專利名稱：錳超氧化物歧化酶模擬物在制備保肝藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種錳超氧化物歧化酶模擬物MnSODm的醫(yī)藥新用途——在制備保肝藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝臟是動物體內(nèi)極其重要的器官，參與消化、代謝、排泄、解毒以及免疫等多種功能。肝臟是各類物質(zhì)攻擊的重要靶點。肝損傷導(dǎo)致的肝功能障礙是各種肝臟疾病的共同病理表現(xiàn)，有害因子攻擊靶細胞導(dǎo)致細胞損傷，產(chǎn)生并釋放一系列的炎癥介質(zhì)，造成細胞凋亡或壞死，最終導(dǎo)致各種肝臟疾病的發(fā)生。肝損傷的機制非常復(fù)雜，是多種因素在多個層面、多靶點、多途徑綜合作用的結(jié)果。各種有害因素導(dǎo)致的肝損傷有肝細胞的變性壞死、脂肪肝、肝纖維化、肝硬化、甚至肝癌。目前，對肝損傷的治療仍是一個全球性的嚴(yán)峻課題。建立實驗肝損傷動物模型，研究肝損傷發(fā)生的若干共性機制，對篩選保肝活性成分，探索保肝藥物作用機制，具有十分重要的現(xiàn)實意義。生物體在正常生命活動過程中伴隨著氧代謝會產(chǎn)生活性氧。生物體具有十分完善的活性氧清除體系，包括各種抗氧化酶類和抗氧化物，故正常生理條件下機體的活性氧處于動態(tài)平衡狀態(tài)。但在病理狀態(tài)下或逆境條件下，機體內(nèi)活性氧代謝有可能失衡，導(dǎo)致活性氧積累而引發(fā)氧化損傷，加速衰老或?qū)е录膊?。超氧化物歧化?SOD)是生物抗氧化酶類的重要成員，是生物體有效清除活性氧的重要酶類之一。人們通過對SOD的廣泛深入的研究，極大地豐富和推動了自由基生物學(xué)的飛速發(fā)展。目前，對SOD的研究已從抗氧化及抗衰老機制拓展到化妝品、食品和醫(yī)藥等方面的應(yīng)用研究。按結(jié)合金屬離子種類不同，SOD分為三種:含銅與鋅的超氧化物歧化酶(CuZnSOD)，含錳的超氧化物歧化酶(MnSOD)和含鐵的超氧化物歧化酶(FeSOD)，三種SOD都有催化超氧化物陰離子自由基(02_)發(fā)生歧化反應(yīng)的作用。MnSOD主要存在于真核細胞、原核細胞及線粒體的基質(zhì)中，它作為一種重要的抗氧化劑在機體防御疾病的過程中起著重要的作用。天然的MnSOD具有分子質(zhì)量大、在體內(nèi)半衰期短、穩(wěn)定性差、易被蛋白酶 水解，且長期注射使用可誘發(fā)免疫和過敏反應(yīng)等不足，限制了其臨床應(yīng)用。為了解決這一問題，國內(nèi)外學(xué)者主要應(yīng)用分子工程方法對SOD進行分子修飾或制成脂質(zhì)體。對MnSOD的化學(xué)模擬已成為認(rèn)識天然酶的有利工具，以合成的錳超氧化物歧化酶模擬物替代天然SOD應(yīng)用于臨床已成為新的研究熱點。錳超氧化物歧化酶模擬物(MnSODm)是以水溶性較好的柔性脂肪胺和具有良好生物相溶性的鄰香草醛合成的含有雙核結(jié)構(gòu)的MnSOD模擬化合物，其合成方法參見:竇偉.《柔性開鏈席夫堿配體金屬超分子配合物研究》，蘭州大學(xué)，博士論文，2007年。其分子式為(C4tlH57Mn2N9O21),結(jié)構(gòu)式如下。Cl^oMnSODm的結(jié)構(gòu)特征是:在一個配合物分子中含有兩個錳活性中心,增加了同一位點的活性濃度，具有較高的活性。與天然MnSOD相比有性質(zhì)穩(wěn)定、分子量小、水脂兼溶、易跨膜和活性高的特點，并且合成方法簡便，成本低廉，純度高，產(chǎn)率高，較好地克服了天然MnSOD的局限性。目前，對MnSODm的研究主要集中在對腫瘤的抑制作用上。然而，我們發(fā)現(xiàn)，MnSODm具有極強的抗氧化、清除氧自由基作用和抗炎活性。自由基在肝損傷的過程中發(fā)揮著重要的作用，而MnSODm對肝損傷的研究目前尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種錳超氧化物歧化酶模擬物MnSODm的醫(yī)藥新用途——在制備保肝藥物中的應(yīng)用。下面擬采用四氯化碳(CCI4)致小鼠急性肝損傷模型，觀察MnSODm對急性肝損傷的保護作用。實驗材料與方法 1.1動物
昆明種小鼠，體重18 22 g， ，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供。藥品及試劑
錳超氧化物歧化酶模擬化合物(MnSODm，C40H63Cl3Mn2N6O16),由蘭州大學(xué)化工學(xué)院劉偉生教授提供；聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江醫(yī)藥股份有限公司，批號:111013)。CCI4(分析純);花生油(山東魯花);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(S0D)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及考馬斯亮藍試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號:20121120。 主要儀器臺式離心機(KA-1000，上海安亭科學(xué)儀器廠制造)；電動玻璃勻漿機(DY-2，寧波新芝生物科技股份有限公司制造)；可見分光光度計(722S，上海精密科學(xué)儀器有限公司制造)，SPX-250B-D型振蕩培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ELX800型酶標(biāo)儀，購于BIO-TEK INSTRUMENTS, Inc.USA。模型的建立及藥物治療
雄性昆明種小鼠，按體重隨機分為6組，分別為:正常對照組、模型對照組、聯(lián)苯雙酯組、以及 MnS0Dm(10 mg.kg—1)、中(20 mg.kg—1)、高(40 mg.kg—1)齊[J量組。各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后每天灌胃給藥，正常對照組和模型對照組用生理鹽水灌胃，聯(lián)苯雙酯組給予聯(lián)苯雙酯溶液灌胃，MnSODm低、中、高劑量組分別用MnSODm低、中、高溶液灌胃，均0.1mL.lOg—1,每天給藥I次,連續(xù)給藥7 do除正常對照組外，其余各組小鼠于末次給藥24h后灌胃給與5% CCI4花生油溶液10 mL.kg'樣本的采集及處理
所有小鼠于造模24 h后摘取眼球取血，4°C放置2 h后，以1000 g離心10 min,分離血清，用于血清生化測定。取出肝臟，用冷的生理鹽水沖肝臟上殘余血清，沖洗干凈后，用濾紙拭干，稱量整個肝臟，用于計算小鼠肝臟系數(shù)。剪取病變最明顯處組織一小部分，用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色，觀察肝臟的損傷程度。再剪取部分病變組織塊，準(zhǔn)確稱重，用眼科剪剪碎，加冷生理鹽水低溫制成10 %組織勻漿，1000 g離心10 min，分離上清液，-20 V冰 箱保存用于組織生化測定。組織與血清中指標(biāo)的測定
1.6.1組織與血清中ALT活力測定
ALT在適宜的溫度及pH條件下作用于丙氨酸及a-酮戊二酸組成的基質(zhì)，生酮酸及谷氨酸，反應(yīng)至所規(guī)定時間后加入2，4 一二硝基苯腆(DNPH)-鹽酸溶止反應(yīng)，同時2，4- 二硝基苯臍與丙酮酸的撥基加成，生成丙酮酸苯蹤。苯蹤性條件下呈紅棕色，根據(jù)顏色深淺確定酶活力強弱。具體操作按照試劑盒說明進行。組織與血清中AST活力測定
AST能使a-酮戊二酸和天門冬氨酸移換氨基和酮基，生成谷氨酸和草酞乙酸。草酞乙酸在反應(yīng)中可自行脫梭成丙酮酸。丙酮酸與2，4-二硝基苯臍反應(yīng)生成2，4-二硝基苯蹤，在堿性溶液中顯紅棕色。在505 nm比色，測定吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得酶活力單位。具體操作按照試劑盒說明進行。組織和血清中SOD活力測定
采用黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶法檢測。通過黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，用可見分光光度計在550 nm處測定其吸光度。當(dāng)被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子有專一性抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。分別取血清20 UL和1%的組織勻漿上清液50UL按試劑盒說明書進行操作，推算出血清中SOD活力(U/mL)和組織中的SOD活(U/mgprot)。以每毫克組織蛋白或每毫升血清在I mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位(U)。組織和血清中GSH-Px活力測定谷光甘肽過氧化酶(GSH-Px)是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶。GSH-Px可以促進過H2O2與還原型谷光甘肽(GSH)反應(yīng)生成H2O及氧化型谷光甘肽(GSSG)，GSH-Px的活力可用其酶促的速度來表示，測定該酶促反應(yīng)中GSH的消耗，可求出酶的活力。取5%結(jié)腸組織勻漿上清200 UL按試劑盒說明書步驟測定，在412 nm處測其吸光度推算出GSH-Px活力。血清中GSH-Px活力測定原理同上，未稀釋的血清用生理鹽水按1:4稀釋后取100 UL按試劑盒說明書進行測定，血清中GSH-Px酶活力規(guī)定:每0.1 mL血清或每毫克組織蛋白，扣除非酶促反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低I mol/L為一個酶活力單位。組織和血清中MDA含量測定
MDA為脂質(zhì)過氧化物。采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，即過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。分別取10%結(jié)腸組織勻漿上清100 UL和血清50 μ L，按試劑盒說明書進行操作，在532 nm處測定定吸光度從而推算出組織和血清中MDA含量，以每毫克組織蛋白納摩爾數(shù)(nmol/mg prot)或每毫升(nmol/mL)表示。統(tǒng)計學(xué)處理
實驗數(shù)據(jù)以表示，用SPSS 15軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間差異采用單因素方差分析(ANV0A)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，/X0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果
2.1錳超氧 化物歧化酶模擬化合物對CCI4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝組織功能及肝組織形態(tài)的影響
與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清與組織中ALT、AST活力及肝臟指數(shù)明顯增力口 (/X0.01)，證明肝損傷模型復(fù)制成功。與模型對照組比較，聯(lián)苯雙酯及MnSODm低、中、高組小鼠組織與血清中ALT、AST活力及肝臟指數(shù)明顯降低(/X0.05或/X0.01)(見表I)。表1.錳超氧化物歧化酶模擬化合物對CCI4所致肝損傷小鼠肝臟與血清中ALT、AST活力及肝臟系數(shù)的影響(，n=8-10).I:—::.S ALT. S* AU.S T1:二Α ,Ι ；5 *S'S AJ 1 5F Χ
權(quán)利要求
1.錳超氧化物歧化酶模擬物在制備保肝藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述錳超氧化物歧化酶模擬物在制備保肝藥物中的應(yīng)用，其特征在于:以錳超氧化物歧化酶模擬物為活性成分，按常規(guī)工藝和輔料制備成藥劑學(xué)可接受的制劑。
3.如權(quán)利要求2所述錳超氧化物歧化酶模擬物在制備保肝藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述制劑為顆粒、膠囊、滴 丸、注射液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種錳超氧化物歧化酶模擬物MnSODm的醫(yī)藥新用途——在制備保肝藥物中的應(yīng)用。通過考察錳超氧化物歧化酶模擬化合物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用，表明MnSODm對CCI4致小鼠急性肝損傷的有明顯的保護作用，因此，可用于保肝藥物的制備，即以錳超氧化物歧化酶模擬物為活性成分，按常規(guī)工藝和輔料制備成藥劑學(xué)可接受的制劑。
文檔編號A61K38/44GK103223161SQ20131017443
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月13日
發(fā)明者李紅玲, 王艷紅 申請人:甘肅省人民醫(yī)院