專利名稱：五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法。
背景技術(shù)：
始載于《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣》的五味消毒飲，是治療瘡瘍腫毒的著名方劑。由金銀花、紫花地丁、紫背天葵、蒲公英、野菊花五味中藥組成，具有清熱解毒，消散療瘡等功效。大量臨床研究已證實(shí)該方具有廣譜抗菌、抗病毒及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，以此方為基礎(chǔ)的加減方，己被廣泛應(yīng)用于皮膚科、外科、婦科等火毒濕熱所致的多種感染性疾病的治療，臨床效果確切。 然而，目前尚未見國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)此方對(duì)而對(duì)非細(xì)菌性炎癥的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，研究五味消毒飲加味提取物對(duì)非細(xì)菌性炎癥作用效果。本發(fā)明的五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，具體步驟如下
步驟I)準(zhǔn)備材料
金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花、葛根、丹參；清潔級(jí)KM種小鼠；角叉菜膠、阿司匹林泡騰片、腫瘤壞死因子-α、白介素-6和ELISA試劑盒；
步驟2)五味消毒飲加味提取物的安全限度試驗(yàn)
以由金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花組成的五味消毒飲為基礎(chǔ)，加葛根與丹參兩種中藥，采用水提醇沉的方法，提取分離出五味消毒飲加味提取物，對(duì)五味消毒飲加味提取物的浸膏進(jìn)行安全限度試驗(yàn)取若干偶數(shù)只清潔級(jí)KM種小鼠，雌雄各半，分為相同只數(shù)2組，陰性對(duì)照組I組，待試藥物I組，禁食8小時(shí)后，以動(dòng)物能耐受的最大濃度，最大體積的藥量，24h內(nèi)，分2次灌胃給藥，每次O. 4 ml/10g體重(折合生藥量為450 (生藥)/kg)，陰性對(duì)照用等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)觀察7天，每天固定時(shí)刻觀察動(dòng)物的死亡情況；步驟3)小鼠分組及給藥
取若干偶數(shù)只清潔級(jí)KM種小鼠，雌雄各半，分為相同只數(shù)的6組，即生理鹽水組、模型對(duì)照組、阿司匹林陽性對(duì)照組(5g/kg)，五味消毒飲加味提取物小劑量組(IOg (生藥)/kg)、中劑量組(20g(生藥)/kg)、大劑量(40g(生藥)/kg)3個(gè)給藥組；每日固定時(shí)間按O. 2ml/10g體積灌胃給藥，每天I次，連續(xù)7天；末次給藥前標(biāo)記并測(cè)定右后足周長(zhǎng)，取兩次測(cè)量的平均值為準(zhǔn)；末次給藥30分鐘后，于小鼠右后足踝部注射20 μ L/只O. 5%的角叉菜膠致炎，于致炎后30min，90min, 120min, 180min分別測(cè)定足周長(zhǎng)，生理鹽水組同法注射生理鹽水(20 μ L/只)，測(cè)定結(jié)束后，眼眶取血，滴少量制作血涂片，其余全血于4°C 5000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離血清，-20°C保存以備測(cè)定；
步驟4)腫瘤壞死因子-α和白介素-6水平測(cè)定
取血清樣品，按照腫瘤壞死因子-α和白介素-6試劑盒說明書，用ELISA法測(cè)定小鼠血清中腫瘤壞死因子- α和白介素-6的水平；
步驟5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(i
土s)表示，用SPSS 10. O軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用F檢驗(yàn)，P < O. 05表明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 有益效果本發(fā)明的五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，得出五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠血清腫瘤壞死因子-α和白介素-6的水平均有抑制作用，說明其可能是通過抑制炎癥細(xì)胞因子的分泌來達(dá)到抗炎癥的效果，為其應(yīng)用于非細(xì)菌性炎癥疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以五味消毒飲基礎(chǔ)，并加味葛根與丹參兩種中藥，采用水提醇沉的方法，提取分離五味消毒飲加味粗提取物，采取經(jīng)典的角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠足腫脹模型模型，觀察本提取物抗炎癥作用效果，并測(cè)定其對(duì)小鼠血清中腫瘤壞死因子-α和白介素-6的影響，為其應(yīng)用于非細(xì)菌性炎癥疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)施例I
本發(fā)明的五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，具體研究實(shí)驗(yàn)步驟如下
步驟I)準(zhǔn)備材料
材料金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花、葛根、丹參均為市售藥材，經(jīng)蘇州雷允上制藥有限公司執(zhí)業(yè)中藥師陳絢鑒定證實(shí)。清潔級(jí)KM種小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK (滬)2007-0005,雌雄各半，體重 20_25g;
五味消毒飲加味提取物(實(shí)驗(yàn)室自制)；
角叉菜膠(Sigma公司，批號(hào)09JK1394)；
阿司匹林泡騰片(德國(guó)拜耳公司，規(guī)格和批號(hào)H32026201)；
小鼠腫瘤壞死因子-α (TNF-α )和白介素-6 (IL-6);
ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。步驟2)五味消毒飲加味提取物的安全限度試驗(yàn)
以由金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花組成的五味消毒飲為基礎(chǔ)，加葛根與丹參兩種中藥，采用水提醇沉的方法，提取分離出五味消毒飲加味提取物，對(duì)五味消毒飲加味提取物的浸膏進(jìn)行安全限度試驗(yàn)取清潔級(jí)KM種小鼠共40只，雌雄各半，體重20g 25g，分為2組，每組20只，陰性對(duì)照組I組，待試藥物I組，禁食8小時(shí)后，以動(dòng)物能耐受的最大濃度，最大體積的藥量，24h內(nèi)，分2次灌胃給藥，每次O. 4 ml/10g體重(折合生藥量為450 (生藥)/kg，)，陰性對(duì)照用等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)觀察7天，每天固定時(shí)刻觀察動(dòng)物的死亡情況。
步驟3)小鼠分組及給藥
取KM種小鼠60只，雌雄各半，分為6組，即生理鹽水組(NS組)、模型對(duì)照組、阿司匹林陽性對(duì)照組(5g/kg)，五味消毒飲加味提取物小劑量組(IOg (生藥)/kg)、中劑量組(20g (生藥)/kg)和大劑量(40g (生藥)/kg)等3個(gè)給藥組,每組10只。每日固定時(shí)間按O. 2ml/10g體積灌胃給藥，每天I次，連續(xù)7天。末次給藥前標(biāo)記并測(cè)定右后足周長(zhǎng)，取兩次測(cè)量的平均值為準(zhǔn)。末次給藥30分鐘后，于小鼠右后足踝部注射20 μ L/只O. 5%的角叉菜膠致炎，于致炎后30min，90min, 120min, 180min分別測(cè)定足周長(zhǎng)。生理鹽水組同法注射生理鹽水(20yL/只)。測(cè)定結(jié)束后，眼眶取血，滴少量制作血涂片，其余全血于4°C 5000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離血清，-20°C保存以備測(cè)定。步驟4) TNF-α和IL-6的水平測(cè)定
取血清樣品，按照TNF- α和IL-6試劑盒說明書，用ELISA法測(cè)定小鼠血清中TNF- a和IL-6的水平?！げ襟E5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)表示，用SPSS 10. O軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用F檢驗(yàn)，P < O. 05表明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果
I.五味消毒飲加味提取物的安全限度試驗(yàn)
由于受試藥物的濃度或體積限制，一次給藥無法測(cè)出LD5tl,因此，進(jìn)行了最大耐受量的測(cè)定，以提取物浸膏，按小鼠最大體積的藥量灌胃給藥，結(jié)果顯示，給藥劑量為450g (生藥)/kg時(shí)，小鼠無死亡發(fā)生。已知五味消毒飲臨床常用劑量為疒3g (生藥)/kg，小鼠的最大耐受倍數(shù)相當(dāng)于人體的15(Γ225倍，說明本提取物的毒性比較低。2.五味消毒飲加味提取物的對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響
由表I可知，角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠足腫脹在120min之內(nèi)，足周長(zhǎng)隨著時(shí)間變化而逐漸上升，2h后，開始下降；五味消毒飲加味提取物各劑量組可以抑制小鼠腫脹發(fā)生，且呈一定劑量依賴性關(guān)系。大劑量組(40g(生藥)/kg)的抑制作用尤其明顯(/X0. 01或O. 05 Ks NS對(duì)照組)，中劑量組次之。阿司匹林陽性對(duì)照組抗足腫脹效果也較為明顯0°〈0. 01或O. 05 μN(yùn)S對(duì)照組)。
表I.五味消毒飲加味提取物對(duì)角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響(η=10， 土S)
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注與NS對(duì)照組對(duì)照組比較，##Ρ<0· 01, #/Κ0· 05。3.五味消毒飲加味提取物對(duì)TNF-α的影響
TNF-α是機(jī)體重要的炎癥指標(biāo)之一，是免疫宿主反應(yīng)的快速反應(yīng)因子。小鼠注射了角叉菜膠后，模型組小鼠血清中TNF-α水平明顯升高(/X0. 01 Ks模型組)，說明小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了嚴(yán)重的炎癥應(yīng)激反應(yīng)。五味消毒飲加味提取物大劑量組明顯抑制小鼠血清TNF-α水平(/XO. Ol Ks模型組)，提示其有較強(qiáng)的抗炎作用。阿斯匹林也可抑制TNF-α分泌(/X0. 01KS模型組)，但其作用強(qiáng)度沒有提取物大劑量用藥組強(qiáng)。表2.五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠血清TNF-α的影響(n=10，； 土s)
權(quán)利要求
1.五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，其特征在于，具體步驟為 步驟I)準(zhǔn)備材料 金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花、葛根、丹參；清潔級(jí)KM種小鼠；角叉菜膠、阿司匹林泡騰片、腫瘤壞死因子-α、白介素-6和ELISA試劑盒； 步驟2)五味消毒飲加味提取物的安全限度試驗(yàn) 以由金銀花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花組成的五味消毒飲為基礎(chǔ)，加葛根與丹參兩種中藥，采用水提醇沉的方法，提取分離出五味消毒飲加味提取物，對(duì)五味消毒飲加味提取物的浸膏進(jìn)行安全限度試驗(yàn)取若干偶數(shù)只清潔級(jí)KM種小鼠，雌雄各半，分為相同只數(shù)2組，陰性對(duì)照組I組，待試藥物I組，禁食8小時(shí)后，以動(dòng)物能耐受的最大濃度，最大體積的藥量，24h內(nèi)，分2次灌胃給藥，每次O. 4 ml/10g體重(折合生藥量為450 (生藥)/kg)，陰性對(duì)照用等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)觀察7天，每天固定時(shí)刻觀察動(dòng)物的死亡情況； 步驟3)小鼠分組及給藥 取若干偶數(shù)只清潔級(jí)KM種小鼠，雌雄各半，分為相同只數(shù)的6組，即生理鹽水組、模型對(duì)照組、阿司匹林陽性對(duì)照組(5g/kg)，五味消毒飲加味提取物小劑量組(IOg (生藥)/kg)、中劑量組(20g(生藥)/kg)、大劑量(40g(生藥)/kg)3個(gè)給藥組；每日固定時(shí)間按O. 2ml/10g體積灌胃給藥，每天I次，連續(xù)7天；末次給藥前標(biāo)記并測(cè)定右后足周長(zhǎng)，取兩次測(cè)量的平均值為準(zhǔn)；末次給藥30分鐘后，于小鼠右后足踝部注射20 μ L/只O. 5%的角叉菜膠致炎，于致炎后30min，90min, 120min, 180min分別測(cè)定足周長(zhǎng)，生理鹽水組同法注射生理鹽水(20 μ L/只)，測(cè)定結(jié)束后，眼眶取血，滴少量制作血涂片，其余全血于4°C 5000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離血清，-20°C保存以備測(cè)定； 步驟4)腫瘤壞死因子-α和白介素-6水平測(cè)定 取血清樣品，按照腫瘤壞死因子-α和白介素-6試劑盒說明書，用ELISA法測(cè)定小鼠血清中腫瘤壞死因子-α和白介素-6的水平； 步驟5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差( 土s)表示，用SPSS 10. O軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用F檢驗(yàn)，P < O. 05表明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，其特 征在于，所述步驟I)中清潔級(jí)KM種小鼠的體重在20-25g之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，其特征在于，所述步驟2)中，所取的清潔級(jí)KM種小鼠為40只。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，其特征在于，所述步驟3)中，所取的清潔級(jí)KM種小鼠為60只。
全文摘要
本發(fā)明公開了五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，以五味消毒飲基礎(chǔ)，并加味葛根與丹參兩種中藥,采用水提醇沉的方法，提取分離五味消毒飲加味粗提取物，采取經(jīng)典的角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠足腫脹模型模型，觀察本提取物抗炎癥作用效果，并測(cè)定其對(duì)小鼠血清腫瘤壞死因子-α和白介素-6的影響。本發(fā)明的五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠角叉菜膠炎癥的研究方法，得出五味消毒飲加味提取物對(duì)小鼠血清中腫瘤壞死因子-α和白介素-6的水平均有抑制作用，說明其可能是通過抑制炎癥細(xì)胞因子的分泌來達(dá)到抗炎癥的效果，為其應(yīng)用于非細(xì)菌性炎癥疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
文檔編號(hào)A61K49/00GK102836292SQ20111016439
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月20日
發(fā)明者向敏 申請(qǐng)人:蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院