專利名稱：保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的制造方法。特別地，本發(fā)明涉 及保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的制造方法，以及由該方法制造的保持有凝血酶的 生物可吸收性片制劑，所述方法包括在含有作為活性成分的凝血酶，作為添加劑的多羥基 醇、表面活性劑、氨基酸和低聚糖的溶液中浸漬生物可吸收性的片狀支持體，然后進行干
O
背景技術(shù)：
凝血酶是參與血液凝固的酶，且在止血血栓的形成或創(chuàng)傷的處理等生命的維持和 發(fā)展中是不可或缺的。凝血酶通常以非活性凝血酶原的形式存在于血液中，但由于起因于 例如血小板或組織細(xì)胞的損傷的凝固體系的活化而將可溶形式的纖維蛋白原轉(zhuǎn)換為對止 血和創(chuàng)傷處理有用的不溶性纖維蛋白。利用該原理的止血劑已在臨床現(xiàn)場受到廣泛應(yīng)用。盡管凝血酶一直被用作止血劑的活性成分，但利用常規(guī)液體形式的止血劑，無法 對噴出性出血點或涌出性出血點進行壓迫止血或壓迫封閉，因而不能止血。為了該噴出性出血或涌出性出血的止血，嘗試了開發(fā)片型止血劑，其中凝血酶、纖 維蛋白原和/或凝結(jié)因子被保持在膠原海綿、由海藻酸或聚乙醇酸構(gòu)成的非制造織物、或 由明膠或水凝膠構(gòu)成的其它生物可吸收性支持體上(例如，參見專利文獻1、2、3、4、5、6和 7)。然而，所述止血劑的大多由于較厚，并且在以其干燥形式應(yīng)用于器官的封閉部位 時由于支持體本身的剛性的影響而缺乏柔軟性，導(dǎo)致難以與創(chuàng)傷點緊密地接觸，因此不能 發(fā)揮充分的粘合效果，導(dǎo)致尚未被投入實際使用。唯一的已經(jīng)市售的片型纖維蛋白粘合劑是下述產(chǎn)品，其中纖維蛋白原和牛凝血酶 被保持在由馬膠原構(gòu)成的支持體上(產(chǎn)品名JachoComb/CSL Behling)(例如，參見專利文 獻8)。然而，對于其厚度(約3mm)和源自動物的內(nèi)含物來說，該粘合劑在操作性和危險因 子的去除上仍具有改進的余地。另一方面，有數(shù)個關(guān)于凝血酶的穩(wěn)定劑的報告。例如，已經(jīng)報道了保持具有穩(wěn)定 性的凝血酶的方法，對于液體制劑通過含有有機羧酸的鹽(例如，參見專利文獻9)或甘油 (例如，參見專利文獻10、11和12)，對于包裝在小瓶內(nèi)或鋁袋包裝中的干燥制劑通過含有 糖、堿性氨基酸和液體有機酸(例如，參見專利文獻13)，或明膠、甘氨酸和糖(例如，參見專 利文獻14)，或脂肪族多元羧酸和白蛋白(例如，參見專利文獻15)，或人血清白蛋白和氨基 酸(例如，參見專利文獻16)。然而，在片型制劑的情形中，僅凝血酶的穩(wěn)定化不能達到目 的。使用片制劑時，其有時被制成圓形或被折疊以使它可以緊密地接觸創(chuàng)傷點。因此， 為了避免所施加的力導(dǎo)致片的破壞或凝血酶成分的滲漏，必須改善片的柔軟性或凝血酶保 持力。例如，如上述的含有糖、堿性氨基酸和液體有機酸的凝血酶制劑不適于片型制劑，因為當(dāng)該凝血酶制劑被保持在片上時柔軟性會損失。此外，當(dāng)將非織造織物浸漬于凝血酶 溶液中并單一地進行凍干時，凝血酶不會被保持在該非織造織物上。為了解決所述問題，報 道了下述技術(shù)，將由幾丁質(zhì)制成的非織造織物作為支持體，交替地浸漬于三個溶液亦即比 如硫酸軟骨素、海藻酸或透明質(zhì)酸的酸性高分子化合物溶液，比如殼聚糖的堿性高分子化 合物溶液，以及凝血酶溶液中，以保持凝血酶，然后真空或通風(fēng)干燥而制造片狀止血劑或片 狀創(chuàng)傷用藥劑(例如，參見專利文獻17)。然而，采用該交替吸附技術(shù)，即便可確保片的柔軟 性，也不能避免凝血酶活性的降低和生產(chǎn)中操作的煩雜。因此，更有效的制劑方法的開發(fā)受 到期待。專利文獻1 日本專利公開No. 61-59737專利文獻2 日本專利公開No. 05-163157專利文獻3 日本專利公開No. 2002-515300專利文獻4丄US專利4453939專利文獻5 日本專利公開No. 9-510357專利文獻6 日本專利公開No. 2000-510357專利文獻7 日本專利公開No. 2001-513368專利文獻8 歐洲專利0059265專利文獻9 日本專利公開No. 56-39782專利文獻10 日本專利公開No. 62-106028專利文獻11專利文獻12專利文獻13專利文獻14專利文獻15專利文獻16專利文獻17
日本專利公開No. 7-64747 日本專利公開No. 63-192723 日本專利公開No. 2-53732 日本專利公開No. 7-165604 日本專利公開No. 2002-193832 日本專利公開No. 2006-117678 日本專利公開No. 2006-306759

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題如上所述，盡管含有凝血酶作為活性成分的片型制劑已被開發(fā)，但對于片制劑的 柔軟性、凝血酶的穩(wěn)定性和保持力、以及煩雜的制造工藝和未知危險因子的除去方面，仍留 有改進的余地。因此，本發(fā)明的目的在于提供便利的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的制造 方法和由該方法得到的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑。(解決問題的方法)為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過在凝血酶溶 液中含有甘油，可以抑制凍干粉體的過量產(chǎn)生，可以維持片制劑的柔軟性，從而可以避免干 燥后粉體的逸散所致的非織造織物上凝血酶成分的損失或損壞。進而，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)，TweenSO的添加會增強凝血酶對非織造織物的滲透性，以及海藻糖和少量組氨酸的添加 與制造干燥制劑時分別單獨添加海藻糖或組氨酸相比顯著地增強了凝血酶的穩(wěn)定性。由此，本發(fā)明的發(fā)明人完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明如下所述。[1]生物可吸收性片制劑的制造方法，其包括以下工序(1)至(3)(1)將活性成分與含有軟化劑和滲透劑的溶液混合的工序；(2)將(1)的溶液滴加至生物可吸收性片或?qū)⑸锟晌招云n在所述(1)的 溶液中的工序；和(3)對所述⑵的生物可吸收性片進行干燥的工序。[2]上述[1]的方法，其中所述活性成分是凝血酶或纖維蛋白原。[3]上述[2]的方法，其中凝血酶的濃度為1，000-2, 000單位/mL。[4]上述[1]_[3]中任一項的方法，其中所述軟化劑是多羥基醇或氨基多糖，且所 述滲透劑是表面活性劑。[5]上述[4]的方法，其中所述多羥基醇選自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇構(gòu) 成的組，所述氨基多糖選自由透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和硫酸乙酰肝素構(gòu)成的 組，且所述表面活性劑選自由Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗 糖單月桂酸酯、膽酸鈉、Tween 20,Triton X-100,Nonidet Ρ40、硫酸_3_[ (3-膽酰胺丙基) 二甲氨基]"I"丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麥芽糖苷和毛地黃皂苷。[6]上述[1]_[5]中任一項的方法，其中所述溶液進一步含有氨基酸和低聚糖。[7]上述W]的方法，其中所述氨基酸選自由精氨酸、組氨酸、賴氨酸、谷氨酸、甘 氨酸和天冬氨酸構(gòu)成的組，且所述低聚糖選自由甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和赤蘚 醇構(gòu)成的組。[8]上述[1]-[3]中任一項的方法，其中所述溶液含有甘油、TweenSO、組氨酸和海 藻糖作為添加劑。[9]上述[1]_[8]中任一項的方法，其中所述軟化劑的濃度為1_2%，且所述滲透 劑的濃度為0.01-1%。[10]上述中任一項的方法，其中所述氨基酸的濃度為2. 4-180mM，且所述 低聚糖的濃度為5-40mg/mL。[11]上述[1]_[10]中任一項的方法，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述 基材選自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖、海藻酸、膠原、明膠和水凝膠 構(gòu)成的組。[12]保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑，其含有作為活性成分的凝血酶，和作 為添加劑的軟化劑、滲透劑、氨基酸和少量低聚糖。[13]上述[12]的制劑，其中凝血酶的濃度為1，000-2, 000單位/mL。[14]上述[12]或[13]的制劑，其中所述軟化劑是多羥基醇或氨基多糖，且所述滲 透劑是表面活性劑。[15]上述[14]的制劑，其中所述多羥基醇選自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇 構(gòu)成的組，所述氨基多糖選自由透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和硫酸乙酰肝素構(gòu)成的 組，且所述表面活性劑選自由Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗 糖單月桂酸酯、膽酸鈉、Tween 20,Triton X-100,Nonidet Ρ40、硫酸_3_[ (3-膽酰胺丙基) 二甲氨基]"I"丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麥芽糖苷和毛地黃皂苷。[16]上述[12]_[15]中任一項的制劑，其中所述氨基酸選自由精氨酸、組氨酸、賴氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸構(gòu)成的組，且所述低聚糖選自由甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、 山梨糖醇和赤蘚醇構(gòu)成的組。[17]上述[12]或[13]的制劑，其中所述制劑含有作為添加劑的甘油、Tween 80、 組氨酸和海藻糖。[18]上述[12]-[17]中任一項的制劑，其中所述軟化劑的濃度為1_2%，所述滲 透劑的濃度為0. 01-1%，所述氨基酸的濃度為2. 4-180mM，且所述低聚糖的濃度為5_40mg/
mLo[19]上述[12]-[18]中任一項的制劑，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所 述基材選自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖、海藻酸、膠原、明膠和水凝 膠構(gòu)成的組。[20]多羥基醇作為生物可吸收性片制劑的軟化劑的用途。[21]上述[20]的用途，其中所述多羥基醇選自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇 構(gòu)成的組。[22]上述[20]或[21]的用途，其中所述多羥基醇的濃度為1_2%。[23]上述[20]_[22]中任一項的用途，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所 述基材選自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖、海藻酸、膠原、明膠和水凝 膠構(gòu)成的組。[24]上述[20]-[23]中任一項的用途，其中所述生物可吸收性片制劑是將凝血酶 或纖維蛋白原保持在所述生物可吸收性片上得到的。[25]表面活性劑作為生物可吸收性片制劑中活性成分的滲透劑的用途。[26]上述[25]的用途，其中所述表面活性劑選自由Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚 (Brij 35)、Pluronic F-68、蔗糖單月桂酸酯、膽酸鈉、Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、硫酸-3-[(3-膽酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基 麥芽糖苷和毛地黃皂苷構(gòu)成的組。[27]上述[25]或[26]的用途，其中所述表面活性劑的濃度為0. 01_1 %。[28]上述[25]_[27]中任一項的用途，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所 述基材選自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖、海藻酸、膠原、明膠和水凝 膠構(gòu)成的組。[29]上述[25]-[28]中任一項的用途，其中所述生物可吸收性片制劑是將凝血酶 或纖維蛋白原保持在所述生物可吸收性片上得到的。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，提供保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑及其制造方法。本發(fā)明所 述的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑可通過例如將由聚乙醇酸構(gòu)成的生物可吸收性 片浸漬于含有甘油、Tween 80、海藻糖和少量組氨酸的凝血酶溶液中，然后進行凍干而制 造。通過含有甘油，可避免凝血酶成分從生物可吸收性片脫落并且可賦予保持有凝血酶的 生物可吸收性片制劑以柔軟性。通過含有Tween 80，可增強凝血酶對生物可吸收性片的滲 透而促進凝血酶的保持。進而，通過含有海藻糖和少量組氨酸，可在制造干燥制劑時充分維 持凝血酶的活性。因此，本發(fā)明可促進保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的制造。通過 本發(fā)明的方法制造的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑可擁有凝血酶的穩(wěn)定性和生物可吸收性片制劑所需的柔軟性。此外，本發(fā)明所述的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑由于可極其快速地溶出 至溶液中，故凝血酶可在保持有凝血酶的片與液體纖維蛋白原或血液接觸后立即發(fā)揮其酶 活性。即，期待利用本發(fā)明所述的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑，凝血酶可在粘合封 閉面或在活動性出血點快速地溶出而發(fā)揮其利用纖維蛋白原作為底物的酶活性，迅速地提 供纖維蛋白變換，提供組織粘合/封閉效果和止血效果。


圖1顯示利用添加和未添加甘油的凝血酶溶液制備的保持有凝血酶的生物可吸 收性片制劑的形狀。圖2顯示利用添加或未添加甘油的凝血酶溶液制備的保持有凝血酶的生物可吸 收性片制劑中的凝血酶在保存一定時間后的殘留活性。圖3顯示利用添加或未添加人血清白蛋白的凝血酶溶液制備的保持有凝血酶的 生物可吸收性片制劑中的凝血酶在保存一定時間后的殘留活性。圖4顯示利用添加各種低聚糖的凝血酶溶液制備的保持有凝血酶的生物可吸收 性片制劑中的凝血酶在保存一定時間后的殘留活性。圖5顯示利用添加各種濃度的甘露糖醇或海藻糖的凝血酶溶液制備的保持有凝 血酶的生物可吸收性片制劑中的凝血酶在保存一定時間后的殘留活性。圖6顯示利用添加各種氨基酸的凝血酶溶液制備的保持有凝血酶的生物可吸收 性片制劑中的凝血酶在保存一定時間后的殘留活性。圖7顯示利用添加各種濃度的海藻糖和組氨酸的凝血酶溶液制備的保持有凝血 酶的生物可吸收性片制劑中的凝血酶在保存一定時間后的殘留活性。No. 1 未添加組氨酸、 No. 2 2. 4mM的組氨酸、No. 3 :4. 8mM的組氨酸、No. 4 :9. 6mM的組氨酸、No. 5 :22. 5mM的組氨 酸、No. 6 :45mM的組氨酸、No. 7 :90mM的組氨酸、No. 8 :180mM的組氨酸。圖8顯示浸漬在添加和未添加各種表面活性劑的凝血酶溶液中的生物可吸收性 片于一定時間所吸附的液體重量。No. 1 未添加表面活性劑、No. 2 =Tween 80,No. 3 聚氧乙 烯月桂基醚(Brij 35)、No. 4 :PluronicF-68、No. 5 蔗糖單月桂酸酯、No. 6 膽酸鈉、No. 7 Tween 20,No. 8 =Triton X_100、No. 9 :Nonidet Ρ40、Νο· 10 硫酸 _3_[ (3-膽酰胺丙基)-二 甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、No. 11 正辛基葡萄糖苷、No. 12 正十二烷基麥芽糖苷、No. 13 毛地黃皂苷。圖9顯示浸漬在添加和未添加各種濃度的Tween 80的凝血酶溶液中的生物可吸 收性片于一定時間所吸附的液體重量。圖10顯示保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的柔軟性比較試驗方法。圖11顯示保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的柔軟性比較試驗結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明的特征在于保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的制造方法，及由該方法 得到的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑，所述方法采用含有作為制劑用軟化劑有效的 多羥基醇、用作增強凝血酶對生物可吸收性片的滲透性的表面活性劑、和維持凝血酶穩(wěn)定性的特定氨基酸和低聚糖的溶液。此處所使用的凝血酶成分可以是市售的凝血酶(例如來自人血漿的凝血酶 (Sigma-Aldrich，編碼No. T6884等))、或由動物血液通過低溫乙醇分餾或色譜法制備的來 自生物體的凝血酶、或由重組DNA技術(shù)得到的重組體凝血酶。優(yōu)選地，可使用重組體凝血酶 以排除未知感染因子或危險因子的污染。在使用重組DNA技術(shù)時，可優(yōu)選使用從將要施行 止血的動物種類獲得的凝血酶基因。在生物體中，凝血酶以維生素K依存性的方式在肝細(xì)胞中被合成為前體凝血酶 原，并被細(xì)胞膜的磷脂上的FXa-FVa限制性降解(切斷發(fā)生在凝血酶原的Arg320-ILe321 和Arg271-Thr272這兩個位點)而產(chǎn)生凝血酶。在通過重組DNA技術(shù)得到凝血酶的情形中， 可先完成凝血酶原的表達，將其純化后，用蝰蛇毒(ecarin)處理而轉(zhuǎn)換為凝血酶。 例如，人凝血酶原基因可按照如Sambrook等人所教導(dǎo)的一般重組DNA技術(shù) (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second EditionCold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.，1989)，起始于總RNA, mRNA或基因組DNA來制備?，F(xiàn)在，可使用 各種市售的試劑盒。例如，可以使用用于RNA提取的試劑比如TRIzoI試劑(Invitrogen)、 ISOGEN(NIPPON gene CO. , LTD.), StrataPrep Total RNA Purification Kit(TOYOBO)； 用于 mRNA 純化的試劑盒比如 mRNA Purification Kit (Amersham Bioscience)、Poly (a) Quick mRNA Isolation Kit (Τ0Υ0Β0)、mRNA Separator Kit(Clontech)；用于轉(zhuǎn)換為 cDNA 的 T-Primed First Strand Kit (Amersham Pharmacia)、SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning (Invitrogen) > cDNAsynthesis Kit (TAKARA SHUZO CO. , LTD.) > SMART PCR cDNA synthesis Library Construction Kits (Clontech)、 Directionary cDNA Library Construction systems(Novagen Inc. ) > GeneAmp PCR Gold(Applied Biosystems)。這樣得到的人凝血酶基因可被插入適合的表達載體，并利用所得表達載體實施寄 主細(xì)胞例如動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。此處所用的表達載體沒有特別限定，但可添加有適于外源基 因的啟動子等的表達調(diào)控區(qū)域、終止密碼子、poly A添加信號序列、kozack序列、分泌信號 等。所述表達載體中所含的啟動子基于用作宿主的動物細(xì)胞來選定，可為任意啟動子，只要 引起外源基因的表達即可，比如SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、巨細(xì)胞病毒啟動子、雞 β-肌動蛋白啟動子。優(yōu)選地，可使用雞β-肌動蛋白啟動子系表達質(zhì)粒pCAGG(日本專利 公開No. 3-168087)。用于選擇或基因擴增的標(biāo)志基因可以是本領(lǐng)域公知的，比如neo基因、 二氫葉酸還原酶(dhfr)基因、嘌呤霉素抗性酶基因或谷氨酰胺合成酶(GQ基因。此處所用宿主可以是來自各種哺乳動物的任意培養(yǎng)細(xì)胞，且包括中國倉鼠卵巢 細(xì)胞(CH0細(xì)胞)、來自人的293細(xì)胞、來自雞的細(xì)胞等。向動物細(xì)胞導(dǎo)入基因可沒有特別 限制地施行，例如通過磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、利用Lipofectin脂質(zhì)體的方法，原生質(zhì) 體聚乙二醇融合法、電穿孔法等，它們可取決于所使用的寄主細(xì)胞而適當(dāng)選擇(Molecular Cloning (3rd Ed.), Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001))。用于培養(yǎng)的 培養(yǎng)基，由其形狀分類包括瓊脂培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基，或由其種類分類包括YMM-01、DMEM、 RPMI、αΜΕΜ等，可取決于細(xì)胞、培養(yǎng)目的或培養(yǎng)階段而適當(dāng)選擇。按照各自的規(guī)程，可使用 其中添加了血清、氨基酸、維生素、糖、抗生素、PH調(diào)節(jié)緩沖液等的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的ρΗ可 調(diào)節(jié)為6-8的范圍，培養(yǎng)溫度可為30°C -39°C的范圍。培養(yǎng)基的量、添加物和培養(yǎng)時間可取決于培養(yǎng)規(guī)模而適當(dāng)調(diào)節(jié)。人凝血酶原產(chǎn)生細(xì)胞可利用采用抗凝血酶抗體的特異性反應(yīng)的檢測方法，比如斑 點印跡、Western印跡、夾層ELISA等，通過檢測存在于克隆的耐藥性細(xì)胞的培養(yǎng)液中的人 凝血酶原而得到?？墒褂纱说玫降漠a(chǎn)生人凝血酶原的細(xì)胞適合于無血清培養(yǎng)基，然后在工 業(yè)生產(chǎn)水平下大量培養(yǎng)。大量培養(yǎng)可通過例如補料分批培養(yǎng)(fed batch culture)、分批培 養(yǎng)等，沒有特別限制地進行。對于由所述人凝血酶原產(chǎn)生細(xì)胞純化人凝血酶原，可使用通常蛋白質(zhì)化學(xué)中所用 的純化方法，比如例如鹽析、超濾、等電點沉淀、電泳、離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法、親 合色譜法、疏水色譜法、羥磷灰石色譜法等。在實踐中，由于各種細(xì)胞碎屑的存在有時可采 用上述方法的組合?？蓛?yōu)選地使用重組體蝰蛇毒用于將人凝血酶原轉(zhuǎn)換為人凝血酶。重組體蝰蛇毒可 如專利公開(W02003/004641)中所述地制備。簡要地，如Nishida等人所教導(dǎo)地制備蛇毒 蜂蛇毒 cDNA (S. Nishida et al.，Biochemistry，34，1771-1778，1995)，并整合至此處所用 的雞β-肌動蛋白啟動子系表達質(zhì)粒pCAGG中。將所得表達載體導(dǎo)入動物細(xì)胞，例如CHO 細(xì)胞，以提供產(chǎn)生重組體蝰蛇毒的細(xì)胞?？赏ㄟ^陽離子交換色譜法和凝膠過濾來純化重組 體蝰蛇毒。這樣純化的重組體蝰蛇毒可作用于人凝血酶原，以將其轉(zhuǎn)換為人凝血酶。反應(yīng) 條件可與通常的酶促反應(yīng)的條件相同。例如，可向1000 μ g/mL的人凝血酶原添加2-8單位 /mL終濃度的蝰蛇毒，在36-38°C反應(yīng)1_4小時以完成人凝血酶原向人凝血酶的轉(zhuǎn)換。在由用蝰蛇毒處理后的溶液純化人凝血酶時，可通過將該溶液進行如上述的純化 蛋白質(zhì)的方法來進行。優(yōu)選地，可使用利用苯甲脒色譜法和陽離子交換色譜法的組合的純 化方法。苯甲脒色譜法中，人凝血酶可被吸附至用含有0. 3-0. 7M NaCl, pH7_9的緩沖液平 衡的柱上，并可在用該緩沖液洗滌后，用補充有0. IM苯甲脒鹽酸鹽的該緩沖液溶出。接著，可對上述人凝血酶的溶出液進行陽離子交換色譜。已開發(fā)出比如磺基 丙基型或羧甲基型的陽離子交換體并可適宜選擇使用。本發(fā)明中使用SP Toyopearl 550C (Tosoh Corporation)。人凝血酶可吸附在用含有0. 2M NaCl、pH6_7的IOmM檸檬酸鹽 緩沖液平衡的柱上，并可在用該緩沖液洗滌后，用含有0. 6M NaCl的該緩沖液溶出。通過這 些步驟，可得到高純度的人凝血酶。這樣得到的人凝血酶的活性單位可通過凝固活性和合成底物(S-2238)切斷活性 來指示。凝固活性值表示相對于標(biāo)準(zhǔn)品的校正曲線的纖維蛋白原凝固所需的時間，所述標(biāo) 準(zhǔn)品包括日本藥典標(biāo)準(zhǔn)品和WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品(NIB SC)的凝血酶。基于凝血酶及其特異性 底物之間的反應(yīng)的S-2238切斷活性，可經(jīng)由0D405/650的吸光度變化，通過測定合成底物 S-2238被凝血酶切斷時釋放的對硝基苯胺的量來測定?？蓪⑦@樣得到的重組體人凝血酶(以下也僅稱作“凝血酶”)保持在生物可吸收性 片上。生物可吸收性片可為任意形狀，只要可確保一定程度的柔軟性和彈性即可，比如通過 將生物可吸收性合成纖維加工為片而制備的紡織品、織造織物或非織造織物。生物可吸收 性合成纖維可選自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖、海藻酸、膠原、明膠 和水凝膠構(gòu)成的組。優(yōu)選地，可使用聚乙醇酸非織造織物，其通過下述制備，即作為基材針 織或機織聚乙醇酸，并針刺該針織品或織物而制備非織造織物。不僅可向用于將凝血酶保持在生物可吸收性片上的溶液(以下也稱為“凝血酶溶液”)中添加作為止血劑活性成分的凝血酶，還可添加用于維持凝血酶本身活性的穩(wěn)定劑， 用于避免保持在生物可吸收性片上的凝血酶成分的損失或逸散的軟化劑，以及用于增強凝 血酶對生物可吸收性片的滲透性的滲透劑。凝血酶溶液中可含的凝血酶的濃度為發(fā)揮止血 活性的濃度，例如為100-5，000單位/mL，優(yōu)選1，000-2，000單位/mL的終濃度。凝血酶活性的損失或減小起因于保存時凝血酶的聚集。因此，對于凝血酶的穩(wěn)定 劑，可使用能夠抑制凝血酶的聚集形成的物質(zhì)。該物質(zhì)可包括例如白蛋白、特定氨基酸和低 聚糖的蛋白質(zhì)。氨基酸可包括精氨酸、組氨酸、賴氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸。谷氨酸和組氨 酸作為穩(wěn)定劑被期望特別有效。然而，對于谷氨酸，大量使用時會有神經(jīng)毒性的危險。因此， 從安全性方面考慮，可優(yōu)選使用組氨酸。氨基酸的終濃度可在2. 4-180mM的范圍內(nèi)?？墒褂迷诒４鏁r有效維持凝血酶活性的低聚糖。這樣的低聚糖可包括甘露糖醇、 蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和赤蘚醇。據(jù)報道，海藻糖若在外科手術(shù)時供給至器官表面，則可 抑制組織的變性和防止干燥性粘連(http://www. vm. a. u-tokyo. ac. jp/vmc/achievement/ treharose. html,或http://www. next21. info/press/images/20050624Treha. pdf)。因此， 海藻糖不僅被期待作為穩(wěn)定劑有效，而且還被期待對于減少封閉處置表面與其它器官的粘 連。因此，可優(yōu)選使用海藻糖。低聚糖的終濃度可在5-40mg/mL的范圍內(nèi)。通過將氨基酸和低聚糖一起使用，與它們各自單獨使用相比可獲得穩(wěn)定凝血酶的 協(xié)同作用。因此，本發(fā)明的凝血酶溶液可含有氨基酸和低聚糖兩者，且這兩者的比例可在上 述范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)節(jié)。優(yōu)選地，可使用22. 5-180mM的氨基酸和30-40mg/mL的低聚糖。最優(yōu) 選的實施方案是180mM的組氨酸和40mg/mL的海藻糖?？墒褂貌挥绊懩富钚郧铱删S持生物可吸收性片柔軟性的軟化劑和滲透劑。該 軟化劑可包括多羥基醇和比如透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和硫酸乙酰肝素的氨基 多糖，優(yōu)選多羥基醇。多羥基醇可包括甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇?？蓛?yōu)選使用甘油，因 為其已在多種藥物和疫苗中被用作穩(wěn)定劑。可使終濃度在1-2%范圍內(nèi)的軟化劑。對于滲透劑，可使用比如Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗糖單月桂酸酯、膽酸鈉、Tween 20, Triton X-100、Nonidet P40、硫酸 _3_[ (3-膽酰 胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麥芽糖苷和毛地黃皂 苷的表面活性劑，優(yōu)選Tween 80。可使用濃度在0. 01_1 %、優(yōu)選0. 01_0. 1 %范圍內(nèi)的滲透 劑。本發(fā)明的軟化劑和滲透劑不僅可在保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑中使用，而且 可在保持有其它止血蛋白質(zhì)例如纖維蛋白原的生物可吸收性片制劑中使用。用于制備凝血酶溶液的緩沖液可包括磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、檸檬酸鹽緩沖 液等，PH范圍為6. 0-8.0?？梢暻闆r添加適量的其它添加劑，例如氯化鈣、氯化鈉等鹽，或蔗 糖和甘露糖醇等賦形劑。本發(fā)明的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑可通過，例如，將凝血酶溶液滴加 至放于適當(dāng)容器中的聚乙醇酸構(gòu)成的生物可吸收性片，或?qū)⒃撋锟晌招云n于容器 中的凝血酶溶液中，并在-80°C下凍干后，將該片干燥來獲得?？蛇x地，可對填充有凝血酶溶 液的生物可吸收性片進行自然干燥。通過在凝血酶溶液中含有滲透劑，可增強凝血酶對所 述生物可吸收性片的滲透性。在通過干燥除去水分的過程中，凝血酶可包覆于穩(wěn)定劑和軟 化劑中而穩(wěn)定地保持在生物可吸收性片的纖維上。所得保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑可與干燥劑一起密封包裝于雙層(聚乙烯-鋁)薄膜包裝中在室溫下保存。這樣得到的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的評價可通過檢測保持于生物 可吸收性片上的凝血酶的保持率、成型后的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的柔軟 性、凝血酶的穩(wěn)定性等來進行。凝血酶在生物可吸收性片上的保持率可通過比較將該片浸漬于生理鹽水或合適 的緩沖液中并搖振后從該片溶出的凝血酶的活性與保持在該片上的凝血酶的活性來計算。 對于凝血酶活性的測定，可使用如上述的凝固活性和合成底物切斷活性。根據(jù)本發(fā)明，可得 到具有80%以上保持率的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑。本發(fā)明的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的柔軟性可如下所述進行評價。 即，將保持有凝血酶的生物可吸收性片剪切成合適的片，并將該片的一端固定在基座上。然 后對從該基座水平地突出的部分滴加制備為約^mg/mL的纖維蛋白原溶液。所述纖維蛋白 原在保持于所述生物可吸收性片上的凝血酶的作用下立即轉(zhuǎn)換為纖維蛋白，使得所述片因 纖維蛋白的重量而下垂。柔軟性可通過測定所述凸出部分的前端自水平水準(zhǔn)線下垂了多少 來評價。本發(fā)明的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的穩(wěn)定性可通過評估長期保存后 的凝血酶的殘留酶活性或凝血酶分子的聚集或降解程度來評價。凝血酶的殘留酶活性可通 過與如上述檢測凝血酶的保持率相同的方式測定酶活性來檢測。凝血酶分子的聚集或降解 程度可通過將從所述片溶出的凝血酶的一部分進行SDS-PAGE或尺寸排阻高效液相色譜來 檢測。本發(fā)明的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑可通過將該制劑施加于創(chuàng)傷或止 血點而用作粘合劑。取決于出血的嚴(yán)重程度，所述保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑可 單獨或與纖維蛋白粘合劑制劑成分的纖維蛋白原一起應(yīng)用。在消化器官的外科領(lǐng)域中，對于肝或脾的部分切離或部分破裂等損傷時發(fā)生的涌 出性出血，可將保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑單獨施加至患部表面，然后按壓3-5 分鐘完成止血。另一方面，若與纖維蛋白粘合劑制劑的成分的纖維蛋白原一起施加，則可增 強封閉效果或止血效果。例如，在呼吸器的外科領(lǐng)域中，可以有效地封閉產(chǎn)生肺的膨脹和收 縮壓力的肺胸膜的剝離面、肺葉實質(zhì)切離面、或支氣管切斷邊緣處的漏氣位點。在大量血管 網(wǎng)絡(luò)遍布的子宮和胎盤周圍的涌出性出血的情形中，切開和切除時的出血的風(fēng)險高，止血 處理由于出血點不明而變得極其困難，但本發(fā)明卻可以以單次處置同時封閉一定面積。對于應(yīng)用于有高血壓的動脈的損傷部位或人造血管的縫合處置處的噴出性出血， 本發(fā)明可發(fā)揮最高效果，在維持纖維蛋白原在患部足夠量的同時，使得纖維蛋白迅速且牢 固地形成，從而完成止血。如上述的粘合于封閉效果歸因于下述事實，即本發(fā)明的保持有凝血酶的生物可吸 收性片制劑為高柔軟性因而可追隨組織的凹凸以致緊密地粘附，以及凝血酶被迅速地溶出 而將纖維蛋白原轉(zhuǎn)換為纖維蛋白。以下借助實施例對本發(fā)明進行更詳細(xì)地說明，但并不應(yīng)受實施例的束縛。EXAMPLE^MM 1 d甬丄寸添力D甘油抑泡丨凍干干'燥本的過量形成將含有終濃度1 %、1. 5 %或2 %的甘油、1875單位/mL的凝血酶、10mg/mL的人血清白蛋白、40mM的凝血酶溶液(pH6. 0)、5mg/mL的甘露糖醇和0. 的Tween 80的凝血酶 溶液(pH6.0)以ImM的厚度倒入鋪有生物可吸收性片(聚乙醇酸生物可吸收性合成非織造 織物，產(chǎn)品名=Neoveil (Gunze Limited))的容器中，并且在_80°C凍干2小時后，真空干燥 而制備保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑。將該制劑與用不含甘油的凝血酶溶液以上述 相同方式制備的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑進行比較。如圖1所示，通過添加甘油，在保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑中，凍干干燥 粉體的過量形成得到抑制。實施例2 添加甘油對凝血酶穩(wěn)定件的效果將實施例1中得到的添加或未添加甘油的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑， 作為在容器中的樣子，與干燥劑一起放于雙層(聚乙烯-鋁)薄膜袋中密封包裝，并在室溫 下Q2-25°C )保存。保存1、2、3、8周后，將樣品開封，將保持有凝血酶的生物可吸收性片制 劑從所述容器剝離并切成2CmX2Cm(km2)的片，將其浸漬于生理鹽水(l.OmL)中充分混合 以使凝血酶溶出。將所得凝血酶溶出液按照日本藥典“凝血酶的定量方法”檢測凝固活性。 以下，對“凝血酶的定量方法”進行簡要說明。首先，凝固時間定義為在混合纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液后，所得含有纖維蛋 白的溶液達到0.3的吸光度G50nm)所需要的時間。將用申請人自己的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)制備的 標(biāo)準(zhǔn)溶液(四種單位)與一定濃度的纖維蛋白原溶液混合，并測定凝固時間。制成了顯示 凝血酶的活性單位與凝固時間之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)直線，其中橫軸表示活性單位而縱軸表示凝 固時間。對于上述凝血酶溶出液，同樣地測定凝固時間，并使用該標(biāo)準(zhǔn)直線獲得凝血酶活性 單位，計算每片面積的殘留凝血酶活性單位(單位/cm2)。圖2顯示添加或未添加甘油的樣 品中的殘留凝血酶活性，其中橫軸表示保存時間，縱軸表示與保存之前相比的保存后凝血 酶溶出液的凝固活性值(單位/cm2)。作為添加和未添加甘油的樣品之間的比較結(jié)果，可知添加甘油并不降低凝血酶活性。實施例3 添加人血清白蛋白對凝血酶穩(wěn)定性的效果使用實施例1中所得的添加有甘油的凝血酶溶液和由所述凝血酶溶液除去了 白蛋白的2種凝血酶溶液，如實例1和2所述制備保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑，密 封包裝并保存于37°C。保存1和2周后，將樣品開封，獲取凝血酶溶出液并測定相對于保存前的活性而維 持的殘留凝血酶活性，表示在圖中如圖3所示。結(jié)果，保存2周后，添加有人血清白蛋白的樣品維持了保存前活性的80%，但未添 加人血清白蛋白的樣品顯示活性減少至20%。實施例4 添加低聚糖對凝血酶穩(wěn)定性的效果使用具有表1所示組成的凝血酶溶液，如實例1和2所述制備保持有凝血酶的生 物可吸收性片制劑，密封包裝并保存于65°C。對于表1中的低聚糖，使用蔗糖、海藻糖、山梨 糖醇、赤蘚醇、乳糖，并且作為對照使用之前報道的成分即甘露糖醇。保存8天后，將樣品開 封，獲取凝血酶溶出液并測定相對于保存前活性所維持的殘留凝血酶活性，表示在圖中如 圖4所示。結(jié)果，證實蔗糖、海藻糖和山梨糖醇顯示了與甘露糖醇相當(dāng)?shù)膶δ傅姆€(wěn)定效果ο表權(quán)利要求
1.生物可吸收性片制劑的制造方法，其包括以下工序(1)至(3)(1)將活性成分與含有軟化劑和滲透劑的溶液混合的工序；(2)將(1)的溶液滴加至生物可吸收性片或?qū)⑸锟晌招云n在所述(1)的溶液 中；和(3)對所述O)的生物可吸收性片進行干燥的工序。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述活性成分是凝血酶或纖維蛋白原。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中凝血酶的濃度為1，000-2，000單位/mL。
4.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述軟化劑是多羥基醇或氨基多糖，且所 述滲透劑是表面活性劑。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述多羥基醇選自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇 構(gòu)成的組，所述氨基多糖選自由透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和硫酸乙酰肝素構(gòu)成的 組，且所述表面活性劑選自由Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗 糖單月桂酸酯、膽酸鈉、Tween 20,Triton X-100,Nonidet Ρ40、硫酸-3-[ (3-膽酰胺丙基) 二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麥芽糖苷和毛地黃皂苷。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中所述溶液進一步含有氨基酸和低聚糖。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述氨基酸選自由精氨酸、組氨酸、賴氨酸、谷氨酸、甘 氨酸和天冬氨酸構(gòu)成的組，且所述低聚糖選自由甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和赤蘚 醇構(gòu)成的組。
8.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述溶液含有作為添加劑的甘油、Tween 80、組氨酸和海藻糖。
9.權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述軟化劑的濃度為1_2%，且所述滲透劑 的濃度為0.01-1%。
10.權(quán)利要求6-9中任一項所述的方法，其中所述氨基酸的濃度為2.4-180mM,且所述 低聚糖的濃度為5-40mg/mL。
11.權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述 基材選自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖、海藻酸、膠原、明膠和水凝膠 構(gòu)成的組。
12.保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑，其含有作為活性成分的凝血酶，和作為添加 劑的軟化劑、滲透劑、氨基酸和少量低聚糖。
13.權(quán)利要求12所述的制劑，其中凝血酶的濃度為1，000-2，000單位/mL。
14.權(quán)利要求12或13所述的制劑，其中所述軟化劑是多羥基醇或氨基多糖，且所述滲 透劑是表面活性劑。
15.權(quán)利要求14所述的制劑，其中所述多羥基醇選自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇 構(gòu)成的組，所述氨基多糖選自由透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和硫酸乙酰肝素構(gòu)成的 組，且所述表面活性劑選自由Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗 糖單月桂酸酯、膽酸鈉、Tween 20,Triton X-100,Nonidet Ρ40、硫酸-3-[ (3-膽酰胺丙基) 二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麥芽糖苷和毛地黃皂苷。
16.權(quán)利要求12-15中任一項所述的制劑，其中所述氨基酸選自由精氨酸、組氨酸、賴 氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸構(gòu)成的組，且所述低聚糖選自由甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和赤蘚醇構(gòu)成的組。
17.權(quán)利要求12或13所述的制劑，其中所述制劑含有作為添加劑的甘油、Tween80、 組氨酸和海藻糖。
18.權(quán)利要求12-17中任一項所述的制劑，其中所述軟化劑的濃度為1_2%，所述滲透 劑的濃度為0.01-1%，所述氨基酸的濃度為2. 4-180mM，且所述低聚糖的濃度為5_40mg/mL。
19.權(quán)利要求12-18中任一項所述的方法，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述 基材選自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖、海藻酸、膠原、明膠和水凝膠 構(gòu)成的組。
20.多羥基醇作為生物可吸收性片制劑的軟化劑的用途。
21.權(quán)利要求20所述的用途，其中所述多羥基醇選自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇 構(gòu)成的組。
22.權(quán)利要求20或21所述的用途，其中所述多羥基醇的濃度為1-2%。
23.權(quán)利要求20-22中任一項所述的方法，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述 基材選自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖、海藻酸、膠原、明膠和水凝膠 構(gòu)成的組。
24.權(quán)利要求20-23中任一項所述的用途，其中所述生物可吸收性片制劑是將凝血酶 或纖維蛋白原保持在所述生物可吸收性片上得到的。
25.表面活性劑作為生物可吸收性片制劑中活性成分的滲透劑的用途。
26.權(quán)利要求25所述的用途，其中所述表面活性劑選自由TweenSO、聚氧乙烯月桂基醚 (Brij 35)、Pluronic F-68、蔗糖單月桂酸酯、膽酸鈉、Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、硫酸-3-[(3-膽酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基 麥芽糖苷和毛地黃皂苷構(gòu)成的組。
27.權(quán)利要求25或沈的用途，其中所述表面活性劑的濃度為0.01-1%。
28.權(quán)利要求25-27中任一項所述的用途，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述 基材選自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)、殼聚糖、海藻酸、膠原、明膠和水凝膠 構(gòu)成的組。
29.權(quán)利要求25-28中任一項所述的用途，其中所述生物可吸收性片制劑是將凝血酶 或纖維蛋白原保持在所述生物可吸收性片上得到的。
全文摘要
本發(fā)明提供保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的制造方法。保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑的制造方法以及由該方法制備的保持有凝血酶的生物可吸收性片制劑，所述制造方法包括將由聚乙醇酸構(gòu)成的生物可吸收性片浸漬于凝血酶溶液中，然后進行干燥，所述凝血酶溶液含有作為活性成分的凝血酶、作為軟化劑的甘油、作為滲透劑的Tween 80、和任選的作為穩(wěn)定劑的組氨酸和海藻糖。
文檔編號A61K47/26GK102105141SQ20098012273
公開日2011年6月22日 申請日期2009年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日
發(fā)明者今村隆幸, 尾脅瞳, 川村亮一 申請人:一般財團法人化學(xué)及血清療法研究所