中含有特征序列，如RGD序列和Lys-Gly-Asp (KGD)序列。研究較多的解離素多妝有:accutin、contortrostatin、echistatin 和 rhodostomin 等。解離素為整合素家族的特異性抑制劑，可競爭性抑制整合素受體與細胞外基質(zhì)蛋白如層粘蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白、玻連蛋白、血小板、纖維蛋白原受體、骨橋蛋白等的結(jié)合，改變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并發(fā)揮作用，包括:抑制血小板的聚集、抑制細胞間粘附、抑制腫瘤血管的生成、發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的作用等，進而抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和進展。
[0038]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，白介素IL-24特別適合于與解離素多肽CN的融合，形成的融合蛋白不僅易于表達，而且分離純化獲得的融合蛋白具有更高的與腫瘤細胞的相互作用力，可顯著誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞的遷移或侵襲。本發(fā)明可用的全長蛋白或其的變構(gòu)體蛋白。任何一種CN的變構(gòu)體蛋白都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，CN的變構(gòu)體蛋白的含義是指:(I)經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的CN氨基酸序列；
(2)將CN蛋白中的作用元件與其它解離素多肽中的作用元件進行置換獲得的變構(gòu)體。術(shù)語“作用元件”是指在解離素多肽與細胞結(jié)合的過程中發(fā)揮作用的氨基酸序列，如特征性序列(如，RGD序列，KGD序列等)，羧基端氨基酸序列等。所述的變構(gòu)體CN蛋白與白介素IL-24融合后也具有增強的與腫瘤細胞的相互作用力，且具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞遷移或侵襲的作用。
[0039]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的CN的氨基酸序列可以與SEQ IDNO:6所示的序列基本上相同。更優(yōu)選的CN的氨基酸序列可以與SEQ IDNO:2中170-237位所示的氨基酸序列基本相同。
[0040]融合蛋白
[0041]本發(fā)明提供一種白介素融合蛋白IL-24-CN，所述融合蛋白包括白介素IL_24(或其變構(gòu)體蛋白)和解離素多肽CN(或其變構(gòu)體蛋白)。術(shù)語“IL-24-CN”、“融合蛋白”以及“白介素融合蛋白IL-24-CN”等可互換使用，都是指所述的融合蛋白。
[0042]所述的IL-24和CN之間可以直接相連接，或通過連接肽連接。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方式，所述的IL-24和CN之間是通過連接肽連接，從而形成融合蛋白。所述的連接肽包括1-20個氨基酸,較佳地為1-15個氨基酸,更佳地為1-10個氨基酸,最佳地是1-4個氨基酸，如2-3個。
[0043]作為一種優(yōu)選的方式，所述的IL-24蛋白位于融合蛋白的氨基端，所述的CN多肽位于融合蛋白的羧基端?？蛇x擇地，也可互換兩種蛋白所處的位置。
[0044]此外，可選擇地，所述的融合蛋白的氨基端(或羧基端)還可含有一個或多個多肽片段，作為蛋白標(biāo) 簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是GST、FLAG、His-tag、Trx等。這些標(biāo)簽可用于促進融合蛋白的可溶表達或?qū)θ诤系鞍走M行純化。一個具體的例子是在融合蛋白的氨基端連接有His-tag。本領(lǐng)域人員應(yīng)理解,可以在蛋白標(biāo)簽氨基酸序列與融合蛋白IL-24-CN序列之間設(shè)置可酶切的結(jié)構(gòu)，從而可將標(biāo)簽從融合蛋白上去除。
[0045]另一方面，本發(fā)明還提供了編碼所述的融合蛋白的分離的核酸，也可以是其互補鏈。
[0046]編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列，可以是全序列人工合成的，也可以是通過PCR擴增的方法(I)分別獲得編碼IL-24和CN氨基酸序列的DNA序列，然后將其拼接起來(2)將編碼CN氨基酸序列的DNA序列逐步擴增至IL-24氨基酸序列編碼基因的3'-端，形成編碼本發(fā)明所述融合蛋白的DNA序列。
[0047]在獲得了編碼本發(fā)明所述融合蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞。最后通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細胞，通過分離純化得到本發(fā)明的融合蛋白。
[0048]因此，本發(fā)明還提供了包含編碼所述融合蛋白的核酸分子的載體。
[0049]在本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞的克隆和表達的載體。可選用本領(lǐng)域已知的載體如市售的載體，或經(jīng)過改造的市售載體。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的載體為原核載體，如PET載體。
[0050]生產(chǎn)融合蛋白的方法也已包括在本發(fā)明中。所述方法包括培養(yǎng)含有IL-24-CN融合蛋白編碼核酸的重組細胞。所述方法可包括讓細胞表達編碼的融合蛋白，以及所述表達的融合蛋白的分離和/或純化?？蓪⑸鲜鲋苽浍@得的融合蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。所述純化可采用超濾濃縮、親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析等的一種或不同的組合，最終使蛋白純度達到基本均一。
[0051]本發(fā)明的融合蛋白可用于制備抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的組合物，從而用于殺傷腫瘤細胞，用于治療腫瘤。本發(fā)明的融合蛋白具有優(yōu)異的與腫瘤細胞結(jié)合的能力，且可顯著誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞遷移或侵襲，從而抑制腫瘤的發(fā)展。因此，本發(fā)明的融合蛋白具有比IL-24更優(yōu)異的腫瘤殺傷效果，從而可用于開發(fā)高效的抗腫瘤藥物。
[0052]本發(fā)明所述“腫瘤”可以是多種類型的，如腫瘤細胞表面可表達細胞因子受體或表整合素受體，如可包括但不限于:黑色素瘤細胞A375和乳腺癌細胞MCF-7等。
[0053]組合物
[0054]本發(fā)明還提供一種抑制腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移的組合物，所述的組合物含有:(I)有效量(如摩爾濃度為1-100 μ M ;更佳的是1-1OOOnM)的本發(fā)明所述的IL-24與CN的融合蛋白；和(2)藥學(xué)上可接受的載體。所述載體是指這樣一些藥劑載體:他們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。
[0055]可將所述的組合物制成各種適合于哺乳動物(如人)給藥的劑型，如所述劑型包括但不限于:注射劑、膠囊劑、片劑、乳劑、栓劑。
[0056]在用于抑制哺乳動物腫瘤時，所述的融合蛋白可全身性施用，或局部施用，具體可視腫瘤的種類、生長部位、進展程度等因素決定。
[0057]本發(fā)明的組合物可直接用于殺傷腫瘤細胞。此外，還可同時與其它治療劑或輔助劑聯(lián)合使用。
[0058]本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點主要在于:
[0059](I)首次提供且制備 出IL-24與CN的融合蛋白，且所述白介素融合蛋白IL_24_CN在本發(fā)明中所述宿主細胞中以可溶形式表達；
[0060](2)所述白介素融合蛋白IL-24-CN與單獨的IL-24和CN相比具有更高的與腫瘤細胞的相互作用力，可顯著誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞的遷移或侵襲，且對正常細胞無毒副作用；
[0061](3)本發(fā)明所述白介素融合蛋白IL-24-CN具有比IL-24更顯著更優(yōu)異的抗腫瘤活性，且可用于多種腫瘤的治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0062]圖1示出了獲得IL-24-CN基因的PCR步驟；
[0063]圖2示出了 pET32a-1L24_CN的構(gòu)建策略；
[0064]圖3示出了 IL-24-CN基因的擴增結(jié)果，其中，M:Marker ;1_5:各步驟PCR產(chǎn)物；
[0065]圖4示出了重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果(A)和雙酶切鑒定結(jié)果(B)，其中，M =Marker ；1-6:單菌落PCR產(chǎn)物；7:重組質(zhì)粒的雙酶切消化產(chǎn)物；
[0066]圖5示出了 SDS-PAGE檢測IL_24_CN在基因工程菌中的表達的結(jié)果，其中，M:Marker ；1:全細胞；2:上清液；3:沉淀；
[0067]圖6示出了 SDS-PAGE檢測IL_24_CN融合蛋白的鎳離子親和純化的結(jié)果，其中，M:Marker ；1:破碎上清；2:穿出液；3:洗雜液；4:50mM咪唑濃度洗脫液；5 =IOOmM咪唑濃度洗脫液；6:200mM咪唑濃度洗脫液；7:500mM咪唑濃度洗脫液；
[0068]圖7示出了 SDS-PAGE檢測腸激酶酶切去除Trx-tag的結(jié)果，其中，M =Marker ；1:Trx-1L24-CN ；2:酶切反應(yīng)24h ；3:鎳離子親和柱穿出液；4:洗脫液；
[0069]圖8示出了 MTT法檢測IL-24-CN融合蛋白對A375生長的抑制作用；[0070]圖9示出了流式細胞術(shù)檢測IL-24-CN融合蛋白對A375細胞的凋亡作用；
[0071]圖10示出了傷口愈合實驗檢測IL-24-CN融合蛋白對A375細胞遷移的影響；
[0072]圖11示出了 Transwell檢測IL-24-CN融合蛋白對A375細胞遷移和侵襲的影響；
[0073]圖12示出了細胞粘附實驗分析IL-24-CN對A375細胞的親和力。
【具體實施方式】
[0074]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0075]實施例1IL-24-CN融合蛋白的構(gòu)建及重組基因工程菌的制備
[0076]GeneBank 已報道白介素 IL-24 的蛋白編碼基因(Accession N0.BT007156.1),如SEQ ID N0:3所示。CN多肽的編碼基因如SEQ ID NO:5所示，采用PCR逐步擴增的方法將CN編碼基因合成至IL-24蛋白編碼基因的3'端。在上游引物R-1中引入Kpn I位點，下游引物F-5中引入Xho I位點(序列中斜體加粗顯示)，便于克隆到pET-32a(+)的Kpn I和Xho I位點之間。為了在表達純化之后將Trx-Tag切除，在上游引物R-1中引入腸激酶(Enterokinase, EK)識別位點DDDDK，以下劃線標(biāo)出。引物(由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成)如下:
【權(quán)利要求】
1.一種白介素融合蛋白，其特征在于，所述白介素融合蛋白包括: (1)白介素IL-24； (2)解離素多肽CN;以及 (3)位于所述白介素IL-24和所述解離素多肽CN之間的由0-20個氨基酸構(gòu)成的連接肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白介素融合蛋白，其特征在于，所述白介素IL-24是: (a)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白或者SEQ ID NO:3所示的堿基序列編碼的蛋白； (b)SEQID NO:2中第2-159位所示氨基酸序列的蛋白；或 (c)將(a)或(b)所限定的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)或(b)所限定的蛋白功能的由(a)或(b)衍生的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的白介素融合蛋白，其特征在于，所述白介素IL-24是: 將SEQ ID NO:2中第2-159位所限定的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過1_10個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO:2中第2-159位所限定的蛋白功能的由其衍生的蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白介素融合蛋白，其特征在于，所述解離素多肽CN是: (i)SEQID NO:6所示的氨基酸序列的蛋白或者是SEQ ID NO:5所示的堿基序列編碼的蛋白； (ii)SEQID NO:2中第170-237位所示氨基酸序列的蛋白；或 (iii)將(i)或(ii)所限定的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有⑴或(ii)所限定的蛋白功能的由⑴或(ii)衍生的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的白介素融合蛋白，其特征在于，所述解離素多肽CN是: 將SEQ ID NO:2中第170-237位所示氨基酸序列經(jīng)過1-10個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO:2中第170-237位所限定的蛋白功能的由其衍生的蛋白。
6.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項所述的白介素融合蛋白。
7.—種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體含有權(quán)利要求6所述的核酸分子。
8.一種白介素融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括: 提供白介素IL-24的蛋白編碼基因； 采用PCR逐步擴增的方法將解離素多肽CN的編碼基因合成至所述白介素IL-24的蛋白編碼基因上獲得含有編碼白介素融合蛋白的DNA序列； 將所述DNA序列與經(jīng)過同樣酶切的質(zhì)粒載體連接，再轉(zhuǎn)入宿主細胞中挑選陽性克隆，獲得基因工程化的細胞；以及 培養(yǎng)所述基因工程化的細胞，表達和分離出所述白介素融合蛋白。
9.一種白介素融合蛋白在制備誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞遷移或侵襲的藥物組合物中的應(yīng)用。
10.一種抗腫瘤的組合物，其特征在于，所述的組合物含有:(A)有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項所述的白介素融合蛋白；(B)藥學(xué)上可接受 的載體。
【文檔編號】A61P35/00GK103980366SQ201410187998
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】孫愛友, 魏東芝, 白超剛, 王曉娟, 張艦, 呂欣欣 申請人:華東理工大學(xué)