專利名稱：薄葉山橙素甲,其藥物組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物技術領域，具體地，涉及新穎骨架的單萜吲哚生物堿類 化合物薄葉山橙素甲(melotenineA)及其有機和無機酸鹽，以其為藥物有效成分的藥物組 合物，其制備方法以及它們在制備治療或預防癌癥藥物中的應用。
背景技術：
腫瘤是世界難題。在中國每年新增160萬腫瘤病患者，每年有130萬腫 瘤病患者死亡。目前臨床上使用的化療藥物雖然有一定療效，但因其毒性大而給病人帶來 巨大的肉體痛苦和精神壓力，新的療效確切且毒副作用相對較小的抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)迫在 眉睫。薄葉山橙素甲(melotenine A)是源于天然植物中的新化合物。此前沒有關于此化 合物的結構以及藥用活性報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供單萜吲哚生物堿類化合物薄葉山橙素甲 (melotenine A)及其類似物，以及利用有機酸(酒石酸，檸檬酸，甲酸，乙二酸等)或無機酸 (鹽酸，硫酸，磷酸等)制成的鹽；其制備方法；其作為有效成分與可藥用載體或賦形劑組成 的藥物組合物；以及化合物薄葉山橙素甲(melotenine A)類似物及其藥用鹽在制備預防 或治療肝癌、白血病、胰腺癌、乳腺癌及肺癌的藥物中的用途。
本發(fā)明的上述目的是通過如下的技術方案得以實現(xiàn)的 式(I)所示的單鵬噴哚類化合物薄葉山橙素甲(melotenine A)類似物或其藥用<formula>formula see original document page 4</formula> 其中 R1選自C卜1Q烷基、C2—1Q烯基或C2—1Q炔基，優(yōu)選的R1為C卜6烷基，更優(yōu)選的R1為甲 基； R2選自氫或C00R3，其中R3選自C卜1Q烷基、C2—1Q烯基或C2—1Q炔基，優(yōu)選的R2為 C00CH3; Y代表任選被1-5個R4取代的C2—1Q亞烷基、(V1Q次烷基、(V1Q亞烯基丄2—1Q次烯基、 C2—1Q亞炔基或C2—1Q次炔基；優(yōu)選的Y代表任選被C卜6烷基取代的C2—6亞烷基、C2—6次烷基、 C2—6亞烯基或C2—6次烯基，更優(yōu)選的Y代表任選被C卜6烷基取代的C2—4亞烷基、C2—4次烷基、 C2—4亞烯基或C2—4次烯基，最優(yōu)選的Y代表
<formula>formula see original document page 4</formula>


R4選自氫、C卜1Q烷基、C2—1Q烯基或C2—1Q炔基。 最優(yōu)選的式(I)單萜吲哚類化合物是薄葉山橙素甲
16
COOCH3 所述的藥用鹽是指藥學上可接受的鹽，包括但不限于與有機酸，或無機酸形成的 鹽。所述的有機酸包括但不限于酒石酸或檸檬酸或甲酸或乙二酸，無機酸包括但不限于鹽 本發(fā)明的另一方面提供如式(I)所示的單萜吲哚類化合物的制備方法，包括以下 步驟 (1)式(II)化合物與PhSeCH2CHO反應得到式(III)化合物
SePh
SePh

p i—— 一y v 、N-
Ri R2 Ri r2 」 — R2
II III
其中R、R2的含義與權利要求1相同；
(2)式(III)化合物與式(IV)化合物反應得到式(V)化合物
SePh
+
,入
Br
IV

III
其中L為離去基團，Y與權利要求1的含義相同； (3)式(V)化合物環(huán)合得到式(I)化合物
SePh
SePh
'1ST
V
在此方法中，式(IV)化合物的結構優(yōu)選為
5
<formula>formula see original document page 6</formula>
、R4或L 其中X代表任選被1-5個R4取代的C卜4亞烷基、C2—4亞烯基或C2—4亞炔基，L為離 去基團，R4與權利要求1的含義相同； 在優(yōu)選的方法中，式(III)化合物與式(IV-1)或式(IV-2)反應得到式(V-l)或
式(V-2)，再環(huán)合得到式(1-1)或式(1-2)化合物
R1 R2 R1 R:
V隱2 |誦2 本發(fā)明的最優(yōu)選化合物薄葉山橙素甲(melotenine A)還可按如下步驟制備取 植物薄葉山橙，用水或有機溶劑提取，所得提取物通過酸堿處理除去非生物堿類物質，利用 硅膠柱層析分離得到式(I)所示的單萜吲哚生物堿薄葉山橙素甲(melotenine A)。所述 的提取是在回流的溫度下進行的，所述的有機溶劑選自醇類溶劑、酮類溶劑、酯類溶劑或醚 類溶劑，其中所述的醇類溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、正戊醇，所述的酮類 溶劑選自丙酮、丁酮、甲基異丁基酮，所述的酯類溶劑選自乙酸乙酯。所述的酸堿處理可以 是向提取物中加入酸例如鹽酸或硫酸調節(jié)pH值至1.0-3.0，用有機溶劑例如乙酸乙酯萃 取1-4次，水層用堿例如氨水或氫氧化鈉或碳酸鈉等調節(jié)pH值至8. 0-10. O，再用乙酸乙酯 萃取1-4次，合并濃縮乙酸乙酯萃取物。 具體的方法為取植物薄葉山橙全株，經(jīng)干燥、粉碎后，用醇提取l-4次，每次l-4 小時，得醇浸膏，然后通過酸堿處理，除去非生物堿類物質，在堿性條件下用有機溶劑萃取， 濃縮有機溶劑提取層，浸膏利用硅膠柱層析，用石油醚/丙酮做為洗脫系統(tǒng)分離得到式(I) 所示的化合物薄葉山橙素甲(melotenine A)。 更具體的方法為取風干后的薄葉山橙植物全株，用90%乙醇7(TC加熱，回流提 取3次，回收溶劑，濃縮到小體積，加入5% HC1調節(jié)pH值至2，用乙酸乙酯萃取3次，水層 用10X氨水調節(jié)pH值至9，再用乙酸乙酯萃取3次，濃縮乙酸乙酯層，乙酸乙酯部分用硅膠 拌樣后，進行200-300目硅膠柱層析，劃分為7段Frs 1_7，用石油醚/丙酮梯度洗脫分段，
分配比例為氯仿/甲醇i : o，i5 : i，io : i，6 : i，3 : i，i : i，o : 1，F(xiàn)ri用石油醚/
丙酮=12/1為洗脫劑，硅膠100g柱層析分離得薄葉山橙素甲(melotenineA)。
本發(fā)明的薄葉山橙提取物含有式(I)所示的薄葉山橙素甲(melotenine A)或其 藥用鹽10-95% (重量)可按如下步驟制備取植物薄葉山橙，用有機溶劑提取，所得提取 物通過酸堿處理除去非生物堿類物質，利用硅膠柱層析進一步分離純化。所述的提取是在 回流的溫度下進行的，有機溶劑選自醇類溶劑、酮類溶劑、酯類溶劑或醚類溶劑，其中醇類 溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、正戊醇，酮類溶劑選自丙酮、丁酮、甲基異丁 基酮，酯類溶劑選自乙酸乙酯。酸堿處理是指向提取物中加入酸例如鹽酸或硫酸調節(jié)PH 值至1. 0-3. O，用有機溶劑例如乙酸乙酯萃取1-4次，水層用堿例如氨水或氫氧化鈉或碳酸 鈉等調節(jié)PH值至8. 0-10. 0，再用乙酸乙酯萃取1-4次，合并濃縮乙酸乙酯萃取物。
藥物組合物，其中含有權利要求l的式(I)化合物或其藥用鹽作為有效成分，并含 有常規(guī)藥用載體。 式(I)化合物或其藥用鹽在治療或預防癌癥藥物中的應用。 式(I)化合物或其藥用鹽在制備治療肝癌、白血病、胰腺癌、乳腺癌及肺癌的藥物 中的應用。 本發(fā)明的化合物薄葉山橙素甲(melotenine A)類似物或其鹽可經(jīng)口或不經(jīng)過口
給藥，給藥量因藥物不同而各有不同，對成人來說，每天l-1000mg比較合適。 本說明書中，術語"烷基"是指飽和的直鏈或支鏈的脂族烴基，優(yōu)選具有HO個碳
原子，更優(yōu)選具有l(wèi)-6個碳原子，更優(yōu)選具有l(wèi)-4個碳。代表性的例子包括甲基、乙基、丙基、
異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基等。 術語"烯基"是指具有至少一個碳碳雙鍵，直鏈或支鏈的脂族烴基，優(yōu)選具有2-10 個碳原子，更優(yōu)選具有2-6個碳原子，更優(yōu)選具有2-4個碳。代表性的例子包括乙烯基、丙 烯基、烯丙基、丁烯基、戊二烯基等。 術語"炔基"是指具有至少一個碳碳三鍵，直鏈或支鏈的脂族烴基，優(yōu)選具有2-10 個碳原子，更優(yōu)選具有2-6個碳原子，更優(yōu)選具有2-4個碳。代表性的例子包括乙炔基、丙 炔基、丁炔基等。 本說明書中，亞基是指相應的基團與其它結構通過兩個單鍵連接的方式相連，例 如亞乙基為_(^2(^2-，亞乙烯基為-CH = CH-;次基是指相應的基團與其它結構通過一個單 鍵和一個雙鍵連接的方式相連，例如次甲基為-CH =。 經(jīng)口服給藥時，首先使化合物與常規(guī)的藥用輔劑如賦形劑、崩解劑、黏合劑、潤滑 劑、抗氧化劑、包衣劑、著色劑、芳香劑、表面活性劑等混合，將其制成顆粒劑、膠囊、片劑等 形式給藥；非經(jīng)口給藥時可以注射液、輸液劑或栓劑等形式給藥。制備上述制劑時，可使用 常規(guī)的制劑技術。
具體實施例方式
下面的試驗實施例、實施例和制劑實施例可更詳細地說明本發(fā)明，但不以任何形
式限制本發(fā)明。
試驗實施例1 : 本發(fā)明化合物薄葉山橙素甲(melotenine A)具有明顯的抗腫瘤活性，實驗方法和 結果如下 —、材料與方法
1.樣品及制備 樣品呈無色，二甲基亞砜(DMS0)溶解配制為10mg/ml濃度的貯存液避光保存?zhèn)?用。
2.細胞株
SK-BR-3，人乳腺癌細胞株
S匪C7721，人肝癌細胞株
HL-60，人白血病細胞株
PANC-1 ，人胰腺癌細胞株
A549，人肺癌細胞株
3.實驗方法 (1)接種細胞用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液(DMEM或者RMPI1640)配成單個細胞 懸液，以每孔10000-20000個細胞接種到96孔板，每孔體積100ul，貼壁細胞提前12小時接 種培養(yǎng)。 (2)加入待測化合物溶液(化合物單體固定濃度40uM初篩，粗提物100ug/ml初 篩，在該濃度對腫瘤細胞生長抑制在50%附近的化合物設5個濃度進入梯度復篩)，每孔終 體積200ul，每種處理均設3個復孔。 (3)顯色37攝氏度培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT溶液20ul。繼續(xù)孵育4小時，終 止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液100ul以避免細胞丟失，每孔加20X的SDS100ul，過夜孵 育(溫度37°C )，使結晶物充分融解。 (4)比色選擇595nm波長，酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-Rad 680)讀取各孔光吸收值， 記錄結果，以濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制細胞生長曲線，應用兩點法(Reed and Muench法)計算化合物的IC50值。
(5)陽性對照順鉬
二、結果 表1.薄葉山橙素甲(melotenine A)對人腫瘤細胞株生長的半數(shù)抑制濃度(IC5。， iiM)
IC50 (〃M)
cellsmelotenine A化合物D化合物Gcisplatin
SK-BR-32.811.717.221.7
SMMC-77215.218.812.318.1
HL-600.95.41.72.6
PANC-13.630.516.824.8
A-54910.725.921.915.8 三、結論 在本實驗條件下，化合物薄葉山橙素甲(melotenine A)對以上包括人乳腺癌細 胞株(SK-BR-3)，人肝癌細胞株(S匪C7721)，人白血病細胞株(HL-60)，人胰腺癌細胞株 (PANC-1)，人肺癌細胞株(A549)生長的半數(shù)抑制濃度(IC50)在0. 9_10. 7 y M之間，化合物 D、G對以上腫瘤株的生長的半數(shù)抑制濃度(IC50)在1.7-25. 9 iiM之間，依據(jù)中國醫(yī)藥工業(yè)
8雜志1993,24 :455-457，周建軍等提出的評價抗腫瘤物質活性的改良MTT法得出結論上述 數(shù)據(jù)顯示了明顯的抑制癌癥的作用。
實施例1 : 風干后的14kg植物全株薄葉山橙(Melodi皿s henryi Craib)用90%乙醇加熱 (70°C )回流提取3次，回收溶劑，濃縮到小體積，加入5% HC1調節(jié)pH值至2，用乙酸乙酯 萃取3次，水層用10%氨水調節(jié)pH值至9，再用乙酸乙酯萃取3次，濃縮乙酸乙酯層后稱重 得17g。乙酸乙酯部分用適量硅膠拌樣后，進行硅膠柱層析(400g，200-300目，青島海洋化 工廠)劃分為7段(Frs l-6)，用石油醚/丙酮梯度洗脫分段(分配比例1 : 0，15 : 1，
io : 1，6 : 1，3 : i，i : i，o : i)。 Fri(i.8g)用石油醚/丙酮=12/1為洗脫劑，硅膠
100g柱層析分離得薄葉山橙素甲(melotenine A)。 薄葉山橙素甲(melotenine A)的化學結構式為
COOCH3 薄葉山橙素甲(melotenine A)
(II) 分子量334，分子式C21H22N202。旋光[a ]25D = -136. 5° (c 0. 20， CHC13)。無色 晶體。易溶于氯仿，丙酮，甲醇等有機溶劑。 薄葉山橙素甲(melotenine A)的結構是基于它的紫外光譜、紅外光譜、質譜和核 磁共振譜特別是二維核磁共振譜而確定。 紫外光譜數(shù)據(jù)UVA (max) (MeOH) :328 (3. 92) ， 298 (3. 82) ， 265 (4. 21) ， 221 (4. 64) nm 紅外光譜數(shù)據(jù):IR v(max) (KBr) :3440,2948， 1680， 1610， 1436， 1244
質譜數(shù)據(jù)HR-ESI-MS(m/z) :335. 1772 [M+H] +
力NMR禾P 13C NMR數(shù)據(jù)見表2。 以上數(shù)據(jù)結合2D NMR分析證實了薄葉山橙素甲(melotenine A)的化學結構為式 (II)所示。 表2.薄葉山橙素甲(melotenine A)的^ NMR禾口 13C NMR數(shù)據(jù)(CDC13)
實施例2 按實施例1的方法先制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，加入4%的硫酸乙醇溶 液々H二4，過濾，干燥，制成硫酸薄葉山橙素甲(melotenine A)。
實施例3: 按實施例1的方法制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，加入4%的鹽酸酸溶液， 一H二4，過濾，干燥，制成鹽酸薄葉山橙素甲(melotenineA)。
實施例4 : 按實施例1的方法制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，加入4%的磷酸酸溶液， P'H二4，過濾，干燥，制成磷酸薄葉山橙素甲(melotenineA)。
實施例5 : 按實施例1的方法制得薄葉山橙素甲(melotenine A))，加入4%的酒石酸溶液， P'H二4，過濾，干燥，制成薄葉山橙素甲(melotenineA)。
實施例6 : 按實施例1的方法制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，加入4%的檸檬酸溶液， PH二4，過濾，干燥，制成檸檬酸薄葉山橙素甲(melotenine A)。
實施例7 : 按實施例1的方法制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，加入4 %的甲酸溶液， pH二4，過濾，干燥，制成甲酸薄葉山橙素甲(melotenineA)。
實施例8: 按實施例1的方法制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，加入4 %的乙二酸溶液， —卩1=4，過濾，干燥，制成乙二酸薄葉山橙素甲(melotenine A)。
10
entry A _ S
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3. 74 (1H， s) 3. 79 (3H, s)
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29 5322204331LC 82376n
53 51111111192 111615
HHHH HH HHH
1739 88 807
30017 99 7000
7 7
1 ^I-
d，d，
11211C
2.5equivof Bu3SnH, A舊N, benzene, 85 C, 2 h

實施例10
薄葉山橙素甲類似物的制備
11 實施例9 薄葉山橙素甲類似物的制備
<formula>formula see original document page 11</formula>allyl bromide, THF, 3 days
3equivof Bu3SnH, A舊N, benzene, 85 C, 9 h 制劑實施例1 : 按實施例1-10的方法先制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，以及利用有機酸(酒石酸，檸檬酸，甲酸，乙二酸等)或無機酸(鹽酸，硫酸，磷酸等)制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。
制劑實施例2: 按實施例l二邊的方法先制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，以及利用有機酸(酒石酸，檸檬酸，甲酸，乙二酸等)或無機酸(鹽酸，硫酸，磷酸等)制成的鹽，將其溶于無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于2安瓿中，低溫冷凍干燥后
無菌熔封得粉針劑。
制劑實施例3: 將所分離得到薄葉山橙素甲(melotenine A)，以及利用有機酸(酒石酸，檸檬酸，甲酸，乙二酸等)或無機酸(鹽酸，硫酸，磷酸等)制成的鹽，與賦形劑重量比為9 : 1的比例加入賦形劑，制成粉劑。
制劑實施例4: 按實施例l二邊的方法先制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，以及利用有機酸(酒
12
NH
CH2(SePH)CHO, toluene, reflux, 9 h
COOCH3
一NH
rSePh
COOCH3
N—H石酸，檸檬酸，甲酸，乙二酸等)或無機酸(鹽酸，硫酸，磷酸等)制成的鹽，按其與賦形劑重
量比為i : 5-1 : io的比例加入賦形劑，制粒壓片。 制劑實施例5: 按實施例l二邊的方法先制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，以及利用有機酸(酒
石酸，檸檬酸，甲酸，乙二酸等)或無機酸(鹽酸，硫酸，磷酸等)制成的鹽，按常規(guī)口服液制
法制成口服液。 制劑實施例6: 按實施例1的方法先制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，以及利用有機酸(酒石酸，檸檬酸，甲酸，乙二酸等)或無機酸(鹽酸，硫酸，磷酸等)制成的鹽，按其與賦形劑重量比為5 : 1的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑或沖劑。
制劑實施例7: 按實施例l二邊的方法先制得薄葉山橙素甲(melotenine A)，以及利用有機酸(酒石酸，檸檬酸，甲酸，乙二酸等)或無機酸(鹽酸，硫酸，磷酸等)制成的鹽，按其與賦形劑重量比為3 : 1的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑或沖劑。
1權利要求
式(I)所示的單萜吲哚生物堿或其藥用鹽，其中R1選自C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；R2選自氫或COOR3，其中R3選自C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；Y代表任選被1-5個R4取代的C2-10亞烷基、C2-10次烷基、C2-10亞烯基、C2-10次烯基、C2-10亞炔基或C2-10次炔基；R4選自氫、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基。FSA00000009194200011.tif
2. 如權利要求1所述的單萜吲哚生物堿或其藥用鹽，其中Y代表C2—4亞烷基丄2 基、C2—4亞烯基或C2—4次烯基，R4選自氫或C卜4烷基。
3. 如權利要求2所述的單萜吲哚生物堿或其藥用鹽，其中Y代表C4亞烯基或C4次烯 基，W選自氫或甲基。
4. 如權利要求3所述的單萜吲哚生物堿或其藥用鹽，其中Y代表次烷
5.如權利要求4所述的單萜吲哚生物堿或其藥用鹽，其是薄葉山橙素甲16COOCH3
6. 如權利要求l-5所述的藥用鹽，是指藥學上可接受的鹽，包括但不限于與有機酸如 酒石酸或檸檬酸或甲酸或乙二酸，或是與無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸形成的鹽。
7. 如權利要求l式(I)所示的單萜吲哚類化合物(melotenineA)的制備方法，包括以 下步驟(1)式(II)化合物與PhSeCH2CH0反應得到式(III)化合物SePhII其中R1、 R2的含義與權利要求1相同；(2)式(III)化合物與式(IV)化合物反應得到式(V)化合物,SePh<formula>formula see original document page 3</formula>其中L為離去基團，Y與權利要求1的含義相同 (3)式(V)化合物環(huán)合得到式(I)化合物<formula>formula see original document page 3</formula>
8.如權利要求7的制備方法，其中式(IV)化合物的結構為<formula>formula see original document page 3</formula>其中X代表任選被1-5個R4取代的C卜4亞烷基、C2—4亞烯基或C2—4亞炔基，L為離去基 團，W與權利要求1的含義相同；
9. 一種制備薄葉山橙素甲的方法，包括以下步驟取植物薄葉山橙，用水或有機溶劑 提取，所得提取物通過酸堿處理除去非生物堿類物質，利用硅膠柱層析分離得到式(I)所 示的單萜吲哚生物堿薄葉山橙素甲。
10. 如權利要求9的制備方法，所述的提取是在回流的溫度下進行的，所述的有機溶劑 選自醇類溶劑、酮類溶劑、酯類溶劑或醚類溶劑，其中所述的醇類溶劑選自甲醇、乙醇、正丙 醇、異丙醇、正丁醇、正戊醇，所述的酮類溶劑選自丙酮、丁酮、甲基異丁基酮，所述的酯類溶 劑選自乙酸乙酯。
11. 藥物組合物，其中含有權利要求1-6的式(I)化合物或其藥用鹽作為有效成分，并 含有至少一種可藥用載體。
12. 權利要求1-6的式(I)化合物或其藥用鹽在制備治療或預防癌癥藥物中的應用。
13. 權利要求l-6的式(I)化合物或其藥用鹽在制備治療或預防肝癌、白血病、胰腺癌、 乳腺癌及肺癌的藥物中的應用。
全文摘要
提供由式(I)所示的抗腫瘤活性成分薄葉山橙素甲(melotenineA)類似物，其制備方法及醫(yī)藥用途。
文檔編號A61K31/407GK101775019SQ20101010401
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月28日 優(yōu)先權日2010年1月28日
發(fā)明者馮濤, 李艷, 王媛媛, 羅曉東, 蔡祥海 申請人:中國科學院昆明植物研究所