抗vegf抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了能與VEGF結(jié)合的抗體。本發(fā)明還提供了這些抗VEGF抗體在制備用于阻斷或減少個(gè)體的復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的用途以及在制備用于治療個(gè)體的非腫瘤疾病狀態(tài)的藥物中的用途。
【專利說明】抗VEGF抗體
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明一般涉及抗VEGF選擇的多肽序列和具有用于研究、治療和診斷目的的有益特性的抗體。
[0002]發(fā)明背景
[0003]血管系統(tǒng)的發(fā)育對(duì)于許多生理和病理過程是基礎(chǔ)要求。諸如胚胎和腫瘤的活躍生長(zhǎng)組織要求充分的血液供應(yīng)。它們通過產(chǎn)生促血管生成因子來滿足這種需求，該促血管生成因子通過稱為血管生成的過程促進(jìn)新血管形成。血管形成是復(fù)雜但有序的生物事件，其包括全部或許多下述步驟:a)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)從現(xiàn)有的EC增殖或從祖細(xì)胞分化；b)EC遷移并聚結(jié)以形成索樣結(jié)構(gòu)；c)血管索(vascular cord)然后進(jìn)行小管形成(tubulogenesis)以形成具有中心管腔的血管；d)現(xiàn)有的血管索或血管發(fā)出芽，形成次級(jí)血管；e)原始血管叢進(jìn)行進(jìn)一步的重塑和改造(reshape);以及f)募集周邊內(nèi)皮細(xì)胞以包裝內(nèi)皮管，從而為血管提供維持和調(diào)節(jié)功能，這類細(xì)胞包括小毛細(xì)血管的外膜細(xì)胞、較大血管的平滑肌細(xì)胞以及心臟中的心肌細(xì)胞。Hanahan，D.Science277:48-50 (1997) ; Hogan, B.L.&Kolodziej, P.A.Nature Reviews Genetics.3:513-23(2002);Lubarsky, B.&Krasnow,M.A.Cell.112:19-28(2003)。
[0004]已完全確定的是，血管生成涉及各種病癥的發(fā)病機(jī)理。這些病癥包括實(shí)體瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移；動(dòng)脈粥樣硬化；晶狀體后纖維組織形成；血管瘤；慢性炎癥；諸如增殖性視網(wǎng)膜病變的眼內(nèi)新血管疾病，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑變性(AMD)、新血管性青光眼、移植的角膜組織和其他組織的免疫排斥；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及銀屑病。Folkman et al., J.Biol.Chem., 267:10931-10934(1992);Klagsbrun et al., Annu.Rev.Physiol.53:217-239(1991);和Garner A., Pathobiology of Ocular Disease.A DynamicApproach(眼病的病理學(xué).動(dòng)態(tài)方法)中的“Vascular diseases (血管疾病)，”，GarnerA.,Klintworth GK, eds., 2nd Edition(Marcel Dekker, NY, 1994)，ppl625_1710。
[0005]在腫瘤生長(zhǎng)的情況下，血管生成看起來對(duì)于從增生到瘤形成的轉(zhuǎn)變是關(guān)鍵的，并且對(duì)于為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)是關(guān)鍵的。Folkman et al.，Nature339:58 (1989)。與正常細(xì)胞相比，新血管形成允許腫瘤細(xì)胞獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和增殖自主性。腫瘤通常以異常的細(xì)胞開始，該異常的細(xì)胞其由于距離可用的毛細(xì)血管床的距離而僅增殖成幾個(gè)立方毫米的大小，并且腫瘤可以保持長(zhǎng)時(shí)間段的“休眠”而不進(jìn)一步生長(zhǎng)和擴(kuò)散。某些腫瘤隨后轉(zhuǎn)變成血管表型以激活內(nèi)皮細(xì)胞,其增殖并成熟為新的毛細(xì)血管。這些新形成的血管不僅允許原發(fā)腫瘤的連續(xù)生長(zhǎng)，還允許轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和再建群(recolonization)。因此，在腫瘤切片的微血管密度與幸免于乳腺癌及幾種其他腫瘤的患者之間觀察到了相關(guān)性。Weidner et al., N.Engl.J.Med324:1-6 (1991) ;Horak et al.，Lancet340:1120-1124(1992) ; Macchiarini et al.，Lancet340:145-146 (1992)。尚未理解控制血管生成轉(zhuǎn)變的精確機(jī)制，但是認(rèn)為腫瘤塊的新血管形成是由許多血管生成刺激物與抑制劑的凈差額(netbalance)導(dǎo)致的。(Folkman, Nat Medl (1):27-31 (1995))。 [0006]血管發(fā)育過程受到嚴(yán)緊調(diào)節(jié)。迄今為止，相當(dāng)數(shù)目的分子，大部分是由周圍細(xì)胞所產(chǎn)生的分泌因子，已經(jīng)證實(shí)調(diào)節(jié)EC分化、增殖、遷移和聚結(jié)成索樣結(jié)構(gòu)。例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)已經(jīng)被鑒定為與刺激血管生成和誘導(dǎo)血管通透性有關(guān)的關(guān)鍵因子。Ferrara et al., Endocr.Rev.18:4-25(1997)。甚至一個(gè)VEGF等位基因的損失導(dǎo)致胚胎致死的發(fā)現(xiàn)表明這種因子在血管系統(tǒng)的發(fā)育和分化中所起到的不可替代的作用。而且，已經(jīng)證實(shí)，VEGF是與腫瘤和眼內(nèi)病癥有關(guān)的新血管形成的關(guān)鍵介質(zhì)(mediator)。Ferrara etal., Endocr.Rev.見上文。檢查的大部分人腫瘤過量表達(dá)VEGF mRNA。Berkman et al., J.Clin.1nvest.91:153-159 (1993);Brown et a1., Human Pathol.26:86-91 (1995);Brownet al., Cancer Res.53:4727-4735(1993) ;Mattern et a 1., Brit.J.Cancer73:931-934(1996);Dvorak et al., Am.J.Pathol.146:1029-1039(1995)。
[0007]此外，眼睛液體中VEGF的濃度水平與患有糖尿病和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變的患者中血管的活性增殖的存在高度相關(guān)。Aiello et al.，N.Engl.J.Med.331:1480-1487(1994)。而且，研究已經(jīng)證明了 VEGF在受AMD影響的患者的脈絡(luò)膜新血管膜中的定位。Lopez et al., Invest.0phthalmol.Vis.Sc1.37:855-868 (1996) 0
[0008]抗VEGF中和抗體在裸小鼠中抑制各種人腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)(Kim et al., Nature362:841-844 (1993) ; Warren et al., J.Clin.1nvest.95:1789-1797 (1995) ; BorgStroiTletal., Cancer Res.56:4032-4039(1996);Melnyk et al., Cancer Res.56:921-924 (1996))，還在缺血性視網(wǎng)膜病癥模型中抑制眼內(nèi)血管生成。Adamis et al., Arch.0phthalmol.114:66-71(1996)。因此，抗VEGF單克隆抗體或VEGF作用的其他抑制劑對(duì)于治療腫瘤和各種眼內(nèi)新血管病癥是有希望的候選物。這類抗體描述于，例如，1998年I月14H公開的EP817, 648中；和1998年10月15日公開的W098/45331和W098/45332中。這類抗體中的一種，貝伐單抗 (bevacizumab)已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn),與化療方案聯(lián)合使用，治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(CRC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。并且許多進(jìn)行的臨床試驗(yàn)正在研究貝伐單抗對(duì)各種癌癥適應(yīng)癥的治療。
[0009]其他抗VEGF抗體、抗Nrpl抗體和抗Nrp2抗體也是已知的，并且描述于，例如 Liang et al., J Mol Biol366, 815-829 (2007)和 Liang et al., J BiolChem281, 951-961 (2006)，PCT 公開TO2007/056470 號(hào)和 PCT 申請(qǐng) PCT/US2007/069179 號(hào)中，這些專利申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用明確地并入本文中。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明提供了新的抗VEGF抗體及其用途。
[0012]本發(fā)明提供了許多抗VEGF抗體。例如，提供了與VEGF結(jié)合的抗體或其片段，其中所述抗體包含6種選自以下的HVR:
[0013](i) HVR-Ll，其包含氨基酸序列X1X2RX3SL,其中HVR-Ll包含下述位置的任何組合中的1、2或3種取代=X1為G或A5X2為乂或I ;和/或X3ST或R ;
[0014](ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列 DASSLA(SEQ ID NO:6)；
[0015](iii)HVR-L3，其包含氨基酸序列 SYKSPL(SEQ ID NO:7)；
[0016](iv) HVR-Hl，其包含氨基酸序列 SISGSWIF (SEQ ID NO:1)；
[0017](v)HVR-H2，其包含氨基酸序列 GAIWPFGGYTH(SEQ ID NO: 2);以及
[0018](vi)HVR-H3，其包含氨基酸序列 RWGHSTSPWAMDY(SEQ ID NO:3) ?
[0019]在另一實(shí)施方案中，提供了與VEGF結(jié)合的抗體或其片段，其中，該抗體包含:[0020](I)HVR-Hl，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
[0021](2)HVR_H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
[0022](3)HVR_H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
[0023](4)HVR-Ll，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
[0024](5)HVR_L2，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
[0025](6)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
[0026]在另一實(shí)施方案中，提供了與VEGF結(jié)合的抗體或其片段，其中，該抗體包含:
[0027](I)HVR-Hl，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
[0028](2)HVR_H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
[0029](3)HVR_H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
[0030](4)HVR-Ll，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
[0031](5)HVR_L2，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
[0032](6)HVR-L3，其 包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
[0033]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與VEGF結(jié)合的抗體或其片段，其中輕鏈可變域包含SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
[0034]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與VEGF結(jié)合的抗體或其片段，其中該抗VEGF抗體包含重鏈可變域(variable domain)和輕鏈可變域,該重鏈可變域包含SEQ ID N0:43的氨基酸序列，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO:44或45的氨基酸序列。仍然在另一實(shí)施方案中，抗VEGF抗體包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID N0:43的氨基酸序列，該輕鏈可變域包含SEQ ID N0:44的氨基酸序列。仍然在另一實(shí)施方案中，抗VEGF抗體包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
[0035]在某些實(shí)施方案中，任何上述的抗體都是單克隆抗體。在一實(shí)施方案中，抗體是選自Fab、Fab’ _SH、Fv、scFv或(Fab’ )2片段的抗體片段。在一實(shí)施方案中，抗體是人源化的。在一實(shí)施方案中，抗體是人抗體。仍然在另一實(shí)施方案中，至少一部分框架序列是人共有框架序列(consensus framework sequence)。
[0036]本發(fā)明提供了編碼任何上述抗體的多核苷酸以及包含該核苷酸的載體和包含本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。還提供了制備抗VEGF抗體的方法。例如，方法包括在適合表達(dá)編碼抗體的多核苷酸的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞和分離抗體。
[0037]一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)生物樣品中VEGF存在的方法，該方法包括使生物樣品與本發(fā)明的抗體在允許抗體與VEGF結(jié)合的條件下接觸，并檢測(cè)在抗體與VEGF之間是否形成復(fù)合物。在一實(shí)施方案中，方法包括檢測(cè)生物樣品中的VEGF-抗VEGF抗體復(fù)合物，其中該抗VEGF抗體的氨基酸序列包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，該輕鏈可變域包含SEQ ID N0:44或45的氨基酸序列。仍然在另一實(shí)施方案中，方法包括檢測(cè)生物樣品中的VEGF-抗VEGF抗體復(fù)合物，其中該抗VEGF抗體的氨基酸序列包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，該輕鏈可變域包含SEQ ID N0:44的氨基酸序列。仍然在另一實(shí)施方案中，方法包括檢測(cè)生物樣品中的VEGF-抗VEGF抗體復(fù)合物，其中該抗VEGF抗體的氨基酸序列包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。仍然在另一實(shí)施方案中，可檢測(cè)地標(biāo)記了抗VEGF抗體。
[0038]本發(fā)明還提供了藥物組合物及治療方法。一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的抗體和藥物可接受的媒介物(carrier)的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，例如，該方法包括向個(gè)體給予包含任何上述抗體的藥物組合物。本發(fā)明的方法所治療的癌癥包括但不限于鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗癌、腹膜的癌癥、肝細(xì)胞癌、胃癌、胃腸癌、胃腸基質(zhì)癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌或腎癌(kidney or renal cancer)、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和各種類型的頭和頸癌、黑素瘤、淺表擴(kuò)散性黑素瘤、惡性雀斑樣痣黑素瘤、肢端雀斑樣痣性黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、多毛細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)、移植后淋巴組織增生病癥(PTLD)、與斑疲性錯(cuò)構(gòu)瘤病(phakomatoses)有關(guān)的異常血管增殖、與腦瘤有關(guān)的水腫或梅格斯綜合征(Meigs’ syndrome)。在某些實(shí)施方案中，被治療的腫瘤、癌癥或細(xì)胞增殖性病癥是結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌或成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。仍然在另一實(shí)施方式中，被治療的個(gè)體是人。[0039]本發(fā)明還提供包含與諸如藥物或細(xì)胞毒性劑的試劑偶聯(lián)的抗體的免疫偶聯(lián)物。
[0040]附圖簡(jiǎn)述
[0041]圖1:抗VEGF抗體的重鏈和輕鏈HVR環(huán)式序列。該圖表示重鏈HVR序列H1、H2和H3以及輕鏈HVR序列L1、L2和L3。序列編號(hào)如下:克隆B20-4.1.1 (HVR-H1為SEQ ID NO:1 ；HVR-H2 為 SEQ ID NO: 2 ;HVR_H3 為 SEQ ID NO: 3 ;HVR_L1 為 SEQ ID NO:4 ;HVR_L2 為 SEQ IDNO: 6 ;HVR-L3 為 SEQ ID NO: 7);和克隆B20-4.1.1RR(HVR_H1 為 SEQ ID NO:1 ;HVR_H2 為 SEQID NO:2 ；HVR-H3 為 SEQ ID NO:3 ；HVR-Ll 為 SEQ ID NO:5 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO:6 ；HVR-L3為 SEQ ID NO:7)。
[0042]氨基酸位置根據(jù)下文所述的Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。
[0043]圖2a和2b:描述具有下述序列標(biāo)志的用于實(shí)施本發(fā)明的示例性接受體(acceptor)人共有框架序列:
[0044]可變重(VH)共有框架
[0045]除去Kabat CDR的人VH亞組I共有框架(SEQ ID NO:8)
[0046]除去延伸的高變區(qū)的人VH亞組I共有框架(SEQ ID NOs:9-11)
[0047]除去Kabat CDR的人VH亞組II共有框架(SEQ ID NO: 12)
[0048]除去延伸的高變區(qū)的人VH亞組II共有框架(SEQ ID NOs: 13-15)
[0049]除去無Kabat CDR的延伸人VH亞組III共有框架的人VH亞組II共有框架(SEQID NO:16)
[0050]除去延伸的高變區(qū)的人VH亞組III共有框架(SEQ ID NOs: 17-19)
[0051]除去Kabat CDR 的人 VH 接受體框架(SEQ ID NO: 20)
[0052]除去延伸的高變區(qū)的人VH接受體框架(SEQ ID NOs:21-22)
[0053]除去Kabat CDR 的人 VH 接受體 2 框架(SEQ ID NO: 23)
[0054]除去延伸的高變區(qū)的人VH接受體2框架(SEQ ID NOs:24-26)
[0055]氨基酸位置根據(jù)下文所述的Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。[0056]圖3:描述具有下述序列標(biāo)志的用于實(shí)施本發(fā)明的示例性接受體人共有框架序列:
[0057]可奪輕(VL)共有框架
[0058]人VL K 亞組 I 共有框架(SEQ ID NO: 27)
[0059]人VL K 亞組 II 共有框架(SEQ ID NO: 28)
[0060]人VL K 亞組 III 共有框架(SEQ ID NO: 29)
[0061]人VL K 亞組 IV 共有框架(SEQ ID NO: 30)
[0062]圖4:描述huMAb4D5_8重鏈和輕鏈的框架區(qū)序列。上標(biāo)/粗體的數(shù)字表示根據(jù)Kabat的氨基酸位置。
[0063]圖5:描述huMAb4D5_8重鏈和輕鏈的修飾的/變異的框架區(qū)序列。上標(biāo)/粗體的數(shù)字表示根據(jù)Kabat的氨基酸位置。
[0064]圖6:抗 VEGF 抗體 B20-4.1.1 和 B20-4.1.1RR 的輕鏈 HVR 序列 L1、L2 和 L3 的氨
基酸序列。
[0065]圖7:抗 VEGF 抗體 B20-4.1.1 和 B20-4.1.1RR 的重鏈 HVR 序列 Hl、H2 和 H3 的氨
基酸序列。
[0066]圖8:描述抗體克隆B20-4.1.1 (SEQ ID NO:44)和B20-4.1.1RR(SEQ ID NO:45)的
輕鏈可變區(qū)。
[0067]圖9:描述抗體克隆B20-4.1.1和B20-4.1.1RR的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO:43)。
[0068]圖10:總結(jié)B20變體IgG對(duì)人VEGF和鼠VEGF的動(dòng)力學(xué)結(jié)合親和力測(cè)量的表格。將人或鼠VEGF固定以實(shí)現(xiàn)約60個(gè)應(yīng)答單位。
[0069]圖11:總結(jié)B20變體IgG對(duì)人VEGF和鼠VEGF的動(dòng)力學(xué)結(jié)合親和力測(cè)量的表格。將人或鼠VEGF固定以實(shí)現(xiàn)約1000個(gè)應(yīng)答單位。
[0070]圖12 =HUVEC胸苷吸收測(cè)定，其表明B20變體可以有效地抑制HUVEC細(xì)胞增殖。
[0071]圖13:描述B20-4.1.1對(duì)VEGF誘導(dǎo)的BRME增殖的影響。
[0072]圖14:描述如通過根據(jù)治療天數(shù)的腫瘤體積所測(cè)量的，B20-4.1.1對(duì)異種移植了人腫瘤細(xì)胞(A549細(xì)胞)的裸小鼠中腫瘤生長(zhǎng)的影響。
[0073]圖15:描述如通過根據(jù)治療天數(shù)的腫瘤體積所測(cè)量的，B20-4.1.1對(duì)異種移植了人腫瘤細(xì)胞(MDA-MB231細(xì)胞)的裸小鼠中腫瘤生長(zhǎng)的影響。
[0074]圖16:描述阿瓦斯丁抗體(avastin antibody)對(duì)VEGF誘導(dǎo)的BRME增殖的影響。在高達(dá)1500nM的阿瓦斯丁抗體濃度下，沒有觀察到mVEGF的抑制。
[0075]發(fā)明詳述
[0076]本發(fā)明提供了分離的與VEGF結(jié)合的抗體及其用途。本發(fā)明還提供了藥物組合物及治療方法。
[0077]本發(fā)明還提供制備抗VEGF抗體和編碼抗VEGF抗體的多核苷酸的方法。
[0078]一般技術(shù)
[0079]本文所述和所引用的技術(shù)和方法通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且通常由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用常規(guī)方法實(shí)施，例如，在下述文獻(xiàn)中描述的廣泛使用的方法:Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual3rd.Edition (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, Ν.Y.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (分子生物學(xué)最新方法)(F.M.Ausubelj et al.eds.，(2003)) ; the series METHODS IN ENZYM0L0GY(酶學(xué)方法系列)(Academic Press, Inc.):PCR2:A PRACTICAL APPROACH(PCR2:實(shí)用方法)(M.J.MacPhersonj B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995)), Harlow and Lane, eds.(1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE(抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))(R.1.Freshneyj ed.(1987)) ; Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)(M.J.Gait, ed.，1984) ;Methods in Molecular Biology (分子生物學(xué)方法)，Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(細(xì)胞生物學(xué):實(shí)驗(yàn)室手 M ) (J.E.Cellisj ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))(R.1.Freshney),ed.,1987) ;Introduction to Cell and Tissue Culture (細(xì)胞和組織培養(yǎng)介紹)(J.P.Mather and P.E.Roberts, 1998)Plenum Press; Cell andTissue Culture: Laboratory Procedures (細(xì)胞和組織培養(yǎng):實(shí)驗(yàn)方法)(A.Doyle, J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons;Handbook ofExperimental Immunology (實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè))(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.) ;GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells (哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體)(J.M.Millerand M.P.Calosj eds.，1987) ;PCR:The Polymerase Chain Reaction (PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒碝 ), (Mullis et al.，eds.，1994) ; Current Protocols in Immunology (最新免疫學(xué)方法)(J.E.Coligan et al.,eds.,1991);Short Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)簡(jiǎn)單方法)(Wiley and Sons, 1999) ; Immunobiology (免疫學(xué))(C.A.Janewayand P.Travers,1997);Antibodies (抗體)(P.Finch，1997);Antibodies:A PracticalApproach (抗體:實(shí)用方法)(D.Catty.，ed.，IRL Press, 1988-1989) ;MonoclonalAntibodies:A Practical Approach (單克隆抗體:實(shí)用方法)(P.Shepherdand C.Dean, eds., Oxford University Press，2000) ;Using Antibodies: ALaboratory Manual (抗體的使用:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(E.Harlow and D.Lane (ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1999);The Antibodies (抗體)(M.Zanetti andJ.D.Capra, eds., Harwood Academic Publishers,1995);以及 Cancer:Principlesand Practice of Oncology (癌癥:腫瘤學(xué)原理和實(shí)踐)(V.T.DeVita et al., eds., J.B.Lippincott Company, 1993)。
[0080]定義
[0081]為解釋本說明書的目的，將使用下述定義，并且合適時(shí)，以單數(shù)使用的術(shù)語(yǔ)也包括復(fù)數(shù)形式，反之亦然。在下文所列的定義與通過引用并入本文的任何文檔沖突的情況下，以下文所列的定義為準(zhǔn)。
[0082]術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣泛的含義使用，并特別地包括單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物活性。
[0083]本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”意指從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體，即包含個(gè)體抗體的群體是相同的，除了可能的突變，例如可以少量存在的天然存在的突變。因此，修飾詞“單克隆”表示抗體的特征并不是離散抗體的混合物。在某些實(shí)施方案中，這類單克隆抗體通常包括含有與靶標(biāo)結(jié)合的多肽序列的抗體，其中靶標(biāo)結(jié)合多肽序列通過包括從多個(gè)多肽序列選擇單個(gè)靶標(biāo)結(jié)合多肽序列的方法來獲得。例如，選擇方法可以是從從多個(gè)克隆選擇特定的克隆，例如雜交瘤克隆池(pool)、噬菌體克隆池或重組DNA克隆池。應(yīng)當(dāng)理解，可以進(jìn)一步改變所選的靶標(biāo)結(jié)合序列，例如，改進(jìn)對(duì)靶標(biāo)的親和力、將靶標(biāo)結(jié)合序列人源化、改進(jìn)其在細(xì)胞培養(yǎng)中的產(chǎn)生、減少其體內(nèi)免疫原性、產(chǎn)生多特異性抗體等，并且包含改變的靶標(biāo)結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。相對(duì)于通常包含抗不同決定簇(表位)的抗體的多克隆抗體制劑，單克隆抗體制劑的每個(gè)單克隆抗體都針對(duì)抗原上的一個(gè)決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體制劑的優(yōu)勢(shì)在于，它們通常不被其它免疫球蛋白所污染。
[0084]修飾詞“單克隆”表明了從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體的特征，并且不應(yīng)理解為要求通過任何特定方法來制備抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可以根據(jù)各種技術(shù)來制備，其包括，例如雜交瘤方法(例如，Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97(1975);Hongo et al., Hybridoma, 14(3):253-260(1995), Harlow et al., Antibodies: ALaboratory Manual (抗體:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nded.1988) ;Hammerling et al., in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridoma(單克隆抗體與T細(xì)胞雜交瘤)563-681 (Elsevier, N.Y.，1981));重組DNA方法(參見，例如美國(guó)專利4，816，567號(hào))；曬菌體展示技術(shù)(參見，例如Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991) ;Marks et al.，J.Mol.Biol.222: 581-597 (1992) ; Sidhu et al., J.Mol.Biol.338 (2): 299-310 (2004) ; Lee et al.，J.Mol.Biol.340 (5): 1073-1093 (2004)
;Fellouse, Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOl (34): 12467-12472 (2004);和 Lee et al., J.1mmunol.Methods284 (1-2): 119-132 (2004);以及在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動(dòng)物中制備人或人樣抗體的技術(shù)(參見，例如W01998/24893、W01996/34096、W01996/33735、W01991/10741 Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:2551 (1993);Jakobovits et al., Nature362:255-258 (1993);Bruggemann et al., Year in Tmmunol.7:33(1993);美國(guó)專利 5，545，807、5，545，806、5，569，825、5，625，126、5，633，425 以及 5,661,016 號(hào)；Marks et al., Bio/TechnologylO:779-783(1992);Lonberg et al., Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-813(1994);Fishwild et al., Nature Biotechnol.14:845-851 (1996);Neuberger, Nature Biotechnol.14:826(1996)；以及 Lonberg and Huszar, Intern.Rev.Tmmunol.13:65-93(1995)。
[0085]本文的單克隆抗體特別地包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或者屬于特定抗體集合或子集的抗體的對(duì)應(yīng)序列相同或者同源，而鏈的剩余部分與源自另一物種或者屬于另一抗體集合或子集的抗體的對(duì)應(yīng)序列相同或同源，只要它們表現(xiàn)出期望的生物活性(參見，例如美國(guó)專利4，816，567號(hào)和Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984)) 。 嵌合抗體包括PRIMATIZED:1i 抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)源自通過例如用目的抗原免疫恒河猴(rhesus)所產(chǎn)生的抗體。
[0086]非人(例如，鼠)抗體的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在一實(shí)施方案中， 人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體HVR的殘基被非人物種(供體抗體)的HVR的殘基取代，該非人物種例如具有期望的特異性、親和力和/或能力(capacity)的小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類。在某些情況下，人免疫球蛋白的FR殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。而且，人源化抗體可以包含未在受體抗體或供體抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。可以進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步完善抗體性能。通常，人源化抗體基本上包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變域的全部，其中全部或基本上全部高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，并且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體還任選地包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多的細(xì)節(jié)，參見，例如Jones et al., Nature321:522-525(1986);Riechmann et al., Nature332:323-329(1988)；以及 Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。還參見，例如 Vaswani andHamilton, Ann.Allergy, Asthma&Immunol.1:105-115 (1998) ;Harris, Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038 (1995) ; Hurle and Gross, Curr.0p.Biotech.5:428-433 (1994);以及美國(guó)專利6，982，321號(hào)和7，087，409號(hào)。
[0087]“人抗體”是具有氨基酸序列的抗體，該氨基酸序列對(duì)應(yīng)于由人產(chǎn)生和/或利用如本文所公開的用于制備人抗體的任何技術(shù)產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列。人抗體的這個(gè)定義特別地排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。人抗體可以利用本領(lǐng)域已知的包括卩遼菌體展示文庫(kù)在內(nèi)的各種技術(shù)來制備。Hoogenboom and Winter, J.Mol.Biol.,227:381 (1991) ;Marks et al.，J.Mol.Biol.，222: 581 (1991)。 制備人單克隆抗 體其他可用的方法是Cole et al., MonoclonalAntibodies and CancerTherapy (單克隆抗體與癌癥治療)，Alan R.Liss, p.77 (1985) ; Boerner et al., J.1mmunol.，147 (I): 86-95 (1991)中所述的方法。還參見，van Dijk and van deffinkel, Curr.0pin.Pharmacol., 5:368-74(2001)。人抗體可以通過向諸如免疫的異種小鼠(xenomice)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物給予抗原來制備，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)被修飾為對(duì)抗原激發(fā)(antigenic challenge)應(yīng)答而產(chǎn)生這類抗體,但是該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的內(nèi)源基因組已經(jīng)喪失能力。(參見，例如，關(guān)于XEN0M0USE?技術(shù)的美國(guó)專利6，075，181號(hào)和6，150，584號(hào))。關(guān)于通過人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)所產(chǎn)生的人抗體,還參見,例如，Li et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 103:3557-3562(2006)。
[0088]“物種依賴性抗體”是對(duì)來自第一哺乳動(dòng)物物種的抗原比對(duì)來自第二哺乳動(dòng)物物種的該抗原的同源物具有更強(qiáng)的結(jié)合親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體“特異地結(jié)合”于人抗原(即，結(jié)合親和力(Kd)值不大于約1X10_7M，優(yōu)選不大于約1X10_8M，并且最優(yōu)選不大于約IX 10_9M)，但是其對(duì)來自第二非人哺乳動(dòng)物物種的抗原的同源物的結(jié)合親和力比其對(duì)人抗原的結(jié)合親和力至少弱約50倍，或者至少弱約500倍，或者至少弱約1000倍。物種依賴性抗體可以是如上文所定義的任何類型的抗體，但是優(yōu)選為人源化抗體或人抗體。
[0089]如本文所用的，“抗體突變體”或“抗體變異”意指物種依賴性抗體的氨基酸序列變體，其中該物種依賴性抗體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被修飾了。這類突變體與物種依賴性抗體的序列同一性或相似性必須小于100%。在一實(shí)施方案中，抗體突變體的氨基酸序列與物種依賴性抗體的重鏈可變域或輕鏈可變域的氨基酸序列具有至少75%的氨基酸序列同一性或相似性，在另一實(shí)施方案中為至少80%，在另一實(shí)施方案中為至少90%，仍然在另一實(shí)施方案中為至少95%。與這中序列的同一性或相似性在本文中定義為，比對(duì)了序列并且，若需要，引入缺口，以實(shí)現(xiàn)最大序列同一性百分比后，候選序列中與物種依賴性抗體的殘基相同(即，相同的殘基)或相似(即，基于共同側(cè)鏈屬性的相同基團(tuán)的氨基酸殘基，參見下文)的氨基酸殘基的百分比?？贵w序列可變域以外的N-末端、C-末端或內(nèi)部延伸(internal extension)、缺失或插入不應(yīng)理解為影響序列同一'I"生或相似性。
[0090]“分離的”抗體是從其天然環(huán)境的組分鑒定和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染組分是會(huì)干擾抗體的研究、診斷或治療用途的物質(zhì)，并且可以包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，將抗體(1)純化至如通過，例如勞里(Lowry)方法所確定的，按重量計(jì)大于抗體的95%，并且在一些實(shí)施方案中，將抗體純化至按重量計(jì)大于99% ； (2)純化至使用例如，旋杯式測(cè)序儀足以獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度；或者(3)純化至通過利用例如考馬斯藍(lán)染色或銀染色的還原或非還原條件的SDS-PAGE的同質(zhì)性。由于抗體的天然環(huán)境的至少一種組分不會(huì)存在，所以分離的抗體包括重組細(xì)胞中的原位抗體。然而，分離的抗體通常通過至少一個(gè)純化步驟來制備。
[0091]“天然抗體”通常是約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，盡管二硫鍵連接的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中變化。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)律間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一個(gè)末端具有跟隨了許多恒定域的可變域(Vh)。每條輕鏈在一個(gè)末端具有可變域(')，在其另一末端具有恒定域；輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域?qū)R，輕鏈可變域與重鏈可變域?qū)R。特定的氨基酸殘基被認(rèn)為在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成界面。
[0092]抗體的“可變區(qū)”或“可變域”意指抗體的重鏈或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。重鏈的可變域可稱為“VH”。輕鏈的可變域可稱為“VL”。這些結(jié)構(gòu)域通常是抗體最可變的部分，并且含有抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0093]術(shù)語(yǔ)“可變”意指以下事實(shí)，即可變域的某些部分在抗體的序列中廣泛地變化，并且用于每種特定的抗體對(duì)其特定的抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布于抗體的全部可變域中。其集中在輕鏈可變域和重鏈可變域中的稱為高變區(qū)(HVR)的三個(gè)節(jié)段中?？勺冇蚋叨缺Ｊ氐牟糠址Q為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和天然輕鏈的可變域各自包含4個(gè)FR區(qū)，其主要采取β -折疊構(gòu)型，由3個(gè)HVR連接，該HVR形成環(huán)式連接，并且在某些情況下形成部分β_折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈上的HVR通過FR區(qū)緊密地結(jié)合在一起，并且與其他鏈上的HVR —起促進(jìn)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見，Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest, Fifth Edition (免疫學(xué)所關(guān)注的蛋白的序列，第 5版)，National Institute of Health, Bethesda, MD (1991))。恒定域并不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出各種效應(yīng)子功能，例如抗體參與抗體依賴性細(xì)胞毒性。
[0094]來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可以分為稱為K (kappa)和λ (lambda)的兩種截然不同的類型中的一種，基于它們恒定域的氨基酸序列。
[0095]抗體(免疫球蛋白)根據(jù)它們重鏈恒定域的氨基酸序列可以分為不同的種類。有5種主要種類的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM ;并且這些免疫球蛋白中的幾種還可以進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgG1UgG2UgG3UgG4UgAJP IgA2。對(duì)應(yīng)于不同種類的免疫球蛋白的重鏈恒定域分別稱為α、δ、ε、Y和μ。不同種類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是已知的，并且描述于，例如Abbas et al., Cellular and Mol.1mmunology, 4thed.(W.B.Saunders, C0.，2000)?？贵w可以是更大的融合分子的一部分,該融合分子通過抗體與一種或多種其他蛋白或肽的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合形成。
[0096]術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文中互換地使用，并意指基本上處于完整形式的抗體，而不意指下文所定義的抗體片段。該術(shù)語(yǔ)特別地意指具有含有Fe區(qū)的重鏈的抗體。
[0097]“裸抗體”在本文中的目的是指沒有與細(xì)胞毒性部分或放射性標(biāo)記偶聯(lián)的抗體。
[0098]“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選地包括其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段;雙抗體；線性抗體(linear antibody);單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0099]抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生稱為“Fab”片段的兩個(gè)相同的抗體結(jié)合片段和殘留的“Fe”片段，每個(gè)Fab片段都具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)e片段的名字反映其容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并且仍然能夠交聯(lián)抗原的F(ab’)2片段。
[0100]“Fv”是含有完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在一實(shí)施方案中，雙鏈Fv分子由二聚體組成，該二聚體是緊密非共價(jià)聯(lián)系形式的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域。在單鏈Fv(ScFv)分子中，一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域可以通過柔性肽連接物共價(jià)連接，從而該輕鏈和重鏈能夠以類似于雙鏈Fv分子中結(jié)構(gòu)的“二聚體”結(jié)構(gòu)結(jié)合。正是在這種構(gòu)型中，每個(gè)可變域的三個(gè)HVR相互作用來限定VH-VL 二聚體表面的抗原結(jié)合位點(diǎn)。6個(gè)HVR共同地賦予抗體抗原結(jié)合特異性。然而，甚至一個(gè)可變域(或僅包含3個(gè)對(duì)抗原特異性的HVR的Fv的一半)能夠識(shí)別并結(jié)合抗原，盡管親和力比完整的結(jié)合位點(diǎn)要低。
[0101]Fab片段含有重鏈可變域和輕鏈可變域，而且還含有輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab’片段與Fab片段的不同在于，在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加了幾個(gè)殘基，其包括一個(gè)或多個(gè)來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab’ -SH在本文中表示恒定域的半胱氨酸殘基帶有游離的巰基的Fab’。F(ab’)2抗體片段最早作為在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab’片段對(duì)而產(chǎn)生?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。
[0102]“單鏈Fv”或“scFv”片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中，這些結(jié)構(gòu)域存在于單多肽鏈中。通常，scFv多肽還包含VH與VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接物，這使得scFv形成對(duì)抗體結(jié)合所期望的結(jié)構(gòu)。對(duì)于scFv的綜述,參見,例如Pluckthiin, in The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies (單克隆抗體的藥學(xué))，vol.113, Rosenburg and Mooreeds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp.269-315。
[0103]術(shù)語(yǔ)“雙抗體”意指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，該片段包含在相同多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變域(VL)相連的重鏈可變域(VH)。通過利用過短以至于不能允許相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域配對(duì)的連接物，強(qiáng)制使該結(jié)構(gòu)域與另一鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體可以是二價(jià)或雙特異性的。雙抗體更完整地描述于，例如EP404, 097 ；W01993/01161 ；Hudson et al.，Nat.Med.9:129-134 (2003);以及Hollinger etal., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)。三抗體和四抗體也描述于 Hudson etal.，Nat.Med.9:129-134 (2003)。
[0104]術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”，當(dāng)在本文中使用時(shí)，意指抗體可變域的區(qū)域，其在序列中是高變的和/或形成結(jié)構(gòu)上確定的環(huán)。通常，抗體包含6個(gè)HVR，3個(gè)位于VH(H1、H2、H3)，3個(gè)位于VL(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3表現(xiàn)出6個(gè)HVR的最強(qiáng)的多態(tài)性，并且H3特別地被 認(rèn)為在賦予對(duì)抗體的高特異性中起到獨(dú)特的作用。參見，例如Xu etal.，Immunity (免疫力)13:37-45 (2000) ； Johnson and Wu, in Methods in MolecularBiology (分子生物學(xué)方法)248:1-25 (Lo，ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)。實(shí)際上，只由重鏈組成的天然存在的駱駝(camelid)抗體在沒有輕鏈時(shí)是有功能并且穩(wěn)定的。參見，例如，Hamers-Casterman et al., Nature363:446-448 (1993) ；Sheriff et al., NatureStruct.Biol.3:733-736 (1996)。
[0105]本文使用并包括了許多HVR描述。Kabat互補(bǔ)性決定區(qū)(OTR)基于序列可變性，并且是最常用的° (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd (免疫學(xué)所關(guān)注的蛋白的序列,第 5 版).Public Health Service, National Institutesof Health, Bethesda, MD.(1991))。相反，Chothia 意指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia andLesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR 表示 Kabat HVR 與 Chothia 結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折中，并且僅被Oxford Molecular’s AbM抗體建模軟件所使用?！癱ontact (接觸)” HVR
基于可用的復(fù)雜晶體結(jié)構(gòu)的分析。來自這些HVR的每一個(gè)的殘基如下所示:
[0106]
Kabat AbMChothia Contact
LI L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B(Kabat 編號(hào))
Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia 編號(hào))
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
[0107]HVR可以包含如下的“延伸的HVR”:VL上的24-36或24-34(LI)、46-56或50-56 (L2)和 89-97 或 89-96 (L3)以及 VH 上的 26-35 (Hl)、50-65 或 49-65 (H2)和 93-102、94-102或95-102 (H3)。對(duì)于這些定義的每一個(gè)，可變域殘基根據(jù)上文的Kabat et al.來編號(hào)。
[0108]“框架”或“FR”殘基是除了本文所定義的HVR殘基以外那些可變域殘基。
[0109]術(shù)語(yǔ)“如Kabat中的可變域殘基編號(hào)”或“如Kabat中的氨基酸位置編號(hào)”及其變化，意指在Kabat et al.，見上文中用于編輯抗體的重鏈可變域或輕鏈可變域的編號(hào)系統(tǒng)。利用這個(gè)編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可以含有對(duì)應(yīng)于可變域的FR或HVR的縮短或插入的更少或額外的氨基酸序列。例如，重鏈可變域可以包含H2的52號(hào)殘基后的單個(gè)氨基酸插入(根據(jù)Kabat的52a殘基)和重鏈FR82號(hào)殘基后插入的殘基(例如，根據(jù)Kabat的82a號(hào)、82b號(hào)和82c號(hào)殘基等)。給定抗體的殘基的Kabat編號(hào)可以通過用“標(biāo)準(zhǔn)”Kabat編號(hào)的序列比對(duì)抗體序列的同源性區(qū)域來確定.。
[0110]Kabat編號(hào)系統(tǒng)通常在涉及可變域中的殘基時(shí)使用(大約輕鏈的1-107個(gè)殘基和重鏈的 1_113 個(gè)殘基)(例如，Kabat et al., Sequences of Immunological Interest.5thEd(免疫學(xué)所關(guān)注的蛋白的序列，第5版)?！癊U編號(hào)系統(tǒng)”或“EU索引(EU index)”通常在涉及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時(shí)使用(例如，上文的Kabat et al.，所報(bào)道的EU索引)?！癒abat中的EU索引”意指人IGlEU抗體的殘基編號(hào)。除非本文中另外指明，對(duì)抗體可變域中殘基號(hào)碼的涵義表示Kabat編號(hào)系統(tǒng)的殘基編號(hào)(例如，參見美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/640，323號(hào)，EU編號(hào)的附圖)。
[0111]“親和力成熟”的抗體是在其一個(gè)或多個(gè)HVR中具有一個(gè)或多個(gè)改變的抗體，與不具有那些改變的親本抗體(parent antibody)相比,所述改變改善了抗體對(duì)抗原的親和力。在一實(shí)施方案中，親和力成熟的抗體具有對(duì)靶抗原的納摩爾甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟的抗體可以利用本領(lǐng)域已知的某些方法來制備。例如，Marks et al., Bio/TechnologylO:779-783 (1992)描述了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組(shuffling)的親和力成熟。描述了 HVR殘基和/或框架殘基的隨機(jī)誘變描述于:Barbas et al., Proc Nat.Acad.Sc1.USA91:3809-3813(1994) ；Schier et al.，Genel69:147-155(1995);Yelton et al., J.1mmunol.155:1994-2004(1995) ;Jackson et al.，J.1mmunol.154(7):3310—9(1995)；和Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
[0112]“封閉性”抗體(“blocking”antibody)或“拮抗”抗體(“antagonist”antibody)是抑制或降低其結(jié)合的抗原的生物活性的抗體。某些封閉性抗體或拮抗抗體基本或完全抑制抗原的生物活性。
[0113]本文所用的“激動(dòng)抗體(agonist antibody) ”是部分或完全模擬所目的多肽的至少一種功能活性的抗體。
[0114]“生長(zhǎng)抑制”抗體是防止或降低表達(dá)該抗體結(jié)合的抗原的細(xì)胞增殖的那些抗體。
[0115]抗體“效應(yīng)子功能”意指可歸因于抗體的Fe區(qū)(天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變異Fe區(qū))并隨抗體同種型而變化的那些生物活性?？贵w效應(yīng)子功能的實(shí)例包括:Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC) ,Fe受體結(jié)合、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細(xì)胞表面受體(例如，B細(xì)胞受體)的下調(diào)以及B細(xì)胞活化。
[0116]本文的術(shù)語(yǔ)“Fe區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)，其包括天然序列Fe區(qū)和變異Fe區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈的Fe的邊界可能變化，但是人IgG重鏈Fe區(qū)通常限于從Cys226或Pro230位置的氨基酸殘基伸展至該重鏈的羧基末端。Fe區(qū)的C-末端賴氨酸(EU編號(hào)系統(tǒng)的447號(hào)殘基)可以被去除，例如，在抗體的制備或純化期間，或者通過對(duì)編碼該抗體重鏈的核酸進(jìn)行重組改造。因此，完整抗體的組合物可以包含全部K447殘基被去除的抗體群、K447殘基未被去除的抗體群以及含有和不含K447殘基的抗體的混合物的抗體群。
[0117]“功能性Fe區(qū)”具有天然序列Fe區(qū)的“效應(yīng)子功能”。示例性“效應(yīng)子功能”包括Clq結(jié)合、⑶C、Fc受體結(jié)合、ADCC、吞噬作用、細(xì)胞表面受體(例如，B細(xì)胞受體)的下調(diào)等。這些效應(yīng)子功能通常要求Fe區(qū)與結(jié)合域(例如，抗體可變域)結(jié)合，并且可以利用例如在本文的定義中所公開的各種測(cè)定來評(píng)價(jià)。
[0118]“天然序列Fe區(qū)”包含與在自然界中發(fā)現(xiàn)的Fe區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fe區(qū)包含天然序列人IgGlFc區(qū)(非A和A異型)、天然序列人IgG2Fc區(qū)、天然序列人IgG3Fc和天然序列人IgG4Fc區(qū)，以及上述的天然存在的變體。
[0119]“變異Fe區(qū)”包含由于至少一個(gè)氨基酸修飾，優(yōu)選一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代而與天然序列Fe區(qū)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。優(yōu)選地，變異Fe區(qū)與天然序列Fe區(qū)相比或與親本多肽的Fe區(qū)相比，在天然序列Fe區(qū)中或在親本多肽的Fe區(qū)中具有至少一個(gè)氨基酸取代，例如約I至約10個(gè)氨基酸取代，優(yōu)選約I至約5個(gè)氨基酸取代。優(yōu)選地，本文Fe區(qū)的變體與天然序列Fe區(qū)和/或親本多肽的Fe區(qū)具有至少約80%的同源性，最優(yōu)選至少約90%的同源性，更優(yōu)選至少約95%的同源性。
[0120]“Fe受體”或“FcR”描述與抗體的Fe區(qū)結(jié)合的受體。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)cR是天然的人FcR。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)cR是結(jié)合IgG抗體的FcR( Y受體)，并且包括FcyRI, FcyRII和FcyRIII亞組的受體，包括這些受體的等位基因變體和可選擇的剪接形式。FcyRII受體包括Fe Y RIIA( “激活受體”)Fe y RIIB ( “抑制受體”)，它們具有類似的氨基酸序列，該氨基酸序列主要的不同在于它們的胞質(zhì)域。激活受體Fe Y RIIA在其胞質(zhì)域中含有基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fe Y RIIB在其胞質(zhì)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見，例如DaSroii, Annu.Rev.1mmunol.15:203-234(1997))。例如，F(xiàn)cR 總結(jié)于 Ravetch and Kinet, Annu.Rev.1mmunol9:457-92(1991);Capel et al.，Immunomethods4:25-34 (1994)和 de Haas etal., J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995))中。本文的術(shù)語(yǔ) “FcR” 包含其他 FcR，其包括將來要鑒定的那些FcR。
[0121]術(shù)語(yǔ)“Fe受體”或“FcR”還包括新生受體FcRn，其負(fù)責(zé)母體IgG向胎兒的轉(zhuǎn)移(Guyer et al.，J.1mmunol.117:587(1976)和 Kim et al.，J.1mmunol.24:249(1994))和免疫球蛋白體內(nèi)平衡的調(diào)節(jié)。測(cè)量結(jié)合FcRn的方法是已知的(參見，例如，Ghetie andWard., Tmmunol.Todayl8(12):592-598(1997);Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640(1997);Hinton et al.，J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004);W02004/92219(Hinton et al.)。 [0122]可以在體內(nèi)測(cè)定與人FcRn的結(jié)合及人FcRn高親和力結(jié)合多肽的血清半衰期，例如在轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)染的表達(dá)人FcRn的人細(xì)胞系中，或者在給予了具有變異Fe區(qū)的多肽的靈長(zhǎng)類中。W02000/42072 (Presta)描述了與FcR的結(jié)合獲得改善或減弱的抗體變體。還參見，例如 Shields et al., J.Biol.Chem.9 (2): 6591-6604 (2001) ?
[0123]“人效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞表達(dá)至少Fe Y RIII并行使ADCC效應(yīng)子功能。調(diào)節(jié)ADCC的人白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞以及嗜中性粒細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以分離自天然來源，例如血液。
[0124]“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或“ADCC”意指細(xì)胞毒性的形式，其中，分泌的Ig結(jié)合至存在于某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，NK細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上的Fe受體(FcR)，從而使這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞特異地結(jié)合至帶有抗原的靶細(xì)胞并隨后用細(xì)胞毒素殺死該靶細(xì)胞。介導(dǎo)ADCC的初級(jí)細(xì)胞，即NK細(xì)胞，只表達(dá)Fe Y RIII ;而單核細(xì)胞表達(dá)Fe Y R1、Fe Y RII 和 Fe Y RIII。造血細(xì)胞上 FcR 的表達(dá)總結(jié)于 Ravetch and Kinet, Annu.Rev.1mmunol9:457-92 (1991)的第464頁(yè)的表3中。為了評(píng)價(jià)目的分子的ADCC活性，可以進(jìn)行如美國(guó)專利5，500, 362號(hào)或5，821，337號(hào)或者美國(guó)專利6，737，056號(hào)(Presta)所述的體外ADCC測(cè)定。這類測(cè)定可用的效應(yīng)細(xì)胞包括PBMC和NK細(xì)胞。可選擇地，或者另外，可以體內(nèi)評(píng)價(jià)目的分子的ADCC活性，例如在Clynes et al.，PNAS (USA) 95:652-656 (1998)所公開的動(dòng)物模型中。
[0125]“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”意指靶細(xì)胞在補(bǔ)體的存在下的裂解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的活化由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)與(合適亞組的)抗體的結(jié)合引發(fā)，該抗體結(jié)合至它們的同源抗原。為了評(píng)價(jià)補(bǔ)體活化，可以進(jìn)行⑶C測(cè)定,如Gazzano-Santoro et al., J.1mmunol.Methods202:163 (1996)所述的⑶C測(cè)定。Fe區(qū)氨基酸序列發(fā)生改變(具有變異Fe區(qū)的多肽)且Clq結(jié)合能力增加或減少的多肽變體描述于美國(guó)專利6，194，551B1號(hào)和W01999/51642 中。還參見，例如 Idusogie et al.，J.1mmunol.164:4178-4184(2000)。
[0126]術(shù)語(yǔ)“包含F(xiàn)e區(qū)的抗體”意指包含F(xiàn)e區(qū)的抗體。Fe區(qū)的C-末端賴氨酸(根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)的447號(hào)殘基)可以被去除，例如，在抗體的制備或純化期間，或者通過對(duì)編碼該抗體重鏈的核酸進(jìn)行重組改造。因此，包含具有Fe區(qū)的抗體的本發(fā)明的組合物可以包含具有K447的抗體、去除了全部K447的抗體，或者含有和不含K447殘基的抗體的混合物。
[0127]“結(jié)合親和力”通常指分子(例如，抗體)的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合對(duì)象(例如，抗原)之間非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另外指明，本文所用的“結(jié)合親和力”意指內(nèi)在結(jié)合親和力，其反映結(jié)合對(duì)(例如，抗體與抗原)的成員之間1:1的相互作用。分子X對(duì)其對(duì)象Y的親和力通常表示為解離常數(shù)(Kd)。親和力可以通過包括本文所述的那些方法在內(nèi)的本領(lǐng)域已知的方法來測(cè)量。低親和力抗體通常緩慢地結(jié)合抗原，并容易趨向于分離，而高親和力抗體通常較快地結(jié)合抗原并趨向于保持較長(zhǎng)的結(jié)合。測(cè)量結(jié)合親和力的各種方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，其中任何方法都可以用于本發(fā)明的目的。在下文中描述了用于測(cè)量結(jié)合親和力的具體說明性和示例性實(shí)施方案。
[0128]在一實(shí)施方案中，如下文的測(cè)定所述的，本發(fā)明的“Kd”或“Kd值”通過用目的抗體的Fab形式及其抗原進(jìn)行 的放射性標(biāo)記的抗原結(jié)合測(cè)定(RIA)來測(cè)量。Fab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和力通過下述步驟來測(cè)量:用最小濃度的(125I)標(biāo)記的抗原在滴定系列(titrationseries)的未標(biāo)記的抗原的存在下平衡Fab，然后用涂有抗-Fab抗體的板捕獲結(jié)合的抗原。(參見，例如 Chen et al.，J.Mol.Biol.293:865-881 (1999))。為了建立該測(cè)定的條件，將
MICROTITER1、多孔板(Thermo Scientific)用在 50mM 碳酸鈉(pH9.6)中的 5μg/ml
捕捉抗-Fab抗體(Cappel Labs)過夜涂覆，隨后用PBS中的2%(w/v)牛血清白蛋白在室溫下(約230C )封閉2-5小時(shí)。在非吸附板中(Nunc#269620)，將IOOpM或26pM[125I]-抗原與連續(xù)稀釋的目的Fab (例如，與抗VEGF抗體的評(píng)價(jià)一致的Fab_12, Presta et al., CancerRes.57:4593-4599(1997))混合。然后將目的Fab孵育過夜；然而，孵育可以持續(xù)更長(zhǎng)的時(shí)間(例如，約65小時(shí))，以確保達(dá)到平衡。隨后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉板以在室溫下孵育(例如，I小時(shí))。然后去除溶液去除并將板用PBS中的0.1%TWEEN_20?洗滌8次。將板干燥后，添加 150 μ I/ 孔的閃爍劑(scintillant) (MICR0SCINT-20?;Packard)，并將板在 T0PC0UNT?Υ計(jì)數(shù)器(Packard)上計(jì)數(shù)10分鐘。選擇給出小于或等于20%的最大結(jié)合的每種Fab的濃度用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定。
[0129]根據(jù)另一實(shí)施方案，Kd或Kd值利用表面等離子共振測(cè)定來測(cè)量，其利用
BIACORE? -2000 或 BIACORE? -3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway, NJ)，用約 10 應(yīng)答
單位(RU)的固定抗原CM5芯片在25°C下進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，將羧甲基化的葡聚糖生物傳感器芯片(CM5，BIACORE, Inc.)用鹽酸N-乙基-N’ _ (3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)根據(jù)供應(yīng)商的說明書活化。將抗原用pH4.8的IOmM乙酸鈉稀釋至5 μ g/ml (~0.2 μ Μ)，然后以5 μ I/分鐘的流速注入以實(shí)現(xiàn)約10應(yīng)答單位(RU)的偶聯(lián)蛋白。注入抗原后，注入IM的乙醇胺以封閉未反應(yīng)的基團(tuán)。對(duì)于動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25°C下，以約25 μ 1/min的流速注入在含有0.05%TWEEN-20?表面活性劑的PBS中(PBST)兩倍連續(xù)稀釋的Fab (0.78nM至500nM)。結(jié)合速率(kj和解離速率(k。^)利用簡(jiǎn)單的一對(duì)一朗繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIACORE %評(píng)價(jià)軟件，3.2版)，通過同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖(sensorgram)來計(jì)算。平衡解離常數(shù)(Kd)計(jì)算為比值。參見,例如,Chen etal.，J.Mol.Biol.293:865-881 (1999)。如果通過上文的表面等離子共振測(cè)定的結(jié)合速率超過則該結(jié)合速率可以利用熒光淬滅技術(shù)來確定，其測(cè)量pH為7.2的PBS中20nM抗抗原抗體(Fab形式)的突光發(fā)射強(qiáng)度的增加或減少(激發(fā)=295nm ;發(fā)射=340nm, 16nm通帶)，其條件是25°C和存在通過分光計(jì)測(cè)量的漸增濃度的抗原，例如配備停流(stop-flow)的分光光度計(jì)(spectrophometer) (Aviv Instruments)或具有攪拌的比色杯的8000系列SLM-AMINCO? 分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)。
[0130] 本發(fā)明的“結(jié)合速率(on-rate) ”、“結(jié)合速率(rate of association) ”、“結(jié)合速率(association rate) ”或“k。/可以如上文所述地利用 BIACORE?-2000 或BIACORE》-3000 系統(tǒng)(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)來確定。
[0131]本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本上類似”或“基本上相同”表示兩個(gè)數(shù)值(例如，與本發(fā)明的抗體相關(guān)的一個(gè)數(shù)值和與參考/比較抗體相關(guān)的另一數(shù)值)之間充分的高度相似性，從而本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為兩個(gè)值之間的差異在通過所述值(例如，Kd值)測(cè)量的生物學(xué)特征的語(yǔ)境中具有很小的或沒有生物學(xué)和/或統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。作為參考/比較值的函數(shù)，所述兩個(gè)值之間的差異為，例如，小于約50%、小于約40%、小于約30%、小于約20%和/或小于約 10% ο
[0132]本文所用的短語(yǔ)“基本上減少”或“基本上不同”表示兩個(gè)數(shù)值之間充分的高度差異(通常，與分子有關(guān)的一個(gè)數(shù)值和與參考/比較分子有關(guān)的另一數(shù)值)，從而本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為兩個(gè)值之間的差異在在通過所述值(例如，Kd值)測(cè)量的生物學(xué)特征的語(yǔ)境中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。作為參考/比較值的函數(shù)，所述兩個(gè)值之間的差異為，例如，大于約10%、大于約20%、大于約30%、大于約40%和/或大于約50%。
[0133]用于本文目的的“接受體人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL框架或VH框架的氨基酸序列的框架?！霸醋浴比嗣庖咔虻鞍卓蚣芑蛉斯灿锌蚣艿慕邮荏w人框架可以包含與人免疫球蛋白框架或人共有框架相同的氨基酸序列，或者其可以含有已存在的氨基酸變化。在一些實(shí)施方案中，已存在的氨基酸變化的數(shù)目是10或小于10、9或小于9、8或小于8、7或小于7、6或小于6、5或小于5、4或小于4、3或小于3或者2或小于
2。當(dāng)已存在的氨基酸變化存在于VH中時(shí)，優(yōu)選地這些氨基酸變化僅發(fā)生在71H、73H和78H位置的3個(gè)、2個(gè)或I個(gè)處，例如，位于這些位置的氨基酸殘基可以是71A、73T和/或78A。在一實(shí)施方案中，VL接受體人框架在序列上與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
[0134]“人共有框架”是在選擇人免疫球蛋白VL或VH框架序列時(shí)，代表最常出現(xiàn)的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列選自可變域序列的子群。通常序列的子群是上文Kabat et al.中的子群。在一實(shí)施方案中，對(duì)于VL，子群是上文Kabat et al.中的子群K I。在一實(shí)施方案中，對(duì)于VH，子群是上文Kabat et al.中的子群III。
[0135]“VH子群III共有框架”包含獲得自Kabat et al.的可變重鏈子群III中的氨基酸序列的共有序列。在一實(shí)施方案中，VH子群III共有框架氨基酸序列包含每個(gè)下述序列的至少一部分或全部:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO: 31) -H1-WVRQAPGKGLEffV (SEQID NO:32)-H2-RFTISADTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO:33)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQID NO:34)。參見圖 4。
[0136]“VL子群I共有框架”包含獲得自Kabat et al.的可變輕鏈κ子群I中的氨基酸序列的共有序列。在一實(shí)施方案中，VH子群I共有框架氨基酸序列包含每個(gè)下述序列的至少一部分或全部:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO: 35) -Ll-ffYQQKPGKAPKLLIY (SEQID NO:36)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:37)-L3-FGQGTKVEIK(SEQID NO:38)。參見圖 5。
[0137]如本文所用的，“密碼子組(codon set) ”意指用于編碼期望的變異氨基酸的一組不同的核苷酸三聯(lián)序列。例如，可以通過固相合成合成一組寡核苷酸，其包含代表由密碼子組所提供的核苷酸三聯(lián)密碼的全部可能組合的序列并且編碼期望組的氨基酸。標(biāo)準(zhǔn)形式的密碼子命名(designation)是IUB編碼的命名，其在本領(lǐng)域中是已知的并且描述于本文中。密碼子組通常由3個(gè)斜體大寫字母表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK等。因此，本文所用的“非隨機(jī)密碼子組”意指編碼所選氨基酸的密碼子組，其部分地，優(yōu)選完全地執(zhí)行如本文所述氨基酸選擇標(biāo)準(zhǔn)。在某些位置具有所選的核苷酸“簡(jiǎn)并性”的寡核苷酸的合成在該領(lǐng)域是已知的，例如，TRIM 方法(Knappek et al.(1999) J.Mol.Biol.296:57-86) ;Garrard&Henner (1993)Genel28:103) 。具有確定密碼子組的這些寡核苷酸組可以利用商業(yè)核酸合成儀(例如，可商購(gòu)自Applied Biosystems, Foster City, CA)合成,或者是可以商購(gòu)的(例如，購(gòu)自Life Technologies, Rockville, MD)。因此,具有特定密碼子組的一組合成的寡核苷酸通常包含具有不同序列的多個(gè)寡核苷酸，并且由密碼子組在整體序列中建立差異。本發(fā)明所用的寡核苷酸具有允許與可變域核酸模板雜交的序列，并且還可以，但不是必須地包含用于，例如克隆目的的限制性酶切位點(diǎn)。
[0138]表述“線性抗體”意指在Zapata et al.(1995Protein Eng, 8 (10): 1057-1062)中所述的抗體。簡(jiǎn)而言之，這些抗體包含的一對(duì)串聯(lián)的Fd節(jié)段(Vh-Ch1-Vh-ChI),其與互補(bǔ)輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。
[0139]如本文所用的，“文庫(kù)”意指多個(gè)抗體序列或抗體片段序列(例如，本發(fā)明的多肽)，或編碼這些序列的核酸，并且序列在根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)入這些序列的變異氨基酸的組合中是不同的。
[0140]“噬菌體展示”是將各種變異多肽作為與至少一部分外殼蛋白的融合蛋白展示到噬菌體表面的技術(shù)，例如絲狀噬菌體、顆粒。噬菌體展示的用途在于可以將隨機(jī)蛋白變體的大文庫(kù)快速和有效地對(duì)以高親和力與靶抗原結(jié)合的那些序列進(jìn)行分類。肽和蛋白文庫(kù)在噬菌體上的展示已經(jīng)用于從上百萬(wàn)種多肽篩查具有特定結(jié)合特性的多肽。多價(jià)噬菌體展示方法已經(jīng)用于通過與絲狀噬菌體基因III或基因VIII融合展示小隨機(jī)肽和小蛋白。Wells and Lowman(1992)Curr.0pin.Struct.Biol.3:355-362,和本文所引用的參考文獻(xiàn)。在單價(jià)噬菌體展示中，將蛋白或肽文庫(kù)與基因III或其部分融合，并在野生型基因III蛋白的存在下低水平表達(dá)，從而噬菌體顆粒展示該融合蛋白的一個(gè)拷貝或不展示該融合蛋白。相對(duì)于多價(jià)噬菌體，降低了親和力影響，從而分類基于內(nèi)在配體親和力，并且使用噬菌粒載體，這簡(jiǎn)化了 DNA 操作。Lowman and Wells (1991)Methods:A companion to Methods inEnzymology (方法:酶學(xué)方法參考書)3:205-0216。
[0141]“噬菌?！笔蔷哂屑?xì)菌復(fù)制起點(diǎn)如ColEl和噬菌體基因間區(qū)拷貝的質(zhì)粒載體。噬菌?？梢杂糜谌魏我阎氖删w，包括絲狀噬菌體和λ噬菌體。質(zhì)粒通常還含有抗生素抗性選擇標(biāo)志物?？寺∪脒@些載體的DNA節(jié)段可以作為質(zhì)粒增殖。當(dāng)為帶有這些載體的細(xì)胞提供了產(chǎn)生噬菌體顆粒所需的全部基因時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制模式變成滾環(huán)復(fù)制以產(chǎn)生質(zhì)粒DNA —條鏈的拷貝并包裝噬菌體顆粒。噬菌?？梢孕纬筛腥拘曰蚍歉腥拘允删w顆粒。這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括噬菌粒，其含有與異源多肽基因連接的、作為基因融合物的噬菌體外殼蛋白基因或其片段，從而該異源多肽展示在噬菌體顆粒的表面。
[0142]術(shù)語(yǔ)“噬菌體載體”表示含有異源基因并且能夠復(fù)制的雙鏈復(fù)制形式的噬菌體。噬菌體載體具有允許噬菌體復(fù)制和噬菌體顆粒形成的噬菌體復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選地，噬菌體是絲狀噬菌體，如M13、fl、fd、Pf3噬菌體或上述的衍生物；或者λ噬菌體，如A、21、phi80、phi81、82、424、434等，或上述的衍生物。
[0143]本文所用的“溶劑可及位置”意指來源抗體或抗原結(jié)合片段的重鏈和輕鏈的可變區(qū)中氨基酸殘基的位置，該位置是基于抗體或抗原結(jié)合片段的結(jié)構(gòu)、整體結(jié)構(gòu)和/或模擬結(jié)構(gòu)確定的，其對(duì)于溶劑與諸如抗體特異性抗原的分子的接近和/或接觸是潛在可用的。通常在CDR和蛋白的外面發(fā)現(xiàn)這些位置。如本文所定義的抗體或抗原結(jié)合片段的溶劑可及位置可以利用本領(lǐng)域已知的許多算法中的任何算法來確定。在一實(shí)施方案中，溶劑可及位置利用抗體的三維模型的坐標(biāo)來確定，優(yōu)選地利用諸如InsightII程序(Accelrys, SanDiego, CA)的計(jì)算機(jī)程序來確定。溶劑可及位置還可以利用本領(lǐng)域已知的算法來確定(例如，Lee and Richards (1971) J.Mol.Biol.55, 379and Connolly (1983) J.Appl.Cryst.16，548)。溶劑可及位置的確定可以利用適合蛋白建模的軟件和獲得自抗體的三維結(jié)構(gòu)信息來進(jìn)行?？梢杂糜谶@些目的的軟件包括SYBYL Biopolymer Module (SYBYL生物高分子模塊)軟件(Tripos Associates)。通常，當(dāng)算法(程序)要求用戶輸入大小參數(shù)時(shí)，將計(jì)算中所用的探針的“大小”設(shè)為半徑為1.4?；蚋?。另外，PaCi0S(1994)C0mput.Chem.18(4):377-386已經(jīng)描述了利用個(gè)人計(jì)算機(jī)的軟件確定溶劑可及區(qū)和面積的方法。
[0144]“血管生成因子或試劑(angiogenic factor or agent) ”是刺激血管發(fā)育,例如，促進(jìn)血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、血管穩(wěn)定性和/或血管形成等的生長(zhǎng)因子。例如，血管生成因子包括但不限于，例如VEGF和VEGF家族的成員；P1GF家族的成員；H)GF家族的成員；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGF)的成員；TIE配體(促血管生成素)；肝配蛋白；δ樣配體4(DLL4) ；Del-l ;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子:酸性(aFGF)和堿性(bFGF);濾泡素抑制素；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF);肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)/分散因子(SF);白細(xì)胞介素_8 (IL-8)；瘦蛋白；中期因子；神經(jīng)氈蛋白；胎盤生長(zhǎng)因子；血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(H)-ECGF)；血小板衍生生長(zhǎng)因子，特別是I3DGF-BB或TOGFR-β ;多營(yíng)養(yǎng)因子(PTN);顆粒蛋白前體(Progranulin)、增殖蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-a (TGF-α )、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)等。血管生成因子還包括加速傷口愈合的因子，如生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 (IGF-1)、VIGF、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、CTGF和其家族的成員以及TGF-a和 TGF-β ο 參見，例如 Klagsbrun and D，Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39 ；Streit and Detmar(2003)Oncogene22:3172-3179 ；Ferrara&Alitalo(1999)NatureMedicine5 (12):1359-1364 ;Tonini et al.(2003) 0ncogene22:6549-6556 (例如，表 I 所列的已知血管生成因子);和 Sato (2003) Int.J.Clin.0ncol.8:200-206。
[0145]“抗血管生成劑”或“血管生成抑制劑”意指小分子量的物質(zhì)、多核苷酸(包括，例如，抑制性RNA(RNAi or siRNA))、多肽、分離的蛋白、重組蛋白、抗體或其偶聯(lián)物或融合蛋白，它們直接或間接地抑制血管生成、血小管生成(vasculogenesis)或不期望的血管通透性。應(yīng)當(dāng)理解，抗血管生成劑包括結(jié)合并阻斷血管生成因子或其受體的血管生成活性的那些試劑。例如，抗血管生成劑是如上文所定義的血管生成試劑的抗體或其他拮抗劑，例如，VEGF-A的抗體或VEGF-A受體(例如，KDR受體或Flt-1受體)的抗體、諸如GleeVecTM(甲磺酸伊馬替尼)的抗I3DGFR抑制劑、阻斷VEGF受體信號(hào)的小分子(例如，PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT? /SU11248 (蘋果酸舒尼替尼)、AMG706 或在例如國(guó)際專利申請(qǐng)W02004/113304中所述的那些小分子)?？寡苌蓜┻€包括天然血管生成抑制劑，例如血管生成抑制素(angiostatin)、內(nèi)皮抑制素(endostatin)等。參見，例如 Klagsbrun and Dj Amore (1991) Annu.Rev.Physiol.53:217-39 ；Streit andDetmar (2003)0ncogene22:3172-3179(例如，表3列舉了惡性黑素瘤中的抗血管生成療法)；Ferrara&Alitalo(1999)Nature Medicine5(12):1359-1364 ;Tonini et al.(2003)0ncogene22:6549-6556 (例如，表2列舉了已知的抗血管生成因子);以及Sato (2003) Int.J.Clin.0ncol.8:200-206(例如，表1列舉了用于臨床試驗(yàn)的抗血管生成試劑)。
[0146]本文所用的術(shù)語(yǔ)“VEGF”或“VEGF-A”意指如Leung et al.(1989) Science246:1306和Houck et al.(1991) Mol.Endocrin, 5:1806所述的165個(gè)氛基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，和相關(guān)的121、189和206個(gè)氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，及上述的天然存在的等位基因形式和加工形式。術(shù)語(yǔ)“VEGF”還意指來自諸如小鼠、大鼠或靈長(zhǎng)類的非人物種的VEGF0有時(shí)，來自特定物種的VEGF用下述術(shù)語(yǔ)表示:hVEGF表示人VEGF、mVEGF表示鼠VEGF等。術(shù)語(yǔ)“VEGF”還用于指包含165個(gè)氨基酸的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子中的氨基酸8-109或1-109的多肽的截短形式?？梢酝ㄟ^例如“VEGF(8-109) ”、“VEGF(1_109) ”或“VEGF165”確定本申請(qǐng)中所引用的任何這類形式的VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置通過天然VEGF序列中所標(biāo)明的位置來編號(hào)。例如，截短的天然VEGF中的氨基酸位置17(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的位置17 (甲硫氨酸)。截短的天然VEGF對(duì)KDR和Flt-1受體的結(jié)合親和力與天然VEGF相當(dāng)。
[0147]“抗VEGF抗體”是以足夠的親和力和特異性與VEGF結(jié)合的抗體。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗VEGF抗體是抗體B20-4.1.1。仍然在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗VEGF抗體是B20-4.1.1RR。仍然在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗VEGF抗體可以用作靶向和干擾涉及VEGF活性的疾病或疾病狀態(tài)(condition)中的治療劑?？筕EGF抗體通常不與諸如VEGF-B或VEGF-C的其他VEGF同源物結(jié)合，也不與諸如P1GF、PDGF或bFGF的其他生長(zhǎng)因子結(jié)合。
[0148] 抗VEGF抗體“貝伐單抗(BV) ”，也稱作“rhuMAb VEGF”或“ AVASTIN"'",是根據(jù)Presta et al.(1997) Cancer Res.57:4593-4599 產(chǎn)生的重組人源化抗 VEGF 單克隆抗體。其包含突變的人IgGl框架區(qū)和來自鼠抗hVEGF單克隆抗體A.4.6.1的抗原結(jié)合互補(bǔ)性決定區(qū)，所述單克隆抗體阻斷人VEGF與其受體的結(jié)合。約93%的貝伐單抗的氨基酸序列，包括大部分框架區(qū)，源自人IgGl ;而約7%的序列源自鼠抗體A4.6.1。貝伐單抗的分子量為約149，000，并且是糖基化的。
[0149]本文所用的術(shù)語(yǔ)“B20系列多肽”意指包括與VEGF結(jié)合的抗體在內(nèi)的多肽。B20系列多肽包括但不限于如美國(guó)公開20060280747號(hào)、美國(guó)公開20070141065和/或美國(guó)公開20070020267號(hào)所述的源自B20抗體序列的抗體或者B20來源的抗體，這些專利申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用明確地并入本文。在一實(shí)施方案中，B20系列多肽是如美國(guó)公開20060280747號(hào)、美國(guó)公開20070141065號(hào)和/或美國(guó)公開20070020267號(hào)所述的B20-4.1。
[0150]本文所用的術(shù)語(yǔ)“B20-4.1.1”指與VEGF結(jié)合的抗體，并包含抗體，其中HVR-Hl為SEQ ID N0:1 ;HVR-H2 為 SEQ ID NO:2 ;HVR_H3 為 SEQ ID NO:3 ;HVR_L1 為 SEQ ID NO:4 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO:6 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO:7。
[0151]本文所用的術(shù)語(yǔ)“B20-4.1.1RR”意指與VEGF結(jié)合的抗體，并包含抗體，其中HVR-Hl 為 SEQ ID NO:1 ;HVR_H2 為 SEQ ID NO: 2 ;HVR_H3 為 SEQ ID NO: 3 ;HVR_L1 為 SEQ IDNO:5 ；HVR-L2 為 SEQ ID NO:6 ；HVR-L3 為 SEQ ID NO:7。
[0152]本文所用的術(shù)語(yǔ)“G6-31”是如美國(guó)公開20060280747號(hào)、美國(guó)公開20070141065號(hào)和/或美國(guó)公開20070020267號(hào)所述的G6系列多肽中的一種。如美國(guó)公開20060280747號(hào)、美國(guó)公開20070141065號(hào)和/或美國(guó)公開20070020267號(hào)所述的其他G-6系列多肽，包括但不限于G6-8和G6-23。
[0153]對(duì)于VEGF多肽，術(shù)語(yǔ)“生物活性(biological activity) ”和“生物活性(biologically active) ”指與VEGF有關(guān)的物理/化學(xué)特性和生物學(xué)功能。 [0154]“VEGF拮抗劑”意指能夠中和、阻斷、抑制、終止、降低或干擾VEGF活性的分子，該VEGF活性包括但不限于其與一種或多種VEGF受體的結(jié)合。VEGF拮抗劑包括但不限于抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段；受體分子和衍生物，其與VEGF特異性結(jié)合，借此使其不能與一種或多種受體結(jié)合；抗VEGF受體抗體和VEGF受體拮抗劑，如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑。本文所用的術(shù)語(yǔ)“VEGF拮抗劑”特別包括與VEGF結(jié)合并且能夠中和、阻斷、抑制、終止、降低或干擾VEGF活性的分子，包括抗體、抗體片段、其他結(jié)合多肽、肽以及非肽小分子在內(nèi)。因此，術(shù)語(yǔ)“VEGF活性”特別包括VEGF的VEGF介導(dǎo)的生物活性(如上文所定義的)。在一實(shí)施方案中，VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體B20-4.1.1。仍然在另一實(shí)施方案中，VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體B20-4.1.1RR。
[0155]如本文所用的，“治療”(和諸如“治療(treat)”或“治療(treating) ”的變體)意指意圖改變被治療的個(gè)體或細(xì)胞的自然過程的臨床干預(yù)，并且可以用于預(yù)防或在臨床病理學(xué)過程中進(jìn)行。治療的期望效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩和癥狀、減少疾病的任何直接或間接病理結(jié)果、預(yù)防轉(zhuǎn)移、降低疾病惡化的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)以及緩解或改善預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于延緩疾病或病癥的發(fā)展或者用于減慢疾病或病癥的惡化。
[0156]“長(zhǎng)期”給藥意指與和急性模式相反的連續(xù)模式的試劑的給藥，從而將初始治療效果(活性)維持至延長(zhǎng)的時(shí)間段?！伴g歇”給藥指治療不是連續(xù)不間斷進(jìn)行的，但是本身是周期的。
[0157]“病癥”是會(huì)從治療受益的任何疾病狀態(tài)(例如，患有或需要預(yù)防異常血管生成(過度、不合適或不受控制的血管生成)或異常血管通透性的哺乳動(dòng)物)。這包括包括那些病理狀況在內(nèi)的慢性和急性病癥或疾病，其使哺乳動(dòng)物容易患有所討論的病癥。本文要治療的病癥的非限制性實(shí)例包括惡性和良性腫瘤、非白血病和淋巴惡性腫瘤；以及特別地，腫瘤(癌癥)轉(zhuǎn)移。
[0158]術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞增殖病癥”和“增殖病癥”意指與某種程度的異常細(xì)胞增殖有關(guān)的病癥。在一實(shí)施方案中，細(xì)胞增殖病癥是癌癥。
[0159]本文所用的“腫瘤”意指無論是惡性還是良性的全部腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，以及全部癌前和癌細(xì)胞和組織。本文所引的術(shù)語(yǔ)“癌癥”、“癌”、“細(xì)胞增殖病癥”、“增殖病癥”和“腫瘤”不是互斥的。[0160]術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌”意指或描述哺乳動(dòng)物的生理狀況，通常其特征為不受調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這些癌癥更具體的實(shí)例包括但不限于鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)(包括胃腸癌和胃腸基質(zhì)癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌或腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和各種類型的頭和頸癌、黑素瘤、淺表擴(kuò)散性黑素瘤、惡性雀斑樣痣黑素瘤、肢端雀斑樣痣性黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低度/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL);小淋巴細(xì)胞(SL)NHL沖度/濾泡性NHL沖度彌散性NHL ;高度免疫母細(xì)胞NHL ;高度原始淋巴細(xì)胞NHL ;高度小無裂細(xì)胞(small non-cleaved cell)NHL ；腫塊性病變(bulky disease) NHL ;套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)的淋巴瘤；以及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、多毛細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病和移植后淋巴組織增生病癥(PTLD)以及與斑痣性錯(cuò)構(gòu)瘤病有關(guān)的異常血管增殖、水腫(例如，與腦瘤有關(guān)的水腫)和梅格斯綜合征。
[0161]“個(gè)體(individual) ”、“個(gè)體(subject) ”或“患者”是脊椎動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于家畜(例如奶牛)、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(sportanimal)、寵物(例如貓、犬和馬)、靈長(zhǎng)類、小鼠和大鼠。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人。
[0162]術(shù)語(yǔ)“藥物制劑”意指使得活性成分的生物活性有效的形式的制劑，且其不含有對(duì)給予制劑的個(gè)體具有不可接受的毒性的其他組分。這類制劑可以是無菌的。
[0163]“無菌”制劑是消毒的或不含全部活微生物及其孢子。
[0164]“有效量”意指以劑量和在所需的時(shí)間段內(nèi)有效實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防結(jié)果的量。
[0165]本發(fā)明的物質(zhì)/分子的“治療有效量”可以根據(jù)諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重以及該物質(zhì)/分子在個(gè)體中引起期望的應(yīng)答的能力而變化。治療有效量包括治療有益效果超過物質(zhì)/分子的任何毒性或不良影響的量。“預(yù)防有效量”意指以劑量和在所需的時(shí)間段內(nèi)有效地實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防結(jié)果的量。通常但非必須，由于在疾病的較早期階段之前或早期階段時(shí)使用預(yù)防劑量，所以預(yù)防有效量小于治療有效量。
[0166]與一種或多種其他治療劑“聯(lián)合”給藥包括同時(shí)(同時(shí)(concurrent))給藥和以任何次序連續(xù)給藥。
[0167]本文所用的“媒介物(carrier) ”包括藥物可接受的媒介物、賦形劑或穩(wěn)定劑，其對(duì)以所用的劑量和濃度暴露于其下的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無毒的。通常生理可接受的媒介物是PH緩沖的水溶液。生理可接受的媒介物的實(shí)例包括諸如磷酸、檸檬酸和其他有機(jī)酸的緩沖液；包括抗壞血酸在內(nèi)的抗氧化劑；低分子量(小于10個(gè)殘基)多肽；諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白的蛋白質(zhì)；諸如聚乙烯吡咯烷酮的親水聚合物；諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸的氨基酸；單糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精在內(nèi)的其他碳水化合物；諸如EDTA的螯合劑；諸如甘露醇或山梨醇的糖醇；諸如鈉的成鹽反離子；和/或諸如TWEEN?、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS?的非離子表面活性劑。
[0168]“脂質(zhì)體”是由各種類型的脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小媒介物，其用于將藥物(例如VEGF多肽或其抗體)遞送至哺乳動(dòng)物。脂質(zhì)體的組分通常以雙層形式排列，這類似于生物膜的脂質(zhì)排列。
[0169]術(shù)語(yǔ)“抗腫瘤組合物”意指用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種活性治療劑，例如，“抗癌劑”。治療劑(抗癌劑)的實(shí)例包括但不限于，例如化療劑；生長(zhǎng)抑制劑；細(xì)胞毒性劑；用于放射療法的試劑；抗血管生成劑；凋亡劑；抗微管蛋白劑以及治療癌癥的其他試劑，例如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑(例如厄洛替尼(Tarceva?)、血小板衍生生長(zhǎng)因子抑制劑(例如Gleevec?(甲磺酸伊馬替尼))、C0X-2抑制劑(例如塞來昔布)、干擾素、細(xì)胞因子，與下述靶標(biāo)的一種或多種的結(jié)合拮抗劑(例如中和抗體):ErbB2、ErbB3、ErbB4、roGFR-0、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受體、TRAIL/Apo2 ;以及其他生物活性和有機(jī)化學(xué)試劑等。本發(fā)明還包括上述試劑的組合。
[0170]本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性劑”意指抑制或防止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞死亡或破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化療劑(例如氨甲蝶呤、阿霉素、長(zhǎng)春花生物堿(長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、依托泊苷)；多柔比星(doxorubicin)、苯丙氨酸氮芥、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔紅霉素或其他嵌入劑；諸如溶核酶的酶及其片段、抗生素；和諸如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物 或動(dòng)物來源的酶活毒素的毒素，包括其片段和/或變體；以及下文公開的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
[0171]“毒素”是能夠具有對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖具有不利效果的物質(zhì)。
[0172]“化療劑”是用于治療癌癥的化合物?；焺┑膶?shí)例包括烷化劑，如塞替派和
環(huán)磷酰胺(CYTOXAN?);烷基磺酸鹽，如白消安、英丙舒凡和和哌泊舒凡；η 丫丙唆，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；乙烯亞胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和三輕甲基蜜胺(trimethylomelamine);多聚乙酰(acetogenin)(特別是布拉他辛(bulIatacin)和布拉他辛酮(bulIatacinone)) ； δ -9-四氫大麻
酚(屈大麻酚，MARINOL? ) ; β -拉帕醌(Iapachone);拉帕醇；秋水仙堿；樺木酸；喜樹堿(包括合成的類似物托泊替康(HYCAMTIN?)、CPT-1l(伊立替康，CAMPTOSAR?:)、乙酰喜樹堿、東莨菪素(scopolectin)和9_氨基喜樹堿)；苔蘚抑素；海綿多烯酮類化合物(callystatin) ;CC_1065 (包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；鬼白毒素；鬼白酸；替尼泊苷；念珠藻環(huán)肽(特別是念珠藻環(huán)肽I和念珠藻環(huán)肽8);海兔毒素；倍癌霉素(包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾槽素；水鬼蕉堿(pancratistatin);匍枝珊瑚醇(sarcodictyin);海綿素;氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥；氯磷酰胺(chlOTophosphamide);雌莫司??；異環(huán)磷酰胺；氮芥；鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride);苯丙氨酸氮芥；新氮芥；苯芥膽甾醇(phenesterine);潑尼莫司?。磺装?；尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司??；抗生素，如烯二炔類(enediyne)抗生素(例如刺孢霉素，特別是刺孢霉素Y II和刺孢霉素ωΠ (參見，例如 Nicolaou et al., Angew.Chem Intl.Ed.Engl., 33:183-186 (1994)) ；CDP323,即口服α-4整聯(lián)蛋白抑制劑；達(dá)內(nèi)霉素(dynemicin)，包括達(dá)內(nèi)霉素Α;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌菌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)的色素蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))；阿克拉霉素；放線菌素；安曲霉素(authramycin);重氮絲氨酸；博來霉素；放線菌素C;卡柔比星(carabicin);洋紅霉素；嗜癌霉素(carzinophilin);色霉素；放線菌素D ;柔紅霉素；地托比星；6_重氣基_5_氧代-L-正売氛酸；多柔比星(包括ADRIAMYCIN?、嗎啉代-多柔比星、氰基嗎啉代-多柔比星、2-吡咯啉多柔比星
(2-pyrrolino-doxorubicin)、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射劑(D0XIL?)、脂質(zhì)體多柔比星
TLC D-99(MYOCET_?)、聚乙二醇化(peglylated)的脂質(zhì)體多柔比星(CAELYX?)和脫氧多柔比星)；表柔比星；依索比星；伊達(dá)比星；馬賽羅霉素；絲裂霉素，如絲裂霉素C ;麥考酚酸；諾拉霉素；橄欖霉素；培洛霉素；泊非霉素；嘌羅霉素；三鐵阿霉素；羅多比星；鏈黑霉素；鏈佐星；殺結(jié)核菌素；烏苯美司；凈司他丁 ；佐柔比星；抗代謝物，如氨甲蝶呤、吉西他濱(GE_MZAR?)、替加氟(UFT0RAL?)、卡培他濱(XELODA?)、
埃坡霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU);康普瑞?。蝗~酸類似物，如二甲葉酸、氨甲蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，如卡魯睪酮、丙酸曲他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺物(ant1-adrenal),如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充物,如甲酰四氫葉酸(frolinic acid);醋葡醒內(nèi)酯；醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；5-氨基酮戍酸；恩尿嘧唳；安卩丫唳；bestrabucil ;比生群；伊達(dá)曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defofamine);秋水仙胺；地吖醌；依氟鳥氨酸(elfornithine);依利醋胺；埃坡霉素；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明(1nidainine);美登木素生物堿，如美登素和美登木素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖啶(nitraerine);噴
司他??；蛋氨氮芥(Phenamet);吡柔比星；洛索蒽醌；2_乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK? _多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生；利索新(rhizoxin)；細(xì)佐喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2’，2’ -三氯三乙胺；單端孢菌毒素(特別是T-2毒素、撫孢菌素A(verracurin A)、桿孢菌素A和蛇形毒素(anguidine));烏拉坦；
長(zhǎng)春地辛(ELDISINE?、FILDESIN?);達(dá)卡巴嚷(dacarbazine);甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴燒；gacytosine ;阿拉伯糖苷(“Ara_C(阿糖胞苷)”)；塞替派；紫杉烷(taxoid)，例如紫杉醇(TAXOL?)、紫杉醇白蛋白改造的納米顆粒制劑(ABRAXANE?)和多西他賽(TAXOTERE?);苯丁酸氮芥(chloranbucil) ;6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉬試劑，如順鉬、奧沙利鉬(例如，ELOXATIN? )和卡鉬；長(zhǎng)春花屬(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括長(zhǎng)春花堿(VELBAN?)、長(zhǎng)春新堿(ONCOVIN?)、長(zhǎng)春地辛(ELDISINE_?、FILDESIN?):和長(zhǎng)春瑞濱
(NAVELBINE?);依托泊苷(VP-16);異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；亞葉酸；諾安托；伊達(dá)曲沙；道諾霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸鹽；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000 ;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);類視黃醇，如視黃酸，包括貝沙羅汀(TARGRETIN?); 二膦酸鹽，如氯膦
酸鹽(例如 BONEFOS? 或 OSTAC? )、依替膦酸鹽(DIDROCAL?)、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽(ZOMETA?)、阿侖膦酸鹽(FOSAMAX?)、帕米膦酸鹽(AREDIA?)、替魯膦酸鹽(SKELID?).或利塞膦酸鹽(ACTONEL?);曲沙他濱
(I, 3- 二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物);反義寡核苷酸，特別是抑制涉及異常細(xì)胞增殖信號(hào)途徑中的基因表達(dá)的那些反義核苷酸，例如PKC-α、Raf、H_Ras和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF-R)(例如厄洛替尼(Tarceva?));和減少細(xì)胞增殖的VEGF-A ;疫苗，如THERATOPBi^苗，及基因治療疫苗，例如ALLOVECTIN?疫苗、LEUVECTIN?;疫苗和VAXID?.疫苗；拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑(例如LURTOTECAN? ) ；rmRH(例如ABARELIX?);BAY439006(索拉非尼；Bayer) ;SU_11248 (舒尼替尼，SUTENT?, Pfizer);哌立福辛；C0X-2抑制劑(例如塞來考昔或艾托考昔)；蛋白體抑制劑(例如PS341);硼替佐米(VELCADE?) ； CC1-779 ;替匹法尼(R11577) ；orafenib ；ABT510 ;Bcl_2 抑制劑，如奧利
美生鈉(GENASENSE?);匹蒽醌；egfr抑制劑；酪氨酸激酶抑制劑；絲氨酸-蘇氨酸激
酶抑制劑，如雷帕霉素(西羅莫司，RAPAMUNE? );法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，如氯那法尼(1nafarnib) (SCH663 6, SARASAR?);和上述的藥物可接受的鹽、酸或衍生物；及上述的兩種或更多種的組合，如代表環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松龍的聯(lián)合療法的縮寫的CHOP和代表奧沙利鉬(ELOXATIN?)與5-FU和亞葉酸的聯(lián)合治療方案的縮寫的FOLFOX ;及上述任何的藥物可接受的鹽、酸或衍生物；以及上述的兩種或更多種的組合。
[0173]本文所定義的化療劑包括“抗激素劑”或“內(nèi)分泌治療”，其用于調(diào)節(jié)、降低、阻斷或抑制促進(jìn)癌癥生長(zhǎng)的激素的效果。它們可以是激素自身，包括但不限于抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，其包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX?他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奧那司酮和FAREST0N.托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制劑，其調(diào)節(jié)腎上腺中雌激素的產(chǎn)生，例如4(5)-咪唑、氨魯米特、MEGASE?醋酸甲地孕酮、AROMASIN?'依西美坦、福美坦(formestanie)、法倔唑、RIVISOR? 伏氯唑、FEMARA?來曲唑和ARIMIDEX?阿那曲唑；和抗雄激素物(ant1-androgen),如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙立德和戈舍瑞林；及曲沙他濱(1，3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制涉及異常細(xì)胞增殖信號(hào)途徑中的基因表達(dá)的那些反義核苷酸，例如PKC-a、Raf和H-Ras ;核酶，如VEGF表達(dá)抑制劑(例如ANGIOZYME?核酶)和HER2表達(dá)抑制劑；疫苗，如基
因治療疫苗，例如ALLOVECTIN?.疫苗、LEUVECTIN?.疫苗和VAXID?疫苗；
PROLEUKIN? rlL-2 ; LURTOTECAN? 拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 抑制劑；ABARELIX?
rmRH ;長(zhǎng)春瑞濱和埃斯波霉素(參見美國(guó)專利4，675，187號(hào))；及任何上述的藥物可接受的鹽、酸或衍生物；以及上述的兩種或更多種的組合。
[0174]本文所用的“生長(zhǎng)抑制劑”意指在體外或體內(nèi)抑制細(xì)胞(例如表達(dá)VEGF的細(xì)胞)生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此，生長(zhǎng)抑制劑可以是明顯減少S期的細(xì)胞(例如表達(dá)VEGF的細(xì)胞)的百分比的試劑。生長(zhǎng)抑制劑的實(shí)例包括阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程(處于除了S期以外的位置)，例如誘導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的試劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春花(長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿)、紫杉烷和諸如多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、依托泊苷和博來霉素的拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑。諸如DNA烷化劑的停滯Gl的那些試劑還深入至S期停滯，如他莫昔芬、潑尼松、達(dá)卡巴嗪、氮芥、順鉬、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。其他信息可以在下述參考文獻(xiàn)中找到:在Mendelsohn和 Israel 編輯的 The Molecular Basis of Cancer (癌癥的分子基礎(chǔ))的第一章，Murakami 等的題為 “Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplasticdrugs (細(xì)胞周期調(diào)控、癌基因和抗腫瘤藥物)”(W.B.Saunders, Philadelphia, 1995)中，如第13頁(yè)。紫杉烷(紫杉醇和多西他賽)都是源自紫杉的抗癌藥。源自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE?，Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL?, Bristol-Myers
Squibb)的半合成類似物。紫杉醇和多西他賽促進(jìn)微管蛋白二聚體的微管的組裝并通過防止解聚來穩(wěn)定微管，這抑制了細(xì)胞的有絲分裂。
[0175]疾病的“病理學(xué)”包括損害患者身體健康(well-being)的全部現(xiàn)象。對(duì)于癌癥，這包括但不限于異常和不可控制的細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、對(duì)相鄰細(xì)胞正常功能的干擾、異常水平的細(xì)胞因子或其他分泌產(chǎn)物的釋放、炎癥性應(yīng)答或免疫應(yīng)答的抑制或加重等。
[0176]本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)“前體藥物”指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生形式，其與母體藥物相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，并且能夠被酶促活化或轉(zhuǎn)化成更有活性的母體形式。參見，例如 Wilman (1986) “Prodrugs in Cancer Chemotherapy (癌癥化療中的前體藥物)，，Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfastand Stella et al.(1985).“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted DrugDelivery (前體藥物:祀向藥物遞送的化學(xué)方法)，” Directed Drug Delivery, Borchardtet al.，(ed.)，pp.247-267，Humana Press。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸酯(phosphate)的前體藥物、含硫代磷酸酯(thiophosphate)的前藥、含硫酸酯(sulfate)的前體藥物、含肽的前體藥物、D-氨基酸-修飾的前藥、糖基化的前體藥物、含β -內(nèi)酰胺的前體藥物、含任選地被取代的苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選地被取代的苯乙酰胺的前體藥物、能夠被轉(zhuǎn)換為更具活性的細(xì)胞毒性游離藥物的5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前體藥物?？梢员谎苌鸀橛糜诒景l(fā)明的 前體藥物形式的細(xì)胞毒性藥物包括但不限于上述的那些化療劑。
[0177]本文所定義的“小分子”的分子量低于約500道爾頓。
[0178]“純化”表示在含有分子的樣品中，該分子的濃度按重量計(jì)為樣品的至少95%或者按重量計(jì)為樣品的至少98%。[0179]“分離的”核酸分子是這樣的核酸分子，即其分離自至少一種與其通常相關(guān)的其他核酸分子，例如，在該核酸分子的天然環(huán)境中。分尚的核酸分子還包括細(xì)胞中所含的核酸分子，該細(xì)胞通常表達(dá)該核酸分子，但是該核酸分子存在于染色體外或與其天然染色體位置不同的染色體位置。
[0180]術(shù)語(yǔ)“載體”旨在表示能夠運(yùn)輸與其相連的其他核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)粒”，其意指可以連接其他DNA節(jié)段的環(huán)式雙鏈DNA。另一類型的載體是噬菌體載體。另一類型的載體是病毒載體，其中其他DNA節(jié)段可以連接至病毒基因組中。某些載體能夠在其被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)可以在被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)整合至宿主細(xì)胞基因組中，從而隨宿主基因組一起復(fù)制。而且，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作地連接的基因的表達(dá)。這類載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”或簡(jiǎn)單地稱為“表達(dá)載體”。通常，重組DNA技術(shù)中所用的表達(dá)載體一般是質(zhì)粒形式的。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”互換地使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式。
[0181]“多核苷酸”或“核酸”在本文中互換地使用，意指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基和/或它們的類似物、或者可以由DNA或RNA聚合酶通過合成反應(yīng)整合入聚合物的任何物質(zhì)。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸及它們的類似物。如果存在，可以在聚合物組裝前或組裝后對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。核苷酸的序列可以被非核苷酸組分打斷。多核苷酸可以包含合成后的修飾，例如與標(biāo)記物偶聯(lián)。其他類型的修飾包括，例如“帽”，用類似物取代一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸；核苷酸間修飾，例如具有不帶電連接的修飾(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電連接的修飾(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)；含有側(cè)鏈部分的那些修飾，如蛋白(例如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚-L-賴氨酸等)；具有嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的那些修飾；含有螯合劑的那些修飾 (例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)；含有烷化劑(alkylator)的那些修飾；具有修飾的連接的那些修飾(例如α異頭核酸等)；以及未修飾形式的多核苷酸。而且，通常存在于糖上的羥基可以被替代，例如，被膦酸基、磷酸基替代；被標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基保護(hù)；或被激活以準(zhǔn)備與其他核苷酸的連接；或者可以與固體或半固體支持物偶聯(lián)。5’和3’末端OH可以被磷酸化或被1-20個(gè)碳原子的胺或有機(jī)封端基團(tuán)部分取代。也可以將其他羥基衍生為標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基。多核苷酸還可以含有類似物形式的核糖或脫氧核糖，其在本領(lǐng)域通常是已知的，并且包括，例如2’ -O-甲基_、2’ -O-烯丙基_、2’ -氟-或2’ -疊氮基-核糖、碳環(huán)糖類似物、α -異頭糖、諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖的差向異構(gòu)糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、脂肪族類似物以及諸如甲基核苷的基本核苷類似物。一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵可以被替代連接基團(tuán)取代。這些替代連接基團(tuán)包括但不限于磷酸被P(O)S( “硫代(thioate)”)、P(S)S( “二硫代(dithioate) ”)、(O)NR2 ( “酰胺化”)、P (O) R、P (O) OR’、C0 或CH2(“formaCetal”)取代的實(shí)施方案，其中R或R’各自獨(dú)立地為H或者取代或未被取代的烷基(1-20C)，其任選地含有醚鍵(-0-)、烷基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中全部的連接必須相同。上述描述適用于本文所引的包括RNA和DNA在內(nèi)的全部多核苷酸。
[0182]本文所用的“寡核苷酸”通常意指短的、通常是單鏈的、通常是合成的多核苷酸，其長(zhǎng)度通常但非必須是小于約200個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是互斥的。上文對(duì)多核苷酸的描述等同于并完全適用于寡核苷酸。
[0183]相對(duì)于參考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(%) ”被定義為在比對(duì)序列并且，若需要，引入缺口以實(shí)現(xiàn)最大序列同一性百分比，并且不將任何保守取代視為序列同一性的部分后，候選序列中與參考多肽序列的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。用于確定氨基酸序列同一性百分比的取代可以通過本領(lǐng)域中的各種方式來實(shí)現(xiàn)，例如，利用公開可得的計(jì)算機(jī)軟件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定比對(duì)序列的合適參數(shù)，其包括在比較的序列的全長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的任何算法。然而，對(duì)于本文的目的，利用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2，產(chǎn)生氨基酸序列同一性％值。該ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech, Inc.創(chuàng)作，并且已經(jīng)隨用戶文檔一起在美國(guó)版權(quán)局(U.S.Copyright Office), Washington D.C., 20559提交了源代碼,其中該程序以美國(guó)版權(quán)注冊(cè)TXU510087號(hào)進(jìn)行了注冊(cè)。ALIGN-2程序可從Genentech, Inc.，SouthSan Francisco, California公開獲得,或者可以從源代碼進(jìn)行編譯。ALIGN-2程序應(yīng)當(dāng)在UNIX操作系統(tǒng)上編譯使用，優(yōu)選數(shù)字UNIX V4.0D。全部序列比較參數(shù)由ALIGN-2設(shè)定，并且不變。
[0184]在使用ALIGN-2進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)的情況下，給定氨基酸序列A比、與或?qū)o定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者其可以表示為給定氨基酸序列A具有或包含比、與或?qū)o定氨基酸序列B的特定氨基酸序列同一性％)按如下進(jìn)行計(jì)算:
[0185]100 乘以分?jǐn)?shù) X/Y,
[0186]其中X是由序列比對(duì)程序ALIGN-2在該程序的A和B的比對(duì)中評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，而Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)氨基酸序列A的長(zhǎng)度不等于氨基酸序列B的長(zhǎng)度時(shí)，A比B的氨基酸序列同一性％不等于B比A的氨基酸序列同一性％。除非另外指明，本文所用的全部氨基酸序列同一性％值是利用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序，如在上一段中所述的步驟獲得的。
[0187]表述“調(diào)控序列”意指在特定宿主有機(jī)體中表達(dá)可操作地連接的編碼序列所需的DNA序列。例如，適合于原核生物的調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、任選的操縱基因序列以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞使用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
[0188]當(dāng)核酸與其他核酸序列有功能性關(guān)系時(shí)，其是“可操作地連接的”。例如，如果序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA被表達(dá)為參與該多肽分泌的前蛋白，則該前序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA可操作地連接至多肽的DNA ;如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響該序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地連接至編碼序列；或者，如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)促進(jìn)翻譯，則核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接至編碼序列。通常，“可操作地連接”表示連接的DNA序列是相鄰的，并且對(duì)于分泌性前導(dǎo)序列，該DNA序列是相鄰并且是閱讀相(reading phase)的。然而,增強(qiáng)子不必是相鄰的。連接通過常規(guī)限制位點(diǎn)處的連接完成。如果不存在這類位點(diǎn)，則根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸接頭(adaptor)或連接物。 [0189]如本文所用的，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)”互換地使用，并且全部這類命名包括子代。因此，詞語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代個(gè)體細(xì)胞和從其衍生的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)當(dāng)理解，由于故意或非故意的突變，全部子代的DNA含量可以不是精確地相同的。本文包括了在原始轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩查具的有相同功能或生物活性的突變子代。當(dāng)意圖不同的命名時(shí)，將從語(yǔ)境清楚地理解不同的命名。
[0190]本文所用的術(shù)語(yǔ)“同時(shí)”意指兩種或更多種治療劑的給藥，其中至少部分給藥在時(shí)間上是重疊的。因此，當(dāng)一種或多種試劑的給藥在一種或多種其他試劑的給藥停止后連續(xù)時(shí)，同時(shí)給藥包括劑量方案。
[0191]本文的“癌癥復(fù)發(fā)”意指癌癥在治療后恢復(fù)。在一實(shí)施方案中，癌癥復(fù)發(fā)包括乳房中癌癥的恢復(fù)，以及癌癥在乳房外恢復(fù)的遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)。
[0192]本發(fā)明的組合物
[0193]本發(fā)明涉及分離的抗體和多核苷酸的實(shí)施方案。在一實(shí)施方案中，抗VEGF抗體是純化的。
[0194]本發(fā)明還涉及包括藥物組合物在內(nèi)的組合物，其包含抗VEGF抗體；和多核苷酸，其包含編碼抗VEGF抗體的序列。如本文所用的，組合物包含與VEGF結(jié)合的一種或多種抗體，和/或一種或多種多核苷酸，其包含編碼與VEGF結(jié)合的一種或多種抗體的序列。這些組合物還可以包含合適的媒介物，例如包括緩沖劑在內(nèi)的藥物可接受的賦形劑，其在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。
[0195]在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗VEGF抗體是單克隆的。仍然在另一實(shí)施方案中，抗VEGF抗體是多克隆的。本文所提供的抗VEGF抗體的Fab、Fab’、Fab’ -SH和F(ab’)2片段也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些抗體片段通過諸如酶消化的常規(guī)方法制備，或者可以通過重組技術(shù)產(chǎn)生。這些抗體片段可以是嵌合的或人源化的。這些片段用于診斷和下文所列的目的。在一實(shí)施方案中，抗VEGF抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
[0196]單克隆抗體獲得自基本上同質(zhì)的抗體群，即除了可能少量存在的天然存在的突變以外，組成的群體個(gè)體抗體是相同的。因此，修飾語(yǔ)“單克隆”表明抗體的特征是，其并不是不同抗體的混合物。
[0197]本文提供了源自噬菌體文庫(kù)的示例性單克隆抗體，并且描述于實(shí)施例1中。這些抗體命名為B20-4.1.1和B20-4.1.1RR0 B20-4.1.1和B20-4.1.1RR的重鏈可變域和輕鏈可變域的序列示于圖1和圖6-9中。
[0198]為了篩查與目的抗原的特定表位結(jié)合的抗體，可以進(jìn)行如Antibodies, ALaboratory Manual (抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow andDavid Lane (1988)所述的常規(guī)交叉阻斷(cross-blocking)測(cè)定。或者，可以進(jìn)行Champeet al.(1995) J.Biol.Chem.270:1388-1394所述的表位作圖來確定抗體是否結(jié)合目的表位。下文提供了抗VEGF抗體的其他示例性實(shí)施方案。
[0199]抗VEGF抗體的具體實(shí)施方案
[0200]在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體，其包含:
[0201](i)HVR-Hl 序列，其包含 SEQ ID NO:1 的序列；
[0202](ii)HVR-H2 序列，其包含 SEQ ID NO:2 的序列；
[0203](iii)HVR-H3 序列，其包含 SEQ ID NO:3 的序列；
[0204](iV)HVR-Ll 序列，其包含 SEQ ID NO:4 的序列；
[0205](v)HVR-L2 序列，其包含 SEQ ID NO:6 的序列；
[0206](vi)HVR-L3 序列，其包含 SEQ ID NO:7 的序列。
[0207]在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體，其包含:[0208](i)HVR-Hl 序列，其包含 SEQ ID NO:1 的序列；
[0209](ii)HVR-H2 序列，其包含 SEQ ID NO:2 的序列；
[0210](iii)HVR-H3 序列，其包含 SEQ ID NO:3 的序列；
[0211](iV)HVR-Ll 序列，其包含 SEQ ID NO:5 的序列；
[0212](V)HVR-L2 序列，其包含 SEQ ID NO:6 的序列；
[0213](vi)HVR-L3 序列，其包含 SEQ ID NO:7 的序列。
[0214]如圖1所示，SEQ ID NOs: 1-7的氨基酸序列相對(duì)于單個(gè)HVR來編號(hào)(即，H1、H2或H3),該編號(hào)與本文所述的Kabt編號(hào)系統(tǒng)一致。
[0215]一方面，如圖1所示，本發(fā)明提供了包含重鏈HVR序列的抗體。
[0216]如下述SEQ ID NO:39所示，本發(fā)明的某些實(shí)施方案包含人源化4D5抗體的輕鏈
可變域(huMAb4D5_8) ( HERCEPTIN!<, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (還參見美國(guó)專利 6，407，213 號(hào)和 Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340 (5): 1073-93)。
[0217]1Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp ArgVal Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly ValPro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser LeuGln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr PheGly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys1。7 (SEQ ID NO: 39) (HVR 殘基用下劃線標(biāo)出)。
[0218]在一實(shí)施方案中，在位置30、66和91 (分別是上文的粗體/斜體所標(biāo)明的Asn、Arg和His)中的一個(gè)或多個(gè)位置，對(duì)huMAb4D5-8輕鏈可變域進(jìn)行了修飾。在一實(shí)施方案中，修飾的huMAb4D5-8序列包含位置30處的Ser、位置66處的Gly和/或位置91處的Ser。因此，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含下述SEQ ID NO:40所示的序列:
[0219]1Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp ArgVal Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly ValPro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser LeuGln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr PheGly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys1。7 (SEQ ID NO: 40) (HVR 殘基用下劃線標(biāo)出)。
[0220]關(guān)于huMAb4D5_8被取代的殘基在上文用黑體/斜體標(biāo)明。
[0221]本發(fā)明的抗體可以包含任何合適的框架可變域序列，其條件是基本上保持了對(duì)VEGF的結(jié)合活性。例如，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含人亞組III重鏈框架共有序列。在這些抗體的一實(shí)施方案中，框架共有序列包含位置71、73和/或78處的取代。在這些抗體的某些實(shí)施方案中，位置71是A，位置73是T和/或位置78是A。在一實(shí)施方案中，這些抗體包含huMAb4D5-8的重鏈可變域框架序列(HERCEPTIN.，Genentech, Inc.，SouthSan Francisco, CA, USA)(還參見美國(guó)專利 6，407，213 號(hào)和 5,821,337 號(hào)，以及 Lee etal.，J.Mol.Biol.(2004)，340 (5): 1073-93)。在一實(shí)施方案中，這些抗體還包含人κ I輕鏈框架共有序列。在一實(shí)施方案中，這些抗體包含如美國(guó)專利6，407，213號(hào)和5，821，337號(hào)所述的huMAb4D5-8的輕鏈HVR序列。在一實(shí)施方案中，這些抗體包含huMAb4D5_8的輕鏈可變域序列(HERCEPTINK, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)(還參見
6，407，213 號(hào)和 5，821，337 號(hào)，以及 Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340 (5): 1073-93)。
[0222]在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域，其中框架序列包含SEQ ID勵(lì)5:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和/或26(圖 2a和 2b)的序列，并且HVR H1、H2和H3序列分別是SEQ ID勵(lì)3:1、2和/或3。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，其中框架序列包含SEQ ID勵(lì)5:27、28、29和/或30(圖3)的序列，并且HVR LI序列為SEQ ID N0S:4或5，HVR L2序列為SEQ ID NO:6，而HVR L3序列為SEQ ID NO:7。
[0223]在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域，其包含SEQ ID NO:43的序列。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，其包含SEQ ID N0:44或45的序列。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO:43的序列，該輕鏈可變域包含SEQ ID N0:45的序列。仍然在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO:44的序列，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO:45的序列。
[0224]一方面，本發(fā)明提供了與任何上述抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合VEGF的抗體。一方面，本發(fā)明提供了與任何上述抗體結(jié)合VEGF上相同表位的抗體。
[0225]抗體片 段
[0226]本發(fā)明涉及抗體片段?？贵w片段可以通過諸如酶消化的常規(guī)方法產(chǎn)生，或者通過重組技術(shù)產(chǎn)生。在某些情況下，使用抗體片段而不是全抗體，是有優(yōu)勢(shì)的。大小較小的片段允許快速的清除，并且可以導(dǎo)致更好地接近實(shí)體瘤。對(duì)于某些抗體片段的綜述，參見Hudsonet al.(2003) Nat.Med.9:129-134。
[0227]已經(jīng)開發(fā)了用于產(chǎn)生抗體片段的各種技術(shù)。常規(guī)地，通過完整抗體的蛋白水解消化獲得這些片段(參見，例如Morimoto et al., Journal of Biochemical and BiophysicalMethods24:107-117 (1992);和 Brennan et al.，Science, 229:81 (1985))。然而，這些片段現(xiàn)在可以通過重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生。Fab、Fv和ScFv抗體片段可以在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)并分泌，因而允許容易地產(chǎn)生大量的這些片段。抗體片段可以分離自上文所討論的抗體噬菌體文庫(kù)。或者，F(xiàn)ab’ -SH片段可以直接從大腸桿菌中回收并化學(xué)偶聯(lián)以形成 F(ab’)2 片段(Carter et al.，Bio/TechnologylO: 163-167 (1992))。根據(jù)另一方法，F(xiàn)(ab’)2片段可以直接分離自重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。在美國(guó)專利5，869，046號(hào)中討論了體內(nèi)半衰期增加的Fab和F(ab’)2片段,其包含補(bǔ)救受體(salvage receptor)結(jié)合表位殘基。產(chǎn)生抗體片段的其他技術(shù)，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在某些實(shí)施方案中，抗體是單鏈Fv片段(scFv) ο參見冊(cè)93/16185、美國(guó)專利5，571，894號(hào)和5，587，458號(hào)。Fv是scFv僅有的具有完整的結(jié)合位點(diǎn)且沒有恒定區(qū)的分子，因此，它們可以適合于在體內(nèi)用途中減少非特異性結(jié)合?？梢詷?gòu)建scFv融合蛋白以在scFv的氨基末端或羧基末端獲得效應(yīng)蛋白的融合。參見Antibody Engineering(抗體工程)，ed.Borrebaeck,見上文。例如,如美國(guó)專利5，641，870號(hào)所述，抗體片段也可以是“線性抗體”。這類線性抗體可以是單特異性的或雙特性的。
[0228]人源化抗體[0229]本發(fā)明涉及人源化抗體。各種將非人抗體人源化的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，人源化抗體可以具有一個(gè)或多個(gè)從非人來源導(dǎo)入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為“輸入”殘基，其通常來自“輸入”可變域。人源化可以基本上按照Winter 和合作者(Jones et al.(1986) Nature321:522-525; Riechmann et al.(1988)Nature332:323-327; Verhoeyen et al.(1988) Science239:1534-1536)的如下方法進(jìn)行:用高變區(qū)序列取代人抗體的相應(yīng)序列。因此，這類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利4，816，567號(hào))，其中基本上小于完整的人可變域被來自非人物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)際上，人源化抗體通常是人抗體，其中某些高變區(qū)殘基和可能的FR殘基被來自嚙齒類抗體的類似位點(diǎn)的殘基取代。
[0230]制備人源化抗體中所用的人可變域的選擇，既包括輕鏈又包括重鏈可變域，對(duì)于降低抗原性是重要的。根據(jù)所謂的“最佳擬合”方法，針對(duì)已知的人可變域序列的完全文庫(kù)，篩查嚙齒類抗體的可變域序列。然后，接受最接近嚙齒類序列的人序列，作為人源化抗體的人框架。參見，例如 Sims et al.(1993) J.1mmunol.151:2296; Chothia et al.(1987) J.Mol.Biol.196:901。另一方法使用源自輕鏈或重鏈的特定亞組的全部人抗體的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于幾種不同的人源化抗體。參見，例如Carter et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:4285; Presta et al.(1993) J.1mmunol.，151:2623。
[0231]通常還期望的是，被人源化的抗體保持對(duì)抗原的高親和力和其他有利的生物特性。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，根據(jù)一種方法，利用親本序列和人源化序列的三維模型，通過分析親本序列和各種概念的人源化產(chǎn)物的過程，制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可用的，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。說明并展示所選的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序是可用的。這些展示的檢查允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能的作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。通過這種方法，可以從受體和輸入序列選擇并組合FR殘基，從而實(shí)現(xiàn)期望的抗體特征，如增加對(duì)靶抗原的親和力。通常，高變區(qū)殘基直接并幾乎與抗原結(jié)合的影響有關(guān)。
[0232]人抗體
[0233]如上文所述，本發(fā)明的人抗體可以通過組合選自人來源的噬菌體展示文庫(kù)的Fv克隆可變域序列與已知的人恒定域序列來構(gòu)建?；蛘撸景l(fā)明的人單克隆抗體可以通過雜交瘤方法來制備。例如，Kozbor, J.1mmunol.，133:3001 (1984) ;Brodeur etal., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (單克隆抗體制備技術(shù)和應(yīng)用),pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)和 Boerner et al., J.1mmunol.，147:86 (1991)描述了用于產(chǎn)生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠_人異源骨髓瘤細(xì)胞系。
[0234]現(xiàn)在可能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)，其能夠在免疫時(shí)，在不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白的情況下，產(chǎn)生人抗體的完整集合(repertoire)。例如，已經(jīng)描述,在嵌合和種系突變體小鼠的抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合性缺失，導(dǎo)致內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。這種種系突變體小鼠中人種系免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn)移，會(huì)在抗原激發(fā)時(shí)導(dǎo)致人抗體產(chǎn)生。參見，例如 Jakobovits et al., Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A, 90:2551 (1993) ; Jakobovits etal., Nature, 362:255(1993);Bruggermann et al., Year in Immunol.，7:33 (1993)。
[0235]基因改組也能用 于從諸如嚙齒類的非人抗體衍生人抗體，其中該人抗體對(duì)起始的非人抗體具有類似的親和力和特異性。根據(jù)又稱為“表位印跡”的這種方法，用人V域基因的集合取代通過本文所述的噬菌體展示技術(shù)獲得的非人抗體片段的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)，從而產(chǎn)生非人鏈/人鏈SCFv或Fab嵌合體的群體。使用抗原的選擇導(dǎo)致非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab分離，其中人鏈恢復(fù)在原代噬菌體展示克隆中去除相應(yīng)的非人鏈時(shí)破壞的抗原結(jié)合位點(diǎn)，即表位控制(印跡)人鏈對(duì)象的選擇。當(dāng)重復(fù)該過程以取代剩余的非人鏈時(shí)，獲得了人抗體(參見1993年4月I日公開的PCT W093/06213)。和通過⑶R移植的常規(guī)非人抗體人源化不同，這種技術(shù)提供完全的人抗體，其不含非人來源的FR或CDR殘基。
[0236]雙特異性抗體
[0237]雙特異性抗體是對(duì)至少兩種不同的抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體是人抗體或人源化抗體。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合特異性之一是對(duì)VEGF的，而另一個(gè)是對(duì)任何其他抗原的。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體可以與兩種不同的VEGF的表位結(jié)合。雙特異性抗體還可以用于將細(xì)胞毒性劑定位于表達(dá)VEGF的細(xì)胞。這些抗體具有VEGF結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒性劑的臂，例如皂草毒蛋白、抗干擾素_α、長(zhǎng)春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原。雙特異性抗體可以被制備為全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。
[0238]制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。常規(guī)地，雙特異性抗體的重組產(chǎn)生基于兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中兩條重鏈具有不同的特異性(Milsteinand Cuello, Nature, 305:537 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，所以這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化，通常通過親和層析步驟進(jìn)行，是相當(dāng)繁瑣的，并且產(chǎn)物的產(chǎn)量不高。1993年5月13日公開的W093/08829和Traunecker et al.，EMBOJ.，10:3655(1991)公 開了類似的方法。
[0239]根據(jù)不同的方法，將具有期望的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。該融合，例如，具有免疫球蛋白重鏈恒定域，其包含鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的至少一部分。在某些實(shí)施方案中，含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)存在于至少一種融合物中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物的DNA，以及若需要，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA，插入單獨(dú)的表達(dá)載體中，并將其共轉(zhuǎn)染于合適的宿主有機(jī)體中。這在構(gòu)建中所用的不等比率的三種多肽鏈提供最優(yōu)產(chǎn)率的實(shí)施方案中，為調(diào)節(jié)三種多肽片段的相互比例提供了相當(dāng)?shù)撵`活性。然而，當(dāng)至少兩種相等比率的多肽的表達(dá)獲得高產(chǎn)率或者當(dāng)比率不具有特殊的重要性時(shí)，可能將兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體中。
[0240]在這種方法的一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體由在一條臂上具有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈和在另一條臂上的雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)組成。發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)促進(jìn)期望的雙特異性化合物與不期望的免疫球蛋白鏈組成的分離，因?yàn)槊庖咔虻鞍纵p鏈在僅一半雙特異性分子中的存在提供了容易的分離方式。這種方法公開于W094/04690。產(chǎn)生雙特異性抗體的其他細(xì)節(jié)，參見，例如Suresh etal., Methods in Enzymology, 121:210(1986)。
[0241]根據(jù)另一方法，抗體分子對(duì)之間的界面可以經(jīng)改造，將從重組細(xì)胞培養(yǎng)中回收的異源二聚體的百分比最大化。該界面包含至少一部分抗體恒定區(qū)的(^3結(jié)構(gòu)域。在這種方法中，來自第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈被較大的側(cè)鏈(酪氨酸或色氨酸)取代。通過用較小的氨基酸側(cè)鏈取代大氨基酸側(cè)鏈，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生了與大側(cè)鏈相同或類似大小的補(bǔ)償“腔”。這提供了相對(duì)于諸如同型二聚體的不期望的副產(chǎn)物增加異源二聚體產(chǎn)率的機(jī)制。
[0242]雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源偶聯(lián)(heteroconjugate) ”抗體。例如,異源偶聯(lián)物中的一個(gè)抗體可以與抗生物素蛋白偶聯(lián)，而另一個(gè)抗體與生物素偶聯(lián)。例如，這類抗體被認(rèn)為將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不期望的細(xì)胞(美國(guó)專利4，676，980號(hào))，并且用于治療HIV感染(W091/00360、W092/00373和EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可以利用任何常規(guī)交聯(lián)方法來制備。合適的交聯(lián)劑在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并且隨許多交聯(lián)技術(shù)一起公開于美國(guó)專利4，676，980號(hào)中。
[0243]文獻(xiàn)中也描述了從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，雙特異性抗體可以利用化學(xué)連接來制備。Brennan et al., Science, 229:81(1985)描述了將完整抗體蛋白水解剪切以產(chǎn)生F(ab’)片段的方法。這些片段在二巰基配合劑亞砷酸鈉的存在下被還原，以穩(wěn)定鄰近的二巰基并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab’ s片段轉(zhuǎn)變成硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后將Fab’ s-TNB衍生物之一通過用巰基乙胺還原再轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab’-巰基，并與等摩爾量的其他Fab’ s-TNB衍生物混合，形成雙特異性抗體。所產(chǎn)生的雙特異性抗體可以用作酶的選擇性固定的試劑。[0244]最近的進(jìn)展促進(jìn)了從大腸桿菌中直接回收Fab’ _SH片段，其可以經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby et al., J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab’)2分子的產(chǎn)生。每個(gè)Fab’片段分別分泌自大腸桿菌，并且將其進(jìn)行體外定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。因此而形成的雙特異性抗體能夠與過量表達(dá)HER2受體的細(xì)胞和正常的人T細(xì)胞結(jié)合，并且能夠引發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對(duì)人乳腺瘤靶標(biāo)的裂解活性。
[0245]也描述了直接由重組細(xì)胞培養(yǎng)物制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)。例如，利用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生雙特異性抗體。Kostelny et al.，J.1mmunol.，148 (5): 1547-1553 (1992)。將來自Fos蛋白和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合連接至兩種不同抗體的Fab’部分。在鉸鏈區(qū)將抗體同型二聚體還原以形成單體，然后將其再氧化以形成抗體異源二聚體。這種方法還可以用于產(chǎn)生抗體同型二聚體。Hollingeret al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A, 90:6444-6448 (1993)所述的“雙抗體”技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的可選機(jī)制。該片段包含通過連接物與輕鏈可變域(VL)相連的重鏈可變域(VH)，該連接物太短而不允許相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的配對(duì)。因此，一個(gè)片段的VH域和VL域被強(qiáng)制與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)的VL域和VH域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了使用單鏈Fv(sFv) 二聚體制備雙特異性抗體片段的另一策略。參見Gruberet al., J.1mmunol., 152:5368 (1994)。
[0246]本發(fā)明考慮了多于二價(jià)的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt etal.J.1mmunol.147:60 (1991)。
[0247]多價(jià)抗體
[0248]可以通過表達(dá)抗體所結(jié)合的抗原的細(xì)胞，將多價(jià)抗體比二價(jià)抗體更快地內(nèi)化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是具有三個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)抗體(其不同于IgM類)(例如，四價(jià)抗體)，其可以通過編碼抗體的多肽鏈的核酸的重組表達(dá)來容易地制備。多價(jià)抗體可以包含二聚化結(jié)構(gòu)域和3個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，二聚化結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)e區(qū)或鉸鏈區(qū)(或由Fe區(qū)或鉸鏈區(qū)組成)。在這個(gè)方案中，抗體包含F(xiàn)e區(qū)和Fe區(qū)氨基末端的三個(gè)或更多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，多價(jià)抗體包含3個(gè)至約8個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(或由3個(gè)至約8個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)組成)。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，多價(jià)抗體包含4個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(或由4個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)組成)。多價(jià)抗體包含至少一條多肽鏈(例如，兩條多肽鏈)，其中該多肽鏈包含兩個(gè)或更多個(gè)可變域。例如，多肽鏈可以包含VDl- (Xl) n-VD2- (X2) n_Fc，其中VDl是第一可變域，VD2是第二可變域，F(xiàn)e是Fe區(qū)的一條多肽鏈，Xl和X2表示氨基酸或多肽，并且η為O或I。例如，多肽鏈可以包含VH-CHl-彈性連接物(flexible linker)-VH-CHl-Fc 區(qū)鏈，或 VH-CHl-VH-CHl-Fc 區(qū)鏈。本文的多價(jià)抗體還可以包含至少兩條(例如，4條)輕鏈可變域多肽。本文的多價(jià)抗體可以，例如，包含約2至約8條輕鏈可變域多肽。本文所涉及的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，并且任選地還包含CL結(jié)構(gòu)域。
[0249]單域抗體
[0250]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是單域抗體(single-domain antibody)。單域抗體是單多肽鏈，其包含抗體的重鏈可變域的全部或一部分或者包含抗體的輕鏈可變域的全部或一部分。在某些實(shí)施方案中，單域抗體是人單域抗體(Domantis, Inc.，Waltham, MA ;參見，例如美國(guó)專利6，248，516B1號(hào))。在一實(shí)施方案中，單域抗體由抗體的重鏈可變域的全部或部分組成。
[0251]抗體變體
[0252]一些實(shí)施方案中考慮了本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可以期望改善抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物特性?？贵w的氨基酸序列變體可以通過向編碼該抗體的核苷酸序列導(dǎo)入合適的變化來制備，或者通過肽合成來制備。這類修飾包括，例如抗體的氨基酸序列中殘基的缺失和/或插入和/或取代?？梢赃M(jìn)行缺失、插入和取代的任何組合，以獲得最終構(gòu)建體，其條件是最終構(gòu)建體具有期望的特征?？梢栽谏尚蛄袝r(shí)在個(gè)體抗體氨基酸序列中導(dǎo)入氨基酸變異。
[0253]用于鑒定誘變的優(yōu)選位置的抗體的某些殘基或區(qū)域的方法被稱為如Cunninghamand Wells (1989) Science, 244:1081-1085所述的“丙氨酸掃描誘變”。此處，靶殘基的殘基或基團(tuán)被鑒定(例如,帶電殘基,如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且被中性或帶負(fù)電的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后，通過在取代位點(diǎn)，或?yàn)槿〈稽c(diǎn)導(dǎo)入另外或其他變異來改進(jìn)(refine)證明對(duì)取代功能性敏感的那些氨基酸位置。因此，盡管用于導(dǎo)入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)定的，但是突變自身本質(zhì)上不必是預(yù)定的。例如，為了分析給定位點(diǎn)突變的性能，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行ala掃描或隨機(jī)誘變，并針對(duì)期望的活性篩查表達(dá)的免疫球蛋白。
[0254]氨基酸序列插入包括氨基-末端和/或羧基末端融合，其長(zhǎng)度范圍是I個(gè)殘基至含有I百或更多殘基的多肽；以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列間插入。末端插入的實(shí)例包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的抗體。 抗體分子的其他插入變體包括抗體的N-末端或C-末端與增加抗體的血清半衰期的酶或多肽的融合。
[0255]在某些實(shí)施方案中，改變本發(fā)明的抗體，以增強(qiáng)或減少糖基化的程度?？贵w的糖基化通常是N-連接或O-連接的。N-連接意指糖類部分連接至天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列即天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸，是糖類部分連接至天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。因此，多肽中這些三肽序列中任何一個(gè)的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化意指糖即N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種連接至羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥基脯氨酸或
5-羥基賴氨酸。
[0256]抗體糖基化位點(diǎn)的添加或缺失，通常通過改變氨基酸序列，從而可以產(chǎn)生或去除一個(gè)或多個(gè)上文所述三肽序列(對(duì)于N-連接的糖基化位點(diǎn))，而方便地完成。還可以通過向原始抗體添加、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來進(jìn)行改變(對(duì)于O-連接的糖基化)。
[0257]當(dāng)抗體包含F(xiàn)e區(qū)時(shí)，可以改變與該抗體連接的糖類。哺乳動(dòng)物細(xì)胞所產(chǎn)生的天然抗體通常包含分支的、二分支的寡糖，其通常通過N-連接而連接于Fe區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297。參見，例如Wright et al.(1997)TIBTECH15:26-32。寡糖可以包括各種糖類，如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸；以及與二分支低聚糖結(jié)構(gòu)“莖”中的GIcNAc相連的巖藻糖。在一些實(shí)施方案中，還可以修飾本發(fā)明抗體中的寡糖以產(chǎn)生某些特性獲得改善的抗體變體。
[0258]例如，可以提供具有糖類結(jié)構(gòu)的抗體變體，該糖類結(jié)構(gòu)缺乏與Fe區(qū)連接(直接或間接)的巖藻糖。這些變體的ADCC功能可以獲得改善。參見，例如美國(guó)專利公開2003/0157108 號(hào)(Presta, L.)、2004/0093621 號(hào)(Kyowa Hakko Kogyo C0., Ltd) ? 涉及“去巖藻糖基化”或“巖藻糖缺乏”的抗體的公開的實(shí)例包括:US2003/0157108 ；W02000/61739 ；W02001/29246 ；US2003/0115614 ；US2002/0164328 ；US2004/0093621 ；US2004/0132140 ；US2004/0110704；US2004/0110282 ；US2004/0109865 ；W02003/085119 ；W02003/084570 ；W02005/035586 ；W02005/035778 ；W02005/053742 ；W02002/031140 ；0kazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004) ；Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614 (2004)。能夠產(chǎn)生去巖藻糖基化抗體的細(xì)胞系的實(shí)例包括缺乏蛋白巖藻糖基化的Lecl3CH0細(xì)胞(Ripkaet al.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986) ；US2003/0157108A1, Presta, L ；和W02004/056312A1, Adams et al.，特別是實(shí)施例11);以及敲除細(xì)胞系，如α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)UT8,敲除CHO細(xì)胞(參見，例如Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614 (2004) ; Kanda, Y.et al., Biotechnol.Bioeng., 94 (4): 680-688 (2006) ; andW02003/085107)。
[0259]本發(fā)明還提供具有二等分的寡糖(bisected oligosaccharide)的抗體變體，例如，其中連接至抗體的Fe區(qū)的二分支寡糖被GlcNAc 二等分。這類抗體變體可以具有降低的巖藻糖基化和/或改善的ADCC功能。這類抗體變體的實(shí)例描述于，例如 W02003/011878 (Jean-Mairet et al.);美國(guó)專利 6，602，684 號(hào)(Umana et al.);和US2005/0123546 (Umana et al.)。本發(fā)明還提供在與Fe區(qū)連接的低聚糖中具有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體變體。這類抗 體變體的⑶C功能可以獲得改善。這類抗體變體描述于，例如 W01997/30087 (Patel et al.)、W01998/58964 (Raju, S.)和 W01999/22764 (Raju, S.)中。
[0260]在某些實(shí)施方案中，抗體變體包含具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的Fe區(qū)，這進(jìn)一步改善ADCC，例如，在Fe區(qū)的298、333和/或334位置(殘基的Eu編號(hào))處的取代。這類取代可以與任何上述變異組合發(fā)生。
[0261]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明慮及具有某些但并非全部效應(yīng)子功能的抗體變體，效應(yīng)子功能使得該抗體變體對(duì)于許多應(yīng)用而言是期望的候選物，其中抗體的體內(nèi)半衰期是重要的，然而某些效應(yīng)子功能(例如，補(bǔ)體和ADCC)不是必須的或者是不利的。在某些實(shí)施方案中，測(cè)量抗體的Fe活性，以確保只保留了期望的特性?？梢赃M(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測(cè)定，以證實(shí)CDC和/或ADCC活性的減少/耗盡。例如，可以進(jìn)行Fe受體(FcR)測(cè)定，以確?？贵w缺乏Fe Y R結(jié)合(因而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結(jié)合能力。介導(dǎo)ADCC的原代細(xì)胞，即NK細(xì)胞，只表達(dá)Fe Y RIII，而單核細(xì)胞表達(dá)Fe Y R1、Fe Y RII 和 Fe Y RIII。造血細(xì)胞上 FcR 的表達(dá)總結(jié)于 Ravetch and Kinet, Annu.Rev.1mmunol.9:457-92(1991)的第464頁(yè)的表3中。評(píng)價(jià)目的分子的ADCC活性的體外測(cè)定的非限制性實(shí)例描述于美國(guó)專利5，500，362號(hào)(參見，例如Hellstrom, 1.，et al.Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA83:7059-7063(1986))和 Hellstrom, I et al.，Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA82:1499-1502 (1985);美國(guó)專利 5，821，337 號(hào)(參見 Bruggemann, M.et al., J.Exp.Med.166:1351-1361 (1987))?；蛘?，可以使用非放射性測(cè)定方法，參見，例如用于流式細(xì)胞術(shù)的ACTI?非放射性細(xì)胞毒性測(cè)定(CellTechnology，Inc.Mountain View, CA);和CytoTox 96?非放射性細(xì)胞毒性測(cè)定(Promega, Madison, WI)。用于這類測(cè)定的效應(yīng)細(xì)胞包
括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞?？蛇x擇地，或者另外，可以在體內(nèi)評(píng)價(jià)目的分子的 ADCC 活性，例如在 Clynes et al.Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA95:652-656 (1998)所公開的動(dòng)物模型中。還可以進(jìn)行Clq結(jié)合測(cè)定，證實(shí)抗體不能結(jié)合Clq并因而缺乏⑶C活性。為了評(píng)價(jià)補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行⑶C測(cè)定(參見,例如Gazzano-Santoro et al.，J.1mmunol.Methods202:163(1996) ；Cragg, M.S.et al.，BloodlOl:1045-1052(2003)；和Cragg, M.S.and M.J.Glennie, Bloodl03:2738-2743 (2004))。還可以利用本領(lǐng)域已知的方法來進(jìn)行FcRn結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期確定(參見，例如Petkova, S.B.et al., Int’l.1mmunol.18(12):1759-1769(2006))。
[0262]本發(fā)明提供了具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的其他抗體變體。取代誘變的目的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但是也考慮了 FR改變。保守性取代顯示于標(biāo)題為“優(yōu)選的取代”的表1中。名為“示例性取代”的更多基本變化提供于表1中，或者在下文中對(duì)氨基酸分類的引用中進(jìn)一步進(jìn)行描述?？梢詫被崛〈鷮?dǎo)入目的抗體中，并例如，對(duì)產(chǎn)物篩查期望活性，例如，改善的抗原結(jié)合、降低的免疫原性、改善的ADCC或CDC等。
[0263]表1
[0264]
【權(quán)利要求】
1.有效量的抗VEGF抗體在制備用于阻斷或減少個(gè)體的復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的用途，其中所述抗體包含6種選自以下的HVR: (a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列X1X2R X3SL,其中所述HVR-Ll包含以下位置的任何組合中的1、2或3種取代=X1為G或A，X2為V或I ;和/或X3為T或R ; (b)HVR-L2，其包含氨基酸序列DASSLA(SEQ ID NO:6)； (c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SYKSPL(SEQ ID NO:7)； (d)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SISGSWIF(SEQ ID NO:1)； (e)HVR-H2，其包含氨基酸序列GAIWPFGGYTH(SEQ ID NO: 2);以及 (f)HVR-H3，其包含氨基酸序列RWGHSTSPWAMDY(SEQ ID NO:3)。
2.有效量的抗VEGF抗體在制備用于阻斷或減少個(gè)體的復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的用途，其中所述抗體包含: (a)HVR-Hl，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列； (b)HVR-H2，其包含SEQID NO:2的氨基酸序列； (c)HVR-H3，其包含SEQID NO:3的氨基酸序列； (d)HVR-Ll，其包含SEQID NO:4的氨基酸序列； (e)HVR-L2，其包含SEQID NO: 6的氨基酸序列；以及 (f)HVR-L3，其包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
3.有效量的抗VEGF抗體在制備用于阻斷或減少個(gè)體的復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的用途，其中所述抗體包含: (a)HVR-Hl，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列； (b)HVR-H2，其包含SEQID NO:2的氨基酸序列； (c)HVR-H3，其包含SEQID NO:3的氨基酸序列； (d)HVR-Ll，其包含SEQID NO:5的氨基酸序列； (e)HVR-L2，其包含SEQID NO: 6的氨基酸序列；以及 (f)HVR-L3，其包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
4.有效量的抗VEGF抗體在制備用于阻斷或減少個(gè)體的復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物中的用途，其中所述抗體包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO:44或45的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其中所述重鏈可變域包含SEQID N0:43的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其中所述重鏈可變域包含SEQID N0:43的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
7.有效量的抗VEGF抗體在制備用于治療個(gè)體的非腫瘤疾病狀態(tài)的藥物中的用途，其中所述抗體包含6種選自以下的HVR: (a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列X1X2R X3SL,其中所述HVR-Ll包含以下位置的任何組合中的1、2或3種取代=X1為G或A ，X2為V或I ;和/或X3為T或R ; (b)HVR-L2，其包含氨基酸序列DASSLA(SEQ ID NO:6)； (c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SYKSPL(SEQ ID NO:7)；(d)HVR-Hl，其包含氨基酸序列 SISGSWIF (SEQ ID NO:1)； (e)HVR-H2，其包含氨基酸序列GAIWPFGGYTH(SEQ ID NO:2);以及 (f)HVR-H3，其包含氨基酸序列RWGHSTSPWAMDY(SEQ ID NO:3)。
8.有效量的抗VEGF抗體在制備用于治療個(gè)體的非腫瘤疾病狀態(tài)的藥物中的用途，其中所述抗體包含: (a)HVR-Hl，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列； (b)HVR-H2，其包含SEQID NO:2的氨基酸序列； (c)HVR-H3，其包含SEQID NO:3的氨基酸序列； (d)HVR-LI，其包含SEQID NO:4的氨基酸序列； (e)HVR-L2，其包含SEQID NO: 6的氨基酸序列；以及 (f)HVR-L3，其包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
9.有效量的抗VEGF抗體在制備用于治療個(gè)體的非腫瘤疾病狀態(tài)的藥物中的用途，其中所述抗體包含: (a)HVR-Hl，其包含SEQID NO:1的氨基酸序列； (b)HVR-H2，其包含SEQID NO:2的氨基酸序列； (c)HVR-H3，其包含SEQID NO:3的氨基酸序列； (d)HVR-Ll，其包含SEQID NO:5的氨基酸序列； (e)HVR-L2，其包含SEQID NO: 6的氨基酸序列；以及 (f)HVR-L3，其包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
10.有效量的抗VEGF抗體在制備用于治療個(gè)體的非腫瘤疾病狀態(tài)的藥物中的用途，其中所述抗體包含重鏈可變域和輕鏈可變域，所述重鏈可變域包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO:44或45的氨基酸序列。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述重鏈可變域包含SEQID NO:43的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求10所述的用途，其中所述重鏈可變域包含SEQID NO:43的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變域包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
13.如權(quán)利要求7至12中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述非腫瘤疾病狀態(tài)是慢性炎癥或動(dòng)脈粥樣硬化。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述慢性炎癥是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或銀屑病。
15.如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述抗體是單克隆抗體。
16.如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述抗體是人源化的。
17.如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述抗體是人抗體。
18.如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述抗體包含人共有框架序列。
19.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述抗體是抗體片段。
20.如權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述抗VEGF抗體以有效量存在于所述藥物中。
21.如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述個(gè)體是人。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103893759SQ201410006693
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2008年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2007年11月30日
【發(fā)明者】熱爾梅娜·富, 重偉·V·李 申請(qǐng)人:基因技術(shù)公司