凝結芽孢桿菌在制備預防和治療幽門螺桿菌感染制劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及凝結芽孢桿菌在制備預防和治療幽門螺桿菌感染制劑中的應用，具體是用凝結芽孢桿菌預防或根除胃部或十二指腸幽門螺桿菌感染。
【專利說明】凝結芽孢桿菌在制備預防和治療幽門螺桿菌感染制劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及凝結芽孢桿菌在制備預防和治療幽門螺桿菌感染制劑中的應用，具體是用凝結芽孢桿菌預防或根除胃部或十二指腸幽門螺桿菌感染。
【背景技術】
[0002]幽門螺桿菌(helicobacter pylori, Hp)是上消化道疾病的主要致病菌。目前主要采用抗生素治療，但隨著Hp對抗生素耐藥率上升，根除率正在逐步降低，產(chǎn)生耐藥性后，根除會更加困難。因此，尋找新的根除方案迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種能預防胃部或十二指腸幽門螺桿菌感染或根除胃部或十二指腸幽門螺桿菌感染的制劑，該制劑由凝結芽孢桿菌制成。
[0004]本發(fā)明的制劑的制備優(yōu)選是通過下述步驟實施的，但不局限于此制備工藝，公知的能實現(xiàn)的制備工藝均可以:采取可能含凝結芽孢桿菌的樣品，然后將樣品置于滅菌瓶內(nèi)，研究時從中取一定量的樣品加入18mL滅菌的稀釋液中，充分混勻，在無菌操作臺內(nèi)，進行ιο'ιο'ιο'ιοΛ 10_5，10_6，10_7梯度稀釋，取10_5，10_6，10_7三個稀釋梯度，分別涂布于凝結芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱，37°c下培養(yǎng)48小時，選擇長勢良好的單菌落分別接種于液體擴增培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，37°C下擴增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調制出干燥菌粉，然后根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》、相關細菌鑒定文獻或16S rRNA序列對比分析進行凝結芽孢桿菌鑒定和毒性試驗，將無毒性的凝結芽孢桿菌干燥菌粉按需要比例添加輔料制成片劑、膠囊、散劑、粉劑或液體制劑等各種劑型，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到協(xié)同作用。
[0005]凝結芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于:純化水1000mL,蛋白胨IOg,牛肉浸取物IOg,檸檬酸二銨2g,乙酸鈉5g,酵母粉5g,葡萄糖5g,磷酸二氫鉀2g,吐溫801.0ml，碳酸鈣20g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，瓊脂15g，調ρΗ6.2-6.5，115°C高壓滅菌20min。
[0006]凝結芽孢桿菌液體擴增培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于:純化水1000mL,蛋白胨10g，牛肉浸取物3g,氯化鈉5g,葡萄糖5g,調pH7,115°C高壓滅菌20min。
[0007]為進一步具體說明本發(fā)明，發(fā)明人利用上述方法通過凝結芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基分離鑒定出了無毒性的凝結芽孢桿菌，本發(fā)明所述凝結芽孢桿菌并不局限于為說明本發(fā)明所述的菌，只要無毒性的凝結芽孢桿菌均是本發(fā)明所述，均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0008]本發(fā)明所述凝結芽孢桿菌優(yōu)選但不限于凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207或凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407。
[0009]本發(fā)明實施說明 中優(yōu)選使用的凝結芽孢桿菌的細菌學性質:[0010]1、為說明本發(fā)明，本發(fā)明利用上述方法分離的凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌TBC169 保藏編號 CGMCC1207。
[0011]2、菌落形態(tài)
[0012]顯微鏡觀察:桿狀，革蘭氏染色陽性。
[0013]平板形態(tài):菌落呈白色、圓形、邊緣整齊、大小2_3mm。
[0014]3、生理生化鑒定[0015]明膠液化:_ ;過氧化氫酶:+ ；VP試驗:+ ;苯丙氨酸脫氨酶試驗_。
[0016]4、糖酵解實驗鑒定
[0017]葡萄糖:+ ;麥芽糖:+ ;蔗糖:+ ;木糖:_ ;果糖:+ ；鼠李糖:_ ;乳糖:+ ;菊粉:+ ;半乳糖:+ ;糊精:+。
[0018]5、分離的菌進行16S rRNA基因測序，測得序列用BLAST與GenBank和RDP數(shù)據(jù)庫中的基因序列進行相似性分析，確定分離的菌為凝結芽孢桿菌。
[0019]本發(fā)明所述的凝結芽孢桿菌指活生物個體。
[0020]本發(fā)明是以有效劑量按上述方法分離的凝結芽孢桿菌作為主要活性成份，按照一定的制劑工藝，加入常規(guī)的賦形劑、調味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、濕潤劑、黏合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等輔料，制成任何一種適合于使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑、粉劑等劑型。
[0021]本發(fā)明所述凝結芽孢桿菌作為主要藥物活性成份制成活菌制劑。
[0022]本發(fā)明所指有效劑量是指凝結芽孢桿菌根據(jù)上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于I X 106CFU/g，一般在I X 107CFU/g以上，最高可達到I X 1012CFU/g或I X 1012CFU/g以上。
[0023]本發(fā)明所指有效劑量是指按上述方法分離的凝結芽孢桿菌根據(jù)上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的液體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于I X 106CFU/mL,一般在 IX 107CFU/mL 以上，最高可達到 IX 1012CFU/mL 或 I X 1012CFU/mL 以上。
[0024]由于本發(fā)明首次公開了凝結芽孢桿菌作為主要活性成份制成制劑在預防和治療幽門螺桿菌感染中的應用，因此含上述凝結芽孢桿菌的制劑在預防和治療幽門螺桿菌感染制劑中的應用均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0025]本發(fā)明所述的凝結芽孢桿菌在制成任何一種劑型時，均具有預防和治療幽門螺桿菌感染的作用。如果其組份中含有凝結芽孢桿菌成份制備成制劑，在其包裝或說明書等標識上或者在其他任何宣傳品上只要注明或提示具有預防和治療幽門螺桿菌感染的作用，則落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0026]本發(fā)明所述的凝結芽孢桿菌可以制成藥品、保健食品、食品或飲品等。
【具體實施方式】
[0027]制備例說明:上述已經(jīng)對凝結芽孢桿菌制劑的制備進行說明，這里通過凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207或凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407 (凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)為例進行具體說明，其他凝結芽孢桿菌菌種制劑的制備方法本領域技術人員通過本實施例很容易掌握，其他劑型的制備方法本領域技術人員通過本實施很容易掌握，在此不再一一敘述說明。制備方法并不局限于本發(fā)明實施例所述，公知的能夠達到制備目的的方法均可以，實施例的制備說明只是對本發(fā)明的說明，并不是對本發(fā)明保護范圍的限制。
[0028]制備實施例1凝結芽孢桿菌粉劑的制備
[0029]1菌粉的制備和菌種的鑒定
[0030]采取人的糞便、土壤、草垛底物等樣品，然后將樣品置于滅菌瓶內(nèi)，從中取2克樣品加入ISmL滅菌的稀釋液中，充分混勻，在無菌操作臺內(nèi)，進行10-1,10-2,10-3,10-4,10-510_6，10-7梯度稀釋，取10_5，10-6，10-7三個稀釋梯度，涂布于凝結芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱，37°C下培養(yǎng)48小時，選擇長勢良好的單菌落接種到凝結芽孢桿菌液體擴增培養(yǎng)基中，37°C下擴增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調制出干燥菌粉，活菌數(shù)均為lX109CFU/g以上，然后進行菌種鑒定，經(jīng)生理生化和16S rRNA序列對比分析鑒定為凝結芽孢桿菌，為凝結芽孢桿菌TBC169 保藏編號 CGMCC1207。
[0031]凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407菌粉制備，將凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407接種到凝結芽孢桿菌液體擴增培養(yǎng)基中，37°C下擴增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調制出干燥菌粉，活菌數(shù)均為I X 109CFU/g 以上。
[0032]2毒性試驗
[0033]2.1動物及分組取30只SPF級別小鼠，6~8周齡，體重14~18g，隨機分入凝結芽孢桿菌CGMCC1207組、凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407組和未給藥組，每組10只。
[0034]2.2制備菌液將上述不同的凝結芽孢桿菌菌粉分別用純化水調制為含菌數(shù)均為I X 109CFU/mL 的菌液。
[0035]2.3方法各凝結芽孢桿菌組和未給藥組均給予相同的基礎飼料，且飼養(yǎng)條件均一致，各凝結芽孢桿菌組每天灌服凝結芽孢桿菌菌液0.5mL，未給藥組每天灌服純化水
0.5mL，飼喂14天，觀察體重及毒性反應。
[0036]2.4 結果
[0037]各組小鼠均未出現(xiàn)異常情況，未發(fā)生振顫、痙攣、運動失調、姿態(tài)異常，無眼球突出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無死亡情況，未見中毒反應。
[0038]3制備成粉劑等劑型
[0039]根據(jù)上述步驟和方法分離鑒定后，經(jīng)實驗檢驗無毒性，就可將凝結芽孢桿菌菌種制成菌粉，然后按照需要添加相關輔料制成各種劑型，優(yōu)選據(jù)凝結芽孢桿菌菌粉的活菌數(shù)，按比例添加淀粉制成粉劑，使活菌數(shù)不低于I X 107CFU/g,然后裝袋。
[0040]應用效果實施例說明:
[0041]本發(fā)明以凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207或凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407為代表說明凝結芽孢桿菌的應用效果。
[0042]應用效果實施例1:凝結芽孢桿菌在治療幽門螺桿菌中的應用
[0043]I對象與方法
[0044]1.1病例資料
[0045]經(jīng)13C呼氣試驗檢測，確認有幽門螺桿菌感染的患者36例，平均年齡46歲，病史在2年~10年，隨機分為凝結芽孢桿菌CGMCC1207組、凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407組和對照組，每組12例。各組之間臨床數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學差異(P > 0.05)。
[0046]1.2給藥方法
[0047]凝結芽孢桿菌CGMCC1207散，每袋350mg (含凝結芽孢桿菌活菌數(shù)不低于1.0X107cfU/g)，由青島東海藥業(yè)有限公司提供。3袋/次，一天3次。療程4周。
[0048]凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407散，每袋350mg (含凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407活菌數(shù)不低于1.0X107cfU/g)，由青島東海藥業(yè)有限公司提供。3袋/次，一天3次。療程4周。
[0049]對照組不服用任何藥物。
[0050]1.3觀察方法服藥4周后，對照組也是4周后，經(jīng)13C呼氣試驗檢測幽門螺桿菌根除率。
[0051]2結果判定
[0052]凝結芽孢桿菌CGMCC1207組幽門螺桿菌陰性5例，根除率41 % ;凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407組幽門螺桿菌陰性5例，根除率41 % ;對照組O例，根除率O %。凝結芽孢桿菌CGMCC1207組與凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407組之間根除率無統(tǒng)計學差異(P > 0.05)，但兩組與對照組比較，有統(tǒng)計學差異(P < 0.05)。
[0053]3 結論
[0054]凝結芽孢桿菌能夠有效 預防和治療幽門螺桿菌，是根除幽門螺桿菌新治療方法和突破。
[0055]本發(fā)明在實施過程中所使用的微生物菌種已于2004年8月23日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所郵編100101)保藏。分類命名:凝結芽孢桿菌bacillus coagulans,保藏編號1207。凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207由本發(fā)明申請單位自行分離獲得，已在商業(yè)渠道銷售，并且已經(jīng)授權專利保護(專利號200410098660.4)，按照專利審查指南的規(guī)定，公眾能夠從商業(yè)渠道買到或已經(jīng)授權，不用保藏，即不用提供保藏證明，因此，本發(fā)明未提供凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207保藏證明。
[0056]凝結芽孢桿菌CGMCC1.2407購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
【權利要求】
1.凝結芽孢桿菌在制備預防和治療幽門螺桿菌感染制劑中的應用。
2.按權利要求1所述應用，其特征在于所述制劑包括藥品、保健食品、食品、飲品。
3.按權利要求1所述應用，其特征在于所述凝結芽孢桿菌指活的生物個體。
4.按權利要求1所述應用，其特征在于所述凝結芽孢桿菌包括凝結芽孢桿菌TBC169保藏編號CGMCC1207或凝結芽孢桿菌保藏編號CGMCC1.2407。
5.按權利要求1所述應用，其特征在于所述凝結芽孢桿菌單獨應用，或與其他藥物聯(lián)合應用。
6.按權利要求1所述應用，其特征在于預防和治療幽門螺桿菌感染包括胃部或十二指腸感染
7.按權利要求1所述制劑，其特征在于固體制劑包含的總活菌數(shù)不低于IX106CFU/g，一般在I X 107CFU/g以上，最高可達到I X 1012CFU/g或I X 1012CFU/g以上；或液體制劑包含的總活菌數(shù)不能低于I X 106CFU/mL, 一般在I X 107CFU/mL以上，最高可達到I X 1012CFU/mL或 I X 1012CFU/mL 以上。
【文檔編號】A61P31/04GK103565848SQ201310105638
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年3月19日 優(yōu)先權日:2013年3月19日
【發(fā)明者】李洪福, 崔云龍 申請人:青島東海藥業(yè)有限公司