狂犬病病毒era減毒疫苗突變株及其制備方法和狂犬病活疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株及其制備方法和狂犬病活疫苗。其中，狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株表達編碼突變糖蛋白，并且所述突變糖蛋白具有下列突變：信號肽第2位的氨基酸缺失；信號肽的第3位的氨基酸缺失；第333位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔蝗笔si假基因區(qū)；所述糖蛋白的G基因插入M基因之前。由此上述狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株更安全、有效、成本低。
【專利說明】狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株及其制備方法和狂犬病活疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，本發(fā)明涉及狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株及其制備方法和狂犬病活疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]狂犬病是一種人畜共患的病毒性傳染病，人一旦發(fā)病，病死率為100%。近兩年我國人狂犬病的發(fā)病和死亡數(shù)均超過3000人/年，并且疫情呈上升態(tài)勢。人類主要是通過被患有狂犬病的家養(yǎng)或野生動物咬傷而感染狂犬病毒。因此，控制家養(yǎng)或野生動物狂犬病感染不僅可以降低這些動物的死亡率，而且可以有效控制人類感染狂犬病毒，是預(yù)防狂犬病的有效手段。
[0003]控制動物感染狂犬病毒的主要手段是投撒口服減毒活疫苗。當(dāng)前所有上市的口服狂犬疫苗其病毒都來源于Evelyn-Rokitnick1-Abelseth (ERA)株。ERA株是狂犬病病毒街毒Street-Alabama-Dufferin(SAD)株的固定株。SAD株于1935年從美國阿拉巴馬的一條瘋狗中分離，在小鼠腦、幼倉鼠腎BHK-21細胞和雞胚中進行多次傳代減毒后,獲得ERA株。傳統(tǒng)的減毒活疫苗由于殘余毒力或在體內(nèi)繁殖變異可能導(dǎo)致接種的動物患病，具有一定的危險性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株及其制備方法。
[0005]在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株，所述狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株表達編碼突變糖蛋白，并且所述突變糖蛋白具有下列突變:信號肽第2位的氨基酸缺失；信號肽的第3位的氨基酸缺失;第333位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔蝗笔si假基因區(qū)；所述糖蛋白的G基因插入M基因之前。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述突變糖蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0007]SEQ ID NO:1 氨基酸序列為:
[0008]MQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYRWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGKCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVETWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPLADPSTVFKD⑶EAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSffESHKSGGETRL0
[0009]根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，上述突變株的基因組中包含SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。SEQ ID NO:2 核苷酸序列為:TGTTAAGCGT CTGATGAGTC CGTGAGGACGAAACTATAGGV3VXXXVX333XXVVV000X XXX0X0XXV3 3XXXXX00X3 XX3333VX0X XX0X33X3X300V3X30XX0OXVOVVVOOV V3X3V0VVVV 3X333XV3VV 0V30X33VVVVVVV0XV3VV 3X0VVVX33X0XV0V033X0 VVVXVV3V0V X3X333X0V3X3V33X3X30 VV033VVX30 XX3XV3VXVX 303XVV0XX3V0XV0VV30XV3XVVVVX0V 0X30VV3V03 3XVV03X0VX X0XX0V33XX VVV0VVX3X3VV3300XXX303X000XV00 0X3VX0X0XV 0VVX33333X 3VVV33X0003V0XV3330V XXX0333V0X0X00V33VX0 XVVVVVV300 V0VVVXX0VXVXV0XV0XX3 3VV0XVVVV0 XXW30V0XX xxvvxvxoxx3X3VXV000V3X33XV03X0 X333XXX0VV XVXVVVVVVO 3X3XXX0VVV 0V30XXV0V33V3X303XV0V0X300V00X 0V3XVX3XV0 XVOOVVVVOX VV33V33003X00XVV0XX3 330V33X33000X3XX30X3 VVV3X30030 0XV00V330VVV03XV3XVV 330VVV0V0V 0V3X3XX33X 3V333V3VV3V0V00VV0VV3X30V0V033 00X3VX3V0V 333VV3XVVV XV00V0V3XX 3X0VVV00V33X333VVOOOXXX3VV3X00 303X0XVX33 XVXVXXVOVO VV0VX033V0V3V3X00XVX V0VV3X3XXXVOVOVOVOOV 3X00V0XVVV 3V0V3X0VXVVV33X0V00X XOXVVVVOOX 33VXV3X0V3 3XX0X33XX30VX33XV00V0V00VV0XV0 0XV0V3XXX3 V00V0V03XV X0VV300VV0 VOOOXOOVV3300XV0V0X00X333VV333 03XVVVV00X V0XV00X33V 3XX3V030000XVXV00V0X 333X3XVV3VOOXOVVOVXV 333VVOOOOV V33X3XV3X300V3XVV3V0 VV03XVXVVV 0VXVV3XV0X 3XV0XX0X3VVV0VV0X300XV0V0XX3XV 03300X3X00 330V0VXXVX 30X0VX33XV V3X0XXX3XV0VV30V0XV3VVV333XV33 VV03XXX33X 3333V3VVX3 VVVVVVV0XV3XV33XVXVX 0X0XXV003VX3XVVV0033 0XVVVV3VVX VVOXXOVVOVVXVOXOVOXO V03XXVXV3V 0VV3VVVX3X XX0V03303XXV3X3VVV33X03330VV3X V3XVV33XX0 V3X0V3X3X0 XVXV0V003V XV3V3X3XV0V0VVVX3V03XOOVOOXVVO XV0XV3XVV0 3X3VXVXXX0 X300V0033X0VV0V33VVV 0X00V3X3XX3VX3V00V03 V03V0X3X3V V3X0X3VV00XV0XV0V300 X3V30VX03V 0X3V0VVV3V 0X3VV0X300300V03VXVV0VV3XX3VV0 VVVOVOXVOV 0V3XX3XXV0 VVOVVVOXXX V3V000VVV0003XX3XXVV00V0V000X3 XVX300000V X3XX0X3X0X VVV0XV3X33X30X0XV30X 30XXVXX003VV30XVVVX3 33XV0V3X0V V3X000XVXVX30XV00VX0 XXX3V3XXV3 X3XVV3XX0X 03V3X00XX0X30XVVV3XV3XXVXX33X3 XVVVOOOXOV 0XX300VX3V 3XX033XX3V 33XV3XXXVXX3X3V3X30XX0X30V3V0V 00V3000V33 OVOXXXOXVV OVVOVVXVOVOVVOOVOXXX 3VV0VV3V33XXOXXXVXVX 3VXVV300V0 V0VX3033V3X3XVV3XVVV 3VVVVXV3XX 000X3VXXXV 3XVX00X3V00V3XX0X3V0VV0XVXX30X 3V3X0XX0V3 V3000X0V0V 3XVV30V 3XX VXVXOXVOOVOXXViBOOOX3XXXXX0XV3 V0XVX33VV0 03300XXXXX V0V3XX3VVV33VXVX3VX0 V00XXVVX30X0X0XVVVV3 V3X3VV3V0X VVX3X3VXV33V3VV00X03 XVVVVXXOXX XX33330V3V OVOXXXXXVOV30V0VXV00V3V0V30XXV 3VVV3V0VVX VX3VVX00X3 V3VVVV3000 33XVXVVVV30V0XX00VXVX0X3X0V0XX 3X3XX3X003 X0VXX33X03 0XV30V0X333X0X3V3333 V0V0VV3V0X3VV00XV300 V00V3V0X3X 3000XXVV000VV0VX0XV0 XOVXOOVVVV XVOVOOXOOX 3X3XX00V3333V3XV0VVXV0V00VVVV0 3V30XXV0X0 OXVVODXVXO 0V33V00X3V 0VV0033X0XV3V0000V0XXXXXX0V30X VV30030V30 0XXXVX33XX 0XVX0XV03V0X33XV0XX3 VVV33033030V0XV300V3 X0XXXX0V3X 0VV3VXV30VVVXVVVXXXV 0333X300VV V00VX333VV XVX0X3330VVVVV0XXXV0VVV3XV330X 333VX0VV3V X0V0XV3VV3 XV00X03XVX XV0V0X330VV0XXX3X3X00X00V3XVVX VV3X0VVV3X XVXOXXVOVV 3V0330XV00XVV3VX3333 V3VVX0XVVV
【權(quán)利要求】
1.一種狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株，其特征在于，所述狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株表達編碼突變糖蛋白，并且所述突變糖蛋白具有下列突變: 信號肽第2位的氨基酸缺失； 信號肽的第3位的氨基酸缺失； 第333位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔? 缺失Psi假基因區(qū)； 所述糖蛋白的G基因插入M基因之前。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株，其特征在于，所述突變糖蛋白具有SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株，其特征在于，所述突變株的基因組中包含SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
4.一種制備權(quán)利要求1-3任一項所述的狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株的方法，其特征在于，包括: (1)利用表達載體對宿主細胞進行轉(zhuǎn)染； (2)對步驟(1)中所得到的經(jīng)過轉(zhuǎn)染的宿主細胞進行培養(yǎng)； (3)對步驟(2)中所得到的 培養(yǎng)物進行過濾，以便獲得所述狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株， 其中， 所述表達載體攜帶第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼突變糖蛋白，并且所述突變糖蛋白具有下列突變: 所述信號肽第2位的氨基酸缺失； 所述信號肽的第3位的氨基酸缺失； 第333位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔? 缺失Psi假基因區(qū)； 所述糖蛋白的G基因插入M基因之前。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述突變糖蛋白具有SEQID N0:1所示的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一核酸分子具有SEQID N0:2所示的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所示的方法，其特征在于，所述第一核酸分子的5’端連接有編碼錘頭狀核酶的核酸分子，所述第一核酸分子的3’端連接有編碼丁型肝炎核酶的核酸分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，將所述表達載體與輔助載體對所述宿主細胞進行共轉(zhuǎn)染，其中，所述輔助載體包括: 第一載體，所述第一載體攜帶N基因序列； 第二載體，所述第二載體攜帶P基因序列； 第三載體，所述第三載體攜帶L基因序列；以及 第四載體，所述第四載體攜帶編碼T7RNA聚合酶的核酸分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述表達載體和所述第一至第四載體均為pBlue質(zhì)粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為BHK-21細胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，包括: 將BHK-21細胞于10%的新生牛血清的MEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至6孔板90%匯合度時；用4ug/孔的表達載體和第一載體、第二載體、第三載體以及第四載體脂質(zhì)體2000法對所述BHK-21細胞進行共轉(zhuǎn)染；將經(jīng)過所述共轉(zhuǎn)染后的BHK-21細胞置于5%的CO2培養(yǎng)箱中并于37°C的溫度下培養(yǎng)4-6小時后棄掉上清液；補加5%的所述新生牛血清的MEM完全培養(yǎng)基，并置于5%的CO2培養(yǎng)箱中于37°C的溫度下培養(yǎng)72小時，將細胞凍融3次，離心收集上清液并采用0.22um的濾膜進行過濾，以便獲得所述狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株， 其中，所述表達載體為pBlueERA ； 所述第一載體為PBlueN (2ug/孔)，所述第二載體為pBlue P (lug/孔)，所述第三載體為pBlueL(lug/孔),所述第四載體為pT7 (2ug/孔)。
12.—種狂犬病活疫苗，其特征在于，包括權(quán)利要求1-3任一項所述的狂犬病病毒ERA減毒疫苗突變株 。
【文檔編號】A61P31/14GK103881985SQ201410056860
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月19日
【發(fā)明者】李耀東, 劉俊生, 劉延亭, 鄭杰, 熊煒, 高楊 申請人:北京中聯(lián)康生物科技有限公司