專利名稱：雪上一枝蒿生物堿的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物提取物的制備方法及應(yīng)用，具體涉及雪上一枝蒿生物堿成分的制備方法及其在制備預(yù)防或治療腫瘤疾病的藥物中的用途，屬于天然藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
毛茛科烏頭屬(Aconitum)植物作為有毒植物及藥用植物一直受到廣泛的關(guān)注。我國(guó)西南橫斷山區(qū)南部(四川西部、云南西北和西藏東部)是國(guó)產(chǎn)烏頭屬植物的重要分布區(qū)。毛茛科烏頭屬植物的傳統(tǒng)功效為祛風(fēng)除濕、活血祛瘀、溫里散寒等，主要用于各類瘟疫的防治，如牙痛、關(guān)節(jié)炎及痛風(fēng)的鎮(zhèn)痛以及各類跌打骨 傷的消炎鎮(zhèn)痛等。

雪上一枝筒為毛艮科烏頭屬(Aconitum)植物短柄烏頭、展毛短柄烏頭、曲毛短柄烏頭、宣威烏頭brachypodum)、'\、'^擒■ (A似講/ )、鐵棒錘(兒pendulum)、伏毛鐵棒錘(A. fIavum.)等的干燥塊根,性溫,味苦、辛，有大毒，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、散瘀療傷及活血止痛等功效，被用于治療風(fēng)寒濕痹所致的筋骨和關(guān)節(jié)疼痛、跌打損傷的瘀血疼痛及牙痛等癥，療效顯著。

CN1698836A公開(kāi)了一種含雪上一枝蒿總生物堿的水包油乳劑組合物，其包含雪上一枝蒿總生物堿、油性載體、水和表面活性劑；其中雪上一枝蒿總生物堿是以有效劑量被均勻分散到所述的油性載體中，雪上一枝蒿總生物堿和油性載體在水中形成穩(wěn)定的分散相。然而，該文獻(xiàn)僅僅披露了雪上一枝蒿總生物堿的一種制劑方案，并沒(méi)有公開(kāi)其制備方法及抗癌活性。通過(guò)檢索發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有報(bào)道過(guò)采用高速逆流色譜(HSCCC)分離純化雪上一枝蒿生物堿的方法，也沒(méi)有披露過(guò)雪上一枝蒿生物堿的抗癌活性。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于通過(guò)大量試驗(yàn)研究，提供一種雪上一枝蒿生物堿成分的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
雪上一枝蒿生物堿的制備方法，包括如下步驟
(1)取雪上一枝蒿，粉碎，用I 10倍量(g/v)50% 95%乙醇溶液浸泡提取3 6次每次12 24 h，然后用I 10倍量(g/v)蒸餾水浸泡提取2-4次，合并提取液，減壓回收至無(wú)醇味，得褐色浸膏；
(2)用0.5 3倍量去離子水懸浮浸膏，以I 5倍量(v/v)的有機(jī)溶劑萃取，所述的有機(jī)溶劑為正己烷、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇，得到萃取物，回收溶劑并干燥，得浸膏；
(3)將正己烷乙酸乙酯甲醇水按體積比5 9:2 5:3 7:3 7比例混合，于分液漏斗中靜置過(guò)夜，次日體系分層平衡后分離出上下相，并超聲脫氣備用；
(4)稱取步驟(2)制備的浸膏，溶于步驟(3)的上相或下相或混合上下相溶劑中，振蕩使之完全溶解；(5)將步驟(3)獲得的上相以10 40ml/min的流速泵入高速逆流色譜儀的螺旋管，開(kāi)啟循環(huán)水浴并設(shè)定恒溫器溫度為20 40°C，然后以0. 8 5. Oml/min的流速泵入步驟
(3)獲得的下相，同時(shí)開(kāi)啟檢測(cè)器設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)200 365nm，并按700 1000r/min的轉(zhuǎn)速啟動(dòng)主機(jī)，待流動(dòng)相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后，將步驟(4)獲得的樣品溶液由進(jìn)樣圈注入，管柱出口處的流出成分經(jīng)過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)并由色譜工作站和記錄儀記錄，按5 12ml每管設(shè)定收集體積或根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分，待進(jìn)樣3h后，停止主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，將固定相推出，固定相保留比為40 75%。經(jīng)過(guò)體內(nèi)和體外抗腫瘤活性研究表明，采用MTT法、熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)，本發(fā)明通過(guò)高速逆流色譜制備的雪上一枝蒿4個(gè)生物堿組分，對(duì)肝癌H印G2、子宮頸癌He la-60及小鼠骨髓瘤SP20細(xì)胞，以及小鼠肝癌、子宮頸癌和骨髓癌均有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，是優(yōu)良的抗腫瘤藥物的候選品種。鑒于此，本發(fā)明第二個(gè)目的在于提供上述方法制備的雪上一枝蒿生物堿在制備預(yù)防或治療腫瘤疾病的藥物中的用途。 優(yōu)選地，所述的腫瘤為肝癌、子宮頸癌或骨髓瘤。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的具有抗腫瘤活性的雪上一枝蒿生物堿成分的制備和應(yīng)用具有以下優(yōu)點(diǎn)和進(jìn)步
(I)利用系統(tǒng)溶劑法和高速逆流色譜方法，可程序化、批量的從雪上一枝蒿塊根提取分離生物堿成分，方法簡(jiǎn)便、快捷，以薄層色譜法(TLC)對(duì)各個(gè)生物堿成分群進(jìn)行鑒定。(2)采用高速逆流色譜分離雪上一枝蒿生物堿，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)有效的分配分離功能，完全排除了支撐體對(duì)樣品組分的吸附、玷染、變性、失活等不良影響，避免了不可逆吸附所造成的溶質(zhì)色譜峰拖尾現(xiàn)象，能實(shí)現(xiàn)很高的回收率。(3)通過(guò)高速逆流色譜制備的雪上一枝蒿4個(gè)生物堿組分，對(duì)肝癌IfepG2、子宮頸癌Hela-60及小鼠骨髓瘤SP20細(xì)胞，以及小鼠肝癌、子宮頸癌和骨髓癌均有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，是優(yōu)良的抗腫瘤藥物的候選品種，豐富了現(xiàn)有技術(shù)。


圖1為實(shí)施例1中正己烷萃取液HSCCC分離色譜圖(II 5組分)，一Manual Run1:10 UV —Manual Run 1:10 Fractions。圖2為實(shí)施例1中氯仿萃取液HSCCC分離色譜圖(III 4組分)，—Manual Run3:10 UV 一Manual Run 3:10 Fractions。圖3為實(shí)施例1中乙酸乙酯萃取液HSCCC分離色譜圖(III1 3組分)，一ManualRun 4:10 UV —Manual Run 4:10 Fractions。圖4為實(shí)施例1中正丁醇萃取液HSCCC分離色譜圖(IVl 5組分)，—ManualRun 7:10 UV —Manual Run 7:10 Fractions。圖5為實(shí)施例1制備的雪上一枝蒿生物堿(正己烷部位分離得到的Il 5組分全部；或氯仿部位分離得到的IIl 4組分全部；或乙酸乙酯部位分離得到的IIIl 3組分全部；或正丁醇部位分離得到的IVl 5組分全部)對(duì)小鼠骨髓瘤SP20細(xì)胞的毒性作用，n=6，，與正常組比較，W < 0. 05，*妒< 0. 01。圖6為實(shí)施例1制備的雪上一枝蒿生物堿(正己烷部位分離得到的Il 5組分全部；或氯仿部位分離得到的IIl 4組分全部；或乙酸乙酯部位分離得到的IIIl 3組分全部；或正丁醇部位分離得到的IVl 5組分全部)對(duì)IfepG2細(xì)胞的毒性作用，n=6，S，與正常組比較，< 0. 05，*妒< 0. 01。圖7為實(shí)施例1制備的雪上一枝蒿生物堿(或正己烷部位分離得到的Il 5組分全部；或氯仿部位分離得到的IIl 4組分全部；或乙酸乙酯部位分離得到的IIIl 3組分全部；或正丁醇部位分離得到的IVl 5組分全部)對(duì)Hela細(xì)胞的毒性作用 ，n=6, L S，與正常組比較，< 0. 05，*妒< 0. 01。圖8為實(shí)施例2制備的雪上一枝蒿生物堿(正己烷部位分離得到的Il 5組分全部；或氯仿部位分離得到的IIl 4組分全部；或乙酸乙酯部位分離得到的IIIl 3組分全部；或正丁醇部位分離得到的IVl 5組分全部)對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響；其中圖8(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)分別為對(duì)照組、氯仿提取部位、乙酸乙酯提取部位、水相提取部位、正丁醇提取部位、正己烷提取部位對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果。圖9為實(shí)施例2制備的雪上一枝蒿生物堿(正己烷部位分離得到的Il 5組分全部；或氯仿部位分離得到的IIl 4組分全部；或乙酸乙酯部位分離得到的IIIl 3組分全部；或正丁醇部位分離得到的IVl 5組分全部)對(duì)IfepG2細(xì)胞凋亡的影響；其中圖9(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)分別為對(duì)照組、氯仿提取部位、乙酸乙酯提取部位、水溶部位、正丁醇提取部位、正己烷提取部位對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果。圖10為實(shí)施例2制備的雪上一枝蒿生物堿(正己烷部位分離得到的Il 5組分全部；或氯仿部位分離得到的IIl 4組分全部；或乙酸乙酯部位分離得到的IIIl 3組分全部；或正丁醇部位分離得到的IVl 5組分全部)對(duì)肝癌細(xì)胞HoeChest33258熒光染色結(jié)果；其中圖10 (A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)分別為對(duì)照組、氯仿提取部位、乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位、水溶部位、正己烷提取部位對(duì)肝癌細(xì)胞HoeChest33258的影響結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及的雪上一枝蒿生物堿成分的制備方法，包括如下步驟，
(I)取雪上一枝蒿藥材1kg，粉碎，用I 10倍量(g/v)50% 95 %乙醇浸泡提取3 6次(每次12 24 h)，同樣用I 10倍量(g/v)蒸餾水浸泡提取2-4次，合并提取液，減壓回收至無(wú)醇味，得褐色浸膏100 300g。(2)藥材提取物浸膏用0. 5 3倍量去離子水懸浮，分別以正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(1:1 1:5，v/v)萃取，得到正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物，分別回收溶劑并干燥備用，所得浸膏重5 50g。(3)將正己烷乙酸乙酯甲醇水按體積比5 9:2 5:3 7:3 7比例混合，于分液漏斗中靜置過(guò)夜，次日體系分層平衡后分離出上下相，并超聲脫氣20min備用。(4)分別稱取100 300mg正己燒、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇浸骨，溶于5 20ml上相溶劑中，振蕩使之完全溶解，以備高速逆流色譜分離。(5)將上相(固定相)以10 40ml/min的流速泵入高速逆流色譜儀的螺旋管，開(kāi)啟循環(huán)水浴并設(shè)定恒溫器溫度為20 40°C。然后以0. 8 5. Oml/min的流速泵入下相(流動(dòng)相)，同時(shí)開(kāi)啟檢測(cè)器設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)200 365nm，并按700 1000r/min的轉(zhuǎn)速啟動(dòng)主機(jī)。待流動(dòng)相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后，分次將正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇樣品溶液由進(jìn)樣圈注入。管柱出口處的流出成分經(jīng)過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)并由色譜工作站和記錄儀記錄，按5 12ml每管設(shè)定收集體積或根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分。待進(jìn)樣3h后，停止主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，將固定相推出，固定相保留比為40 75%。以上制備方法得到生物堿組分II 5、I Il 4、III I 3、IV I 5共4個(gè)組分。以下通過(guò)實(shí)施例形式對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1雪上一支蒿生物堿的制備
(I)取雪上一枝蒿藥材1kg，粉碎，用I倍量(g/v) 50%乙醇浸泡提取3次(每次12 h)，同樣用I倍量(g/v)蒸餾水浸泡提取3次，合并提取液，減壓回收至無(wú)醇味，得褐色浸膏。(2)藥材提取物浸膏用0.5倍量去離子水懸浮，分別以正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正 丁醇(1:1，V/V)萃取，得到正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物，分別回收溶劑并干燥備用。(3)將正己烷乙酸乙酯甲醇水按體積比5 2 3 3比例混合，于分液漏斗中靜置過(guò)夜，次日體系分層平衡后分離出上下相，并超聲脫氣20min備用。(4)分別稱取IOOmg正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇浸膏、溶于5ml上相溶劑中，振蕩使之完全溶解，以備高速逆流色譜分離。(5)將上相(固定相)以10ml/min的流速泵入高速逆流色譜儀的螺旋管，開(kāi)啟循環(huán)水浴并設(shè)定恒溫器溫度為20°C。然后以0. 8ml/min的流速泵入下相(流動(dòng)相)，同時(shí)開(kāi)啟檢測(cè)器設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，并按700r/min的轉(zhuǎn)速啟動(dòng)主機(jī)。待流動(dòng)相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后分次將正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇樣品溶液由進(jìn)樣圈注入。管柱出口處的流出成分經(jīng)過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)并由色譜工作站和記錄儀記錄，按5ml每管設(shè)定收集體積或根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分。待進(jìn)樣3h后，停止主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，將固定相推出，固定相保留比為40%。以上制備方法得到生物堿組分I I 5、IIl 4、III I 3、IV I 5共4個(gè)組分，結(jié)果如圖1 4所示。實(shí)施例2雪上一支蒿生物堿的制備
(I)取雪上一枝蒿藥材lkg，粉碎，用10倍量(g/v)95 %乙醇浸泡提取6次(每次24 h)，同樣用10倍量(g/v)蒸餾水浸泡提取3次，合并提取液，減壓回收至無(wú)醇味，得褐色浸膏。(2)藥材提取物浸膏用3倍量去離子水懸浮，分別以正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(1:5，V/V)萃取，得到正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物，分別回收溶劑并干燥備用。(3)將正己烷乙酸乙酯甲醇水按體積比9 2 7 7比例混合，于分液漏斗中靜置過(guò)夜，次日體系分層平衡后分離出上下相，并超聲脫氣20min備用。(4)分別稱取300mg正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇浸膏、溶于20ml上相溶劑中，振蕩使之完全溶解，以備高速逆流色譜分離。(5)將上相(固定相)以40ml/min的流速泵入高速逆流色譜儀的螺旋管，開(kāi)啟循環(huán)水浴并設(shè)定恒溫器溫度為35°C。然后以5. Oml/min的流速泵入下相(流動(dòng)相)，同時(shí)開(kāi)啟檢測(cè)器設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)365nm，并按1000r/min的轉(zhuǎn)速啟動(dòng)主機(jī)。待流動(dòng)相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后分次將正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇樣品溶液由進(jìn)樣圈注入。管柱出口處的流出成分經(jīng)過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)并由色譜工作站和記錄儀記錄，按12ml每管設(shè)定收集體積或根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分。待進(jìn)樣3h后，停止主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，將固定相推出，固定相保留比為75%。以上制備方法得到生物堿組分I I 5、I Il 4、III I 3、IV I 5共4個(gè)組分。實(shí)施例3 SP20、H印G2及Hela細(xì)胞傳代培養(yǎng)及雪上一支蒿生物堿給藥影響
小鼠骨髓瘤SP20細(xì)胞株懸浮于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1640培養(yǎng)基)，人肝癌HepG2細(xì)胞及人宮頸癌Hela細(xì)胞株貼壁培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基(或含10%胎牛血清的DMEM)中。將上述細(xì)胞置于37°C，含5% CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育，24 h換液，培養(yǎng)3-5天以備實(shí)驗(yàn)使用。貼壁細(xì)胞胰酶消化，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞與不同濃度的藥物共孵育24h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。雪上一枝蒿生物堿對(duì)小鼠骨髓瘤SP20細(xì)胞增殖具有劑量依賴性地抑制作用， 50 u g/ml即抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，400ii g/ml可使細(xì)胞活力下降至正常組的(63. 96±5. 21)%。結(jié)果如圖5所示，其各個(gè)生物堿部位對(duì)SP20細(xì)胞均有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用；制備的雪上一枝蒿不同的生物堿對(duì)H印G2細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，結(jié)果如圖6所示；制備的雪上一枝蒿不同的生物堿對(duì)Hela細(xì)胞有很強(qiáng)的劑量依賴性抑制作用，結(jié)果如圖7所示。實(shí)施例4 SP20、H印G2及Hela細(xì)胞活力檢測(cè)
MTT法用來(lái)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和體細(xì)胞存活情況?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶具有將3-(4, 5)-2-噻唑-(2-5)- 二苯基溴化四氮唑蘭(MTT)中的四氮唑環(huán)還原成一種藍(lán)紫色的化合物一甲噴的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。損傷結(jié)束后，向接種細(xì)胞的96孔板(8X12)中加入MTT (0.5 g/L)，37 1常溫條件下孵育4 h，孵育結(jié)束后將上清除去，每孔加入150耵二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMS0),震蕩20 min使深藍(lán)色甲噴充分溶解,然后再全自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀出570 nm的光密度值。細(xì)胞存活率(cell survival rate)=(樣品組A490/正常組A490) X 100%，計(jì)算出抑制率=(1-細(xì)胞存活率)X 100%。實(shí)施例5流式細(xì)胞儀檢測(cè)雪上一枝蒿生物堿對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞消化后接種于10 mL培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底約80% 90%后，分別加入終濃度為100Pg/ml的雪上一枝蒿生物堿。孵育24 h后，消化收集細(xì)胞懸液，D-hank’ s緩沖液洗兩遍，分別用Annexin V-FITC和碘化丙錠(PI)孵育。混勻后室溫避光15min,加入500 ii L Buffer液重懸，于流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果顯示制備的雪上一枝蒿生物堿對(duì)Hela細(xì)胞中壞死細(xì)胞，早期凋亡細(xì)胞，晚期凋亡細(xì)胞都有不同程度的增加，如圖8所示；制備的雪上一枝蒿生物堿對(duì)肝癌細(xì)胞(HepG2)中壞死細(xì)胞，早期凋亡細(xì)胞，晚期凋亡細(xì)胞都有不同程度的增加，說(shuō)明制備的雪上一枝蒿生物堿能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞(H印G2)產(chǎn)生凋亡，如圖9所示。實(shí)施例6 Hoechest33258熒光檢測(cè)雪上一枝蒿生物堿對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 Hochest33258染料可以直接和細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下發(fā)出藍(lán)色熒光。凋
亡細(xì)胞由于染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。選取生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞，胰酶消化后以IX 104/ml轉(zhuǎn)移到96孔板中，12h培養(yǎng)后加藥處理(制備的雪上一枝蒿生物堿，濃度均為IOOii g/ml )，培養(yǎng)24h后，去上清液，D-hank’ s緩沖液清洗細(xì)胞2遍，加入H0echeSt33258染劑(終濃度lPg/ml)避光染色15min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。在熒光顯微鏡觀察下可知，在加入制備的雪上一枝蒿生物堿作用之后，肝癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了較大變化，細(xì)胞核變小，染色質(zhì)固縮，熒光染色增強(qiáng)，有凋亡小體生成，可見(jiàn)不規(guī)則顆粒熒光。而對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞壁完整，細(xì)胞藍(lán)染，少見(jiàn)凋亡的細(xì)胞，結(jié)果如圖10所示。 以上抗腫瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明本發(fā)明制備的雪上一支蒿生物堿具有高抗腫瘤活性，有望開(kāi)發(fā)成為新的抗腫瘤藥物。
權(quán)利要求
1.雪上一枝蒿生物堿的制備方法，包括如下步驟(1)取雪上一枝蒿，粉碎，用I 10倍量(g/v)50% 95%乙醇溶液浸泡提取3 6次每次12 24 h，然后用I 10倍量(g/v)蒸餾水浸泡提取2-4次，合并提取液，減壓回收至無(wú)醇味，得褐色浸膏；(2)用O.5 3倍量去離子水懸浮浸膏，以I 5倍量(ν/ν)的有機(jī)溶劑萃取，所述的有機(jī)溶劑為正己烷、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇，得到萃取物，回收溶劑并干燥，得浸膏；(3)將正己烷乙酸乙酯甲醇水按體積比5 9:2 5:3 7:3 7比例混合，于分液漏斗中靜置過(guò)夜，次日體系分層平衡后分離出上下相，并超聲脫氣備用；(4)稱取步驟(2)制備的浸膏，溶于步驟(3)的上相或下相或混合上下相溶劑中，振蕩使之完全溶解；(5)將步驟(3)獲得的上相以10 40ml/min的流速泵入高速逆流色譜儀的螺旋管， 開(kāi)啟循環(huán)水浴并設(shè)定恒溫器溫度為20 40°C，然后以O(shè). 8 5. Oml/min的流速泵入步驟(3)獲得的下相，同時(shí)開(kāi)啟檢測(cè)器設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)200 365nm，并按700 1000r/min的轉(zhuǎn)速啟動(dòng)主機(jī)，待流動(dòng)相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后，將步驟(4)獲得的樣品溶液由進(jìn)樣圈注入，管柱出口處的流出成分經(jīng)過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)并由色譜工作站和記錄儀記錄，按5 12ml每管設(shè)定收集體積或根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分，待進(jìn)樣3h后，停止主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，將固定相推出，固定相保留比為40 75%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雪上一枝蒿生物堿在制備預(yù)防或治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的癌癥為肝癌、子宮頸癌或骨髓瘤。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及雪上一枝蒿生物堿成分的制備方法及其在制備預(yù)防或治療腫瘤疾病的藥物中的用途。本發(fā)明利用系統(tǒng)溶劑法和高速逆流色譜(HSCCC)方法，可程序化、批量的從雪上一枝蒿塊根提取分離生物堿成分，方法簡(jiǎn)便、快捷，以薄層色譜法(TLC)對(duì)各個(gè)生物堿成分群進(jìn)行鑒定。本發(fā)明所制備的生物堿有效成分采用MTT法、熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)，篩選其對(duì)肝癌HepG2、子宮頸癌Hela-60及小鼠骨髓瘤SP20細(xì)胞的抑制作用，是優(yōu)良的抗腫瘤藥物的候選品種。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103006813SQ20121013684
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者李竣, 黃先菊, 袁琳, 孫東坡 申請(qǐng)人:中南民族大學(xué)