專利名稱：：預(yù)防犬、貓和馬流感傳染的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有外源基因的重組的、嵌合的單股負(fù)鏈病毒(mononegavirale)載體的用途。更特別地，本發(fā)明涉及這樣的載體用于治療犬、貓或馬的呼吸道疾病的用途。
背景技術(shù)：
：能夠在受感染宿主中復(fù)制的活病毒誘導(dǎo)強(qiáng)烈而長效的針對其所表達(dá)抗原的免疫應(yīng)答。它們在引發(fā)體液-和細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以及刺激細(xì)胞因子和趨化因子途徑中都是有效的。因此，活的、減毒的病毒提供了優(yōu)于基于滅活或亞基免疫原的疫苗組合物的截然不同的優(yōu)勢，滅活或亞基免疫原通常在很大程度上只刺激免疫系統(tǒng)的體液分支部分。在過去的十年間，重組DNA技術(shù)已經(jīng)使DNA和RNA病毒基因組的遺傳工程領(lǐng)域發(fā)生了巨大的變化。特別地，現(xiàn)在將外源基因引入病毒的基因組中，使得新載體病毒在宿主動(dòng)物中復(fù)制時(shí)表達(dá)可以在宿主動(dòng)物中發(fā)揮生物作用的外源蛋白是可能的。因此，已經(jīng)將重組載體病毒開發(fā)利用，不僅用于微生物感染的控制和預(yù)防，而且還用于設(shè)計(jì)非微生物疾病如惡性腫瘤的靶向治療和基因治療中。美國專利No.6，033，886中最先描述了通過稱為“反向遺傳學(xué)”的技術(shù)從克隆的cDNA完整地產(chǎn)生未分段的、負(fù)鏈RNA病毒(單股負(fù)鏈病毒目的病毒)，在此將其全部引入作為參考。該專利使得使用單股負(fù)鏈病毒目(MV)的病毒作為載體成為可能。隨后已經(jīng)公開的研究描述了使用MV目的病毒作為病毒載體來表達(dá)源自病原體的外源抗原，目的在于研發(fā)針對該病原體的疫苗。將單股負(fù)鏈病毒目分成四個(gè)主要的科副粘病毒科、棒狀病毒科、絲狀病毒科和博爾納病毒科。屬于這些科的病毒具有由單個(gè)、負(fù)(_)向RNA分子表示的基因組，S卩，RNA基因組的極性與稱為正⑴向的信使RNA(mRNA)的極性相反。下表中呈現(xiàn)了主要的人和獸醫(yī)MV病毒的分類表1單股負(fù)鏈病毒目內(nèi)的主要病毒的分類<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>MV病毒的基因組組構(gòu)和生活周期的細(xì)節(jié)是公知的并且不同的作者對此作了綜述。盡管，單股負(fù)鏈病毒具有不同的宿主以及截然不同的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特性，但它們具有許多共有的特征，如基因組組構(gòu)以及對于其典型的復(fù)制模型和基因表達(dá)必需的元件，這說明了它們源自共同的祖先。它們是在細(xì)胞的胞質(zhì)中復(fù)制并產(chǎn)生未剪接的mRNA的包膜病毒。單股負(fù)鏈病毒由兩個(gè)主要的功能單位組成核蛋白(RNP)復(fù)合物和包膜。對于以上提及的所有科的屬的代表性病毒的完整基因組序列已經(jīng)得到了測定?；蚪M大小范圍為約9，000個(gè)核苷酸至約19，000個(gè)核苷酸，并且它們含有5至10個(gè)基因。MV病毒基因組的結(jié)構(gòu)和組構(gòu)非常相似，并且通過它們特定的基因表達(dá)模式來控制。所有的MV病毒基因組含有三個(gè)核心基因，其編碼核蛋白(N或NP)、磷蛋白(P)和RNA-依賴性RNA聚合酶(L)。病毒包膜由基質(zhì)(M)蛋白和一個(gè)或多個(gè)跨膜糖蛋白(例如，G、HN和F蛋白)組成，跨膜糖蛋白在病毒裝配/芽殖中以及在細(xì)胞附著和/或病毒的進(jìn)入中起作用。根據(jù)屬，通過在轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制中呈現(xiàn)出某些特異性調(diào)控功能或在病毒宿主反應(yīng)中所涉及的輔助蛋白(例如，C、V和NS蛋白)來延伸蛋白庫。MV病毒的基因次序是高度保守的，在或接近3'末端具有核心基因N和P，而在5'遠(yuǎn)端位置具有大(L)基因。M，表面糖蛋白基因以及其他輔助基因，位于N、P和L基因之間。在RNP復(fù)合物中，基因組或反基因組RNA由N蛋白緊密包裹并與由L和P蛋白組成的RNA-依賴性RNA聚合酶相關(guān)聯(lián)。細(xì)胞感染后，RNP復(fù)合物，而不是裸露的RNA基因組，作為模板用于兩個(gè)截然不同的RNA合成功能，S卩，亞基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄和全長基因組RNA的復(fù)制。所有串聯(lián)排列的基因通過所謂“基因連接”結(jié)構(gòu)隔開?；蜻B接包括保守的“基因末端”(GE)序列，未轉(zhuǎn)錄的“基因間區(qū)域”(IGR)和保守的“基因起始”(GS)序列。這些序列對于基因轉(zhuǎn)錄是充分而必需的。在轉(zhuǎn)錄過程中，通過病毒RNA-依賴性RNA聚合酶在第一個(gè)GS序列的基因組RNA的3'端開始轉(zhuǎn)錄過程，每個(gè)基因被按序轉(zhuǎn)錄成mRNA。在每個(gè)基因連接處，作為RNA聚合酶在GE序列處脫離的結(jié)果，轉(zhuǎn)錄被間斷。在隨后的GS序列處，重新啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，盡管效率有所降低。作為這種間斷性過程(也稱為“停止-開始”過程)的結(jié)果，轉(zhuǎn)錄的弱化發(fā)生于每個(gè)基因連接處，作為其結(jié)果MV病毒基因組上3'近端基因比連續(xù)的下游基因得到更多轉(zhuǎn)錄。其中每個(gè)基因是分開的順反子或轉(zhuǎn)錄單位一部分的MV病毒基因轉(zhuǎn)錄的模形式使得這些病毒非常適于外源基因的插入和表達(dá)。MV病毒基因組中的每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位包括以下元件3'-GS-開放讀框(ORF)-GE-5'。在所有MV病毒基因組的3'-和5‘-基因組末端具有短的未轉(zhuǎn)錄區(qū)域，分別稱為“前導(dǎo)序列”(約40-50nt)和“尾隨序列”(約20-600nt)。前導(dǎo)序列和尾隨序列是控制基因組RNA復(fù)制、病毒包裹和包裝必需的序列。反向遺傳學(xué)技術(shù)和傳染性MV病毒的拯救使得通過其cDNA拷貝來操縱其RNA基固組成為可能。這樣的技術(shù)在美國專利6，033，886中有涉及，在此將其全部引入作為參考。合成病毒RNA所需的最小復(fù)制啟動(dòng)復(fù)合物是核蛋白(RNP)復(fù)合物。可以通過(反)基因組RNA和來自(T7)RNA聚合酶驅(qū)動(dòng)質(zhì)粒的合適支持蛋白的胞內(nèi)共表達(dá)來拯救傳染性MV病毒?；诿绹鴮＠?，033，886中所述的實(shí)驗(yàn)方案(或略有改動(dòng))已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了許多MV病毒種的可靠恢復(fù)。新城疫是一種重要的家禽疾病，其可以引起全世界家禽工業(yè)的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。新城疫病毒是MV目內(nèi)的未分段的、負(fù)鏈RNA病毒。約15kb長的基因組含有六個(gè)基因，其編碼核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)(M)蛋白、融合(F)蛋白、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白和RNA-依賴性RNA聚合酶或大(L)蛋白。NDV基因以3‘-NP-P-M-F-HN-L-5‘的次序按序排列，并由不同長度的基因間區(qū)域隔開。所有基因最前為基因起始(GS)序列，其后為非編碼區(qū)域，編碼NDV蛋白的開放讀框，第二個(gè)非編碼區(qū)域和基因末端(GE)序列。NDV基因組的長度是六的倍數(shù)，這對于引入外源基因是必須考慮的。流感是狗、馬和貓的一種疾病，其特征在于溫和的呼吸道病征至嚴(yán)重的疾病，具有高死亡率。流感已經(jīng)成為狗和馬的地方病。犬流感疾病由H3N8流感病毒(CIV)引起，該病毒與馬H3N8病毒密切相關(guān)，并且所有狗都易受感染。大約80%暴露的狗產(chǎn)生臨床病征。病原體是屬于正粘病毒科的H3N8流感A病毒。犬和馬流感在2005年4月21日提交的美國專利申請60/673，443;2006年4月21日提交的11/409，416；2006年3月3日提交的60/779，080；2005年10月19日提交的60/728，449；2005年12月29日提交的60/754，881；2006年1月14日提交的60/759，162；和2006年1月23日提交的60/761，451；和2006年4月21日提交的國際專利申請PCT/US2006/015090(作為W006/116082公開)中有進(jìn)一步的討論，在此將其全部引入作為參考。貓流感在2006年10月25日以Lakshmanan等名稱提交的美國專利申請60/854，351中有進(jìn)一步的討論，在此將其全部引入作為參考。與單股負(fù)鏈病毒不同，流感A病毒含有八個(gè)負(fù)極性的基因組RNA片段，其編碼10個(gè)蛋白?；诒砻嫣堑鞍籽?HA)和神經(jīng)氨酸酶(N)的抗原性，將流感A病毒進(jìn)行亞分類。到目前為止，已知16種血凝素(H1-H16)和9種神經(jīng)氨酸酶(N1-N9)亞型。反向遺傳學(xué)技術(shù)和這樣的傳染性分段的負(fù)鏈RNA病毒如流感病毒的拯救使得通過cDNA拷貝來操縱這樣的RNA基因組成為可能。這樣的技術(shù)在美國專利6，544，785；6，649，372和6，951，754中有涉及，在此將其全部引入作為參考。這樣的技術(shù)在各種公開的美國專利申請中也有涉及，這些申請具有公開號(hào)2004/0142003；2003/035814；2006/0057116；2006/0134138；2005/0186563，在此也將其全部引入作為參考。已經(jīng)構(gòu)建了不同的表達(dá)外源基因的重組負(fù)鏈RNA病毒。已經(jīng)將嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥的S基因和呼吸道合胞病毒的F基因插入到NDV中，用于給予靈長類動(dòng)物。來自不同流感亞型的血凝素(HA)也已經(jīng)被插入到不同的載體病毒中。例如，已經(jīng)將編碼來自H5N2流感的HA的核酸插入到傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)中(Luschow等，Vaccine^4249-59，2001)；將來自H3N2流感的HA插入到牛瘟病毒中(Walsh等，J.Virol.74，10165-75，2000)；將來自H1N1的HA插入到水泡性口膜炎病毒(VSV)中(Roberts等，J.Virol.72,4704-11,1998)。還已經(jīng)將NDV用于源自H5N1、H5N2和H7N7流感亞型的血凝素(或血凝素衍生物)的表達(dá)(Ge,J.等，J.Virol81(1)150-8(2007)；Veits,J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(21)8197-202(2006)；Park,M.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(21)8203-8(2006))。已經(jīng)將流感A/WSN/33(H1N1)的血凝素基因插入到NDVHitchnerBl株的P和M基因之間。該重組體保護(hù)小鼠抵抗致命的感染，盡管在10天內(nèi)完全恢復(fù)的小鼠中存在可檢測的體重減輕(Nakaya等，J.Virol.75,11868-73,2001)0對外源基因具有相同插入位點(diǎn)的其他重組NDV表達(dá)了低致病性AIV的H7，但僅有40%接種疫苗的小雞受到保護(hù)而免受強(qiáng)毒NDV和高致病性AIV的侵害(Swayne等，AvianDis.￡7,1047-50，2003)。迄今，編碼流感基因的NDV病毒的用途受到限制，因?yàn)榱鞲谢蛟醋訦I-、H5-或H7-亞型流感A血凝素基因。此外，這類重組負(fù)鏈病毒的使用局限于并集中于家禽或靈長類動(dòng)物抵抗禽流感的保護(hù)。在在此所述的本發(fā)明之前，沒有公開過描述使用具有插入的流感A血凝素基因的重組NDV來保護(hù)馬、犬或貓免受流感侵害的工作。然而，因?yàn)楣贰ⅠR和貓易患流感，所以對這樣的可以用作流感疫苗基礎(chǔ)的構(gòu)建體存在需求。發(fā)明_既述本發(fā)明涉及含有重組單股負(fù)鏈病毒的免疫組合物，該重組單股負(fù)鏈病毒具有來自H3-型流感或H3N8流感的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及含有重組單股負(fù)鏈病毒的免疫組合物，該重組單股負(fù)鏈病毒具有來自犬流感的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及含有重組單股負(fù)鏈病毒的免疫組合物，該重組單股負(fù)鏈病毒具有來自馬流感的核苷酸序列。該單股負(fù)鏈病毒可以是NDV，并且該流感序列可以是血凝素序列。本發(fā)明還涉及保護(hù)犬抵抗呼吸道感染的方法，包括給予具有異源呼吸道病毒核苷酸序列的重組單股負(fù)鏈病毒。本發(fā)明還涉及保護(hù)貓抵抗呼吸道感染的方法，包括給予具有異源呼吸道病毒核苷酸序列的重組單股負(fù)鏈病毒。本發(fā)明還涉及保護(hù)馬抵抗呼吸道感染的方法，包括給予具有異源呼吸道病毒核苷酸序列的重組單股負(fù)鏈病毒。該序列可以是流感核苷酸序列。該序列可以是犬流感序列或馬流感序列。該序列可以是H3N8流感序列。該流感序列可以是血凝素流感序列。該重組單股負(fù)鏈病毒可以鼻內(nèi)給予。該重組單股負(fù)鏈病毒可以是重組NDV病毒。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及含有外源或異源基因的重組嵌合MV病毒載體。該外源基因可以是相同種的MV病毒載體的不同株?；蛘?，該外源基因可以來自非MV病毒載體的不同病毒種。更特別地，本發(fā)明涉及這樣的載體用于治療犬、貓或馬的呼吸道疾病的用途。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是含有來自H3N8流感的血凝素的重組新城疫病毒載體在保護(hù)或治療犬、馬或貓抵抗流感中的用途。犬、馬和貓易受H3-、N8-和H3N8-亞型流感A病毒感染。此外，犬、馬和/或貓易受H5-、Ni-,H5N1-,H3-、N8-、H3N8-、H7-、N7-和/或H7N7-亞型流感A病毒感染。因?yàn)榱鞲蠬和N蛋白的抗體在體液免疫應(yīng)答中是重要的并且抑制感染或防止疾病，所以根據(jù)本發(fā)明的疫苗及其用途可以基于上述流感A病毒亞型的一種或多種。用于制備這樣的帶有額外的含有外源基因的轉(zhuǎn)錄單位的重組嵌合MV病毒載體的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，2007年3月15日以R6mer-0berdorfer等的名稱提交的國際專利申請PCT/US07/64046和2006年3月15日以R6mer_0berdorfer等的相同姓名提交的美國專利申請60/783，194(在此將這兩篇全部引入作為參考)描述了怎樣制備這樣的包括額外的具有外源基因的轉(zhuǎn)錄單位的重組嵌合MV病毒載體。這些專利申請涉及描述了對于各種MV病毒種制備這樣的重組載體病毒的文件。原則上，該用于制備用于本發(fā)明中的這樣的重組嵌合MV病毒載體的方法與現(xiàn)有技術(shù)中的方法相同。待插入到MV病毒基因組中的外源基因兩側(cè)可以為合適的3'-和5'-非編碼區(qū)，如國際專利申請PCT/US07/64046和美國專利申請60/783，194中所限定的。國際專利申請PCT/US07/64046和美國專利申請60/783，194描述了在含有插入到MV病毒基因組中的外源基因的轉(zhuǎn)錄單位中MV病毒基因的3'-和5'非編碼區(qū)的存在怎樣對該外源基因的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)具有積極作用。這些專利申請中顯示了將GS序列與禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因之間以及AIVHA基因與GE序列之間的MV病毒基因的非編碼區(qū)工程化使由帶有AIVHA基因的MV病毒載體合成的HAmRNA的量增加。這些專利申請還顯示了對該外源(或異源)基因的蛋白表達(dá)水平的積極作用。因此，可以構(gòu)建用于根據(jù)本發(fā)明的用途的重組MV病毒載體，使得如這些專利申請中所述的非編碼區(qū)在該外源基因的兩側(cè)。因此，可以構(gòu)建用于本發(fā)明方法中的重組、嵌合MV載體，使得含有該外源基因的另外的轉(zhuǎn)錄單位與上游MV病毒基因起始(GS)序列和下游MV病毒基因末端(GE)序列可操作地連接。在GS序列與外源基因的起始密碼子之間，可以定位MV病毒基因的3'非編碼區(qū)(基因組意義)。在外源基因的終止密碼子與GE序列之間可以定位MV病毒基因的5'非編碼區(qū)(基因組意義)。非編碼區(qū)可以是編碼MV病毒包膜蛋白，特別是M、G、F或HN蛋白，或RNP蛋白，特別地，N、P或L蛋白的基因。在本發(fā)明中可以用作轉(zhuǎn)錄控制序列的GS和GE序列優(yōu)選是源自MV病毒天然基因的那些。不限于以下的理論，認(rèn)為這些序列在轉(zhuǎn)錄過程中調(diào)節(jié)RNA聚合酶的活性，特別是在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和mRNA5'末端修飾的過程中以及在轉(zhuǎn)錄3'末端多腺苷酸化和終止的控制中。MV病毒的基因組組構(gòu)的詳細(xì)信息是本領(lǐng)域已知的，包括各種MV病毒基因的核苷酸序列及其轉(zhuǎn)錄控制(GS和GE)序列和該基因兩側(cè)的非編碼序列。這樣的信息例如可從美國衛(wèi)生和服務(wù)部的國家醫(yī)學(xué)中心的國家健康庫的生物技術(shù)信心互聯(lián)網(wǎng)站上獲得。國際專利申請PCT/US07/64046和美國專利申請60/783，194中提供了這些序列中的一些，在此將其全部引入作為參考?？梢酝ㄟ^將分離的核酸分子插入到MV病毒的基因組中來制備用于本發(fā)明中的重組、嵌合MV病毒載體，該分離的核酸分子包含(i)兩側(cè)為如上所述的3'-和5'-非編碼區(qū)的外源基因和(ii)合適的轉(zhuǎn)錄控制序列，使得在所形成的MV病毒載體中，外源基因之前和之后都為MV病毒基因連接，特別是包含GE-IGR-GS元件的基因組核苷酸序列片段。這樣的上游和下游元件的存在不僅確保了插入的外源基因的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄，而且還確保了位于插入的外源基因的上游和下游的MV病毒基因的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄?？梢砸云鋍DNA形式(+義)在遺傳上操縱分離的核酸分子和MV病毒的基因組。這使得易于操縱所需的核酸分子并將其插入病毒基因組中?；蚪M的各個(gè)部分可以用于外源基因在兩個(gè)基因之間的插入，即，在基因間區(qū)域(IGR)中、基因的3'或5'非編碼區(qū)以及基因組的3'啟動(dòng)子近端(在N/NP基因之前)或5'遠(yuǎn)端(在L基因之后)。有利地，在NP基因之前、在NP和P基因之間、在P和M基因之間、在M和F基因之間、在F和HN基因之間、在HN和L基因之間或在L基因之后插入外源基因。這樣的轉(zhuǎn)錄盒的制備以及將其插入到MV病毒基因組中只涉及常規(guī)的分子生物技術(shù)，如國際專利申請PCT/US07/64046和美國專利申請60/783，194中例舉的。特別地，如定點(diǎn)誘變和PCR誘變這樣的技術(shù)可以用于該目的。更特別地，可以通過沿用已久的“反向遺傳學(xué)”方法來制備根據(jù)本發(fā)明的重組MV病毒載體，該方法能夠?qū)V目的未分段的、負(fù)鏈RNA病毒進(jìn)行遺傳修飾，如美國專利6，033，886中所述的，在此將其全部引入作為參考。在該方法中，在足以允許MV(反)基因組和支持蛋白的轉(zhuǎn)錄和共同表達(dá)以及重組MV載體產(chǎn)生的條件下，通過含有包括編碼全長基因組或優(yōu)選MV病毒的反基因組(正義)的核苷酸序列的cDNA分子的載體和一個(gè)或多個(gè)含有包括編碼所需支持蛋白的核苷酸序列(即，用于表達(dá)可以形成核蛋白復(fù)合物的功能性病毒RNA依賴性RNA聚合酶)的cDNA分子的載體共同轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞。在該方法中，如上所述，編碼全長MV病毒(反)基因組的核酸分子含有另外的轉(zhuǎn)錄單位。用于表達(dá)病毒聚合酶或用于制備基因組RNA的載體的非限制性實(shí)例包括質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，可以將另一個(gè)DNA片段與其連接，使得產(chǎn)生所連接的DNA片段在用該載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中復(fù)制及其轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。對于合適的支持蛋白的胞內(nèi)表達(dá)，優(yōu)選使用含有編碼這些蛋白的cDNA序列的質(zhì)粒，在合適的表達(dá)控制序列，如，T7聚合酶啟動(dòng)子的控制下。優(yōu)選，用于全長基因組轉(zhuǎn)錄的載體是含有編碼MV病毒的(反)基因組的cDNA序列的質(zhì)粒，在其兩側(cè)的序列如下5'端為T7聚合酶啟動(dòng)子，3'端為(肝炎5)核酶序列，盡管也可以使用T3或SP6RNA聚合酶啟動(dòng)子。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用編碼MV病毒的N(或NP)、P和L蛋白的表達(dá)質(zhì)粒來制備用于根據(jù)本發(fā)明的用途的重組MV病毒載體。用于該反向遺傳學(xué)技術(shù)中的轉(zhuǎn)染的支持質(zhì)粒的量或比例可以涵蓋一個(gè)寬泛的范圍。用于支持質(zhì)粒的比例NPL可以為約20101至112，并且對于每種病毒的有效轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)方案是本領(lǐng)域已知的。通過T7RNA聚合酶啟動(dòng)子和核酶序列的聯(lián)合作用，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中制備基因組RNA的精確拷貝，并且隨后通過由共同轉(zhuǎn)染的表達(dá)質(zhì)粒提供的病毒支持蛋白來包裝和復(fù)制該RNA?？梢酝ㄟ^感染轉(zhuǎn)染細(xì)胞的重組牛痘病毒，特別是通過牛痘病毒VTF7-3來提供T7聚合酶，以及還有其他的重組痘載體，如雞痘病毒，例如fpEFLT7pol，或其他病毒載體也可以用于T7RNA聚合酶的表達(dá)。通過簡單的物理技術(shù)，如過濾，可以容易地完成從牛痘病毒中分離出拯救的病毒。也可以通過在孵化蛋中接種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液來實(shí)現(xiàn)NDV的拯救?；蛘?，可以將細(xì)胞系用于組成型表達(dá)(T7)RNA聚合酶和/或一個(gè)或多個(gè)所需支持蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染。此外，關(guān)于在此用于制備根據(jù)本發(fā)明的MV病毒的反向遺傳學(xué)技術(shù)的更多詳細(xì)信息公開于美國專利6，033，886中，在此將其全部引入作為參考。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了重組MV病毒載體，其中MV病毒是表達(dá)來自犬、馬或貓流感的抗原的重組新城疫病毒(NDV)。犬、馬或貓流感可以是H3N8-亞型流感A。用于NDV遺傳操縱的一般反向遺傳學(xué)方法之前已經(jīng)公開于美國專利6，146，642,6,451，323和6，719，979中，在此將其全部引入作為參考。有利地，可以將外源基因在各個(gè)位置引入到NDV基因組中，如以上對于MV病毒概述的。特別地，在根據(jù)本發(fā)明的重組NDV載體中，可以將外源基因(作為合適的轉(zhuǎn)錄單位的一部分)插入到以下的NDV基因之間在NP和P基因之間、在P和M基因之間、在M和F基因之間、在F和HN基因之間、在HN和L基因之間以及在3'近端-和5'遠(yuǎn)端基因座，如在3'近端、P-M、M-F和F-HN片段中。此外，在根據(jù)本發(fā)明的重組NDV載體中，在外源基因側(cè)翼的非編碼區(qū)可以源自全部天然產(chǎn)生的NDV基因，特別是來自N、P、M、F或HN基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組NDV載體突變體包含流感A病毒，優(yōu)選是犬、馬或貓流感病毒，更優(yōu)選是H3、N8或H3N8流感病毒的血凝素(HA)基因。用于根據(jù)本發(fā)明的重組MV病毒載體中的外源基因的其他實(shí)例包括血凝素或神經(jīng)氨酸酶基因或H3N8-、H7N7-或H5m-亞型流感A型種的任何其他基因。MV載體病毒可以是減毒的，換句話說，該載體病毒對于靶動(dòng)物不是致病性的或與野生型病毒相比呈現(xiàn)出毒力的實(shí)質(zhì)性降低。例如，NDV病毒在犬、馬和貓?bào)w內(nèi)只有有限的復(fù)制；并且在暴露于NDV病毒時(shí)，犬沒有表現(xiàn)出臨床癥狀。此外，存在常規(guī)的技術(shù)來獲得和篩選顯示出有效的復(fù)制或感染潛能的減毒病毒。這樣的技術(shù)包括在異源基質(zhì)中將病毒連續(xù)(冷)傳代和化學(xué)誘變。這樣的病毒描述于美國專利6，177，082；6,398，774；6,482，414；6，579，528；7,029，903和7，074，414中，在此將其全部引入作為參考。根據(jù)本發(fā)明的重組NDV載體可以源自任何常規(guī)的ND疫苗株。這樣合適的NDV株的非限制性實(shí)例是存在于可購得的NDV疫苗中的那些，如克隆30株(在Combovac-30vaccine,IntervetInc.,Millsboro,Delaware中可獲得),LaSota株，HitchnerB1株，NDW株，C2株和AV4株。根據(jù)本發(fā)明的重組MV病毒載體能夠在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫應(yīng)答。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了針對病毒、微生物或寄生病原體的疫苗，其含有活的或滅活形式的如上限定的重組MV病毒載體和藥物學(xué)上可接受的載體或稀釋劑?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法，如通常用于可購得的活-和滅活MV病毒疫苗的那些，來制備根據(jù)本發(fā)明的疫苗。可以用重組MV病毒載體接種易感基質(zhì)并傳代，直至病毒復(fù)制至所需的滴定度，此后收集含有病毒的材料。隨后，將收集的材料配制成具有免疫特性的藥物制劑。能夠支持重組MV病毒載體復(fù)制的任何基質(zhì)都可以用于本發(fā)明中。作為基質(zhì)，根據(jù)MV病毒，可以使用來自原核生物和真核生物來源的宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞可以是脊椎動(dòng)物的，例如，靈長類動(dòng)物細(xì)胞。合適的實(shí)例是人細(xì)胞系HEK、WI-38、MRC-5或H-239、猿細(xì)胞系Vero、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系CH0、BHK、犬細(xì)胞系MDCK或禽CEF或CEK細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的重組NDV載體可以在其上繁殖的特別合適的基質(zhì)是SPF孵化蛋。例如，可以用0.2ml含有NDV的尿囊液接種孵化蛋，尿囊液含有至少102_°EID5(1/蛋。優(yōu)選，用約105_°EID5(i接種9-至11-天大的孵化蛋，并隨后在37°C下孵育2-4天。在2_4天后，優(yōu)選通過收集尿囊液來收集ND病毒產(chǎn)物。此后將流體在2500g下離心10分鐘，接著將上清液通過濾器(100um)過濾。根據(jù)本發(fā)明的疫苗含有重組MV病毒載體和藥物學(xué)上可接受的通常用于這樣的組合物的載體或稀釋劑?？梢灾苽浜谢畈《镜囊呙绮⒁詰腋∫盒问交騼龈尚问戒N售。載體包括穩(wěn)定劑、防腐劑和緩沖劑。稀釋劑包括水、含水緩沖液和多元醇。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了含有滅活形式的重組MV病毒載體的疫苗。滅活疫苗的主要優(yōu)點(diǎn)是其安全性和可以誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間長的高水平保護(hù)性抗體。在繁殖步驟之后所收集病毒滅活的目的是消除病毒的繁殖。通常，這可以通過公知的化學(xué)或物理方式來實(shí)現(xiàn)。如果需要，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以含有佐劑。對于該目的具有佐劑活性的合適化合物和組合物的實(shí)例是氫氧化鋁、磷酸鋁或氧化鋁、基于例如礦物油或植物油如維生素E醋酸酯和皂苷的水包油型或油包水型乳液。將疫苗給予受試者導(dǎo)致刺激了受試哺乳動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答。可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來實(shí)現(xiàn)將疫苗給予哺乳動(dòng)物靶的途徑。這樣的方法包括，但不限于，皮內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、非腸道、鼻內(nèi)、口服、口鼻和皮下，以及吸入、栓劑或經(jīng)皮?？梢酝ㄟ^任何裝置來給予疫苗，這些裝置包括但不限于注射器、霧化器、彌霧機(jī)、噴霧器、無針注射裝置，或微彈轟擊基因槍(Balistic轟擊)。優(yōu)選通過通常用于NDV疫苗接種的相同廉價(jià)的優(yōu)勢噴射技術(shù)來給予用于根據(jù)本發(fā)明使用的重組NDV載體疫苗。對于NDV疫苗接種，這些技術(shù)包括飲水和噴霧疫苗接種。根據(jù)本發(fā)明的疫苗施用于靶哺乳動(dòng)物的方案可以是單劑量或多劑量，可以同時(shí)或按序給予，以與劑量和制劑相容的方式，并且這樣的量將是免疫有效的。根據(jù)本發(fā)明的疫苗含有有效劑量的重組MV病毒載體作為活性成分，S卩，將在接種疫苗的犬、貓或馬體內(nèi)誘導(dǎo)免疫力的免疫M(jìn)V病毒材料的量，該免疫針對由毒性病毒或微生物或寄生生物體引起的激發(fā)。在此將免疫力限定為在接種疫苗后與未接種組相比，在動(dòng)物群中誘導(dǎo)了明顯較高水平的針對死亡率和臨床癥狀的保護(hù)。特別地，根據(jù)本發(fā)明的疫苗預(yù)防較大比例的接種疫苗的動(dòng)物，以抵抗疾病的臨床癥狀和死亡率的發(fā)生。通常，可以給予劑量為102_°-108_°組構(gòu)培養(yǎng)物/胚感染劑量(TC/EID5(I)，優(yōu)選劑量為104_°-107_°TC/EID5(I的活疫苗。滅活的疫苗可以含有104_°-109_°TC/EID5(I的抗原等價(jià)物。本發(fā)明還包括聯(lián)合疫苗，其除了含有根據(jù)本發(fā)明的重組MV病毒載體以外，還含有能夠誘導(dǎo)抵抗其他病原體的保護(hù)的疫苗。因此，可以將根據(jù)本發(fā)明的重組MV病毒載體配制于含有一種或多種額外免疫原的疫苗中。額外的免疫活性成分可以是整個(gè)寄生物、細(xì)菌或病毒(滅活或修飾的活的)或其分級分離部分或提取物(例如，蛋白、脂質(zhì)、脂多糖、碳水化合物或核酸)。在根據(jù)本發(fā)明的重組MV病毒載體用于犬疫苗中的情況下，可以將其他犬病原體的抗原加入到制劑中?？梢约尤氲牧硗獾目乖钠渌≡w的非限制性實(shí)例包括支氣管炎博德特氏菌(Bordetellabronchis印tica)、由犬瘟熱病毒(CDV)引起的犬瘟熱、由犬腺病毒1型(CAV-I)病毒引起的傳染性犬肝炎(ICH)、由犬腺病毒2型(CAV-2)病毒引起的呼吸道疾病、由犬副流感病毒(CPI)引起的犬副流感、由犬冠狀病毒(CCV)和犬細(xì)小病毒(CPV)引起的腸炎、麻疹病毒、和由下列鉤端螺旋體引起的鉤端螺旋體病布拉迪斯拉發(fā)鉤^MilJiE#(Leptospirabr;atisl;av;a)、|、π^(@||#Λ[青M(Leptospirainterrogansserovarcanicola)>^^μ^ΜΙΦHjilJtlfiifiliRM(Leptospirainterrogansserovaricterohaemorrhagiae)、fn]^Φ^Μ^ΜΦ^JJtiiTii^ifiliRM(Leptospirainterrogansserovarbratis1ava)、問號(hào)鉤端電累方寵體波莫納ifili青型(Leptospirainterrogansserovarpomona)、問號(hào)鉤端螺方寵體流感傷寒血清型(Leptospirainterrogansserovargrippotyphosa)、出血性黃痕鉤端螺旋體(Leptospiraicterohaemorrhagiae)或波蒙納鉤端螺旋體(Leptospirapomona)、狂犬病病毒、犬肝簇蟲Ofepatozooncanis)和布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)、犬輪狀病毒(CRV)、犬皰疹病毒(CHV)、犬細(xì)小病毒(MVC)、賈第鞭毛蟲屬(Giardia)種和杜氏利什曼蟲(Leishmaniadonovani)-復(fù)合物。在根據(jù)本發(fā)明的重組MV病毒載體用于馬疫苗中的情況下，可以將其他馬病原體的抗原加入到制劑中。可以加入的另外的抗原的其他病原體的非限制性實(shí)例包括東方腦炎病毒、西方腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉腦炎病毒、1型馬皰疹病毒、4型馬皰疹病毒、馬流感病毒(例如，KY93/A2、KY02/A2和NM/2/93/A2)、西尼羅河病毒、鼻肺炎病毒、狂犬病病毒、馬鏈球菌(Streptococcusequi)、梭狀芽孢桿菌屬種(例如，肉毒梭狀芽孢桿菌(C.botulinum)、里氏埃里希氏體(Ehrlichiaristicii)lif(Ε·coli)、馬紅球菌(Rhodococcusequi)、輪狀病毒、沙門氏菌屬種、Sarcocystisneurona和破傷風(fēng)類毒素部分。在根據(jù)本發(fā)明的重組MV病毒載體用于貓疫苗中的情況下，可以將其他貓病原體的抗原加入到制劑中。可以加入的另外的抗原的其他病原體的非限制性實(shí)例包括鼻氣管炎病毒、卡里西病毒、全白細(xì)胞減少病毒、衣原體(包括鸚鵡熱衣原體)、支氣管炎博德特氏菌、賈第鞭毛蟲屬種、貓免疫缺陷病毒、貓白血病病毒或狂犬病病毒?；蛘?，基于根據(jù)本發(fā)明的重組MV的疫苗可以與其他的活的或滅活的疫苗同時(shí)或伴隨給予。提供了以下實(shí)施例僅用于說明的目的，并且并非旨在以任何方式來限制本發(fā)明的范圍。以下所述的實(shí)施例顯示了通過鼻內(nèi)或SC途徑給狗接種疫苗后表達(dá)H3N8流感病毒的HA基因的重組NDV的功效。實(shí)施例實(shí)施例1.表達(dá)犬流感血凝素基因的重組NDV的構(gòu)建A.編碼流感血凝素(HA)的DNA的制備使用AccessRT-PCR系統(tǒng)試劑盒(PromegaCorporation,Madison,WI)通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲得流感ha插入片段。在Robocycler微處理器控制的機(jī)器人溫度循環(huán)器上(Stratagene，SantaClara，加利福尼亞)，使用來自試劑盒的TflDNA聚合酶，使用病毒分離物A/犬/Jacksonville/05(也稱為犬/Jax/05，保藏號(hào)PTA-7941，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),10801UniversityBlvd,Manassas,VA20110-2209)，使用血凝素特異性引物(5'-acggcaatcgATGAAGACAACCATTATTTTGA-3')和(5'-acggcagcgcgcTCAAATGCAAATGTTGCATC-3‘)來擴(kuò)增HA插入片段。在電泳凝膠上將擴(kuò)增的HA序列與PCR混合物的其他成分分開并分離。根據(jù)載體試劑盒的制造商的說明，將純化的HA序列克隆至pCRII-T0P0中(Invitrogen，Carlsbad,加利福尼亞)。所得到的質(zhì)粒pCRII:CB1含有擴(kuò)增的流感HA序列。用Big-Dye終止子循環(huán)測序(AppliedBiosystems,FosterCity，加利福尼亞)來證實(shí)血凝素序列，并使用AppliedBiosystems3100-AvantCapillary測序儀來分析。B.將流感HA基因序列克隆至中間體質(zhì)粒中首先從pCRII:CBl中切除HA基因序列并亞克隆至中間體質(zhì)粒pM3E中。之前已經(jīng)描述了重組PM3E中間體質(zhì)粒的產(chǎn)生(Engel-Herbert，I.等，“CharacterizationofarecombinantNewcastlediseasevirusexpressingthegreenfluorescentprotein，，(表達(dá)綠色熒光蛋白的重組新城疫病毒的表征)，J.Virol.Methods.10819-28(2003))。簡而言之，pM3E源自基于疫苗株克隆-30的全長cDNA克隆(以下將更詳細(xì)地描述)。用DNA聚合酶I(Klenow)處理后，將含有從nt5233至nt6559的NDV序列的DraI-NheI片段克隆至pUC18的Smal位點(diǎn)中(GenScriptCorporation，Piscataway，NJ)。然M，il!ffl弓L5'-gagagttaagaaaaaactaccgttaattaatgaccaaaggacg-3',ifiii/^^i^^j將F和HN基因之間的基因間區(qū)域(igr)(位于nt6290至nt6320)進(jìn)行修飾以在nt位置6300(6296-6303)含有PacI-限制位點(diǎn)。將所得到的質(zhì)粒命名為pMIE。使用PshAI-位點(diǎn)進(jìn)行克隆-30的F-NHigr與含有PacI-位點(diǎn)的新igr的交換。在pMIE的PacI消化后，引入轉(zhuǎn)錄起始和終止信號(hào)，含有合成的基因起始(GS)和基因終止(GE)信號(hào)的兩個(gè)互補(bǔ)寡核—(5‘-cgattaattaaacgggtagaagcgatcgcacgcgttaagaaaaaattaattaacag^P5‘—ctgttaattaattttttcttaacgcgtgcgatcgcttctacccgtttaattaatcg(具有PacI-和MluI-steds),以產(chǎn)生質(zhì)粒pM3E。制備pM3E用于通過MluI消化的血凝素插入，用Klenow酶平整末端，并凝膠純化，接著用小牛腸堿性磷酸酶脫磷酸。為準(zhǔn)備插入到PM3E中，通過用SpeI的消化和ClaI的部分消化來切除血凝素基因，用Klenow酶平整末端，并切除所得到的1.7kb片段并純化。將制得的編碼DNA的血凝素克隆到制得的pM3E中間體載體中，以產(chǎn)生中間體重組質(zhì)粒M3E:CI。C.將流感HA基因序列克隆至克隆30cDNA中NDV克隆30株在Combovac-30疫苗中可購得(IntervetInc.，Millsboro，特拉華)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知從該可購得的病毒中分離RNA并產(chǎn)生NDV克隆30株的全長cDNA克隆的方法。之前已經(jīng)描述了這樣的全長cDNA克隆的構(gòu)建。參見R6mer-0berd6rfer,A.等,"GenerationofrecombinantlentogenicNewcastlediseasevirusfromclonedcDNA”(從克隆的cDNA產(chǎn)生重組弱毒新城疫病毒)，J.Gen.Vir.80=2987-2995(1999)。簡而言之，NDV株克隆-30的cDNA合成和全長克隆的裝配如下。NDV株克隆30是源自LaSota的弱毒NDV株的疫苗株，并可從Intervetlnc.，Millsboro，特拉華獲得。從50ml具有101Q蛋感染劑量(EID5C1)/ml滴定度的尿囊液中純化NDV株克隆-30。將尿囊液澄清后，通過超離心將NDV沉淀(1.5小時(shí)，4°C，150000g)，并且通過異硫氰酸胍提取和隨后通過CsCl襯墊的離心來分離病毒RNA。通過兩個(gè)特異性引發(fā)的cDNA合成酶來產(chǎn)生cDNA至基因組RNA(第一鏈反應(yīng)，TimeSavecDNA合成試劑盒，Pharmacia)，使用引物對P1F(歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室-歐洲生物信息研究院(EMBL-EBI)保藏號(hào)Y18898D克隆-30ntl-21)和P5F(克隆-30nt8326-8346)。使用SuperScriptIIRNaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco-BRL)，使用引物P7F(克隆30nt12736-12754)來進(jìn)行第三個(gè)第一鏈反應(yīng)。隨后，用2單位RNaseH(Biozym)在37°C下將反應(yīng)混合物培養(yǎng)20分鐘。熱滅活(5分鐘，70°C)后，通過苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀來純化第一鏈cDNA。將每個(gè)第一鏈cDNA重新溶解于總的20u1H20中。隨后，使用擴(kuò)大高保真(HF)PCR系統(tǒng)(BoehringerMannheim)對1yl第一鏈cDNA進(jìn)行PCR，使用引物對P2FMluI(5'-TGTGAATCACGCGTGCGAGCCCGA-3‘，克隆-30nt68-91，帶下劃線的是Mlul位點(diǎn)，粗體的是不同于克隆-30共有序列的nt)和P3R(5'-GACAAGCGGAAGAGCCATGCAAACTTGGCTGTG-3‘，克隆-30nt8911_8890，合成的含有下劃線表示的Sapl限制位點(diǎn)的適配子，和斜體的其他核苷酸)，以獲得片段m(克隆-30nt1-8911)，和使用引物對P5F(克隆-30nt8326-8346)和P6R(克隆-30nt12919-12900)，用于產(chǎn)生片段N2(克隆-30nt8326-12919)。使用引物對P7F(克隆-30nt12736-12754)和P8RMlul(5'GTATAATTAAATCAACGCGTATACAA3‘，BeaudetteCnt15058-15033；帶下劃線的是Mlul位點(diǎn)，粗體是不同于克隆-30共有序列的nt)從之前通過RT-PCR獲得的克隆NDV片段(nt12736-15073)通過HF-PCR產(chǎn)生片段N3(克隆-30ntl2736_15058)。如Mundt，E.等，Virology20910-18(1995)中所述的，使用5'-RACE實(shí)驗(yàn)方案(GibcoBRL)通過RNA的多核苷酸化以及3'端的擴(kuò)增和5'端的擴(kuò)增來測定基因組RNA的末端序列。推論出特定的寡核苷酸通過HF-PCR來擴(kuò)增包括前導(dǎo)序列和尾隨序列的PCR片段，其各自使用引物P4FT7(5‘CTGAAGCTTGTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAGAGAATCCGTAAG3'，帶下劃線的是Hindlll位點(diǎn)，粗體的是T7啟動(dòng)子和三個(gè)另外的G殘基，克隆-30nt1-21)和P2RMluI(5'TCGGGCTCGCACGCGTGATTCACACCT3‘，克隆-30nt91-65)，與P8FMluI(5'TTGTATACGCGTTGATTTTATCATATTATG3‘，克隆-30ntl5033_15062)和P9R(5'TACTGCAGGGAAGACGTACCAAACAAAGATTTGGTGAA3'，斜體是合成的適配子，含有下劃線表示的PstI/BbsI限制位點(diǎn)，克隆-30nt15186-15166)，通過五個(gè)核苷酸(粗體)(克隆-30nt76T至A，nt79A至C，nt15039T至A，nt15041T至G和nt15042T至C)的突變引入兩個(gè)人造Mlul位點(diǎn)(帶下劃線的，nt76，1NP基因非編碼區(qū)，和nt15039，L基因非編碼區(qū))。在多步驟克隆程序中，使用天然產(chǎn)生的限制位點(diǎn)和人造Mlul位點(diǎn)，從上述克隆的PCR片段，在pX8STSmaI位點(diǎn)裝配完整的NDV反基因組表達(dá)質(zhì)粒(pflNDV-1)，如Schnell等中所述的，EMBOJ.134195-4203(1994)。通過PacI消化切除側(cè)翼為NDV轉(zhuǎn)錄起始和終止信號(hào)(M3E:CI)的血凝素基因并連接至含有唯一的PacI位點(diǎn)的NDV株克隆-30的全長克隆中，形成全長克隆NDV:CI。D.將NDV:CI轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并收集重組NDV如之前Romer-Oberdorfer,A.等在“GenerationofrecombinantlentogenicNewcastlediseasevirusfromclonedcDNA，，(從克隆的cDNA產(chǎn)生重組弱毒新城疫病毒)，J.Gen.Vir.80=2987-2995(1999)中所述的，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。簡而言之，使用BHK21細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)噬菌體T7RNA聚合酶的克隆BSRT7/5進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，如Buchholz，U.J.等，J.Virol.73(1)=251-9(1999)中所述的。將細(xì)胞在32mm直徑的培養(yǎng)皿中生長至70%匯合，并用總量為20iig的DNA轉(zhuǎn)染(5iigNPDNA,2.5ugPDNA,2.5ugLDNA和10iig全長DNA)(MirusTransIT轉(zhuǎn)染試劑盒，MirusCorporation,Madison,WI)。轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中48至72小時(shí)后，收集上清液。通過低速離心澄清細(xì)胞碎片后，將700u1體積的上清液接種10天大的含胚SPF雞蛋的尿囊腔中。將約200u1接種體積的尿囊液用于隨后的蛋傳代中。在第二次72小時(shí)蛋傳代后，用收集的尿樣液，使用5%雞紅血球進(jìn)行血凝素測試。將HA陽性尿囊液用于進(jìn)一步的蛋傳代。E.重組NDV中H3N8流感血凝素表達(dá)的證實(shí)免疫熒光測定(IFA)實(shí)驗(yàn)在補(bǔ)充了5%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)幼倉鼠腎細(xì)胞(BSR細(xì)胞)。用0.5-2iU從每個(gè)傳代16-24小時(shí)的蛋中收集的尿囊液感染細(xì)胞，接著用100%乙醇固定。使用針對F蛋白的單克隆抗體NDV-57和FITC-綴合的山羊抗-鼠IgG(Kirkegaard禾口PerryLaboratoriesInc.,Gaithersburg,Maryland)測試NDV抗原的存在。使用獲自用A/犬/佛羅里達(dá)/242/2003犬流感病毒分離物(保藏號(hào)PTA-7915，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd,Manassas,VA20110-2209)激發(fā)的狗的恢復(fù)期血清和FITC-綴合的山羊抗-狗IgG(Kirkegaard和PerryLaboratorieslnc.，Gaithersburg，Maryland)來測定犬H3N8流感病毒的血凝素的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡分析通過受感染尿囊液的超離心來收集重組和親本新城疫病毒。從用于產(chǎn)生多克隆抗血清的儲(chǔ)液中獲得犬流感病毒(A/犬/佛羅里達(dá)/242/2003)。使用抗-NP單克隆NDV-36和HRP-綴合的山羊抗-鼠IgG(Kirkegaard和PerryLaboratoriesInc.，Gaithersburg,Maryland)在蛋白質(zhì)印跡中檢測重組和親本新城疫病毒，并且使用抗-病毒狗多克隆和HRP-綴合的山羊抗-狗IgG(Kirkegaard和PerryLaboratoriesInc.，Gaithersburg，Maryland)在蛋白質(zhì)印跡中檢測犬流感抗原。實(shí)施例2.犬流感疫苗功效研究在以下的研究中，研究了保護(hù)犬針對呼吸道感染的方法，其包括給予具有異源呼吸道病毒核苷酸序列的重組單股負(fù)鏈病毒。將重組病毒在蛋中傳代總共七次，并收集尿囊液。通過將200U110-倍連續(xù)稀釋的P7尿囊液接種于10個(gè)含胚的10天大的蛋/稀釋度中來測定EID5(i滴定度。接種5天后，測試尿囊液的凝聚。計(jì)算EID5(I滴定度。通過將尿囊液在無菌磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋10-倍至合適的108病毒粒/ml的滴定度來制備疫苗，等分并冷凍。每個(gè)劑量的疫苗含有108EID5(1并加入充足的PBS，使總劑量體積為1ml。該研究中使用了15只1歲+大的雌性小獵犬。將小獵犬隨機(jī)分成三組(表2)。給所有狗喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)生長膳食，并隨意飲水。表2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>第1組中的狗以4周的間隔通過皮下途徑接受了兩劑表達(dá)犬流感血凝素的重組新城疫病毒。第2組中的狗以4周的間隔通過鼻內(nèi)途徑接受了兩劑表達(dá)犬流感血凝素的重組新城疫病毒。第3組中的狗用作激發(fā)對照動(dòng)物來測定流感病毒激發(fā)后的臨床病征。在激發(fā)前七天，將狗轉(zhuǎn)移至BSL-2研究室并在單獨(dú)的籠子中圈養(yǎng)。在第二次疫苗接種后2周時(shí)，用毒性犬流感病毒(A/犬/佛羅里達(dá)/242/2003/狗的1072TCID5(I)通過口鼻激發(fā)所有接種的和對照的狗。使用噴霧器將激發(fā)病毒作為薄霧(2ml/狗)來給予。在激發(fā)給藥后，觀察狗的流感相關(guān)臨床病征14天。從-1天(即，激發(fā)前一天)至激發(fā)后第14天，每日將鼻和口咽擦拭物收集至含有2ml病毒轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)的試管中，用于病毒分離。在激發(fā)后觀察過程中觀察到的臨床體征顯示于表3中。在第一次接種疫苗那天，激發(fā)那天和激發(fā)后14天，從所有狗中收集血清樣品，以使用H3N8馬流感病毒標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案(SupplementalAssayMethod(SAM)#124,CenterforVeterinaryBiologies(CVB),U.S.Dept.ofAgriculture(USDA),Ames,IA)測定HI滴定度。結(jié)果第1組中的所有狗(皮下，SC)產(chǎn)生了應(yīng)答皮下給予疫苗構(gòu)建體的HI抗體滴定度。第2和第3組中狗在激發(fā)之前沒有產(chǎn)生任何針對HI滴定的滴定度(表4)。所有狗產(chǎn)生了應(yīng)答激發(fā)的提高的HI抗體滴定度，屬于第1組的平均滴定度最高。所有組中的狗呈現(xiàn)出一個(gè)或多個(gè)以下的犬流感臨床癥狀發(fā)熱(彡103.0°F；彡39.4°C)，咳嗽，流涕，眼睛和鼻子分泌，嘔吐和食欲不振。然而，狗的數(shù)量和癥狀發(fā)生的數(shù)量在組之間差異很大(表5)。與第1組接種疫苗的和第3組對照相比時(shí)，通過鼻內(nèi)接受了重組疫苗的狗(第2組)具有明顯更溫和和更短的流感相關(guān)臨床病征持續(xù)時(shí)間(表5)。病毒分離結(jié)果顯示于表6中。毒性犬流感病毒激發(fā)后，從第1組(NDV:CISC)的5只狗中的5只(100%)，第2組(NDV-CIIN)的5只狗中的3只(60%)和第3組(對照)的5只狗中的5只(100%)的鼻擦拭物中分離出犬流感病毒。從第1組和第3組(各自為NDV:CISC和對照)的5只狗中的2只(40%)，第2組的5只狗中的0只(0%)的口咽擦拭物中分離出犬流感病毒。重組疫苗的鼻內(nèi)給藥證明了與未接種疫苗的對照組相比，口和鼻分泌途徑中病毒流出整體降低了40%(表6)。15結(jié)論來自該研究的結(jié)果證明(1)具有異源呼吸道病毒核苷酸序列(該實(shí)例中為H3)的重組單股負(fù)鏈病毒(該實(shí)例中為NDV)可以作為有效的鼻內(nèi)疫苗給予犬，并且推定可以給予貓和馬，以針對呼吸道病原體，(2)重組NDV:H3馬流感病毒或犬流感病毒疫苗的鼻內(nèi)使用可以減輕狗體內(nèi)犬流感病毒疾病的嚴(yán)重程度和(3)NDVH3馬或犬流感病毒疫苗的鼻內(nèi)應(yīng)用基本上可以減少鼻和/或口腔分泌的病毒排出。表3.臨床病征<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表4.血清學(xué)_紅血球凝集抑制滴定<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*第一次接種**第二次接種***激發(fā)日表5.臨床觀察激發(fā)后的犬流感<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*括號(hào)中的數(shù)字表示了顯示出臨床病征的動(dòng)物百分比。表6.激發(fā)后病毒排出結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>權(quán)利要求含有重組單股負(fù)鏈病毒的免疫組合物，該病毒具有來自H3N8流感的核苷酸序列。2.含有重組單股負(fù)鏈病毒的免疫組合物，該病毒具有來自犬流感的核苷酸序列。3.含有重組單股負(fù)鏈病毒的免疫組合物，該病毒具有來自馬流感的核苷酸序列。4.權(quán)利要求1、2或3的組合物，其中所述單股負(fù)鏈病毒是NDV。5.權(quán)利要求1、2或3的組合物，其中所述流感序列是血凝素序列。6.保護(hù)犬針對呼吸道感染的方法，包括給予具有異源呼吸道病毒核苷酸序列的重組單股負(fù)鏈病毒。7.保護(hù)貓針對呼吸道感染的方法，包括給予具有異源呼吸道病毒核苷酸序列的重組單股負(fù)鏈病毒。8.保護(hù)馬針對呼吸道感染的方法，包括給予具有異源呼吸道病毒核苷酸序列的重組單股負(fù)鏈病毒。9.根據(jù)權(quán)利要求6、7或8的方法，其中所述序列是流感核苷酸序列。10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述序列是犬流感序列。11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述序列是貓流感序列。12.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述序列是馬流感序列。13.根據(jù)權(quán)利要求10、11或12的方法，其中所述流感序列是H3N8流感序列。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述流感序列是血凝素流感序列。15.根據(jù)權(quán)利要求6、7或8的方法，其中所述的重組單股負(fù)鏈病毒通過鼻內(nèi)給予。16.根據(jù)權(quán)利要求6、7或8的方法，其中所述重組單股負(fù)鏈病毒是重組NDV病毒。全文摘要本發(fā)明涉及含有外源基因的重組、嵌合單股負(fù)鏈病毒載體的用途。更特別地，本發(fā)明涉及這樣的載體用于治療犬、貓或馬的呼吸道疾病的用途。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是含有來自H3N8流感的血凝素的重組新城疫病毒載體在保護(hù)或治療犬、馬或貓抵抗流感中的用途。文檔編號(hào)A61K39/145GK101801410SQ200880106431公開日2010年8月11日申請日期2008年9月9日優(yōu)先權(quán)日2007年9月10日發(fā)明者J·莫里,P·R·林茲,T·梅巴齊翁申請人:英特威國際有限公司