專利名稱：一種f基因型腮腺炎減毒活疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腮腺炎減毒活疫苗，更具體地說，本發(fā)明涉及將分離得到的F基因 型腮腺炎減毒毒種，接種于人二倍體細(xì)胞(KMB17株)并進(jìn)行后續(xù)工藝處理及凍干技 術(shù)，制備的腮腺炎減毒活疫苗。
背景技術(shù)：
腮腺炎病毒(mumps virus，MuV)是引起流行性腮腺炎的病原體。依據(jù)其SH 抗原上核苷酸的差異，腮腺炎病毒可分為A-L共12個基因型。隨著近年來國內(nèi)在腮腺 炎流行毒株方面的分子流行病學(xué)分析的深入，日益增加的資料均表明，目前在我國流行 的腮腺炎病毒株主要為F基因型；與此同時，我們主要使用的減毒活疫苗為國際通用的 Jeryl-Lyim株培育得到的S79株，其基因為國外流行的A基因型。越來越多的研究者發(fā) 現(xiàn)MuV的特異性免疫在不同基因型之間是存在差別的，即使用同一疫苗對不同基因型病 毒的感染會產(chǎn)生不同的保護(hù)效果。這可能也是盡管已在大范圍人群內(nèi)使用了疫苗，流行 性腮腺炎近年來仍呈現(xiàn)一種高發(fā)態(tài)勢的可能原因。2005年至今，腮腺炎的病例數(shù)均高居 全國丙類傳染病報告數(shù)的第二位。針對以上流行病學(xué)的實際情況，研究開發(fā)具有主要流 行傾向并具有較好免疫原性的F基因型腮腺炎減毒活疫苗，具有重要的現(xiàn)實意義。
其次，目前常規(guī)使用的S79株及Jeryl-Lyrai株減毒活疫苗均為雞胚細(xì)胞上制備， 而雞胚細(xì)胞作為一種異源性細(xì)胞基質(zhì)，可能帶來諸如過敏反應(yīng)以及攜帶傳染性禽逆轉(zhuǎn)錄 病毒等程度輕重不等的副反應(yīng)。而人源性細(xì)胞基質(zhì)(人二倍體細(xì)胞)具有能夠充分鑒定 和標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點，可實現(xiàn)細(xì)胞種子庫系統(tǒng)，建立的細(xì)胞庫可多年用于生產(chǎn)，有利于質(zhì)量 控制；并且二倍體細(xì)胞理論上不存在致腫瘤的潛在危險性。因而，無論從理論上還是應(yīng) 用上看，使用人二倍體細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)制備的腮腺炎減毒活疫苗，可以避免采用雞胚 細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)可能帶來的危害，將具有更實際的應(yīng)用價值。
之前本申請人曾進(jìn)行過關(guān)于《F基因型腮腺炎減毒毒種及其用途》的專利申 請，在該申請中，主要涉及到的是減毒毒種的研究，包括了毒種的制備、毒種減毒性狀 的觀察、毒種免疫原性的分析、安全性的分析及種子庫的建立；而未將該毒種進(jìn)一步研 發(fā)成為F基因型的腮腺炎減毒活疫苗，而只有將減毒毒種進(jìn)一步制備為減毒活疫苗，才 能起到真正的預(yù)防控制流行性腮腺炎疾病的作用，而發(fā)揮其實際的意義。由此，本發(fā)明 與前申請《F基因型腮腺炎減毒毒種及其用途》的區(qū)別及不同點就在于將前申請中所涉 及的F基因型腮腺炎減毒毒種經(jīng)后處理加工及凍干工藝后研制成為F基因型腮腺炎減毒活 疫苗，從而可用于流行性腮腺炎疾病的預(yù)防或治療。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種采用人二倍體細(xì)胞作為細(xì) 胞基質(zhì)的流行基因型(F基因型)腮腺炎減毒活疫苗。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。
A.本發(fā)明提供了一種腮腺炎減毒活疫苗的毒種，保藏編號為CGMCC No .3579。 其包括原始種子、主種子和工作種子三個庫；具有序列表所示的結(jié)構(gòu)和特征。
B.本發(fā)明提供了一種人用腮腺炎減毒活疫苗。
C.本發(fā)明提供了所述減毒活疫苗的制備方法，該方法采用下列步驟
1.根據(jù)KMB-17細(xì)胞生產(chǎn)檢定規(guī)程，挑選生長致密的第細(xì)胞，棄 去培養(yǎng)液；
2.按接種量0.1-0.25moi將病毒種子稀釋于不含血清的細(xì)胞維持液中，不經(jīng)吸附 直接接種于前述單層細(xì)胞。置37°C培養(yǎng)7 9天，
待細(xì)胞完全病變后，收集收獲液；
3.將病毒收獲液以5000rpm 30min離心去除細(xì)胞碎片；
4.加入等量的凍干保護(hù)劑至上述離心后的病毒原液中，凍干保護(hù)劑配方為 (2X)蔗糖8%、海藻糖8%、甘氨酸2%、右旋糖酐2%、人白蛋白1%、精氨酸 0.2%,谷氨酸鈉1%。
5.分裝并進(jìn)行凍干，凍干后即為所需的腮腺炎減毒活疫苗。
D.本發(fā)明減毒活疫苗在預(yù)防腮腺炎疾病中的應(yīng)用
將本發(fā)明的腮腺炎減毒活疫苗免疫恒河猴后，SP-A株減毒活疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生良 好的體液免疫效應(yīng)，其免疫后不同時間點的中和效價均明顯優(yōu)于S79株減毒活疫苗。并 且，SP-A株腮腺炎減毒活疫苗與S79株腮腺炎減毒活疫苗在實驗動物體內(nèi)所誘導(dǎo)的免疫 反應(yīng)均具有免疫保護(hù)效果，并具有在野毒株的攻擊下能夠保護(hù)所有被免疫個體的能力。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
1.提供了一種使用KMB-17人二倍體細(xì)胞基質(zhì)制備的F基因型腮腺炎減毒活疫 苗的生產(chǎn)制備方法，該疫苗制品具有良好的免疫原性和安全性。
2.提供了一種不含明膠的凍干保護(hù)劑，以保證腮腺炎減毒活疫苗具有外觀好、 水分低以及良好穩(wěn)定性的特點，取得了實質(zhì)性的進(jìn)展和重要突破。
保藏生物材料的說明
本發(fā)明所涉及的毒種，已2010年01月12日在位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，分類命名 為腮腺炎病毒，保藏編號為CGMCC Na .3579。


圖-1 SP-A株減毒活疫苗與S79株減毒活疫苗免疫后的中和抗體效價比較 圖；具體實施方式
通過借助以下實施例將更加詳細(xì)地說明本發(fā)明。需要指出的是，以下實施例僅 僅是說明性的，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受這些實施例的限制。
實施例1
——病毒原液的培養(yǎng)及收獲
用腮腺炎疫苗毒種第M代工作種子按0.1-0.25moi稀釋于不含血清的細(xì)胞維持液 中，不經(jīng)吸附直接接種于單層KMB17細(xì)胞。置37°C培養(yǎng)7 9天，待細(xì)胞完全病變后，收集收獲液。將所收獲病毒原液進(jìn)行5000rpm 30min離心去除細(xì)胞碎片。
實施例2
——腿腺炎減毒活疫苗半成品的制備
使用MEM營養(yǎng)液稀釋病毒原液至5.0 lgCCID50/ml，加入等量凍干保護(hù)劑，即 為半成品。凍干保護(hù)劑配方為OX)蔗糖8%、海藻糖8%、甘氨酸2%、右旋糖酐 2%>人白蛋白1%、精氨酸0.2%、谷氨酸鈉
實施例3
——腿腺炎減毒活疫苗病毒原液、半成品的檢測
(1)、病毒原液均為無異物、無沉淀的澄清液體，無菌檢測、支原體檢測均應(yīng)為 陰性，無異常毒素，且病毒滴度需大于5.0 lgCCID50/ml (見表-1)。
表-1 病毒原液的檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種F基因型腮腺炎減毒活疫苗，其特征在于該減毒活疫苗的毒種，保藏編號 為CGMCC N2 .3579 ；其包括原始種子、主種子和工作種子三個庫，具有序列表所示的結(jié) 構(gòu)和特征。
2.權(quán)利要求1所述減毒活疫苗的制備方法，其特征在于該方法采用以下步驟(1)根據(jù)KMB-17細(xì)胞生產(chǎn)檢定規(guī)程，挑選生長致密的第28代KMB-17細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液；(2)按接種量0.1-0.25moi將病毒種子稀釋于不含血清的細(xì)胞維持液中，不經(jīng)吸附直 接接種于前述單層細(xì)胞。置37°C培養(yǎng)7 9天，待細(xì)胞完全病變后，收集收獲液；(3)將病毒收獲液以5000rpm30min離心去除細(xì)胞碎片；(4)加入等量的凍干保護(hù)劑至上述離心后的病毒原液中，凍干保護(hù)劑配方為(2X) 蔗糖8%、海藻糖8%、甘氨酸2%、右旋糖酐2%、人白蛋白1%、精氨酸0.2%、谷氨酸 鈉1%。(5)分裝并進(jìn)行凍干，凍干后即為所需的腮腺炎減毒活疫苗。
3.權(quán)利要求1所述減毒活疫苗在制備預(yù)防或治療腮腺炎疾病的藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種F基因型腮腺炎減毒活疫苗及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明涉及將分離得到的F基因型腮腺炎減毒毒種，接種于人二倍體細(xì)胞(KMB17株)并進(jìn)行后續(xù)工藝處理及凍干技術(shù)，制備的腮腺炎減毒活疫苗。該疫苗制品具有良好的免疫原性和安全性。本發(fā)明提供了一種不含明膠的凍干保護(hù)劑，以保證腮腺炎減毒活疫苗具有外觀好、水分低以及良好穩(wěn)定性的特點。
文檔編號A61P31/14GK102018956SQ20101054490
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月16日
發(fā)明者劉龍丁, 史長軍, 崔平芳, 李琦涵, 梁燕, 王麗春, 董承紅, 謝忠平, 馬紹輝 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所