專利名稱：：免疫療法的新型免疫抗原表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及可與任一類MHC復(fù)合物相結(jié)合且引發(fā)免疫反應(yīng)的腫瘤相關(guān)抗原衍生肽的新型氨基酸序列。
背景技術(shù)：
：是否能剌激免疫反應(yīng)取決于是否提呈被宿主免疫系統(tǒng)視為異物的抗原。發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原的提呈增加了運用宿主免疫系統(tǒng)干預(yù)腫瘤生長的可能性。對于癌癥免疫療法，目前正在探索利用免疫系統(tǒng)中的體液和細胞免疫的各種機制。細胞免疫反應(yīng)的某些元素能特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的細胞毒性T細胞(CTL)表明，這些細胞對癌癥的天然免疫防御中發(fā)揮了重要作用(Cheeveretal.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.1993690:101—112;ZehHJ，Perry-LalleyD，DudleyME，RosenbergSA，YangJC;JImmunol.1999,162(2):989-94;HighavidityCTLsfortwoself—antigensdemonstratesuperiorinvitroandinvivoantit翻urefficacy.)。特別是CD8陽性T細胞(TCD8+)在這種反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，TCD8+能識別細胞液8至10個源自蛋白或缺損核糖體產(chǎn)物(DRIPS)(SchubertU，Ant6n1X，GibbsJ，NorburyCC，YewdellJW，Be皿inkJR.;Rapiddegradationofalargefractionofnewlysynthesizedproteinsbyproteasomes;Nature2000;404(6779):770-774)的殘基中載有主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的肽中所含的I類分子。人MHC分子也稱為人白細胞-抗原(HLA)。MHC分子有兩類MHC-I類分子，大部分細胞核提呈內(nèi)源性蛋白DRIPS裂解生成的肽以及較大肽的細胞上都能發(fā)現(xiàn)此類分子。MHC-II類分子，主要發(fā)現(xiàn)于專職抗原提呈細胞(APC)及其在內(nèi)吞作用過程中攝取并且隨后進行加工的外源性蛋白提呈肽中(CresswellP.An皿.Rev.Immunol.1994;12:259-93)。月太禾口MHC-1類分子的復(fù)合物由載有相應(yīng)TCR的CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞識別，肽和MHC-II類分子的復(fù)合物由載有相應(yīng)TCR的CD4陽性輔助T細胞識別。本領(lǐng)域已熟知TCR、肽和MHC的化學計量數(shù)量豐富，比例為1:1:1。CD4陽性輔助T細胞在安排抗腫瘤T細胞反應(yīng)的效應(yīng)子功能中發(fā)揮重要作用，因此，腫瘤相關(guān)抗原(TAA)衍生的CD4陽性T細胞表位的識別對開發(fā)能引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)的藥4勿可能非常重要(Kobayashi，H.，R.Omiya，M.Ruiz，E.Huarte，P.Sarobe，J.J.Lasarte，M.Herraiz，B.Sangro，J.Prieto，F(xiàn).Borras-Cuesta，andE.Celis.2002.IdentificationofanantigenicepitopeforhelperTlymphocytesfromcarcinoembryonicantigen.Clin.CancerRes.8:3219-3225.，Gnjatic，S.，D.Atanackovic，E.J汪ger，M.Matsuo，A.Selvakumar，N.K.Altorki，R.G.Maki，B.D卯ont，G.Ritter，Y.T.Chen，A.Knuth，andLJ.Old.2003.SurveyofnaturallyoccurringCD4+T_cellresponsesagainstNY_ES0_lincancerpatients-Correlationwithantibodyresponses.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(15):8862-7)CD4+TcellscanleadtolocallyincreasedlevelsofIFN(QinZ，SchwartzkopffJ，PraderaF，KammertoensT，SeligerB，PircherH，BlankensteinT;Acriticalrequirementofinterferongamma—mediatedangiostasisfortumourrejectionbyCD8+Tcells;CancerRes.2003J;63(14):4095-4100)。在沒有炎癥的情況下，MHC-II類分子的表達主要局限于免疫系統(tǒng)細胞，尤其是專職抗原提呈細胞(APC)，例如，單核細胞、單核細胞源性細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞。令人吃驚的是，在腫瘤患者的腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)有MHC-II類分子的表達(DengjelJ，NastkeMD，GouttefangeasC，GitsioudisG，Schoor0，AltenberendF，MiillerM，KrSmerB，MissiouA，SauterM，He皿enlotterJ，WernetD，StenzlA，RammenseeHG，KlingelK，Stevanovi<5S.;UnexpectedabundanceofHLAclassIIpresentedpeptidesinprimaryrenalcellcarcinomas;ClinCancerRes.2006;12:4163-4170)。哺乳動物(如小鼠)模型顯示，即使沒有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)效應(yīng)細胞(如，CD8陽性T淋巴細胞)，CD4陽性T細胞也能通過分泌干擾素_y(IFNy)抑制血管生成，從而抑制腫瘤的出現(xiàn)(Qin，Z.andT.Blankenstein.2000.CD4+T-cell-mediatedtumourrejectioninvolvesinhibitionofangiogenesisthatisdependentonIFNgammareceptorexpressionbynonhematopoieticcells.Immunity.12:677-686)。此外，研究還顯示，CD4陽性T細胞可識別HLA-II類分子所提呈的腫瘤相關(guān)抗原中的肽，這樣可通過誘導抗體(Ab)反應(yīng)而阻止腫瘤進展(Kennedy,R.C.，M.H.Shearer,A.M.Watts，andR.K.Bright,2003.CD4+Tlymphocytesplayacriticalroleinantibodyproductionandtumourimmunityagainstsimianvirus401argetumourantigen.CancerRes.63:1040-1045)。與腫瘤相關(guān)肽和HLA-I類分子相結(jié)合相比較而言，迄今只對TAA的少量II類配體有過描述(www.cancerimm皿ity.org,www.syfpeithi.de)。由于HLA-II類分子的組成性表達通常僅限于免疫系統(tǒng)的細胞(Mach，B.，V.Steimle，E.Martinez_Soria，andW.Reith.1996.RegulationofMHCclassIIgenes:lessonsfromadisease.Annu.Rev.Immunol.14:301—331)，因此，直接從原發(fā)月中瘤中分離II類肽被認為是不可能的事。然而，Dengjel等人最近成功地在腫瘤中直接識別了MHC-II類抗原的表位(EP04023546.7，EP05019254.1;DengjelJ，NastkeMD，GouttefangeasC，GitsioudisG，Schoor0，AltenberendF，MiillerM，KrSmerB，MissiouA，SauterM，He皿enlotterJ，WernetD，StenzlA，RammenseeHG，KlingelK，Stevanovi6S.;UnexpectedabundanceofHLAclassIIpresentedp印tidesinprimaryrenalcellcarcinomas;ClinCancerRes.2006;12:4163-4170)。對于觸發(fā)(引發(fā))細胞免疫反應(yīng)的肽，它必須與MHC分子結(jié)合。這一過程依賴于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態(tài)性。MHC-I類-結(jié)合肽的長度通常為8-10個氨基酸殘基，并且在其與MHC分子相應(yīng)結(jié)合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基("錨")。這樣，每個MHC的等位基因都有"結(jié)合基序"，從而確定哪些肽能與結(jié)合溝槽特異性結(jié)合(RammenseeH.G.，BachmannJ.andStevanovic，S;MHCLigandsandP印tideMotifs,Chapman&Hall1998)。在MHC-I類依賴性免疫反應(yīng)中，肽不僅能與腫瘤細胞表達的某些MHC-I類分子結(jié)合，而且它們還必須能被T細胞負載的特異性T細胞受體(TCR)識別。腫瘤特異性T淋巴細胞所識別的抗原，即它們的表位，可以是源自所有類蛋白的分子，如，酶、受體、轉(zhuǎn)錄因子等，這些分子在各個腫瘤的細胞中表達上調(diào)。此外，腫瘤相關(guān)抗原也可以只存在于腫瘤細胞中，例如，突變基因產(chǎn)物或其他開放閱讀框架(0RF)或蛋白剪接產(chǎn)物中(VigneronN，StroobantV，ChapiroJ，OomsA，Degiova皿iG，MorelS，vanderBruggenP，BoonT，VandenEyndeBJ.Anantigenicpeptideproducedbypeptidesplicingintheproteasome，Science2004Apr23;304(5670):587-90.)。另一種重要的腫瘤相關(guān)抗原是組織特異性抗原，如，表達于不同類型腫瘤和健康睪丸組織中的癌睪丸(CT)抗原。多種腫瘤相關(guān)抗原已經(jīng)得到確定。此外，在識別其他腫瘤相關(guān)抗原方面也做了大量研究。有些腫瘤相關(guān)抗原，在本領(lǐng)域中也稱作腫瘤特異性抗原，具有組織特異性。例子包括但(不僅限于)黑色素瘤的酪氨酸酶、前列腺癌的PSA和PSMA、淋巴瘤中諸如bcr/abl的染色體交叉部位。但是，許多得到確定的腫瘤相關(guān)抗原出現(xiàn)于多種類型腫瘤中，有些抗原，如，實際上導致轉(zhuǎn)化事件的致癌蛋白和/或腫瘤抑制基因(腫瘤抑制基因是Linehan麗，felther匪，ZbarB關(guān)于腎癌綜述Thegeneticbasisofcancerofthekidney.JUrol.2003Dec;170(6Ptl):2163-72中所提及的)幾乎出現(xiàn)于所有類型的腫瘤。例如，控制細胞生長和分化的正常細胞蛋白，如p53(—種腫瘤抑制基因)、ras、c-met、myc、pRB、VHL和HER-2/neu可累積突變，導致這些基因的表達上調(diào)，從而致癌(McCarteyetal.CancerResearch199815:582601-5;Disisetal.CibaFound.Symp.1994，187:198—211)。這些突變蛋白也可是多種癌癥的腫瘤特異性免疫反應(yīng)的一個標靶。對于被細胞毒性T淋巴細胞識別為腫瘤特異性抗原或相關(guān)性抗原以及用于治療的蛋白，必須具備特殊的條件。該抗原應(yīng)主要由腫瘤細胞表達，而正常健康組織根本不表達或表達數(shù)量較少。此外，必要時，各個抗原不僅出現(xiàn)于一種腫瘤中而且濃度(即，每細胞肽的拷貝數(shù))高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原通常是源于由于細胞周期調(diào)控或凋亡等功能在正常細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞中直接受累的蛋白。另外，這些直接導致轉(zhuǎn)化事件的蛋白的下游靶標可能會被上調(diào)，因此可能與腫瘤間接相關(guān)。這些腫瘤間接相關(guān)抗原也可能是預(yù)防接禾中方法的革巴標(Singh—JasujaH.，EmmerichN.P.，RammenseeH.G.，CancerImmunol.Immunoether.2004Mar;453(3):187-95)。在這兩種情況中，至關(guān)重要的是，都要存在抗原氨基酸序列的表位，所以這種來自腫瘤相關(guān)抗原的肽("免疫原性肽")可導致體外或體內(nèi)T細胞反應(yīng)?；旧?，任何能與MHC分子結(jié)合的肽都可能充當一個T細胞表位。誘導體外或體內(nèi)T細胞反應(yīng)的前提是存在有著相應(yīng)TCR的T細胞并且沒有這個特定表位的免疫耐受性。因此，TAA是開發(fā)腫瘤疫苗的出發(fā)點。識別和標記TAA的方法基于對患者或健康受試者CTL的使用情況，或基于差別轉(zhuǎn)錄特性或腫瘤與正常組織肽差別表達模式情況(LemmelC.，WeikS.，EberleU.，DengjelJ.，KrattT.，BeckerH.D.，RammenseeH.G.，StevanovicS.Nat.Biotechnol.2004Apr.;22(4):450-4，T.Weinschenk，C.Gouttefangeas，M.Schirle，F(xiàn).0bermayr，S.Walter,0.Schoor，R.Kurek，W.Loeser，K.H.Bichler，D.Wernet，S.Stevanovic,andH.G.Rammensee.Integratedfunctionalgenomicsapproachforthedesignofpatient—individualantit咖orvaccines.CancerRes.62(20):5818-5827，2002.)。然而，識別腫瘤組織或人腫瘤細胞株中過量或選擇性表達的基因，不能提供免疫療法中使用這些基因所轉(zhuǎn)錄抗原的準確信息。這是因為，有著相應(yīng)TCR的T細胞必須要存在而且對這個特定表位的免疫耐受性需要不存在或達到最低水平，因此，這些抗原表位只有一部分適用于這種情況。因此，只選擇那些蛋白過量或選擇性表達的肽，并且這些肽與可發(fā)現(xiàn)功能性T細胞的MHC分子一起提呈，這一點非常重要。這種功能性T細胞被定義為"效應(yīng)T細胞"，在特異性抗剌激后，可復(fù)制擴增并可執(zhí)行效應(yīng)功能。輔助T細胞在安排抗腫瘤免疫方面的CTL效應(yīng)子功能中發(fā)揮著重要作用。觸發(fā)TH1細胞反應(yīng)的輔助T細胞表位支持CD8陽性殺傷T細胞的效應(yīng)子功能，其中包括直接作用于腫瘤細胞的細胞毒性功能(該類腫瘤細胞表面顯示有腫瘤相關(guān)肽/MHC復(fù)合物)。這樣，腫瘤相關(guān)T輔助細胞表位單獨使用或與其他腫瘤相關(guān)肽結(jié)合使用可作為剌激抗腫瘤免疫反應(yīng)疫苗化合物的活性藥物成分。由于CD8及CD4依賴型反應(yīng)共同和協(xié)同促進抗腫瘤作用，因此，CD8+CTL(配體MHC-I分子+肽表位)或CD4陽性CTL(配體MHC-II類分子)對腫瘤相關(guān)抗原的識別和鑒定對開發(fā)腫瘤疫苗非常重要。因此，本發(fā)明的一個目標是為可與任一類MHC復(fù)合物結(jié)合的肽提供新型氨基酸序列。圖1顯示了ESI液相色譜質(zhì)譜確定的結(jié)腸癌樣本CCA707的腫瘤相關(guān)肽(TUMAP)PCN-002(圖la)、膠質(zhì)母細胞瘤樣本GB1006的T0P-002(圖lb)、膠質(zhì)母細胞瘤樣本GB1006的PTP-001(圖lc)、腎細胞癌樣本RCC190的GAL-001(圖Id)、膠質(zhì)母細胞瘤樣本GB1002的CHI-001(圖le)、膠質(zhì)母細胞瘤樣本GB1002的JAK-001(圖If)、非小細胞肺癌NSCLC庫2中的AKR-001(圖lg)、以及胰腺癌樣本PC330的FNI-001(圖lh)，這些物質(zhì)都以MHC-I類限制方式提呈。圖2顯示了ESI液相色譜質(zhì)譜確定的胃癌GC庫2中的腫瘤相關(guān)肽(TUMAP)CEA-009(圖2)、胃癌GC庫1中的TGFBI-006(圖2b)、膠質(zhì)母細胞瘤樣本GB6002的TGFBI-007(圖2c)、膠質(zhì)母細胞瘤樣本GB1004的TGFBI-008(圖2d)、非小細胞肺癌NSCLC庫1中的TGFBI-009(圖21e)、以及膠質(zhì)母細胞瘤樣本GB6002的TGFBI-010(圖2f)，這些物質(zhì)都以MHC-II類限制方式提呈。圖3描述了編碼膠質(zhì)母細胞瘤相關(guān)肽PTP-001(圖3a)和CHI-OOl(圖3b)的兩種基因的表達譜。這兩種基因在正常組織不表達或表達很低，而在膠質(zhì)母細胞瘤樣本(GB1006T至GB1011T;NCH359T和NCH361T)中表達增加250多倍。圖4描述了選定肽對HLA_A*0201的結(jié)合親和力，結(jié)果用EplELISA法根據(jù)Sylvester—Hvid，C，Kristensen，N，Blicher，T，F(xiàn)erre，H，Lauemoller，SL，Wolf，XA，Lamberth，K，Nissen，MH，Pedersen，LO，禾口B墜，S;2002年在"EstablishmentofaquantitativeELISAcapableofdeterminingp印tide—MHCclassIinteraction,TissueAntigens,59，251±-258"—文的敘述測得。僅對已知與MHC-I類分子結(jié)合的肽進行分析。HLA-DR結(jié)合肽的親和力不能用這種測定法測得。圖5描述了微球促使的外周血ODC-001和NOX-001特異性CD8+淋巴細胞增殖的四聚體技術(shù)分析。與抗CD28+高密度腫瘤抗原A*0201/0DC-001(上板)或抗CD28+高密度腫瘤抗原A*0201/N0X-001(下板)耦合的微球每周對每孔中健康HLA-A*0201的IX106CD8+濃縮PBMC+供體HD100進行剌激。經(jīng)過三次體外剌激，所有的細胞用抗體CD8FITC+四聚體A*0201/N0X-001PE和A*0201/0DC_001APC進行染色。細胞在淋巴細胞群或CD8+淋巴細胞(右板)上得到門控，數(shù)字代表CD8+淋巴細胞群內(nèi)四聚體+的百分比。圖6描述了5個剌激周期后干擾素y酶聯(lián)免疫斑點(IFNyELISPOT)檢測到的TGFBI-004體外免疫原性。TGFBI-004反復(fù)引發(fā)和再剌激細胞，然后以分別相關(guān)TGFBI-004(第1、2、3和4孔)和不相關(guān)(陰性對照)肽進行培養(yǎng)。IFNYELISPOT檢測后，對ELISPOT閱讀器(CTL，美國克利夫蘭)進行分析。植物血凝素離子霉素作為陽性對照。數(shù)字表示陽性點計數(shù)。圖7描述了5個剌激周期后ICS法檢測到的TGFBI-004體外免疫原性。負載TGFBI-004的DC引發(fā)細胞，自體PBMC+TGFBI-004反復(fù)再剌激細胞。對于讀出細胞分別以相關(guān)TGFBI-004(第1、2、3和4孔)和不相關(guān)(陰性對照)肽進行培養(yǎng)。除了細胞內(nèi)IFNy染色，細胞還用CD4-FITC和CD8-PerCP抗體染色。用四色流式細胞儀(BD生物科學公司，德國)進行分析。圖8描述了NOX-001肽體外重剌激后T細胞株產(chǎn)生IFNy的ELISPOT分析。A.T細胞株7+源自供體HBC-154(分選的CD8+N0X-001四聚體+);B.T細胞株7-源自供體HBC-l54(分選的CD8+N0X-001四聚體)。分選的CD8+N0X-001四聚體+(A.)和分選的CD8+N0X-001四聚體-(B.)細胞在用不相關(guān)(MLA-001)(上孔)和相關(guān)(NOX-001)(下孔)肽(10yg/ml)重新剌激之后，用IFNyELISPOT法分析。數(shù)字表示陽性點計數(shù)。圖9顯示了本發(fā)明肽對HLA-A柳201的親和力。P116HLA-I類肽和病毒標志物HBV-001的解離常數(shù)(KD)用基于ELISA的測定法測得(見"實施例")。發(fā)明詳述在第一方面，本發(fā)明提出了一種肽，其包括選自SEQIDNo.l至SEQIDNo.29群組的一個序列、或與SEQIDNo.1至SEQIDNo.29具有80%同源性的其變體、或誘導與該肽發(fā)生T細胞交叉反應(yīng)的一個變體。在本發(fā)明中，"同源性"一詞系指兩個氨基酸序列之間的同一度，如肽或多肽序列。前文所述的"同源"是通過將理想條件下調(diào)整的兩個序列與待比較序列進行比對后確定的。此處要比對的序列在兩個序列最佳排列中可能有增加或刪除(例如，序列缺口等)。此類序列同源性可通過使用ClustalW等算法創(chuàng)建一個排列而進行計算(NucleicAcidRes.，22(22):46734680(1994).也可用使用一般序列分析軟件，更具體地說，是VectorNTI、GENETYX或由公共數(shù)據(jù)庫，如http:〃dragon.bio,purdue.edu/bioinfolinks/提供的分析工具。本領(lǐng)域技術(shù)人員能評估特定肽變體誘導的T細胞是否可與該肽本身發(fā)生交叉反應(yīng)(Fong，L，Hou，Y，Rivas，A，Benike，C，Yuen，A，F(xiàn)isher，GA，Davis，匪，andEngleman，EG;2001，AlteredpeptideligandvaccinationwithFlt31igandexpandeddendriticcellsfortumorimmunotherapy，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，98，8809-8814)、(Zaremba，S，Barzaga，E，Zhu，M，Soares，N，Tsang，KY，andSchlom，J;IdentificationofanenhanceragonistcytotoxicTlymphocytepeptidefromhumancarcinoembryonicantigen,CancerRes.，1997，57，4570—4577;Colombetti，S，F(xiàn)agerberg，T，Baumgartner，P，Chapatte，L，Speiser，DE，Rufer，N，Michielin，0，andLevy,F;，Impactoforthologousmelan-Apeptideimmunizationsontheanti-selfmelan_A/HLA_A2Tcellcross—reactivity，JImmunol.，2006，176，6560—6567;Appay，V，Speiser，DE，Rufer，N，Reynard，S，Barbey，C，Cerottini，JC，Leyvraz，S，Pinilla，C，andRomero,P;DecreasedspecificCD8+Tcellcross—reactivityofantigenrecognitionfollowingvaccinationwithMelan-Apeptide,Eur.JImmunol.，2006，36，1805-1814)。表1顯示了這些肽、各自SEQIDNO以及親本蛋白的信息。表l:本發(fā)明中的肽<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>檢測顯示，正常組織表達僅限于神經(jīng)肌肉組織(Weinstein，EJ，Bourner，M，Head，R，Zakeri，H，Bauer，C，andMazzarella，R;URP1:amemberofanovelfamilyofPHandFERMdomain_containingmembrane_associatedproteinsissignificantlyover—expressedinlungandcoloncarcinomas,Biochim.Biophys.Acta,2003，1637，207-216)。此夕卜，C20orf42已被確定為參與TGF-P介導的細胞遷移和腫瘤浸潤的一種基因(Kloeker，S，Major,MB，Calderwood，DA，Ginsberg,MH，Jones，DA，andBeckerle，MC;TheKindlersyndromeproteinisregulatedbytransforminggrowthfactor_betaandinvolvedinintegrin-mediatedadhesion,J.Biol.Chem.，2004，279，6824-6833)。NADPH氧化酶同源物_1(N0X1)N0X1是一種對生長因子有反應(yīng)的酶，催化生成活性氧超氧化物(02-)和過氧化氫(H202)。其表達最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸、前列腺、子宮和增殖的血管平滑肌細胞中(Suh，Y.A.etal.1999;Celltransformationbythesuperoxide—generatingoxidaseMoxl.Nature401,79-82)。它的表達與一些生物反應(yīng)相關(guān)，如細胞增殖、血管生成、細胞信號通路激活(Harper,R.W.，Xu，C.，Soucek，K.，Setiadi，H.&Eiserich，J.P.AreappraisalofthegenomicorganizationofhumanNoxlanditssplicevariants.Arch.Biochem.Biophys.2005，435，323-330)。N0X1在結(jié)腸中高表達，但其在結(jié)腸生理或病理學中的功能仍然知之甚少。對于正常組織，N0X1在回腸中表達低，在右結(jié)腸中表達中等，在左結(jié)腸中表達高。N0X1在腺瘤、高分化或低分化結(jié)腸腺癌樣本中的表達沒有統(tǒng)計學差異。N0X1在結(jié)腸上皮細胞的隱窩內(nèi)和腔表面均呈高表達?？傊?，N0X1是組成型表達于結(jié)腸上皮細胞并與致瘤不直接相關(guān)的一種酶(Szanto，I.etal.ExpressionofNOXl，asuperoxide-generatingNADPHoxidase,incoloncancerandinflammatoryboweldisease.JPathol.2005，207，164-176)。免疫組織化學表明，N0X1組成型表達于表面粘液細胞。腺瘤和高分化腺癌上調(diào)N0X1表達。核因子(NF)-KB主要在N0X1表達豐富的腺瘤和腺癌細胞中被激活，這表明N0X1可在結(jié)腸腫瘤中剌激NF-KB依賴型抗凋亡途徑(Fukuyama，M.etal.Overexpressionofanovelsuperoxide—producingenzyme,NADPHoxidase1，inadenomaandwelldifferentiatedadenocarcinomaofthehumancolon.CancerLett.2005，221，97-104)。Wnt3a/P-Catenin信號傳導被描述為可誘導N0X1表達(Petropoulos，H.&Skerjanc，I.S.Beta_cateninisessentialandsufficientforskeletalmyogenesisinP19cells,JBiolChem.2002，277，15393-15399)。最近，活性氧分子表明可誘導內(nèi)皮細胞凋亡，隨后可誘導各種腫瘤細胞粘附分子的表達。這表明，通過阻止ROS的生成而預(yù)防腫瘤遠處復(fù)發(fā)是可行的(Ten，KM，vanderWal，JB，Sluiter，W，Hofland，LJ，Jeekel，J，So皿eveld，P，andvanEijck，CH;Theroleofsuperoxideanionsinthedevelopmentofdistanttumourrecurrence,Br.JCancer,2006,95，14971503)。[OO49]增殖細胞核抗原(PCNA)PCNA發(fā)現(xiàn)于細胞核中，是DNA聚合酶S的輔助因子。編碼蛋白質(zhì)充當一個同源三聚體，幫助提高DNA復(fù)制過程中前導鏈的持續(xù)合成能力。因此，它在所有增殖細胞尤其是腫瘤細胞中表達，用作檢測增殖的標志物。11DNA拓撲異構(gòu)酶IIT0P2A和T0P2B編碼一種DNA拓撲異構(gòu)酶的異形體，這種酶能夠控制和改變轉(zhuǎn)錄過程中DNA的拓撲狀態(tài)。這種核酶參與諸如染色體凝集、染色單體分離以及減輕DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)應(yīng)力等過程。DNA拓撲異構(gòu)酶可催化兩個雙鏈DNA的短暫斷裂和重新連接，這使得DNA鏈可穿過對方，從而改變DNA的拓撲結(jié)構(gòu)。這種酶的兩種異構(gòu)體可能以基因復(fù)制產(chǎn)物的形式存在。該基因編碼的a形式位于17號染色體處，13基因位于3號染色體處。T0P2A是幾種抗癌藥物的耙標，這個基因的各種突變都可導致出現(xiàn)耐藥。T0P2A基因與HER-2癌基因(最常見的乳腺癌擴增癌基因)相鄰，位于染色體位置17ql2-q21處，其擴增或刪除頻率在幾乎90%的HER-2擴增原發(fā)性乳腺腫瘤中都相等(Jarvinen，TAandLiu，ET;TopoisomeraseIIalphagene(T0P2A)amplificationanddeletionincancer-morecommonthananticipated,Cytopathology，2003，14，309-313)。另外，對于其他癌癥，也報告了有T0P2A擴增。沒有T0P2ADNA復(fù)制和細胞分裂是不可能的。因此，它成為了眾多抗癌治療方案的主要靶標，即使殺傷細胞的確切機制仍難以解釋(Kellner，U，Sehested，M，Jensen,PB，Gieseler，F(xiàn)，andRudolph,P;Culpritandvictim-DNAtopoisomeraseII，LancetOncol.，2002，3，235-243)。這種方法的成功與否受到自發(fā)耐藥性的限制，藥物引起的DNA損傷可增加腫瘤的惡性程度。最近的數(shù)據(jù)表明，T0P2A的擴增和缺失可證明該基因?qū)0P2A-抑制劑化療的敏感或耐藥，這取決于T0P2A處的具體基因缺陷。目前尚不清楚T0P2B在癌癥中的參是否與T0P2A相似或者這兩種異構(gòu)體之間是否存在重大差別。T0P2B至少可以增加T0P2A的一些活性(Sakaguchi，AandKikuchi，A;FunctionalcompatibilitybetweenisoformalphaandbetaoftypeIIDNAtopoisomerase，JCellSci.，2004，117，1047—1054)。癌胚抗原相關(guān)細胞粘附分子5癌胚抗原(CEA=CEACAM5)是一種分子量為180kDa的高度糖基化膜蛋白分子，由三個C2Ig樣重復(fù)單元組成，兩側(cè)含有一個N-端IgV樣區(qū)域和一個C-端區(qū)域，其中包括糖磷月旨酰肌醇連接區(qū)域(Hegde，P，Qi，R，Gaspard，R，Abernathy，K，Dharap，S，Earle-Hughes，J，Gay，C，Nwokekeh，NU，Chen，T，Saeed，AI，Sharov，V，Lee，NH，Yeatman，TJ，andQuackenbush，Jsldentificationoftumourmarkersinmodelsofhumancolorectalcancerusinga19，200_elementcomplementaryDNAmicroarray，CancerRes.，2001，61，7792-7797)。癌胚抗原CEA在胎兒發(fā)育過程中表達，但是在成人胃腸道上皮表達低。但是，CEA在人腫瘤中有較高比例的過量表達，其中包括90X的胃腸道癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌，70%的非小細胞肺癌細胞和50%的乳腺癌(Thompson,JA，Grunert，F(xiàn)，andZimmermann，W;Carcinoembryonicantigengenefamily:molecularbiologyandclinicalperspectives,JClinLabAnal.，2005，5，344-366)。由于CEA在腫瘤細胞及血清中其分泌物呈高表達，已被廣泛用作腫瘤標志物(Sikorska，H，Shuster，J，andGold,P;Clinicalapplicationsofcarcinoembryonicantigen，CancerDetect.Prev.，12，321-3551988)，并作為監(jiān)測結(jié)直腸癌的標準血清標志物(Locker，GY，Hamilton,S，Harris,J，Jessup，JM，Kemeny，N，Macdonald，JS，Somerfield，MR，Hayes，DF，andBast，RC，Jr.;ASC02006updateofrecommendationsfortheuseoftumourmarkersingastrointestinalcancer,JClin0ncol，2006，24，5313-5327，)。盡管CEA在腫瘤細胞中過量表達，但是癌癥患者通常對這種抗原并未表現(xiàn)出免疫反應(yīng)(0refice，S，F(xiàn)ossati，G，Pietrojusti，E，andBonfanti，G;Delayedcutaneoushypersensitivityreactiontocarcinoembryonicantigenincancerpatients,Tumouri，1982，68，473-475)。由于CEA—般在體內(nèi)表達水平低，因此免疫系統(tǒng)通常對其具有耐受性。但是，在一系列的臨床疫苗試驗中，CEA的免疫原性已得到證明(Sarobe，P，Huarte，E，Lasarte，JJ，andBorras—Cuesta，F(xiàn);Carcinoembryonicantigenasatargettoinduceanti—tumourimmuneresponses,Curr.CancerDrugTargets.，2004，4，443-454)，特別是結(jié)直腸癌(CRC)(Mosolits，S，Ullenhag，G，andMellstedt，H;Therapeuticvaccinationinpatientswithgastrointestinalmalignancies.Areviewofimmunologicalandclinicalresults,Ann.Oncol.，2005，16，847-862)，并且CEA是這種癌種試驗中在最多疫苗平臺上得到測試的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)(vonMehren，M^Colorectalcancervaccines:whatweknowandwhatwedon'tyetknow,Semin.Oncol.，2005，32，76-84)。CEA的幾種細胞毒性和輔助T細胞表位已進行了描述(Crosti，M，Longhi，R，Consogno，G，Melloni，G，Za皿ini，P，andProtti，MP;IdentificationofnovelsubdominantepitopesonthecarcinoembryonicantigenrecognizedbyCD4+T_cellsoflungcancerpatients,JImmunol.，2006，176，5093—5099;Novellino，L，Castelli，C，andParmiani，G;AlistingofhumantumourantigensrecognizedbyT—cells:March2004update，CancerImmunol.Immunother.，2004，54，187-207;Ruiz，M，Kobayashi，H，Lasarte，JJ，Prieto，J，Borras—Cuesta，F(xiàn)，Celis，E，andSarobe，P;IdentificationandcharacterizationofaT—helperpeptidefromcarcinoembryonicantigen,ClinCancerRes.，2004，10，2860-2867)，這使得各種以肽為基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌免疫試驗成為可會g(Babatz，J，Rollig，C，Lobel，B，F(xiàn)olprecht，G，Haack，M，Gunther，H，Kohne，CH，Ehninger，G，Schmitz，M，andBornhauser，M;Inductionofcellularimmuneresponsesagainstcarcinoembryonicantigeninpatientswithmetastatictumoursaftervaccinationwithalteredpeptideligand-loadeddendriticcells,Cancerlmm皿ol.Immunother.，2006，55，268_276;Fong，L，Hou，Y，Rivas，A，Benike，C，Yuen，A，F(xiàn)isher，GA，Davis，MM，andEngleman，EG;AlteredpeptideligandvaccinationwithFlt3ligandexpandeddendriticcellsfortumourimmunotherapy,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，2001，98，8809-8814;Liu，KJ，Wang，CC，Chen，LT，Cheng，AL，Lin，DT，Wu，YC，Yu，WL，Hung，YM，Yang，HY，Juang，SH，andWhang—Peng,J^Generationofcarcinoembryonicantigen(CEA)-specificT-cellresponsesinHLA_A*0201andHLA_A*24021ate_stagecolorectalcancerpatientsaftervaccinationwithdendriticcellsloadedwithCEAp印tides，ClinCancerRes.，2004，10，2645-2651;Matsuda，K，Tsunoda，T，Tanaka，H，Umano，Y，Tanimura，H，Nukaya，I，Takesako，K，andYamaue，H^EnhancementofcytotoxicT_lymphocyteresponsesinpatientswithgastrointestinalmalignanciesfollowingvaccinationwithCEApeptide—pulseddendriticcells,CancerImmunol.Immunother.，2004，53，609—616;Ueda，Y，Itoh，T，Nukaya，I，Kawashima，I，0kugawa，K，Yano，Y，Yamamoto，Y，Naitoh，K，Shimizu，K，Imura，K，F(xiàn)uji,N，F(xiàn)ujiwara，H，0chiai，T，Itoi，H，Sonoyama，T，Hagiwara，A，Takesako，K，andYamagishi，H;Dendriticcell—basedimmunotherapyofcancerwithcarcinoembryonicantigen—derived,HLA_A24_restrictedCTLepitope:Clinicaloutcomesof18patientswithmetastaticgastrointestinalorlungadenocarcinomas,Int.JOncol.，2004，24，909_917;Weihrauch，MR，Ansen，S，Jurkiewicz，E，Geisen，C，Xia，Z，Anderson,KS，Gracien，E，Schmidt,M，Wittig，B，Diehl，V，Wolf，J，Bohlen，H，andNadler，LM;PhaseI/IIcombinedchemoimmunotherapywithcarcinoembryonicantigen-derivedHLA-A2-restrictedCAP-lp印tideandirinotecan，5_fluorouracil，andleucovorininpatientswithprimarymetastaticcolorectalcancer,ClinCancerRes.，2005，11，5993-6001)。到目前為止，上述試驗以及其他臨床試驗已經(jīng)證實了CEA接種的安全性并提供了誘導這禾中抗原免疫反應(yīng)的i正據(jù)(vonMehren，M;Colorectalcancervaccines:whatweknowandwhatwedon'tyetknow,Semin.Oncol.，2005，32，76-84)。轉(zhuǎn)化生長因子13誘導的(TGFBI)基因TGFBI最先被認定為人肺腺癌細胞株的TGF_|3誘導基因。它能編碼分泌出的細胞外基質(zhì)蛋白，該蛋白被認為作用于細胞粘附物和細胞外基質(zhì)成分。TGFBI是一種結(jié)直腸癌中升高最為明顯的基因，也在腺瘤中高表達。定量PCR結(jié)果顯示，它在未純化的和純化的腫瘤上皮細胞中均大大升高。因此，原位雜交實驗表明，TGFBI在基質(zhì)和上皮細胞等多種細胞類型中表達(Buckhaults，P，Rago，C，St，CB，Romans,KE，Saha，S，Zhang，L，Vogelstein，B，andKinzler，KW;Secretedandcellsurfacegenesexpressedinbenignandmalignantcolorectaltumours,CancerRes.，2001，61，6996-7001)。在一次對結(jié)直腸癌基因表達研究進行的薈萃分析中，TGFBI被確認為9個基因中唯一的一個不斷上調(diào)的基因(TGFBI的4個研究)(Shih，W，Chetty，R，andTsao，MS;Expressionprofilingbymicroarraysincolorectalcancer,Oncol.Rep.，2005，13，517-524)。在人胰腺癌組織中，TGFBImRNA水平比正常對照組織中增加32.4倍。原位雜交分析結(jié)果顯示，TGFBImRNA主要表達于胰腺腫瘤中的癌細胞(Schneider,D，Kleeff，J，Berberat，P0，Zhu，Z，Korc，M，F(xiàn)riess，H，andBuchler，麗；Inductionandexpressionofbetaig-h3i即ancreaticcancercells,Biochim.Biophys.Acta,2002，1588，1_6)。在體外模型中，TGFBI被確定為一種促血管生成基因。此外，在另外幾種腫瘤中，檢測到TGFBI表達顯著增強。TGFBI的反義寡核苷酸既阻止體外基因表達又阻止體外內(nèi)皮細胞管形成，這表明TGFBI可在內(nèi)皮細胞基質(zhì)的相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Aitkenhead，M，Wang，SJ，Nakatsu，MN，Mestas，J，Heard,C，andHughes,CCidentificationofendothelialcellgenesexpressedinaninvitromodelofangiogenesis-inductionofESM-l，(beta)ig-h3，andNrCAM，Microvasc.Res.，2002，63，159—171)。蛋白酪氨酸磷酸酶受體型4-1(PTPRZ1)PTPRZ1是受體型蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成員，編碼一次通過(single-pass)I型膜蛋白，該被編碼蛋白含兩個細胞質(zhì)酪氨酸蛋白磷酸酶區(qū)域，一個a-碳酸酐酶區(qū)域和一個纖維連接蛋白III型區(qū)域。在以下細胞中該基因被誘導表達胃癌細胞(Wu，CW，Li，AF，Chi，CW，andLin，WC;Proteintyrosine—phosphataseexpressionprofilingingastriccancertissues,CancerLett.，2006，242，95-103)、多發(fā)性硬化病變的再髓鞘化少突膠質(zhì)細胞(Harroch，S，F(xiàn)urtado，GC，B潔ck，W，Rosenbluth，J，Lafaille，J，Chao，M，Buxbaum，JD，andSchlessinger，J;AcriticalrolefortheproteintyrosinephosphatasereceptortypeZinfunctionalrecoveryfromdemyelinatinglesions，Nat.Genet.，2002，32，411-414)、以及組織缺氧情況下的人胚胎腎細胞(Wang，V，Davis，DA，Haque，M，Huang，LE，andYarchoan，Rdifferentialgeneup—regulationbyhypoxia-induciblefactor—lalphaMidhypoxia—induciblef3ctor-2alph3inHEK293T-cells，CancerRes.，2005，65，3299-3306)。蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物都在膠質(zhì)母細胞瘤細胞中過量表達，這促進了它們按絡(luò)合點次序進行遷移(haptotacticmigration)(Lu，KV，Jong，KA，Kim，GY，Singh，J，Dia，EQ，Yoshimoto，K，Wang，MY，Cloughesy，TF，Nelson,SF，andMischel，PSdifferentialinductionofglioblastomamigrationandgrowthbytwoformsofpleiotrophin,JBiolChem.，2005，280，26953-26964)。此外，PTRPZ1在膠質(zhì)母細胞瘤中經(jīng)常發(fā)生基因組DNA水平的擴增(Mulholland，PJ，F(xiàn)iegler，H，Mazzanti，C，Gorman,P，Sasieni，P，Adams，J，Jones，TA，Babbage，JW，Vatcheva，R，Ichimura，K，East,P，Poullikas，C，Collins,VP，Carter,NP，Tomlinson，IP，andSheer,D;Genomicprofilingidentifiesdiscretedeletionsassociatedwithtranslocationsinglioblastomamultiforme,CellCycle,2006，5，783-791)。Ja皿s激酶與微管相互作用的蛋白2(JAKMIP2)JAKMIP2被確定為PAX3-FKHR眾多已知或假定下游靶標之一，這些靶標在ARMS(小兒肺泡亞型橫紋肌肉瘤)中高度過量表達(Lae，M，Ahn，E，Mercado，G，Chuai，S，Edgar，M，Pawel，B，Olshen，A，Barr，F(xiàn)，andLadanyi，M;GlobalgeneexpressionprofilingofPAX_FKHRfusion_positivealveolarandPAX—FKHRfusion—negativeembryonalrhabdomyosarcomas,JPathol.，2007，212，143-151)。纖維連接蛋白l(FNl)纖維連接蛋白是一種高分子量糖蛋白，其中約含5%碳水化合物，可與跨越細胞膜的受體蛋白(稱為整合素)結(jié)合。除了整合素外，它們還可與細胞外基質(zhì)成分(如，膠原蛋白、纖維蛋白和肝素)結(jié)合。有幾種纖維連接蛋白的異構(gòu)體，所有這些異構(gòu)體都是單一基因的產(chǎn)物。FN在維持正常細胞形態(tài)、細胞粘附、遷移、止血、血栓形成、傷口愈合、分化和增殖中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Hynes，R0;Fibronectins，Sci.Am.，1987，254，42-51)。通過用76-aa肽、IIIl-C(稱為Anastellin，從纖維連接蛋白中第一個III型重復(fù)物中獲得)處理可溶性纖維連接蛋白，從而形成聚合型纖維連接蛋白sFN。荷瘤小鼠體內(nèi)研究表明，Anastellin或sFN全身使用抑制了腫瘤的生長、血管生成和轉(zhuǎn)移(Yi，MandRuoslahti，E;Afibronectinfragmentinhibitstumourgrowth,angiogenesis，andmetastasis,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，2001，98，620-624)。Anginex是一種含33個氨基酸的合成肽，最初設(shè)計為生成抗血管生成蛋白的P-折疊結(jié)構(gòu)。研究已經(jīng)表明，anginex可啟動纖維連接蛋白的聚合，在缺乏血漿纖維結(jié)合蛋白的小鼠中沒有活性(Akerman，ME，Pilch，J，Peters,D，andRuoslahti，E;Angiostaticpeptidesuseplasmafibronectintohometoangiogenicvasculature,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，2005，102，2040-2045)在一項研究中，研究者研究了FN在小鼠中對D-氨基半乳糖(GalN)/脂多糖(LPS)誘導暴發(fā)性肝功能衰竭的作用。結(jié)果表明，F(xiàn)N可保護小鼠免于GalN/LPS誘導的肝衰竭，而肝衰竭由于NF-KB激活受到抑制的機制產(chǎn)生，這可導致下調(diào)TNF-a和IL-10的下調(diào)以及Bcl-xL誘導的凋亡信號阻滯增加，其中GalN/LPS引起的肝細胞凋亡受到抑制(Qiu，Z，Kwon，AH，Tsuji，K，Kamiyama，Y，0kumura，T，andHirao，Y;FibronectinpreventsD-galactos咖ine/lipopolysaccharide-inducedlethalhepaticfailureinmice，Shock,2006，25，80-87)。其他結(jié)果表明，F(xiàn)N可通過誘導C0X-2基因表達和PGE2的生物合成，從而剌激人肺癌細胞增殖并減少體外凋亡(Han，S，Sidell，N，Roser-Page，S，andRoman,J;Fibronectinstimulateshumanlungcarcinomacellgrowthbyinducingcyclooxygenase-2(C0X-2)expression,Int.JCancer,2004，111，322-331)。纖維連接蛋白(FN)已被證實在器官形成和腫瘤形成過程中主要進行選擇性剪接。外主體-B(ED-B)FN是一種此類剪接變體，正常成人組織通常不含該變體，它是腫瘤血管生成的一種推薦標志物(Khan，ZA，Caurtero，J，Barbin，YP，Chan，BM，Uniyal，S，andChakrabarti，S;ED_Bfibronectininnon_smallcelllungcarcinoma,Exp丄皿gRes.，2005，31，701-711)。Mhawech等人的研究表明，EDB染色陽性的頭頸部腫瘤患者的總生存期都有顯著下降的趨勢(Mhawech，P，Dulguerov，P，Assaly，M，Ares，C，andAllal，AS;EB-Dfibronectinexpressioninsqimmouscellcarcinomaoftheheadandneck，OralOncol.，2005,41,82-88)。纖維連接蛋白表達調(diào)節(jié)血管生成和血管新生，并參與腦組織對缺血和癲癇的反應(yīng)。與SWS正常皮膚的成纖維細胞相比，SWS(Sturge-Weber綜合征)病灶部位成纖維細胞中纖維連接蛋白在的基因表達顯著升高(p<0.05)(Comi，AM，Hunt,P，Vawter，MP，Pardo，CA，Becker,KG，andPevsner,J;Increasedfibronectinexpressioninsturge—webersyndromefibroblastsandbraintissue,Pediatr.Res.，2003，53，762-769)。與良性卵巢腫瘤和正常卵巢相比，卵巢癌中的纖維連接蛋白含量明顯增高。與未復(fù)發(fā)卵巢癌患者相比，復(fù)發(fā)性卵巢癌患者的纖維連接蛋白含量明顯升高。表達的腫瘤衍生胞壁質(zhì)水解酶和纖維連接蛋白對于卵巢腫瘤的生長非常重要(Demeter，A，Szir腿i，K，Olah，J，P即p，Z，andJeney，A;Elevatedexpressionofmatrixmetalloproteinase—9，andfibronectinconcentrationinrecurrentepithelialovariancancer,Orv.Hetil.，2004，145，1617-1624)。在一項研究中，分析了1176個基因，F(xiàn)N是僅有的兩個顯著下調(diào)基因之一，這一事實強調(diào)了FN可作為乳腺癌轉(zhuǎn)移癌的重要抑制基因這一假設(shè)(Urtreger，AJ，Werbajh，SE，Verrecchia，F(xiàn)，Mauviel，A，Puricelli，LI，Kornblihtt，AR，andBaldeKierJoffeED;Fibronectinisdistinctlydownregulatedinmurinemammaryadenocarcinomacellswithhighmetastaticpotential,Oncol.R印.，2006，16，1403-1410)。在一份報告中，研究人員發(fā)現(xiàn)，3種可溶性纖維連接蛋白肽(RGD、CS_1和FN_C/H-V)都誘導肺成纖維細胞的凋亡。細胞凋亡的發(fā)生是由于粘附中斷(失巢凋亡)。使用纖維連接蛋白小肽可促進成纖維細胞凋亡，這使我們有理由對抗纖維化療法作進一步的研究(Hadden，HLandHenke，CA;Inductionoflungfibroblastapoptosisbysolublefibronectinp印tides，Am.JRespir.CritCareMed，2000，162，1553—1560)。另一項石開究表明，纖維連接蛋白(FN)剌激人非小細胞肺癌(NSCLC)的細胞增殖。研究顯示，F(xiàn)N在NSCLC細胞中增加匪P-9蛋白和mRNA的表達，并提高了液化明膠的活性(Han，S，Ritzenthaler，JD，Sitaraman，SV，andRoman，J;Fibronectinincreasesmatrixmetalloproteinase9expressionthroughactivationofc—Fosviaextracellular—regulatedkinaseandphosphatidylinositol3_kinasepathwaysinhumanl皿gcarcinomacells,JBiolChem.，2006，281，29614-29624)。在一項研究中，研究人員研究了支配所有細胞黏附性的機制是否也能介導維生素D(VD)化合物的腫瘤抑制作用。引入干擾FN的小RNA造成FN的表達下調(diào)并削弱細胞對膠原蛋白I型基質(zhì)的粘附力。這些研究結(jié)果突出了FN在調(diào)節(jié)甲狀腺癌細胞粘附力中的意義，至少部分地影響了VD對癌細胞生長的作用(Liu，W，Asa，SL，andEzzat，Sslalpha,25-Dihydroxyvit咖inD3tergetsPTEN-d印endentfibronectinexpressiontorestorethyroidcancercelladhesiveness,Mol.Endocrinol.，2005，19,2349-2357)。腫瘤相關(guān)FN異構(gòu)體的生成使得我們可以開發(fā)特定配體(如抗體)，從而將治療藥物選擇性地輸送到腫瘤環(huán)境中。FN可作為生物分子干預(yù)的靶標，既可用于開發(fā)出阻斷FN與整合素和細胞表面其他受體相互作用的抑制分子，又可開發(fā)出基于配體的靶向成像策略和治療策略(Kaspar，M，Zardi，L，andNeri，D;Fibronectinastargetfortumourtherapy,Int.JCancer,2005，118，1331-1339)。一項研究表明，以FN的一種重組CBD-H印II多肽(指定為CH50)體內(nèi)表達進行治療很強地抑制了腫瘤的生長、腫瘤浸潤和腫瘤血管生成。運用CH50的基因療法不僅延長了負荷肝癌小鼠的生存期，而且還抑制了腫瘤在脾臟中的生長和浸潤能力以及向肝臟轉(zhuǎn)移的能力?？偠灾?，這些發(fā)現(xiàn)表明，使用CH50在肝癌的基因治療中是一種很有前途的用途(Liu，Y，Huang，B，Yuan，Y，Gong，W，Xiao，H，Li，D，Yu，ZR，Wu，F(xiàn)H，Zhang，GM，andFeng，ZH;Inhibitionofh印atocarcinomaandt皿ourmetastasistoliverbygenetherapywithrecombinantCBD-H印IIpolypeptideoffibronectin,Int.JCancer,2007121(1)184-92)。纖維連接蛋白(FN)具有一個隱蔽的功能性位點(第14II工型重復(fù)基因的YTIYVIAL序列)，阻止細胞粘附到細胞外基質(zhì)。包含該位點的一種22-merFN肽(稱為FNIII14)，在沒有與整合素結(jié)合的情況下，就能抑制P-l整合素介導的粘附行為。研究表明，F(xiàn)NI1114能防止淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)移(Kato，R，Ishikawa，T，Kamiya，S，0guma，F(xiàn)，Ueki，M，Goto,S，Nakamura，H，Katayama，T，andFukai，F(xiàn);Anewtypeofantimetastaticpeptidederivedfromfibronectin,ClinCancerRes.，2002，8，2455-2462)。表皮生長因子受體(EGFR)EGFR在調(diào)節(jié)正常細胞的增殖、分化和生存中發(fā)揮著重要作用。由于這種原因，EGFR的狀態(tài)往往在一系列人腫瘤中發(fā)生了改變，并通常與預(yù)后不良相關(guān)。在腫瘤細胞中，EGFR通過各種不同途徑促進細胞成長和生存(Maehama，TandDixon，JE;Thetumoursuppressor,PTEN/MMAC1，d印hosphorylatesthelipidsecondmessenger,phosphatidylinositol3，4，5_trisphosphate，JBiolChem.，1998，273，13375-13378)。EGFR異常是膠質(zhì)母細胞瘤最常見的分子畸變(Zawrocki，AandBiernat，W;Epidermalgrowthfactorreceptoringlioblastoma,FoliaNeuropathol.，2005，43，123—132)。EGFR基因擴增和mRNA表達頻繁發(fā)生于起源于星形細胞的高級別膠質(zhì)瘤，并總是與EGFR蛋白的水平增加相關(guān)(Wong，AJ，Bigner，SH，Bigner，DD，Kinzler，KW，Hamilton，SR，andVogelstein，B^Increasedexpressionoftheepidermalgrowthfactorreceptorgeneinmalignantgliomasisinvariablyassociatedwithgeneamplification,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1987，84，6899-6903;Chaffanet，M，Chauvin，C，Laine，M，Berger，F(xiàn)，Chedin，M，Rost，N，Nissou，MF，andBenabid，AL;EGFreceptoramplificationandexpressioninhumanbraintumours,1992，Eur.JCancer，28，11—17)。.據(jù)手艮道，無基因擴增的蛋白過量表達發(fā)生于多達27X的GBM中，但是，惡性度較低的星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤也報告發(fā)生無基因擴增的EGFR過量表達(Reifenberger，J，Reifenberger，G，Ichimura，K，Schmidt,EE，Wechsler，W，andCollins,VP;Epidermalgrowthfactorreceptorexpressioninoligodendroglialtumours,Am.JPathol.，1996，149，29_35)。EGFR在腦瘤中擴增/過量表達對預(yù)后的影響目前尚有爭議。有些作者并沒有發(fā)現(xiàn)EGFR擴增/過量表達對患者的生存期有任何影響(Olson,JJ，Barnett，D，Yang，J，Assietti，R，Cotsonis，G，andJames，CD;Geneamplificationasaprognosticfactorinprimarybraintumours,ClinCancerRes.，1998，4，215—222;Newcomb，EW，Cohen，H，Lee，SR，Bhalla，SK，Bloom，J，Hayes，RL，andMiller，DC^Survivalofpatientswithglioblastomamultiformeisnotinfluencedbyalteredexpressionofpl6，p53，EGFR，MDM2orBcl-2genes，BrainPathol.，1998，8，655_667;Waha，A，Ba麗nn，A，Wolf，HK，F(xiàn)immers，R，Neumann,J，Kindermann，D，Astrahantseff，K，Blumcke，I，von，DA，andSchlegel，U山ackofprognosticrelevanceofalterationsintheepidermalgrowthfactorreceptor—transforminggrowthfactor—alphapathwayinhumanastrocyticgliomas,JNeurosurg.，1996，85，634-641)，而另外一些作者則認為這些變化是一個消極的預(yù)后因素(Etie騰，MC，F(xiàn)o擺nto，幾，Leb進-Frenay，C，Gioa皿i，J，Chatel，M，Paquis，P，Bernard,C，Couirdi，A，Bensadoun，RJ，Pignol，JP，F(xiàn)rancoual，M，Grellier，P，F(xiàn)renay，M，andMilano，G;Epidermalgrowthfactorreceptorandlabellingindexareindependentprognosticfactorsinglialtumouroutcome,ClinCancerRes.，1998，4，2383-2390;Jaros，E，Peiry，RH，Adam，L，Kelly，PJ，Crawford,PJ，Kalbag，RM，Mendelow，AD，Sengupta，RP，andPearson,AD;Prognosticimplicationsofp53protein，epidermalgrowthfactorreceptor,andKi—671abellinginbraintumours,Br.JCancer,1992，66，373-385;Schlegel，J，Merdes，A，St翻，G，Albert,FK，F(xiàn)orsting，M，Hynes，N，andKiessling，M^Amplificationoftheepidermal_growth_factor—receptorgenecorrelateswithdifferentgrowthbehaviourinhumanglioblastoma,Int.JCancer,1994，56，72_77;Zhu，A，Shaeffer，J，Leslie,S，Kolm，P，andEl-Mahdi，AM;Epidermalgrowthfactorreceptor:anindependentpredictorofsurvivalinastrocytictumoursgivendefinitiveirradiation,Int.JRadiat.Oncol.BiolPhys.，1996,34,809-815)。對于癌細胞上的EGFR分子有幾種治療方法。研究最為廣泛的治療方法包括特異性抗體療法(使用未修飾抗體或與毒素、脂質(zhì)體或核素共軛形成的抗體)以及使用受體酪氨酸激酶抑制劑。有幾種直接作用于EGFRwt的單克隆抗體。這些抗體的使用阻斷了其配體(西妥昔單抗)的進入和/或受體(ABX-EGF)快速內(nèi)化(Sridhar，SS，Seymour,L，andSh印herd，F(xiàn)A;Inhibitorsofepidermal—growth—factorreceptors:areviewofclinicalresearchwithafocusonnon_small_celllungcancer，LancetOncol.，2003，4，397-406)。由于EGFRwt也在正常的細胞表面發(fā)生，因此副作用可能會限制其使用。EGFR在頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)中過量表達，其表達水平與生存期下降相關(guān)。阻斷EGFR的療法在臨床試驗中以及和標準療法結(jié)合使用時顯示的療效都有限。EGFRvIII在頭頸部鱗狀細胞癌中表達，導致癌細胞生長加快并且對靶向型野生型EGFR產(chǎn)生抗性。EGFR靶向策略的抗腫瘤療效可通過加入EGFRvIII特異性阻滯劑而得到提高(Sok，JC，Coppelli，F(xiàn)M，Thomas,SM，Lango，MN，Xi，S，H皿t，幾，F(xiàn)reilino，ML，Gra證，麗，Wikstrand，CJ，Bigner，DD，Gooding，WE，F(xiàn)urnari，F(xiàn)B，andGrandis，JR;Mutantepidermalgrowthfactorrec印tor(EGFRvIII)contributestoheadandneckcancergrowthandresistancetoEGFRtargeting,ClinCancerRes.，2006，12，5064-5073)。另一種策略是有選擇性地誘導過量表達EGF受體的膠質(zhì)母細胞瘤細胞和其他癌細胞的死亡。使用包裹EGF受體的非病毒輸送載體，使一種細胞凋亡的強激活劑-合成抗增殖型dsRNA(聚肌苷-胞嘧啶[polyIC])選擇性地耙向作用于癌細胞。EGFR耙向性polyIC在體外和體內(nèi)誘導耙細胞迅速凋亡。向腫瘤輸送EGFR耙向性polyIC導致了預(yù)先建立的裸鼠模型中顱內(nèi)腫瘤完全消退，而且對正常腦組織未產(chǎn)生明顯的不良毒性作用。治療一年后，受治小鼠仍然沒有癌癥并且健康狀況良好(Shir，A，Ogris，M，Wagner，E，andLevitzki，A;EGFrec印tor—targetedsyntheticdouble—strandedRNAeliminatesglioblastoma,breastcancer,andadenocarcinomatumoursinmice,PLoS.Med，2006Jan;3(1):e6.Epub2005Dec6)。應(yīng)用小型干擾RNA(siRNA)已成為調(diào)節(jié)基因表達的一種有效的高度特異性工具，并且廣泛的致癌基因已被成功地壓制。在EGFR表達水平各異的兩種膠質(zhì)瘤細胞株中(U373MG、LN18)，siRNA介導了EGFR的下調(diào)。EGFRmRNA和蛋白質(zhì)的表達下調(diào)了70-90%。但是，siRNA治療對細胞增殖、遷移和EGFR耦合的信號級聯(lián)的激活狀態(tài)并沒有抑制作用。按照這些結(jié)果，微陣列基因表達分析結(jié)果顯示，雖然在表達模式上有特定的變化，但是只有很小的變化?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，EGFR的特異性下調(diào)對惡性膠質(zhì)瘤的單藥療法來說，可會極不夠(Vollma皿，A，Vornlocher，HP，St卿fl，T，Brockhoff，G，Apfel，R，andBogdahn，U;EffectivesilencingofEGFRwithRNAidemonstratesnon-EGFRdependentproliferationofgliomacells，Int.JOncol.，2006，28，1531—1542)。幾項已經(jīng)進行的臨床研究顯示了有希望的結(jié)果。例如h-R3為一人源化單克隆抗體，能識別EGFR外部區(qū)域，具有高親和力，能抑制酪氨酸激酶的活化。為了評價h-R3在新診斷的高級別膠質(zhì)瘤患者中的安全性、免疫原性和初步療效，已經(jīng)進行了I/II期臨床試驗(Ramos，TC，F(xiàn)igueredo，J，Catala，M，Gonzalez,S，Selva，JC，Cruz，TM，Toledo,C，Silva，S，Pestano，Y，Ramos，M，Leonard,I，Torres,0，Marinello，P，Perez，R，andLage，A;Treatmentofhigh—gradegliomapatientswiththehumanizedanti-epidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)antibodyh_R3:r印ortfromaphaseI/IItrial,CancerBiolTher.，2006，5，375-379)。EKB-569是表皮生長因子受體(EGFR)的一種有效的、低分子量、具選擇性且不19可逆的抑制劑，目前正在作為抗癌藥物進行開發(fā)。在日本患者中，進行了一項I期劑量遞增的研究。根據(jù)RECIST標準，這些患者病情穩(wěn)定，但是X光射線檢查發(fā)現(xiàn)到了腫瘤消退(Yoshimura，N，Kudoh，S，Kimura，T，Mitsuoka，S，Mats皿ra，K，Hirata，K，Matsui，K，Negoro，S，Nakagawa，K，andFukuoka，M;EKB_569，anewirreversibleepidermalgrowthfactorrec印tortyrosinekinaseinhibitor,withclinicalactivityinpatientswithnon_smallcelllungcancerwithacquiredresistancetogefitinib，UmgCancer,2006,51,363-368)。吉非替尼是一種表皮生長因子受體(EGFR)相關(guān)酪氨酸激酶的抑制劑，在常規(guī)化療失敗的非小細胞肺癌(NSCLC)患者中顯示出療效。另據(jù)報告，該藥物對NSCLC的腦轉(zhuǎn)移癌也有抗腫瘤作用。此外，EGFR突變都表明與NSCLC對吉非替尼敏感性有著很大的關(guān)系。吉非替尼對NSCLC腦轉(zhuǎn)移癌的療效也進行了評估，并且該療效與EGFR突變之間的關(guān)系也進行了評價。吉非替尼似乎能有效地治療一些患者的腦轉(zhuǎn)移癌。這些數(shù)據(jù)表明了吉非替尼治療腦轉(zhuǎn)移癌的療效與EGFR突變之間的關(guān)系(Shimato，S，Mitsudomi，T，Kosaka，T，Yatabe，Y，Wakabayashi，T，Miz皿o，M，Nakahara，N，Hatano，H，Natsume，A，Ishii，D，andYoshida，J;2006，EGFRmutationsinpatientswithbrainmetastasesfromlungcancer:associationwiththeefficacyofgefitinib，Neuro.Oncol.，8，137-144)。幾丁質(zhì)酶3樣2(CHI3L2)CHI3L2最初確定源自軟骨細胞。它經(jīng)常被描述為類風濕關(guān)節(jié)炎的靶抗原。CHI3L2與癌癥的相關(guān)性尚未確定。幾丁質(zhì)酶3樣蛋白表明可通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶和PKB介導的信號通路而剌激人體結(jié)締組織細胞(例如成纖維細胞)的增殖(ReckliesAD，WhiteC，LingH;Thechitinase3_likeproteinhumancartilageglycoprotein39(HC_gp39)stimulatesproliferationofhumanconnective—tissuecellsandactivatesbothextracellularsignal_regulatedkinase_andproteinkinaseB-mediatedsignallingpathways;BiochemJ.2002;365:119-126)。在幽門螺桿菌誘導的小鼠胃癌模型中，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶3樣蛋白大巾雖上調(diào)(TakaishiS，WangTC;GeneexpressionprofilinginamousemodelofHelicobacter-inducedgastriccancer;CancerSci.2007(3):284-293)雙皮質(zhì)素和CaM激酶-樣2蛋白(DCAMKL2)微管(MT)相關(guān)DCX蛋白在哺乳動物大腦皮層的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。有報告確認了一種蛋白激酶-雙皮質(zhì)素激酶2(DCAMKL2)，其基因區(qū)域(DC)與DCX高度同源。DCAMKL2對MT有結(jié)合活性，該活性與其DC區(qū)域以及激酶區(qū)域介導的蛋白激酶活性有相關(guān)性，因此，在DCAMKL2結(jié)構(gòu)中，這兩個區(qū)域具有獨立的功能。DCAMKL2的過量表達可穩(wěn)定MT的細胞骨架，從而抵抗冷誘導解聚作用。DCAMKL2的自體磷酸化大大降低了DCAMKL2對MT的親和力。DCAMKL2和DCXmRNA均具有神經(jīng)系統(tǒng)特異性，并且在大腦皮層片層化期間表達。DCX在出生后下調(diào)，而DCAMKL2表達量豐富直至成年期，這表明DC序列在成熟神經(jīng)系統(tǒng)中具有先前發(fā)現(xiàn)的功能。在交感神經(jīng)元中，DCAMKL2位于細胞體以及軸突和樹突的終端部分。在神經(jīng)元生長錐附近，DCAMKL2可能扮演磷酸化依賴性開關(guān)的角色，可逆性地控制MT的動態(tài)。DCAMKL2的表達模式、功能活動、調(diào)節(jié)作用和位置表明，它與DC基因家族(DC區(qū)域編碼基因)的其他成員一起或合作參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要事件，也可能參與成熟神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的這些事件。DCAMKL2包含兩個獨立的功能區(qū)域-MT結(jié)合和穩(wěn)定區(qū)域(DC序列)以及具有蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶的激酶區(qū)域。有研究表明，DC序列在轉(zhuǎn)導胞外誘化源及其胞內(nèi)信號從而發(fā)生MT動力學改變中發(fā)揮著重要作用。特別是，根據(jù)其與MT以磷酸化調(diào)節(jié)的方式相互作用之能力以及進入軸突和樹突終端部分之能力(MT的區(qū)域具有動態(tài)不穩(wěn)定性)，DCAMKL2應(yīng)被視為細胞骨架快速重構(gòu)的一種潛在候選介導子，這種重構(gòu)的發(fā)生是對神經(jīng)元信號傳導事件的響應(yīng)(Edelman，AM，Kim，WY，Higgins，D，Goldstein,EG，Oberdoerster，M，andSigurdson，W;Doublecortinkinase-2，anoveldoublecortin—relatedproteinkinaseassociatedwithterminalsegmentsofaxonsanddendrites，JBiolChem.，2005，280，8531-8543)。ATP敏感性內(nèi)向整流鉀通道10(KCNJ10)內(nèi)向整流鉀通道(Kir)的主要作用是建立膠質(zhì)細胞的細胞膜和強負靜息膜電位(RMP)的高度的鉀離子(K+)選擇性，這兩者是膠質(zhì)細胞特有的生理特性。Kir的經(jīng)典特性是，當RMP對鉀離子的平衡電位(E(K))為負時，鉀離子向內(nèi)流動，但是有更多的正電位時，就會抑制向外電流。中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞的特征是表達KCNJIO亞型，這是鉀離子在膠質(zhì)細胞膜內(nèi)傳導的主要方式并且在確定膠質(zhì)細胞RMP中具有關(guān)鍵的作用。因此，Kir，特別是KCNJ10是膠質(zhì)細胞功能的主要調(diào)節(jié)因子，而這又決定了神經(jīng)元的興奮性和軸突的傳導性(Butt，AMandKalsi，A;Inwardlyrectifyingpotassiumchannels(Kir)incentralnervoussystemglia:aspecialroleforKir4.linglialfunctions,JCellMol.Med，2006，10,33-44)。星形膠質(zhì)細胞鉀和谷氨酸的緩沖能力下降會導致神經(jīng)元過度興奮以及突觸傳遞異常。KCNJ10通路主要負責皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞的重要超極化，并有可能在鉀緩沖中發(fā)揮重要作用。KCNJ10水平降低后，星形膠質(zhì)細胞中的谷氨酸清除得到明顯的抑制，這突出了膜超極化在這一過程中的作用(Kucheryavykh，YV，Kucheryavykh，LY，Nichols,CG，Maldonado，HM，Baksi，K，Reichenbach,A，Skatchkov，SN，andEaton，MJ;，DownregulationofKir4.linwardrectifyingpotassiumchannelsubunitsbyRNAiimpairspotassiumtransferandglutamateuptakebyculturedcorticalastrocytes,Glia2006,55(3)，274-281)。由于KCNJ10在膠質(zhì)細胞表面分布不均勻，所以，KCNJ10只能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞外鉀離子進行空間緩沖。在各種人腦腫瘤(低、高級別的星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤)中，觀察到了KCNJ10移位，這表明膠質(zhì)細胞的緩沖能力可能會受到影B向，從而導致水侵入(細胞毒性水月中)(Warth，A，Mittelbronn，M，andWolburg，HRedistributionofthewatercha皿elproteinaqu即orin—4andtheK+cha皿elproteinKir4.ldiffersinlow-andhigh-gradehumanbraint咖ours，ActaNeuropathol.(Berl)，2005，109，418-426)。在腦損傷的星形膠質(zhì)細胞中，KCNJ10表達也上調(diào)。于是，研究人員提出了這樣的假說在星形膠質(zhì)細胞中，正常情況下AQP4將水分運輸與KCNJ10介導的鉀離子虹吸管運輸結(jié)合，但是在病理狀態(tài)下，AQP4促進了腦水腫液的流動，并且KCNJ10緩沖了增多的細胞夕卜鉀離子(Saadoun，S，P即adopoulos，MC，andKrishna，S;WatertransportbecomesuncoupledfromK+siphoninginbraincontusion,bacterialmeningitis，andbraintumours:imm皿ohistochemicalcasereview,JClinPathol.，2003，56，972—975)。21發(fā)明人用給定氨基酸序列的"變種"表示，一個或多個氨基酸殘基等的側(cè)鏈通過被另一個天然氨基酸殘基的側(cè)鏈或其他側(cè)鏈取代而發(fā)生改變，這樣，這種肽仍然能夠以含有給定氨基酸序列的肽大致同樣的方式與HLA分子結(jié)合。例如，一種肽可能被修飾以便至少維持(如果不提升的話)其與HLA-A或-DR等合適的MHC分子互動和結(jié)合，以及至少維持(如果不提升的話)其產(chǎn)生能識別和殺傷細胞(這些細胞表達含本發(fā)明中所定義的一種氨基酸序列的多肽)的激活CTL的能力。正如數(shù)據(jù)庫中所述，HLA-A結(jié)合肽的某些位點通常為錨定殘基，可形成一種與HLA結(jié)合槽的結(jié)合基序相稱的核心序列。這些不與T細胞受體互動的氨基酸殘基可通過取代另一個幾乎不影響T細胞反應(yīng)并不妨礙與相關(guān)MHC結(jié)合的氨基酸而得到修飾。因此，除了特定限制性條件外，本發(fā)明中的肽可能為任何包括給定氨基酸序列或段或變體的肽(發(fā)明人所用的這個術(shù)語包括寡肽或多肽)。MHC-II類提呈肽更為大家熟知，這些肽由含有一個"核心序列"，該序列含某種HLA特異性氨基酸基序，視情況還含有不干擾肽核心序列功能的N和/或C-端延伸區(qū)(即，它們被視為與肽和所有或部分能識別其天然配對物的T細胞克隆物之間的相互作用無關(guān))。N-和/或C端可分別延伸l至10個氨基酸的長度。這些肽可直接用于加載MHC-II類分子或其序列可克隆入下文所述載體。由于這些肽可在細胞內(nèi)形成較大肽加工過程的最終產(chǎn)物，因此，也可用長肽。本發(fā)明中肽的大小不限，但通常它們的分子量可能小于100000，優(yōu)選為小于50000，更優(yōu)選為小于10000，通常約為5000。對于氨基酸殘基數(shù)目，本發(fā)明中的肽可能少于1000個殘基，優(yōu)選為少于500個殘基，更優(yōu)選為少于IOO個殘基。因此，本發(fā)明還提出了總長度為8至100個、優(yōu)選為8至30個、最優(yōu)選為8至16個(即8、9、10、11、12、13U4、15或16個)氨基酸的肽或變體。相應(yīng)地，誘導T細胞與本發(fā)明中的肽發(fā)生交叉反應(yīng)的天然或人工變體往往為長度可變的變體。表l中分別列舉了長度為SEQIDNO11、12、21、24的天然變體的例子。如果長度約為12個氨基酸殘基的肽直接與MHC-II類分子結(jié)合，那么，兩側(cè)有核心HLA結(jié)合區(qū)、且不會對該肽與MHC-II類分子的結(jié)合槽特異性結(jié)合能力或該肽提呈至CTL的能力產(chǎn)生重大影響的殘基則為優(yōu)選。但是，正如上所述，應(yīng)了解，可使用較大的肽(例如，核苷酸進行編碼時)，因為這些較大的肽可被適當?shù)目乖岢始毎殖善?。MHC-I類表位(通常長度為8至10個氨基酸)也可能由肽從較長的肽或包含實際表位的蛋白中加工而產(chǎn)生。與MHC-II表位相似，兩側(cè)有結(jié)合區(qū)、不會對該肽與MHC-I類分子的結(jié)合槽特異性結(jié)合能力或該肽提呈至CTL的能力產(chǎn)生重大影響、也不會掩蓋加工過程中暴露實際表位所需蛋白裂解位點的殘基為MHC-I類表位的優(yōu)選。因此，本發(fā)明還提出了總長度為8至100個、優(yōu)選為8至30個、最優(yōu)選為8至16個(即8、9、10、11、12、13、14、15或16個)氨基酸的MHC-I類表位的肽或變體。當然，本發(fā)明中的肽或變體能與人主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I或II類分子結(jié)合。肽或變體與MHC復(fù)合物結(jié)合性可用本領(lǐng)域內(nèi)的已知方法進行測試，例如，本發(fā)明實施例4中所述的方法或文獻中所述的檢測不同MHC-II類等位基因的方法(例如，VogtAB，KropshoferH，KalbacherH，KalbusM，RammenseeHG，ColiganJE，MartinR;LigandmotifsofHLA-DRB5柳101andDRB1^1501moleculesdelineatedfromself-p印tides;JImmunol.1994;153(4):1665—1673;MalcherekG，GnauV，StevanovicS，RammenseeHG，JungG，MelmsA;Analysisofallele—specificcontactsitesofnaturalHLA-DR171igands;JImmunol.1994;153(3):1141-1149;ManiciS，St咖ioloT，ImroMA，HammerJ，SinigagliaF，NoppenC，SpagnoliG，MazziB，BelloneM，DellabonaP，ProttiMP;MelanomacellspresentaMAGE-3印itopetoCD4(+)cytotoxicTcellsinassociationwithhistocompatibilityleukocyteantigenDR11;JExpMed.1999;189(5):871-876;HammerJ，GallazziF，BonoE，KarrRW，GuenotJ，ValsasniniP，NagyZA，SinigagliaF;P印tidebindingspecificityofHLA_DR4molecules-correlationwithrheumatoidarthritisassociation;.JExpMed.1995181(5):1847-1855;TompkinsSM，RotaPA，MooreJC，JensenPE;AeuropiumfluoroimmunoassayformeasuringbindingofantigentoclassIIMHCglycoproteins;JImmunolMethods.1993;163(2):209-216;BoytonRJ，Lohma皿T，LondeiM，KalbacherH，HaiderT，F(xiàn)raterAJ，DouekDC，LeslieDG，F(xiàn)lavellRA，AltmannDM;GlutamicaciddecarboxylaseTlymphocyteresponsesassociatedwithsusceptibilityorresistancetotypeIdiabetes:analysisindiseasediscordanthumantwins,non_obesediabeticmiceandHLA-DQtransgenicmice;IntImmunol.1998(12):1765-1776)。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選實施方案中，肽系由或基本系由根據(jù)SEQIDNOl至SEQIDN029所選的氨基酸序列組成。"基本由...組成"系指本發(fā)明的肽，除了根據(jù)SEQIDNo.1至SEQIDNo.29中的任一序列或其變體組成外，還含有位于其他N和/或C端延伸處的氨基酸，而它們不一定能形成作為MHC分子表位的肽。但這些延伸區(qū)域?qū)τ行⒈景l(fā)明中的肽引進細胞具有重要作用。在本發(fā)明的一實施案中，本發(fā)明的肽為融合蛋白，含來自NCBI、GenBank登錄號X00497的HLA-DR抗原相關(guān)不變鏈(p33，以下稱為"Ii"鏈)的80個N-端氨基酸等(Strubin，M.，Mach，B.andLong,E.0.ThecompletesequenceofthemRNAfortheHLA_DR_associatedinvariantchainreveals即olyp印tidewithanu皿simltransmembranepolarityEMB0J.1984,3(4)，869-872)。此外，該肽或變體可進一步修飾以提高穩(wěn)定性和/或與MHC分子結(jié)合，從而引發(fā)更強的免疫反應(yīng)。肽序列的該類優(yōu)化方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，包括，例如，反式肽鍵和非肽鍵的引入。在反式肽鍵氨基酸中，肽(-C0-NH-)并未連接其殘基，但是其肽鍵是反向的。這種逆向反向模擬肽(retro-inversop印tidomimetics)可通過本領(lǐng)域已知的方法制備，例如Meziere等人在《免疫學雜志》(J.Immunol.1997，159,3230-3237)中所述的方法，以引用的方式并入本文。這種方法涉及制備包含骨架(而并非側(cè)鏈)改變的模擬肽。Meziere等人(1997年)的研究顯示，這些模擬肽有利于MHC和輔助性T細胞的反應(yīng)。以NH-CO鍵替代C0-NH肽鍵的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。非肽鍵為_CH2_NH、_CH2S_、_CH2CH2_、_CH=CH_、_C0CH2_、_CH(OH)CH廠和-CH^0-等。美國4897445號專利提出了多肽鏈中非肽鍵(_CH2_NH)的非固相合成法，該方法涉及按標準程序合成的多肽以及通過氨基醛和一種含NaCNBH3的氨基酸相互作用而合成的非肽鍵。含上述序列的肽可與其氨基和/或羧基末端的其他化學基團進行合成，從而提高肽的穩(wěn)定性、生物利用度、和/或親和力等。例如，芐氧羰基、丹酰基等疏水基團或叔丁氧羰基團可加入肽的氨基末端。同樣，乙酰基或9-芴甲氧羰基可能位于肽的氨基末端。此外，疏水基團、叔丁氧羰基團或氨基團都可能被加入肽的羧基末端。另外，本發(fā)明中的所有肽都可能經(jīng)合成而改變其空間構(gòu)型。例如，可能使用這些肽的一個或多個氨基酸殘基的右旋體，通常不是其左旋體。更進一步地，本發(fā)明中肽的至少一個氨基酸殘基可被熟知的一個非天然氨基酸殘基取代。諸如此類的改變可能有助于增加本發(fā)明肽的穩(wěn)定性、生物利用度和/或結(jié)合作用。同樣，本發(fā)明中的肽或變體可在合成肽之前或之后通過特異氨基酸的反應(yīng)而進行化學修飾。此類修飾的實施例為本領(lǐng)域所熟知，例如，在R.Lundblad所著的《ChemicalReagentsforProteinModification》(3rded.CRCPress,2005)中有概述，以參考文獻的方式并入本文。雖然氨基酸的化學修飾方法無限制，但其包括(但不限于)通過以下方法修飾?；㈦呋?、賴氨酸吡眵基化、還原烷基化、以2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基團、通過將半胱氨酸過甲酸氧化為磺基丙氨酸而對羧基團和巰基進行氨基修飾、形成易變衍生物、與其他巰基化合物形成混合二硫化合物、與馬來酰亞胺反應(yīng)，與碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化、在堿性pH值下與氰酸鹽甲氨酰化。在這方面，技術(shù)人員參考了《CurrentProtocolslnProteinScience》(Eds.Coliganetal.(JohnWiley&SonsNY1995-2000))中第15章所述的在蛋白質(zhì)化學修飾相關(guān)的廣泛方法。簡言之，修飾蛋白質(zhì)的精氨酰殘基等往往基于于鄰二羰基化合物(如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮以及l(fā)，2-烯巳二酮)的反應(yīng)而形成加合物。另一個實施例是丙酮醛與精氨酸殘基的反應(yīng)。半胱氨酸可在賴氨酸和組氨酸等親核位點不作隨同修飾的情況下就得到修飾。因此，有大量試劑可進行半胱氨酸的修飾。Pierce化學公司、Sigma-Aldrich公司以及其他公司的網(wǎng)站含有具體試劑的信息。蛋白質(zhì)中二硫鍵的選擇性還原也很普遍。二硫鍵可在生物制藥熱處理中形成和氧化。伍德沃德氏試劑K可用于修飾特定的谷氨酸殘基。N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基-碳二亞胺可用于形成賴氨酸殘基和谷氨酸殘基的分子內(nèi)交聯(lián)。例如焦碳酸二乙酯是修飾蛋白質(zhì)組氨酸殘基的試劑。組氨酸也可使用4-羥基-2-壬烯醛進行修飾。賴氨酸殘基與其他a-氨基團的反應(yīng)，例如，有利于肽結(jié)合到蛋白/肽的表面或交聯(lián)處。賴氨酸聚是多(乙烯)乙二醇的附著點，也是蛋白質(zhì)糖基化的主要修飾位點。蛋白質(zhì)的蛋氨酸殘基可通過碘乙酰胺、溴乙胺、氯胺T等被修飾。四硝基甲烷和N-乙?；溥蚩捎糜诶野彼釟埢男揎?。經(jīng)二酪氨酸形成的交聯(lián)可通過過氧化氫/銅離子完成。對色氨酸修飾的最近研究中使用了N-溴代琥珀酰亞胺、2_羥基-5-硝基芐溴或3-溴-3-甲基-2-(2-硝苯巰基)-3H-吲哚(BPNS-糞臭素)。當?shù)鞍着c戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交聯(lián)用于配制水凝膠時，治療性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修飾往往可延長循環(huán)半衰期。針對免疫治療的變態(tài)反應(yīng)原化學修飾往往通過氰酸鉀的氨基甲?；瘜崿F(xiàn)?！N肽或變體，其中肽被修飾或含非肽鍵，優(yōu)選為本發(fā)明的實施方案?！銇碚f，肽和變體(至少含氨基酸殘基之間的肽聯(lián)接)可使用Lu等人(1981)J.Org.Chem.46，3433)以及此處列出的參考文獻所披露的固相肽合成Fmoc-聚酰胺模式進24行合成。芴甲氧羰基(Fmoc)團對N-氨基提供臨時保護。使用N，N-二甲基甲酰胺中的20X二甲基哌啶中對這種堿高度敏感的保護基團進行重復(fù)分裂。由于它們的丁基醚(在絲氨酸蘇氨酸和酪氨酸的情況下)、丁基酯(在谷氨酸和天門冬氨酸的情況下)、叔丁氧羰基衍生物(在賴氨酸和組氨酸的情況下)、三苯甲基衍生物(在半胱氨酸的情況下)及4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；苌?在精氨酸的情況下)，側(cè)鏈功能可能會受到保護。只要谷氨酰胺和天冬酰胺為C-末端殘基，側(cè)鏈氨基功能保護所使用的是由4，4'-二甲氧基二苯基團。固相支撐基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物，其由三個單體二甲基丙烯酰胺(骨架單體)、雙丙烯酰乙烯二胺(交聯(lián)劑)和N-丙烯酰肌胺酸甲酯(功能劑)組成。使用的肽-樹脂聯(lián)劑為酸敏感的4-羥甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物均作為其預(yù)制對稱酸酐衍生物加入，但是天冬酰胺和谷氨酰胺除外，它們使用被逆轉(zhuǎn)的N，N-二環(huán)己基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑介導的耦合程序而加入。所有的耦合和脫保護反應(yīng)用茚三酮、硝基苯磺酸或isotin測試程序監(jiān)測。合成完成后，用濃度為95%含50%清道夫混合物的三氟醋酸，從伴隨去除側(cè)鏈保護基團的樹脂支承物中裂解肽。常用的清道夫混合物為乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，準確的選擇依據(jù)合成肽的氨基酸組成。此外，固相和液相方法結(jié)合使用對肽進行合成是可會g的(例如，請參閱BruckdorferT，MarderO，AlbericioF.Fromproductionofpeptidesinmilligramamountsforresearchtomulti_tonquantitiesfordrugsofthefutureCurrPharmBiotechnol.2004Feb;5(1):29-43以及本文引用的參考文獻)。三氟乙酸用真空中蒸發(fā)、隨后用承載粗肽的二乙基乙醚滴定進行去除。用簡單萃取程序(水相凍干后，該程序制得不含清道夫混合物的肽)清除任何存在的清道夫混合物。肽合成試劑一般可從Calbiochem-Novabiochem(英國)公司(NG72QJ，英國)獲得。純化可通過以下技術(shù)的任何一種或組合方法實現(xiàn)，如再結(jié)晶法、體積排阻色譜法、離子交換色譜法、疏水作用色譜法以及(通常)反相高效液相色譜法(如使用乙腈/水梯度分離)。肽分析可使用以下方法進行薄層色譜法、電泳法、特別是，毛細管電泳法、固相萃取法(CSPE)、反相高效液相色譜法、酸水解后的氨基酸分析、快原子轟擊(FAB)質(zhì)譜分析法以及MALDI、ESI-Q-T0F質(zhì)譜分析法。另一方面，本發(fā)明提出了一種編碼本發(fā)明中肽或變體的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能為DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA、mRNA和siRNA或其組合物，它們可為單鏈和/或雙鏈、或多聚核苷酸的原生或穩(wěn)定形式(如具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，并且只要它編碼肽，就可能包含也可能不包含內(nèi)含子。當然，多聚核苷酸只能編碼加入天然肽鍵并含有天然氨基酸殘基的肽。另一個方面，本發(fā)明提出了一種可根據(jù)本發(fā)明表達多肽的表達載體。對于多核苷酸的可操作性連接，已經(jīng)開發(fā)出多種方法，尤其是針對DNA，可通過向載體補充可連接性末端等方法進行連接。例如，可向DNA片段加入補充性均聚物軌道，之后DNA片段被插入到載體DNA。然后，通過補充性均聚物尾巴的氫鍵結(jié)合，將載體和DNA片段結(jié)合，從而形成重組DNA分子。含有一個或多個酶切位點的合成接頭為DNA片段與載體連接提供了另一種方法。含各種限制性核酸內(nèi)切酶的合成接頭可通過多種渠道購得，其中包括從國際生物技術(shù)公司(InternationalBiotechnologiesInc，NewHaven，CN，美國)購得。編碼本發(fā)明多肽的DNA理想修飾方法利用Saiki等人(1988年)在《科學》(Science239，487-491)雜志上披露的聚合酶鏈反應(yīng)方法。此方法可用于將DNA引入合適的載體(例如，通過設(shè)計合適的酶切位點)，也可用于本領(lǐng)域已知的其它有用方法修飾DNA。如果使用病毒載體，痘病毒載體或腺病毒載體為優(yōu)選。之后，DNA(或在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體情況下，RNA)可能表達于合適的宿主，從而制成含本發(fā)明肽或變體的多肽。因此，可根據(jù)已知技術(shù)使用編碼本發(fā)明肽或變體的DNA，用本文所述方法適當修飾后，構(gòu)建表達載體，然后表達載體用于轉(zhuǎn)化合適宿主細胞，從而表達和產(chǎn)生本發(fā)明中的多肽。這些方法包括下列美國專利中披露的方法1984年4月3日授予Rutter等人的4440859號美國專利、1985年7月23日授予Weissman的4530901號美國專利、1986年4月15日授予Crowl的458200號美國專利、1987年6月30日授予Mark等人的4677063號美國專利、1987年7月7日授予Goeddel的4678751號美國專利、1987年11月3日授予Itakura等人的4704362號美國專利、1987年12月1日授予Murray的4710463號美國專利、1988年7月12日授予Toole、Jr.等人的4757006號美國專利、1988年8月23日授予Goeddel等人的4766075號美國專利、1989年3月7日授予Stalker的4810648號美國專利，這些專利號以參考文獻的方式并入本文。編碼含本發(fā)明化合物多肽的DNA(或在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體情況下，RNA)可能被加入到其它多種DNA序列，從而引入到合適的宿主中。同伴DNA將取決于宿主的性質(zhì)、DNA引入宿主的方式、以及是否需要保持為游離體還是要相互結(jié)合?！銇碚f，DNA可以適當?shù)姆较蚝驼_的表達閱讀框架附著到一種表達載體(如質(zhì)粒)中。如有必要，該DNA可能與所需宿主所識別的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)控制核苷酸序列連接，盡管表達載體中一般存在此類控制功能。然后，該載體通過標準方法被引入宿主。一般來說，并不是所有的宿主都會被載體轉(zhuǎn)化。因此，有必要選擇轉(zhuǎn)化過的宿主細胞。選擇方法包括用任何必要的控制元素向表達載體插入一個DNA序列，該序列對轉(zhuǎn)化細胞中的可選擇性屬性(如抗生素耐藥性)進行編碼。另外，有這種選擇屬性的基因可在另外一個載體上，該載體用來協(xié)同轉(zhuǎn)化所需的宿主細胞。然后，本發(fā)明中的重組DNA所轉(zhuǎn)化的宿主細胞在本文中所述本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的合適條件下培養(yǎng)足夠長的時間，從而表達之后可回收的肽。有許多已知的表達系統(tǒng)，包括細菌(如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)、酵母(如酵母菌)、絲狀真菌(如曲霉菌)、植物細胞、動物細胞及昆蟲細胞。該系統(tǒng)可優(yōu)選為哺乳動物細胞，如來自ATCC細胞生物學庫(CellBiologyCollection)中的結(jié)直腸癌或膠質(zhì)母細胞瘤細胞?！獋€典型的哺乳動物細胞載體質(zhì)粒是從Pharmacia公司(Piscataway，新澤西，美國)獲得的pSVL。一種可誘導型哺乳動物表達載體的例子是pMSG，也可以從Pharmacia公司獲得。有用的酵母質(zhì)粒載體是pRS403-406和pRS413-416，一般可從StratageneCloningSystems公司(LaJolla，CA92037，美國)獲得。質(zhì)粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合型質(zhì)粒(YIp)，并插入了酵母可選擇性標記物HIS3、TRP1、LEU2和URA3。pRS413-416質(zhì)粒為酵母著絲粒質(zhì)粒(Ycp)。其他與各種宿主細胞一起應(yīng)用的載體和表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知眾所周知的。本發(fā)明還涉及一種宿主細胞，其以本發(fā)明的多核苷酸載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化而來。宿主細胞可為原核細胞，也可為真核細胞。在有些情況下，細菌細胞為優(yōu)選原核宿主細胞，典型為大腸桿菌株，例如，大腸桿菌菌株DH5(從BethesdaResearchLaboratories公司(Bethesda，MD，美國)獲得)和RR1(從美國菌種保藏中心(ATCC，Rockville，MD，美國)，ATCC編號31343獲得)。首選的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞，優(yōu)選為脊椎動物細胞，如小鼠、大鼠、猴子或人成纖維細胞和結(jié)腸癌細胞株中的細胞。酵母宿主細胞包括YPH499、YPH500和YPH501，一般可從StratageneCloningSystems公司(LaJolla，CA92037，美國)獲得。首選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CH0)細胞為ATCC中的CCL61細胞、NIH瑞士小鼠胚胎細胞NIH/3T3為ATCC中的CRL1658細胞、猴腎源性C0S-1細胞為ATCC中的CRL1650細胞以及人胚胎腎細胞的293號細胞。首選昆蟲細胞為Sf9細胞，可用桿狀病毒表達載體轉(zhuǎn)染。含本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的適當宿主細胞的轉(zhuǎn)化可使用大家熟知的方法完成，通常取決于使用載體的類型。對于原核宿主細胞的轉(zhuǎn)化，可參閱，如Cohen等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA1972，69，2110中以及Sambrook等人(1989)所著《MolecularCloning,ALaboratoryMa皿al》ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY中使用的方法。酵母細胞的轉(zhuǎn)化在Sherman等人(1986)在MethodsInYeastGenetics,ALaboratoryMa麗l，ColdSpringHarbor，NY中有描述。Beggs，Nature1978，275，104-109中所述方法也很有用。對于脊椎動物細胞，轉(zhuǎn)染這些細胞的試劑等，例如，磷酸鈣和DEAE-葡聚糖或月旨質(zhì)體配方，可從StratageneCloningSystems公司或LifeTechnologies公司(Gaithersburg，MD20877，美國)獲得。電穿孔也可用于轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染細胞，是本領(lǐng)域用于轉(zhuǎn)化酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和脊椎動物細胞大家熟知的方法。被成功轉(zhuǎn)化的細胞(即含本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的細胞)可用本領(lǐng)域熟知的方法(如PCR)進行識別。另外，上清液存在的蛋白可使用抗體進行檢測。應(yīng)了解，本發(fā)明中的某些宿主細胞用于制備本發(fā)明中的肽，例如細菌細胞、酵母細胞和昆蟲細胞。但是，其他宿主細胞可能對某些治療方法有用。例如，抗原提呈細胞(如樹突狀細胞)可用于表達本發(fā)明中的肽，使他們可以加載入相應(yīng)的MHC分子中。因此，本發(fā)明提出了含本發(fā)明中核酸或表達載體的一種宿主細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞為抗原提呈細胞，尤其是樹突狀細胞或抗原提呈細胞。目前，載有含前列腺酸性磷酸酶(PAP)的重組融合蛋白正在針對用于治療前列腺癌(Sipuleucel-T)進行研究(SmallEJ，SchellhammerPF，HiganoCS，RedfemCH，NemunaitisJJ，ValoneFH，VerjeeSS，JonesLA，HershbergRM.;Placebo—controlledphase3trialofimmunologictherapywithsipuleucel-T(APC8015)inpatientswithmetastatic,asymptomatichormonerefractoryprostatecancer;JClinOncol.2006;24(19):3089-3094;RiniBI，WeinbergV，F(xiàn)ongL，ConryS，HershbergRM，SmallEJ;Combinationimmunotherapywithprostaticacidphosphatasepulsedantigen-presentingcells(Provenge)plusbevaciz咖abinpatientswithserologicprogressionofprostatecancerafterdefinitivelocalther鄰ysCancer.2006;107(1):67-74)。另一方面，本發(fā)明提出了制備一種肽或及其變體的一種方法。該方法包括培養(yǎng)宿27主細胞和從宿主細胞或其培養(yǎng)基中分離肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明中的肽、核酸或表達載體用于藥物中。例如，肽或其變體可制備為靜脈(i.v.)注射劑、皮下(s.c.)注射劑、皮內(nèi)(i.d.)注射劑J復(fù)腔(i.p.)注射劑、肌肉(i.m.)注射劑。肽注射的優(yōu)選途徑為s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的優(yōu)選途徑為i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，給予50yg至1.5mg，優(yōu)選為125iig至500iig的肽或DNA，這取決于具體的肽或DNA。上述劑量范圍在以前的試驗中成功使用(Br皿svigPF，AamdalS，GjertsenMK，KvalheimG，Markowski-GrimsrudCJ，SveI，DyrhaugM，TrachselS，M0llerM，EriksenJA，GaudernackG;Telomerasepeptidevaccination:aphaseI/IIstudyinpatientswithnon_smallcelllungcancer;CancerImmunolImm皿other.2006;55(12):1553-1564;M.Staehler，A.Stenzl，P.Y.Dietrich,T.Eisen，A.Haferkamp，J.Beck，A.Mayer，S.Walter,H.Singh，J.Frisch，C.G.Stief;AnopenlabelstudytoevaluatethesafetyandimmunogenicityofthepeptidebasedcancervaccineIMA901，ASC0meeting2007;AbstractNo3017)。本發(fā)明的一個重要方面是得出了一種體外激活CTL的方法。該方法包括將CTL與載有抗原的人I或II類MHC分子進行體外連接，這些分子在合適的抗原提呈細胞表面表達足夠的一段時間從而以抗原特異性方式激活CTL。抗原是本發(fā)明中的一種肽。優(yōu)選情況是足夠量的抗原與抗原提呈細胞一同使用。當腿C-II類表位用作一種抗原時，CTL為CD4陽性輔助細胞，優(yōu)選為TH1型。MHC-II類分子可表達于任何合適細胞的表面，優(yōu)選為不自然表達MHC-II類分子的細胞(在這種情況下，轉(zhuǎn)染細胞表達此類分子)?；蛘撸绻摷毎匀槐磉_MHC-II類分子，則該細胞在抗原加工或抗原提呈途徑中有缺陷。這樣，表達MHC-II類分子的細胞有可能在激活CTL之前就有可能被選定肽抗原幾乎完全啟動?？乖岢始毎?或剌激因子細胞)通常在其表面有一個MHC-II類分子，優(yōu)選為其本身基本上不能以選定抗原加載所述MHC-II類分子。MHC-II類分子可很容易在體外載入選定抗原。優(yōu)選情況是，哺乳動物細胞的TAP肽轉(zhuǎn)運載體缺乏或水平下降或功能降低。缺乏TAP肽轉(zhuǎn)運載體的適合細胞包括T2、RMA-S和果蠅細胞。TAP表示轉(zhuǎn)運載體相關(guān)的抗原加工。人體肽載入的缺陷細胞株T2從屬美國菌種保藏中心(ATCC，12301ParklawnDrive,Rockville，Maryland20852，美國)目錄號CRL1992;果蠅細胞株Schneider2號株從屬ATCC目錄CRL19863;小鼠薩-S細胞株Karre和Ljunggren(985)在《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.162,1745)中有過描述。優(yōu)選情況是，宿主細胞在轉(zhuǎn)染前不表達MHC-I類分子。優(yōu)選情況是，剌激因子細胞表達對T細胞共剌激起到重要作用的分子，如，B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA3中的任一種分子。大量腿C-II類分子和共剌激分子的核酸序列可從GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫中公開獲得。同樣，當MHC-I類表位用作一種抗原時，CTL為CD8陽性輔助細胞。MHC_I類分子可表達于任何合適細胞的表面，優(yōu)選為不自然表達MHC-I類分子的細胞(在這種情況下，轉(zhuǎn)28染細胞表達此類分子)。或者，如果該細胞自然表達MHC-I類分子，則該細胞在抗原加工或抗原提呈途徑中有缺陷。這樣，表達MHC-I類分子的細胞有可能在激活CTL之前就有可能被選定肽抗原幾乎完全啟動。如果抗原提呈細胞受到轉(zhuǎn)染而表達這種表位，則優(yōu)選的細胞包括一個表達載體，該載體有能力表達含SEQIDNO1至SEQIDNO29的肽或其變體氨基酸序列。可使用其他一些方法來體外生成CTL。例如，可使用下述方法Peoples等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA1995，92，432-436中、Kawakami等人在(1992)J.Immunol.148，638-643中使用自體腫瘤浸潤淋巴細胞生成CTL。Plebanski等人在(1995)Eur.J.Immunol.25,1783-1787中，使用自體外周血淋巴細胞(PLB)制得CTL。Jochmus等人在(1997)J.Gen.Virol.78，1689-1695中描述了用肽或多肽脈沖處理樹突狀細胞或通過與重組病毒感染而制成自體CTL。Hill等人在(1995)J.Exp.Med.181,2221-2228中、Jerome等人在(1993)J.Immunol.151,1654-1662中使用B細胞制成自體CTL。此外，用肽或多肽脈沖處理或用重組病毒感染的巨噬細胞可用于配制自體CTL。Walter等人在(WalterS，HerrgenL，SchoorO，J皿gG，WernetD，BuhringHJ，RammenseeHG，StevanovicS.Cuttingedge-predeterminedavidityofhumanCD8T-cellsexpandedoncalibratedMHC/anti-CD28-coatedmicrospheres.JImmunol.2Q03Nov15;171(10):4974-8)中描述了通過使用人工抗原提呈細胞體外啟動T細胞，這也是生成作用于所選肽的T細胞的一種合適也可用同種異體細胞制得CTL，實例方法在W097/26328中有詳細描述，以參考文獻方式并入本文。例如，除了果蠅細胞和T2細胞，也可用其他細胞來提呈肽，如CH0細胞、桿狀病毒感染的昆蟲細胞、細菌、酵母、牛痘感染的靶細胞。此外，也可使用植物病毒(例如，參閱Porta等人在《病毒學》(1994,202,449-955)中描述了將豇豆花葉病毒開發(fā)為一種提呈外來肽的高產(chǎn)系統(tǒng)。被激活的CTL直接針對本發(fā)明中的肽，有助于治療。因此，本發(fā)明的另一方面提出了用本發(fā)明前述方法制得的激活CTL。按上述方法制成的激活CTL將會有選擇性地識別異常表達含SEQIDNO1至29氨基酸序列的多肽的一種細胞。優(yōu)選情況是，CTL通過與其含HLA/肽復(fù)合物的TCR相互作用(如，結(jié)合)而識別該細胞。CTL是殺傷患者靶細胞方法中有用的細胞，其中患者的靶細胞異常表達含本發(fā)明中氨基酸序列的多肽。此類患者給予有效量的激活CTL。給予患者的CTL可能源自患者，并按上述方法激活(即，它們?yōu)樽泽wCTL)?；蛘撸珻TL不是源自該患者，而是來自另一個人。當然，供體優(yōu)選為健康人。"健康人"系指一個人一般狀況良好，優(yōu)選為免疫系統(tǒng)合格，更優(yōu)選為無任何可很容易測試或檢測到的疾病。根據(jù)本發(fā)明，CD4陽性CTL的靶細胞可為腫瘤細胞(有時表達腿C-II類抗原)和/或腫瘤周圍的基質(zhì)細胞(癌細胞)(有時也表達MHC-II類抗原；(Dengjel，J，Nastke，MD，Gouttefangeas，C，Gitsioudis，G，Schoor，0，Altenberend，F(xiàn)，Muller，M，Kramer,B，Missiou，A，Sauter，M，He皿enlotter，J，Wernet，D，Stenzl，A，Rammensee，HG，Klingel，K，andStevanovic，S;UnexpectedAbundanceofHLAClassIIPresentedPeptidesinPrimaryRenalCellCarcinomas,ClinCancerRes.，2006，12，4163—4170))。方法。發(fā)明的CTL可用作治療性組合物中的活性成分。因此，本發(fā)明也提出了一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發(fā)明中氨基酸序列的多肽。該方法包括給予患者上述有效量的CTL。我們所用的"異常表達"的意思包括，與正常表達水平相比，多肽過量表達，或該基因在源自腫瘤的組織中未表達，但是在該腫瘤中卻表達。"過量表達"系指多肽水平至少為正常組織中的1.2倍；優(yōu)選為至少為正常組織中的2倍，更優(yōu)選為至少5或10倍。CTL可用本領(lǐng)域已知的方法制得(如，上述方法)。CTL繼轉(zhuǎn)移方案為本領(lǐng)域所熟知的方案并可在以下參考文獻中找到，例如(Rosenberg,SA，Lotze，MT，Muul，LM，Chang，AE，Avis，F(xiàn)P，Leitman，S，Linehan，WM，Robertson,CN，Lee，RE，Rubin，JT，etal.，Aprogressreportonthetreatmentof157patientswithadvancedcancerusinglymphokine-activatedkillercellsandinterleukin_2orhigh-doseinterleukin-2alone，N.Engl.J.Med.，1987，316，889-897;Rosenberg,SA，Packard,BS，Aebersold，PM，Solomon,D，Topalian，SL，Toy,ST，Simon，P，Lotze，MT，Yang，JC，Seipp，CA，etal.;Useoftumor—infiltratinglymphocytesandinterleukin_2intheimmunotherapyofpatientswithmetastaticmelanoma.Apreliminaryr印ort，N.Engl.JMed，1988，319，1676-1680;Dudley，ME，W皿derlich，JR，Robbins，PF，Yang，JC，Hwu，P，Schwartzentruber，DJ，Topalian，SL，Sherry,R，Restifo，NP，Hubicki，AM，Robinson,MR，Raffeld，M，Duray，P，Seipp，CA，Rogers—Freezer,L，Morton,KE，Mavroukakis,SA，White,DE，andRosenberg,SA;Cancerregressionandautoimmunityinpatientsafterclonalr印opulationwithantitumorlymphocytes,Science,2002，298，850-854;Yee，C，Thompson,JA，Byrd，D，Riddell，SR，Roche，P，Celis，E，andGreenberg，PD;AdoptiveTcelltherapyusingantigen—specificCD8+Tcellclonesforthetreatmentofpatientswithmetastaticmelanoma:invivopersistence,migration,andantitumoreffectoftransferredTcells,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，2002，99，16168—16173;Dudley，ME，Wunderlich，JR，Yang，JC，Sherry,RM，Topalian，SL，Restifo，NP，Royal，RE，Kammula，U，White,DE，Mav麗kakis，SA，Rogers,LJ，Gracia，GJ，Jones，SA，Mangiameli，DP，Pelletier，匪，Gea—Banacloche，J，Robinson,MR，Berman，DM，F(xiàn)ilie，AC，Abati，A，andRosenberg，SA;Adoptivecelltransferther即yfollowingnon-myeloablativebutlymphod印letingchemother即yforthetreatmentofpatientswithrefractorymetastaticmelanoma,J.Clin.Oncol.，2005，23，2346-2357);revierwedin(Gattinoni，L，Powell,DJ，Jr.，Rosenberg,SA，andRestifo，NP;Adoptiveimmunotherapyforcancer:buildingonsuccess,Nat.Rev.Immunol.，2006，6，383-393)and(Morgan,RA，Dudley,ME，W皿derlich，JR，Hughes,MS，Yang，JC，Sherry,RM，Royal，RE，Topalian,SL，Ka匪la，US，Restifo，NP，Zheng，Z，Nahvi，A，deVries，CR，Rogers—Freezer，LJ，Mavroukakis,SA，andRosenberg,SA;CancerRegressioninPatientsAfterTransferofGeneticallyEngineeredLymphocytes,Science,2006，314(5796):126-129)。本發(fā)明的任一分子(即肽、核酸、表達載體、細胞，激活CTL、T細胞受體或編碼核酸)都有益于治療疾病，其特點在于細胞逃避免疫反應(yīng)的打擊。因此，本發(fā)明的任一分子都可用作藥劑或用于制造藥劑。這種分子可單獨使用也可與本發(fā)明中的其他分子或已知分子聯(lián)合使用。藥劑優(yōu)選為一種疫苗。該疫苗可直接給到患者的受影響器官，也可全身給藥，或體外應(yīng)用到來自患者或其細胞株的細胞(隨后再將這些細胞注入到患者中)，或體外用于從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然后再將細胞重新給予患者)。如果核酸體外注入細胞，可能有益于細胞轉(zhuǎn)染，以共同表達免疫剌激細胞因子(如白細胞介素-2)。肽可完全單獨給藥，也可與免疫剌激佐劑相結(jié)合(見下文)、或與免疫剌激細胞因子聯(lián)合使用、或以適當?shù)妮斔拖到y(tǒng)給藥(例如脂質(zhì)體)。該肽也可共軛形成一種合適的載體(如鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)或甘露)到合適的載體(參閱W095/18145及Longenecker等(1993)Ann.NYAcad.Sci.690，276-291)。該肽也可進行標記、或是一種融合蛋白或是雜合分子。本發(fā)明中的肽預(yù)期會剌激CD4或CD8CTL。但是，有反向CD陽性T細胞提供幫助時，剌激更為有效。因此，對于剌激CD4CTL的MHC-II類表位，一種雜合分子的融合伙伴或片段提供了剌激CD8陽性T細胞的適當表位。另一方面，對于剌激CD8CTL的MHC-I類表位，一種雜合分子的融合伙伴或片段提供了剌激CD4陽性T細胞的適當表位。CD4-和CD8剌激表位為本領(lǐng)域所熟知、并包括本發(fā)明中確定的表位。本發(fā)明的一方面，疫苗包括至少一個肽，優(yōu)選為2至50個、更優(yōu)選為2至25個、再優(yōu)選為2至15個、最優(yōu)選為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個本發(fā)明中的肽或者其他肽。肽可能從一個或多個特定TAA獲得，并且可能與MHC-I類和/或II類分子結(jié)合。優(yōu)選情況是，當本發(fā)明的肽用于疫苗或本發(fā)明的藥劑中時，它們以鹽的形式存在(如但不局限于醋酸鹽或氯鹽)。實施例7中描述了對疫苗IMA-910(含本發(fā)明的肽)的研究，并描述了使用以鹽形式或顆粒大小存在的肽制得疫苗。多聚核苷酸可完全單獨給藥，可用合適的載體或輸送系統(tǒng)給藥。核酸可能為DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA也可能為其組合物。這種核酸的設(shè)計和引入方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，下列文獻中有其概述S.Pascolo-VaccinationwithmessengerRNAMethodsMolMed2006，127;23_40;R.Stan，JDWolchokandADCohenDNAvaccinesagainstcancerHematolOncolClinNorthAm2006，3;613_636orAMahdaviandBJMonkRecentadvancesinhumanpapillomavirusvaccinesCurrOncolRep2006，6，465-472。多核苷酸疫苗很容易制備，但這些載體誘導免疫反應(yīng)的作用模式還沒有徹底了解。合適的載體和輸送系統(tǒng)包括病毒DNA和/或RNA，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺相關(guān)病毒或含一種以上病毒元素的混合病毒的系統(tǒng)。非病毒輸送系統(tǒng)包括陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物，是DNA輸送所屬領(lǐng)域內(nèi)熟知的系統(tǒng)。也可使用物理輸送系統(tǒng)，如通過"基因槍"。肽或核酸編碼的肽可以是一種融合蛋白，例如，含剌激T細胞進行上述CDR的表位。本發(fā)明的藥劑也可能包括一種或多種佐劑。佐劑是那些非特異性地增強或加強免疫反應(yīng)的物質(zhì)(例如，通過CTL和輔助T(TH)細胞介導的對一種抗原的免疫應(yīng)答，因此被視為對本發(fā)明的藥劑有用。適合的佐劑包括(但不僅限于)1018ISS、鋁鹽、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CPG7909、CyaA、dSL頂、GM-CSF、IC30、IC31、Imiquimod、ImuFactMP321、ISPatch、ISS、ISC0MATRIX、Juvl匪ne、LipoVac、MF59、單磷酰脂A、Montanide頂S1312、MontanideISA206、MontanideISA50V、MontanideISA_51、0K_432、0M_174、0M-197-MP-EC、0NTAK、PepTel⑧載體系統(tǒng)、PLG微粒、resiquimod、SRL172、病毒顆粒和其他病毒樣顆粒、YF-17D、VEGFtr即、R848、P_葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支桿菌提取物和細菌細胞壁合成模擬物的Aquila公司的QS21剌激子，以及其他專有佐劑，如Ribi'sDetox。優(yōu)選佐劑如弗氏佐劑或GM-CSF。前面一對一些樹突狀細胞特異性免疫佐劑(如MF59)及其制備方法進行了描述(D卯uisM，MurphyTJ，HigginsD，UgozzoliM，vanNestG，0ttG，McDonaldDM;Dendriticcellsinternalizevaccineadjuvantafterintramuscularinjection;CellImmunol.1998;186(1):18-27;AllisonAC;Themodeofactionofimmunologicaladjuvants;DevBiolStand.1998;92:3-11)。也可使用細胞因子。一些細胞因子直接影響樹突狀細胞向淋巴組織遷移(如，TNF-a)，加速樹突狀細胞成熟為T淋巴細胞的有效抗原提呈細胞(如，GM-CSF、IL-l和IL-4)(美國5849589號專利，以其完整引用形式并入本文)，并充當免疫佐劑(如，IL-12)(GabrilovichDI，CunninghamHT，CarboneDP;IL_12andmutantP53p印tide-pulseddendriticcellsforthespecificimm皿other即yofcancerJImm皿otherEmphasisTumorImmunol.1996(6):414-418)。據(jù)報告，CpG免疫剌激寡核苷酸可提高佐劑在疫苗中的作用。如果沒有理論的約束，CpG寡核苷酸可通過Toll樣受體(TLR)(主要為TLR9)激活先天(非適應(yīng)性)免疫系統(tǒng)從而起作用。CpG引發(fā)的TLR9活化作用提高了對各種抗原的抗原特異性體液和細胞反應(yīng)，這些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被殺死的病毒、樹突狀細胞疫苗、自體細胞疫苗以及預(yù)防性和治療性疫苗中的多糖結(jié)合物。更重要的是，它會增強樹突狀細胞的成熟和分化，導致TH1細胞的活化增強以及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)生成加強，甚至CD4T細胞幫助的缺失。甚至有疫苗佐劑的存在也能維持TLR9活化作用誘發(fā)的TH1偏移，這些佐劑如正常促進U扁移的明礬或弗氏不完全佐劑(IFA)。CpG寡核苷酸與以下其他佐劑或配方一起制備或聯(lián)合給藥時，表現(xiàn)出更強的佐劑活性，如微粒、納米粒子、脂肪乳或類似制劑，當抗原相對較弱時，這些對誘發(fā)強反應(yīng)尤為必要。他們還能加速免疫反應(yīng)，使抗原劑量減少約兩個數(shù)量級，在有些實驗中，對不含CpG的全劑量疫苗也能產(chǎn)生類似的抗體反應(yīng)(ArthurM.Krieg，TherapeuticpotentialofToll-likereceptor9activation，NatureReviews,DrugDiscovery，5，JUNE2006,471-484)。美國6406705B1號專利對CpG寡核苷酸、非核酸佐劑和抗原結(jié)合使用促使抗原特異性免疫反應(yīng)進行了描述。市售CpGTLR9拮抗劑為Mologen公司(德國柏林)的dSLIM(雙干環(huán)免疫調(diào)節(jié)劑)，這是本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選成分。也可使用其他如TLR結(jié)合分子，如RNA結(jié)合TLR7、TLR8和/或TLR9。其他有用的佐劑例子包括(但不限于)化學修飾性CpG(如CpR、Idera)、Poly(I:C)，如AmpliGen、非CpG細菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗體，如環(huán)磷酰胺、舒尼替單抗、貝伐單抗、西樂葆、NCX-4016、西地那非、他達拉非、伐地那非、索拉非尼、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4和SC58175，這些藥物都可能有治療作用和/或充當佐劑。技術(shù)人員無需過度進行不當實驗就很容易確定本發(fā)明中有用的佐劑和添加劑的數(shù)量和濃度。優(yōu)選佐劑為dSLM、BCG、0K432、ALDARA、PeviTer和Juvlmmune。本發(fā)明的優(yōu)選藥劑為具有抗癌活性的藥劑。癌種可能是轉(zhuǎn)移癌，也可能不是轉(zhuǎn)移癌，尤其是，口腔癌、咽癌，消化道癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛門癌、呼吸道癌、乳腺癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、子宮體癌、卵巢癌、男性生殖道癌、尿道癌、骨癌、軟組織癌、卡波西肉瘤、皮膚黑色素瘤、眼黑色素瘤、非黑色素瘤眼癌、腦癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、其他內(nèi)分泌腺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤。本發(fā)明方法治療的腫瘤疾病最優(yōu)選為結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、腎癌、胃腸間質(zhì)瘤或膠質(zhì)母細胞瘤。由于本發(fā)明的肽從膠質(zhì)母細胞瘤、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺癌、腎癌或胃癌中分離而得，如果要治療的癌癥為膠質(zhì)母細胞瘤、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺癌、腎癌或胃癌，則本發(fā)明的藥劑會特別有用。本發(fā)明中的肽除了用于治療癌癥，也可用于診斷。由于肽由膠質(zhì)母細胞瘤產(chǎn)生，并且這些肽確定不在正常組織中出現(xiàn)，因此這些肽可用于診斷癌癥是否存在。含本發(fā)明肽的組織切片有助于病理師診斷癌癥。用抗體、質(zhì)譜或其它本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法檢測本發(fā)明的某些肽可使病理師判斷該組織為惡性的、炎癥還是一般病變。本發(fā)明肽的提出使得能對病變組織進行分類或進一步分成子類。對病變標本中本發(fā)明肽的檢測使得能對免疫系統(tǒng)治療方法的利益進行判斷，特別是如果T淋巴細胞已知或預(yù)計與作用機制有關(guān)。MHC表達的缺失是一種機制，充分說明了哪些受感染的惡性細胞逃避了免疫監(jiān)視。因此，本發(fā)明肽的提出表明，分析過的細胞并沒有利用這種機制。本發(fā)明的肽可用于分析對本發(fā)明肽發(fā)生的淋巴細胞反應(yīng)(如T細胞反應(yīng))，或?qū)Ρ景l(fā)明肽發(fā)生的抗體反應(yīng)，或分析本發(fā)明中與MHC分子絡(luò)合的肽。這些淋巴細胞反應(yīng)可以作為預(yù)后指標，決定是否采取進一步的治療。這些反應(yīng)也可以用作免疫療法中的替代指標，旨在以不同方式誘導淋巴細胞反應(yīng)，如接種蛋白疫苗、核酸、自體材料、淋巴細胞過繼轉(zhuǎn)移。基因治療中，對本發(fā)明肽發(fā)生的淋巴細胞反應(yīng)可以在副作用的評估中考慮。淋巴細胞反應(yīng)監(jiān)測也可能成為移植療法復(fù)查中的一種有價值的工具，如，用于檢測移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。本發(fā)明中的肽可用于生成和開發(fā)出針對MHC/肽復(fù)合物的特定抗體。這些抗體可用于治療，將毒素或放射性物質(zhì)靶向作用于病變組織。這些抗體的另一用途是為了成像之目的(如PET)將病變組織作為放射性核素的靶標。這可有助于檢測小轉(zhuǎn)移灶或確定病變組織的大小和準確位置。此外，可用這些肽在活檢樣本的基礎(chǔ)上驗證病理師對癌癥的診斷。在另一個方面，本發(fā)明涉及一個套件，包括(a)—個容器，包含上述溶液或凍干粉形式的藥物組合物；(b)可選項，第二個容器，含凍干粉劑型的稀釋劑或重組溶液；及(c)可選項，(i)使用溶液或(ii)重組和/或使用凍干粉劑型的說明書。該套件還步包括一個或多個(iii)緩沖劑，(iv)稀釋劑，(v)過濾液，(vi)針，或(v)注射器。容器優(yōu)選為瓶子、西林瓶、注射器或試管；也可為多用途容器。藥物組合優(yōu)選為凍干粉劑。本發(fā)明中的套件優(yōu)選包含一種置于合適容器中的凍干制劑以及重組和/或使用說明。適當?shù)娜萜靼?，例如瓶子、西林?如雙室瓶)、注射器(如雙室注射器)和試管。該容器可能由多種材料制成，如玻璃或塑料。優(yōu)選情況是，套件和/或容器上有說明，表明重組和/或使用的指示。例如，標簽可能表明凍干劑型重組為上述肽濃度。該標簽可進一步表明制劑用于皮下注射。存放制劑的容器可使用多用途西林瓶，使得可重復(fù)給予(例如，2-6次)重組劑型。該套件可進一步包括裝有合適稀釋劑(如碳酸氫鈉溶液)的第二個容器。稀釋液和凍干制劑混合后，重組制劑中的肽終濃度優(yōu)選為至少O.15mg/mL/肽(=3375iig)，不超過3mg/mL/肽(=1500yg)。該套件還可包括商業(yè)和用戶角度來說可取的其他材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑，過濾液、針頭、注射器和帶有使用說明書的包裝插頁。本發(fā)明中的套件可能有一個單獨的容器，其中包含本發(fā)明所述的藥物組合物制劑，該制劑可有其他成分(例如，其他化合物或及其藥物組合物)，也可無其他成分，或者每種成分都有其不同容器。優(yōu)選情況是，本發(fā)明的套件包括與本發(fā)明的一種制劑，包裝后與第二種化合物(如佐劑(例如GM-CSF)、化療藥物、天然產(chǎn)品、激素或拮抗劑、抗血管生成劑或抑制劑、凋亡誘導劑或螯合劑)或其藥物組合物聯(lián)合使用。該套件的成分可進行預(yù)絡(luò)合或每種成分在給予患者之前可放置于單獨的不同容器。該套件的成分可以是一種或多種溶液，優(yōu)選為水溶液，更優(yōu)選為無菌水溶液。該套件的成分也可為固體形式，加入合適的溶劑后轉(zhuǎn)換為液體，最好放置于另一個不同的容器中。治療套件的容器可能為西林瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器、或任何其他指裝載固體或液體的工具。通常，當成分不只一種時，套件將包含第二個西林瓶或其他容器，使之可以單獨定量。該套件還可能包含另一個裝載藥用液體的容器。優(yōu)選情況是，治療套件將包含一個設(shè)備(如，一個或多個針頭、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本發(fā)明的藥物(本套件的組合物)。本發(fā)明的藥物配方適合以任何可接受的途徑進行肽給藥，如口服(腸道)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)，靜脈或經(jīng)皮給藥。優(yōu)選為皮下給藥，最優(yōu)選為皮內(nèi)給藥，也可通過輸液泵給藥。為了本發(fā)明之目的，所有參考文獻均以完整引用的形式并入本文。實施例1.合成與結(jié)構(gòu)肽通過使用Fmoc化學以標準、廣為接受的固相合成法合成。制備液HPLC純化之后，進行離子交換純化程序從而加入生理相容性反離子(醋酸或氯化物)。最后，在凍干后制得白色至類白色固體。在制造過程中由于技術(shù)原因IMA-CCN-001以氯化鹽形式存在之外，其它所有TUMAP都作為醋酸鹽給藥。2.細胞表面提呈的腫瘤相關(guān)肽(TUMAP)的識別組織樣本患者腫瘤組織和健康組織由幾個不同的臨床試驗點提供(見下表)。所有患者在手術(shù)前都獲得了書面知情同意。手術(shù)后立即用液態(tài)氮對組織進行冷休克處理，在分離TUMAP前儲存于-8(TC下。從組織樣本中分離HLA肽根據(jù)方案略加修改，使用HLA-A*02特異性抗體BB7.2或HLA-A、-B、-C特異性抗體怖/32、CNBr活化的瓊脂糖凝膠、酸處理和超濾方法以固體組織的免疫沉淀法獲得了冷休克組織樣本的HLA肽庫(Falk，K.，Rotzschke，0.，Stevanovic，S.，Jung，G.andRammensee，H.G.Allele—specificmotifsrevealedbysequencingofself—p印tideselutedfromMHCmolecules.Nature351，290-296(1991);Seeger，F(xiàn).H.etal.TheHLA_A*6601peptidemotif-predictionbypocketstructureandverificationbypeptideanalysis.Imm皿ogenetics49,571-576(1999))。用電噴霧-液相色譜質(zhì)譜(ESI-LCMS)檢測TUMAP獲得HLA肽庫根據(jù)其疏水性用反相色譜(C即LC，Waters)分離，洗脫肽用裝備電噴霧源的四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(Q-TOFUltima,Waters)進行了分析。肽庫被載到C18預(yù)處理柱進行濃縮和脫鹽。載入后，C18預(yù)處理柱排成一行，用填充5mC18反相材料(Dionex)的熔煉石英微毛細管柱(75ym內(nèi)徑X250mm)進行分離。溶劑A為4mM醋酸銨/水。溶劑B為2M濃度為80X乙腈/水中的醋酸銨。這兩種溶劑均用甲酸將pH值調(diào)整為3.0。對15%至60%的溶劑B在90分鐘內(nèi)進行二元梯度色譜法分析，分流系統(tǒng)將應(yīng)用流量從5iU/min降低至200nl/min。金鍍膜玻璃毛細管(PicoTip，NewObjective)用于引入到微電噴霧源。T0F分析儀的積分時間為1.9秒，掃描間延遲時間為0.l秒。隨后，用碰撞誘導解離(CID)質(zhì)譜(ESI-LCMS/MS)揭示肽序列。生成的天然TUMAP的片段模式與合成序列相同參考肽的片段模式進行比較后，確保了識別TUMAP的序列。圖1和圖2顯示了從腫瘤組織中腿C-I類相關(guān)TUMAP(圖la_lh)和腿C-II類相關(guān)TUMAP(圖2a-2f)的典型表達譜。3.編碼本發(fā)明肽的基因的表達譜確定為由MHC分子提呈于腫瘤細胞表面的肽有可能能夠誘導對其來源組織識別有高特異性的T細胞。為了最大限度地降低這些肽接種所誘導的自身免疫的風險，發(fā)明人主要采用從過量表達于腫瘤細胞上(與大多數(shù)正常組織相比)的蛋白中所獲得的肽。理想的肽來源于對該腫瘤獨一無二且不出現(xiàn)于其他組織中的蛋白中。為了確定來源于理想表達基因中的肽，確定的肽被分別分配到蛋白和基因中，從中獲得基因并生成基因表達譜。RNA來源與制備手術(shù)切除組織標本由幾個不同的臨床中心(參見表2)在獲得每名患者的書面知情同意后提供。手術(shù)后立即在液態(tài)氮中速凍腫瘤組織標本，之后在液態(tài)氮中用杵臼勻漿。使用TRIzol(Invitrogen公司，Karlsruhe,德國)，再接著用RNeasy(QIAGEN公司，Hilden，德國)進行清理，從這些樣本中制備總RNA;這兩種方法都按制造商的方案進行應(yīng)用。健康人體組織中的總RNA從商業(yè)途徑獲得(Ambion公司，Huntingdon,英國；Clontech公司，海德堡，德國；Stratagene公司，阿姆斯特丹，荷蘭；BioChain公司，Hayward，CA，美國)。混合數(shù)個人(2至123個人)的RNA，從而使每個人的RNA得到等加權(quán)。白細胞從4個健康志愿者的血液樣本中分離獲得。所有RNA樣本的質(zhì)量和數(shù)量都在Agilent2100Bioanalyzer分析儀(Agilent公司，Waldbronn，德國)上使用RNA6000PicoLabChipKit試劑盒(Agilent公司)進行評估。微陣列實驗所有腫瘤和正常組織的RNA樣本都使用AffymetrixHumanGenome(HG)U133A或HG-U133Plus2.OAffymetrix寡核苷酸芯片(Affymetrix公司，SantaClara，CA，美國)進行基因表達分析。所有步驟都根據(jù)Affymetrix手冊進行(http:〃麗w.affymetrix.com/support/technical/maruml/expressionmamml.affx)。簡言之，如手冊中所述，35使用SuperscriptRTII(Invitrogen公司)以及oligo-dT_T7引物(麗GBiotech公司，Ebersberg，德國)從5-8iigRNA中合成雙鏈cDNA。用BioArrayHighYieldRNATranscriptLabellingKit(ENZODiagnostics公司，F(xiàn)armingdale，NY，美國)進行U133A測定或用GeneChipIVTLabellingKit(Affymetrix公司)進行U133Plus2.0測定，之后用鏈霉親和素-藻紅蛋白和生物素化抗鏈霉素蛋白抗體(MolecularProbes公司，Leiden，荷蘭)進行破碎、雜交和染色，這樣完成體外轉(zhuǎn)錄。用Agilent2500AGeneArrayScanner(U133A)或AffymetrixGene-ChipScanner3000(U133Plus2.0)對圖像進行掃描，用GC0S軟件(Affymetrix公司)在所有參數(shù)默認設(shè)置情況下對數(shù)據(jù)進行分析。為了實現(xiàn)標準化，使用了Affymetrix公司提供的100種管家基因(houseke印inggene)(http:〃www.affymetrix.com/support/technical/mask_files.affx)。相對表達值用軟件給定的signallogratio進行計算，正常樣本的值任意設(shè)置為1.0。本發(fā)明所有肽的表達譜顯示，每種基因在腫瘤組織中呈高表達，而在正常組織中不表達或表達很低。圖3顯示了膠質(zhì)母細胞瘤特異性肽PTP-001(基因PTPRZl，圖3a)和CHI-001(基因CH3L2，圖3b)的基因表達譜。4.用電噴霧-液相色譜質(zhì)譜(ESI-LCMS)再檢測其他腫瘤樣本中的TUMAP用實施例1中的方法確定的TUMAP用質(zhì)譜法在結(jié)直腸癌樣本上進行了系統(tǒng)搜索。獲得HLA肽庫根據(jù)其疏水性用反相色譜(C即LC，Waters)分離，洗脫肽用裝備電噴霧源的四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(Q-T0FUltima,Waters)進行了分析。肽庫被載到C18預(yù)處理柱進行濃縮和脫鹽。載入后，C18預(yù)處理柱排成一行，用填充5iimC18反相材料(Dionex)的熔煉石英微毛細管柱(75ym內(nèi)徑X250mm)進行分離。溶劑A為4mM醋酸銨/水。溶劑B為2M濃度為80X乙腈/水中的醋酸銨。這兩種溶劑均用甲酸將pH值調(diào)整為3.0。對15%至60%的溶劑B在90分鐘內(nèi)進行二元梯度色譜法分析，分流系統(tǒng)將應(yīng)用流量從5iU/min降低至200nl/min。金鍍膜玻璃毛細管(PicoTip，NewObjective)用于引入到微電噴霧源。TOF分析儀的積分時間為1.9秒，掃描間延遲時間為0.l秒。對于已定義肽的檢測，根據(jù)已知分子量和肽在色譜系統(tǒng)中的停留時間，在ESI-LCMS實驗中進行了高靈敏度篩選。因此，在選擇前體中，應(yīng)用一個數(shù)據(jù)清單，其中含先前確定的肽(單電荷和/或雙電荷)的m/z值。隨后，用碰撞誘導解離(CID)質(zhì)譜(ESI-LCMS/MS)揭示序列。生成的天然TUMAP的片段模式與合成序列相同參考肽的片段模式進行比較后，確認了TUMP的序列。使用企業(yè)內(nèi)標準_豐富內(nèi)源性HLA-A*02肽(從DDX5獲得的YLLPAIVHI)的強度和存留時間，評價了HLA純化產(chǎn)量和分析系統(tǒng)的可復(fù)制性，包括保留時間的穩(wěn)定性。因此，這些實驗中為了檢測先前確認的TUMAP所用的結(jié)直腸癌樣本納入標準在LCMS/MS實驗中(企業(yè)內(nèi)標雙電荷信號，YLLPAIVHI)每次掃描的最小強度設(shè)定為650次，以確保成功分離HLA肽以及分析系統(tǒng)的性能。表2顯示了不同階段結(jié)腸和直腸癌樣本以及源自這兩種原發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移癌的分析結(jié)果。大部分樣本中都發(fā)現(xiàn)了所有HLA-A柳2TUMAP。HLA-DRTUMAP—般很少需要再次檢測。這是因為每個核心序列都可能存在HLA-II類肽、幾種長度可變的變體。0DC-001作為陽性對照物，它是一種先前確定的TUMAP(MDiehl，博士論文1998年，Tuebingen大學)并已知在很多結(jié)腸腫瘤中提呈。表2重新檢測結(jié)直腸癌樣本中的TUMAP<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>n.a.:未作分析5.HLA-I類限制肽與HLA_A*0201結(jié)合根據(jù)Sylvester-Hvid提出的方法(Sylvester-Hvid，C，Kristensen，N，Blicher，T，F(xiàn)erre，H，Lauemoller，SL，Wolf，XA，Lamberth，K，Nissen，MH，Pedersen，L0，andB皿s，S5Esteblishment0faquantitativeELISAcapableofdeterminingp印tide—MHCclassIinteraction,TissueAntigens,2002，59，251-258)以及制造商的ELISAEplKit手冊，使用ELISAEplKit(從丹麥哥本哈根大學醫(yī)學微生物學及免疫學研究所SoerenB皿s處獲得)對HLA結(jié)合力進行測定。制備肽溶液肽溶解于濃度為10mg/ml的DMS0+0.5%TFA溶液(Merck公司，Darmstadt,德國)中。本次測定中所用的肽最高濃度為200yM，因此，儲備溶液在肽稀釋緩沖液(含0.1%Lutrol-F68和10mg/l酚紅的PBS)中按1:50的比例稀釋，終溶液為100yl。用肽稀釋緩沖液進行5倍系列稀釋。HLA-A柳201/肽復(fù)合物的重折疊根據(jù)手冊，用PBS溶液混合3倍pH緩沖液(pH6.6)、Lutrol-F68、人P2m、重組HLA-A*0201(所有都包含于ELISAEplKit)，制備2倍濃縮的HLA_A*0201溶液。對于重折疊過程，在96孔板(Nunc公司，RochesterNY，美國)中混合15肽系列稀釋液和15ill的2倍濃縮MHC混合液并在18t:下培養(yǎng)48小時。用ELISA法定量分析復(fù)合物用包被緩沖液(pH9.6)中的5iig/mlw6/32抗體包被Maxisorp板(Nunc公司，Rochester,NY)，在4"C下培養(yǎng)24小時，并用PBS溶液中的5%脫脂奶粉(Merck公司，Darmstadt,德國)在4。C下封閉過夜。用PBS(SMP/PBS)中的2X脫脂奶粉將MHC復(fù)合標準液(ELISAEplKit)的濃度稀釋為10nM。配制3.16倍系列稀釋液，并轉(zhuǎn)移到被包被和封閉的Maxisorp板中。用2%SMP/PBS將肽-MHC復(fù)合物稀釋10倍，然后轉(zhuǎn)到同一個Maxisorp板中，并在fC下培養(yǎng)2小時。將兔抗-hP2m抗體(ELISAEplKit)加入到2%SMP/PBS中，按1:2500比例稀釋，并在fC下培養(yǎng)1小時。擴增緩沖液(HRP偶聯(lián)的羊抗兔聚合物)和小鼠血清(兩者均由ELISAEpIKit提供)在2%SMP/PBS中稀釋，然后加入板中，在室溫下培養(yǎng)30分鐘。加入顯色緩沖液(四甲基聯(lián)苯胺，TMB;ELISAEplKit)增加了，顯色板在室溫下避光培養(yǎng)30分鐘。加入0.2M硫酸(VWR公司，Darmstadt,德國)，停止反應(yīng)。使用VERSAmaxELISA-Reader閱讀器(MolecularDevices公司，Sunnyvale,CA，美國)在0D450nm條件下讀板。數(shù)據(jù)用Excel和Prism取Gr即hpad3.0解讀。結(jié)果如圖4所示。較低的KD值反映了對HLA-A柳201較高的親和力。結(jié)合親和力可擴展至大約40倍的范圍，但大多數(shù)肽都具有相似的結(jié)合親和力，在10倍以內(nèi)(C20-001，0DC-001，PCN-001，T0P-001)。與大多數(shù)納入的配體相比，MUC-OOl的親和力大約低了10倍，但是用作腎癌的疫苗時，MUC-001仍能誘導T細胞反應(yīng)(Wierecky，J，Muller，MR，Wirths，S，Halder-Oehler，E，Dorfel，D，Schmidt,SM，Hantschel，M，Brugger，W，Schroder,S，Horger，MS，Kanz，L，andBrossart，P;Immunologicandclinicalresponsesaftervaccinationswithpeptide—pulseddendriticcellsinmetastaticrenalcancerpatients,CancerRes.，2006，66，5910-5918)。另一方面，N0X-001具有稍高的結(jié)合親和力和TGFBI-001是最強的結(jié)合劑，與大多數(shù)肽相比，其KD值要低IOO倍。從絕對值來看，大多數(shù)具有強結(jié)合力的肽觀察到的KD值為0.01和0.lnM之間。在成功測試的腎細胞癌疫苗IMA901包含的肽中也觀察到了相似的結(jié)合力(H.Singh-Jasuja，S.Walter,T.Weinschenk，A.Mayer，P.Y.Dietrich,M.Staehler，A.Stenzl，S.Stevanovic，H.Rammensee，J.Frisch;CorrelationofT—cellresponse,clinicalactivityandregulatoryT—celllevelsinrenalcellcarcinomapatientstreatedwithIMA901，anovelmulti-peptidevaccine;ASCOMeeting2007Poster#3017;M.Staehler，A.Stenzl，P.Y.Dietrich,T.Eisen，A.Haferkamp，J.Beck，A.Mayer，S.Walter,H.Singh，J.Frisch，C.G.Stief;Anopenlabelstudytoevaluatethesafetyandimmunogenicityofthep印tidebasedcancervaccineIMA901，ASC0meeting2007;Poster#3017).。因此，本發(fā)明中肽的結(jié)合特性與那些在體外顯示出誘導T細胞反應(yīng)的肽十分相似。386.MHC-I類提呈肽的體外免疫原性CD8+T細胞體外啟動為了用載有肽-MHC復(fù)合物(p腿C)和抗-CD28抗體的人工抗原提呈細胞(aAPC)進行體外剌激，我們首先運用標準密度梯度分離介質(zhì)(PAA公司，Cmbe,德國)從新鮮HLA-A柳2+血沉棕黃層中分離出PBMC(外周血單核細胞)。血沉棕黃層從Tubingen或KatharinenhospitalStuttgart的血庫獲得。分離出的PBMC在T細胞培養(yǎng)基(TCM)中培養(yǎng)過夜，在體外填裝，包括RPMI-Glutamax(Invitrogen公司，卡爾斯魯厄，德國)并補充10%熱滅活人AB血清(PAA公司，科爾貝，德國)，100U/ml青霉素/100yg/ml鏈霉素(Cambrex公司，韋爾維耶，比利時)，lmM丙酮酸鈉(CCPro公司，Neustadt，德國)和20iig/ml慶大霉素(Cambrex公司)。CD8+淋巴細胞根據(jù)制造商的說明使用CD8+MACS陽性選擇套件(Miltenyi公司，BergischGladbach，德國)進行分離。獲得的CD8+T細胞培養(yǎng)，直到TCM補充了2.5ng/ml的IL-7(PromoCell公司，海德堡，德國)和10U/ml的IL-2(Chiron公司，慕尼黑，德國)后才使用。pMHC/抗-CD28涂層珠的生成、T細胞的剌激和讀出方法如前所述(Walter,S，Herrgen，L，Schoor，0，Jung，G，Wernet，D，Buhring，HJ，Rammensee，HG，andStevanovic，S5Cuttir1gedge-predeterminedavidityofhumanCD8TcellsexpandedoncalibratedMHC/anti-CD28-coatedmicrospheres,J.Immunol.，2003，171，4974-4978)并作微小改動。簡言之，缺乏跨膜域和在重鏈羧基端生物素化的生物素化重組HLA-A柳201分子用以下所述方法制成(Altmanetal.(Altman，JD，Moss，PA，Goulder，PJ，Ba麗ch，DH，Heyzer-Williams，MG，Bell，JI，McMichael，AJ，andDavis，匪；Phenotypicanalysisofantigen-specificTlymphocytes,Science,1996，274，94-96)。純化的共剌激小鼠IgG2a抗人CD28抗體9.3(J皿g，G，Ledbetter，JA，andMuller-Eberhard，HJ;InductionofcytotoxicityinrestinghumanTlymphocytesboundtotumorcellsbyantibodyheteroconjugates，ProcNatlAcadSciUSA，1987，84，4611-4615)使用制造商(Perbio公司，波恩，德國)推薦的N-羥基琥珀酰亞胺生物素進行化學生物素化處理。所用珠為5.60iim的大鏈霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯顆粒(BangsLabooratories，伊利諾伊州/美國)。作為陽性和陰性對照的pMHC分別為A*0201/MLA-001(從Melan-A/MART-1中修飾制得的肽ELAGIGILTV)和A*0201/DDX5_001(從DDX5中獲得的YLLPAIVHI)或A初201/HBV-001(FLPSDFFPSV)。800.000珠/200y1包裹于96孔板，以600ng生物素抗CD28+200ng相關(guān)生物素pMHC(高密度珠)或2ng相關(guān)+200ng不相關(guān)(pMHC庫)MHC(低密度珠)存在。在37。C下，在含5ng/mlIL-12(PromoCell)的200ii1TCM中共培養(yǎng)1X106CD8+T細胞與2X105的清洗涂層珠3至4天，從而啟動剌激。之后，一半培養(yǎng)基與補充80U/mlIL-2的新鮮TCM進行交換，并且皿在37t:下持續(xù)3至4天。這種剌激性周期總共進行3次。最后，在四色流式細胞儀(BD公司)上用熒光MHC四聚體(如Altman，JD，Moss，PA，Goulder，PJ，Barouch，DH，Heyzer-Williams，MG，Bell，JI，McMichael，AJ，andDavis，匪；Phenotypicanalysisofantigen-specificTlymphocytes,Science,1996，274，94-96)+抗體CD8-FITC克隆SK1(BD公司，海德堡，德國)進行四聚體分析。肽特異性細胞以占總CD8+T細胞的百分比形式進行計算。四聚體分析結(jié)果用FCSExpress軟件(DeNovoSoftware公司)進行評估。特定四聚體+CD8+淋巴細胞的體外填裝用適當?shù)拈T控技術(shù)以及與陰性對照剌激組比較而進行檢測。如果健康供體中的至少一個可評價的體外剌激孔在體外剌激后發(fā)現(xiàn)含有特異性CD8+T細胞株(即該孔包含至少lX特定四聚體+CD8+f細胞，并且特定四聚體+的百分比至少為陰性對照剌激中位數(shù)的10倍)，則檢測給定抗原的免疫原性。本發(fā)明中的肽連同要與之比較的具有已知免疫原性的肽一起測試。代表性染色顯示了N0X-001和0DC-001特異性T細胞的生成，如圖5所示。結(jié)果總結(jié)見表3。表3:與疫苗肽比較，本發(fā)明肽的體外免疫原性<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表3a:本發(fā)明肽的免疫原性<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>發(fā)明人所做的體外免疫原性結(jié)果總結(jié)如上。所示結(jié)果通過剌激高密度珠CD8+細胞而獲得。由于不同批次的血清可能會大大影響免疫原性的結(jié)果，所以只評價了那些只使用同一批次血清的化驗結(jié)果。7.MHC-II類提呈肽的體外免疫原性輔助T細胞在協(xié)助CTL激活和維持腫瘤細胞的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。因此，MHC-II類肽被列入IMA910。TGFBI-004是IMA910中三個II類肽之一，對其體外免疫原性潛力進行了檢測，結(jié)果證明它既是特異性CD4+T細胞也是CD8+T細胞的一種誘導物。使用自體系統(tǒng)剌激的實驗顯示生成了CD4+和功能性CD8+T淋巴細胞。測試原理特異性人CD4+和CD8+細胞的啟動和擴增使用自體DC、通過單核細胞缺乏的PBMC啟動以及使用自體PBMC進行重新剌激而進行體外檢測。簡言之，為了生成抗原特異性CD4+T細胞，健康供體的單核細胞缺乏的PBMC(HLA基因型I類A1/A25/B8/B18和II類DQB1*02/DQB1*06/DRB1*03/DRB1*15/DRB3/DRB)使用肽脈沖擊自體DC進行了剌激并且使用了自體PBMC+肽進行了再剌激。作為一個讀出系統(tǒng)，短期重剌激后的IFNy產(chǎn)量用ELISPOT和流式細胞術(shù)進行了評估。在ELISPOT和細胞內(nèi)IFNy染色+CD4-FITC和CD8-PerCPT剌激8次之后，對T細胞進行了分析以確定特異性T細胞亞群中產(chǎn)生IFNy細胞的百分比。在本實驗中，對不同孔中的TGFBI-004所剌激的細胞，進行匯集、使用讀出的不相關(guān)肽進行培養(yǎng)并作為陰性對照。樹突狀細胞(DC)的生成人DC從DC培養(yǎng)基中培養(yǎng)的單核細胞獲得，培養(yǎng)基包括RPMI1640-Glutamax/25mMH印es(Invitrogen公司，德國)禾P10%自體血槳〃100U/ml青霉素和100iig/ml鏈霉素。首先，血沉棕黃層和血漿經(jīng)離心健康供體血液而獲得(Tubingen血庫)。然后，PBMC使用標準密度梯度分離法(淋巴細胞分離液，PAA公司，奧地利)從血沉棕黃層中分離，并在DC培養(yǎng)液中懸浮以確定總細胞數(shù)。洗滌100-120MioPBMC，在15mlX-Vivo20培養(yǎng)基(BioWhittaker公司，比利時)中重新懸浮，并轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶。在37。C下待2小時后，含外周血白細胞(PBL)的培養(yǎng)液被清除，粘附單核細胞用10mlPBS洗滌兩次并在用100ng/mlGM-CSF和30ng/mlIL—4(I匪noTools公司，德國)或20ng/ml(R&Dsystems公司，德國)在10mlDC培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天。在第3天和第5天，加入100ng/mlGM-CSF和30ng/mlIL-4(Immunotools公司)或20ng/mlIL-4(R&DSystems公司，德國)。第7天，未成熟的DC用10ng/mlTNF-a(R&DSystems公司，德國)和20iig/ml多聚(IC)(SigmaAldrich公司，德國)或lOOng/mlLPS剌激24小時。其余的PBMC以及獲得的PBL進行等分和冷凍。特異性T細胞體外啟動為了生成CD4+T細胞，用2X105自體DC對3百萬PBMC/PBL進行剌激。DC在第8天收集(參見第3.1章，"DC的生成")。含5mM乙二胺四乙酸的PBS用于獲得盡可能多細胞之目的(包括粘附細胞)。DC培養(yǎng)液洗滌后，確定細胞數(shù)。為了裝載肽，DC在lmlDC培養(yǎng)液中再懸浮并用25iig/ml肽在37。C下培養(yǎng))、Padre和CMV。解凍自體PBMC/PBL、用DC培養(yǎng)液洗滌(至少兩次)并在24孔板中展開，密度為1ml中3Mio細胞/ml。然后，將載有肽的DC加入(如含肽的1ml懸浮液)到入板的PBMC/PBL并在37。C下培養(yǎng)7天。啟動后，首先用已接受照射(30Gy;GammacelllOOOElite照射儀，NordionInternational公司，加拿大)。為此目的，每孔加入5X105CTL和2、5X1()6PBMC。使用肽對PBMC進行沖擊如前所述(針對DC的方法)。第一次重新剌激的第1天，加入IL-2(R&DSystems公司，德國)和IL-7使最終濃度分別為2ng/ml和5ng/ml。此后，在每個第2天和第7天，向培養(yǎng)液加入IL-2和IL-7。7天后進行第二次重新剌激，但這次只向培養(yǎng)的CTL加入肽(不加入PBMC)。重剌激7天為一周期用負載肽的PBMC和單肽交替加入。在第8次剌激之后，用細胞內(nèi)IFNy和IFNyELISPOT法進行分析。結(jié)果啟動對相關(guān)肽特異性反應(yīng)的CD4+T細胞株是可能的(圖6和圖3)?？赏ㄟ^ELISPOT法在4個細胞株中檢測到其中2個有T細胞反應(yīng)，而使用ICS法的檢測結(jié)果表明，有四分之三的T細胞株TGFBI-004特異性IFNy產(chǎn)生CD4+和/或CD8+細胞。因此，用上述實驗系統(tǒng)的測試中，TGFBI-004能引發(fā)供體的CD4+和CD8+T細胞反應(yīng)。根據(jù)這一有前景的結(jié)果，很可能這種肽具有免疫原性，并有能力誘導T細胞反應(yīng)。8.NOX-001和TGFBI-001功能驗證舉例IMA910疫苗中所含肽的免疫原性使用immatics—TUMAP驗證平臺(immaticsbiotechnologies公司，Tubingen,德國)進行了論證。對特異性T細胞的誘導說明了肽有能力成功地成功激活免疫系統(tǒng)。由于只有激活的T細胞具有高親合力和功能性時才有可能發(fā)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，因此，我們通過檢測其產(chǎn)生IFNy或殺死腫瘤細胞株的能力從而研究了TUMAP啟動其高親合力和功能性T淋巴細胞的能力。由于NOX-001和TGFBI-OOl能體外誘導CTL的高親合力，因此選擇這兩種肽進行深入驗證。結(jié)果證明，高親合力前體T細胞對人體肽和NOX-001能產(chǎn)生的CD8+T細胞株都有作用。測試原理為了對IMA910肽免疫原性和特異性T細胞的特性更加深入的認識，選定NOX-001和TGFBI-OOl這兩種肽作進一步的評估。為此目的，在immaticsbiotechnologies公司(TUbingen，德國)進行了實驗(細胞分選在Tubingen大學的Dr.B他ring實驗室進行)。T細胞株依據(jù)其被高密度或低密度抗原激活的能力大小，可分為高或低親合力T細胞株。如先前研究所示，(Walter,S，Herrgen，L，Schoor，0，Jung，G，Wernet，D，Buhring，HJ，Rammensee，HG，andStevanovic，S;Cuttingedge-predeterminedavidityofhuman42CD8TcellsexpandedoncalibratedMHC/anti_CD28_coatedmicrospheres,J.Immunol.,2003，171,4974-4978)，與低親合力CD8+T細胞相比，人高親合力CTL可使用較少肽進行激活而成功獲得。研究還表明，細胞以這種方式擴增可更有效地識別抗原表達細胞株，從而構(gòu)成了開發(fā)治療策略的一個可能的主要工具。為了確定肽生成高親合力CTL株的能力，用含低密度pMHC(肽-MHC-復(fù)合體)涂層珠和含IL-12與IL-2的抗-CD28抗體對分離出來的人CD8+細胞進行反復(fù)剌激從而使之啟動和擴增。經(jīng)過三次剌激后，激活T細胞的一部分以四聚體染色和流式細胞術(shù)法檢測。之后，根據(jù)其抗原特異性，對每個供體的四聚體陽性細胞進行儲存，以PMHC-四聚體和人抗CD8-FITC抗體進行染色，最后在FACSAria上進行FACSA分類。分類過的細胞在照射過的飼養(yǎng)細胞、細胞因子及絲裂素中培養(yǎng)和擴增。為了讀出高親合力抗原特異性細胞的生成情況，進行四聚體法染色。為了確定它們的功能，在以相應(yīng)的肽和腫瘤細胞株重剌激這些細胞后，用ELISPOT法測定IFNy的產(chǎn)量，并在死/活細胞染色的基礎(chǔ)上，使用細胞毒性測定法檢查腫細胞株的殺傷情況。特異性CD8+T細胞株的生成如上所述，我們應(yīng)用載有肽-MHC復(fù)合體(pMHC)和抗-CD28抗體的人工剌激抗原提呈細胞(aAPC)進行了體外剌激。與上述方法唯一的區(qū)別就是進行剌激用的珠裝載有2ng相關(guān)+200ng不相關(guān)庫內(nèi)(pMHC)MHC(低密度珠)，而不是200ng相關(guān)MHC(高密度珠)。因此，高親合力T細胞的產(chǎn)生主要是為了對肽進行更深入的驗證。經(jīng)過三次剌激后，激活T細胞的一部分以四聚體染色和流式細胞術(shù)法檢測。如果健康供體中的至少一個可評價的體外剌激孔在體外剌激后發(fā)現(xiàn)含有特異性CD8+T細胞株(即該孔包含至少1%特定四聚體+CD8+f細胞，并且特定四聚體+的百分比至少為陰性對照剌激中位數(shù)的10倍)，則檢測給定抗原的免疫原性。之后，根據(jù)其抗原特異性，對每個供體的四聚體陽性細胞進行儲存，以相應(yīng)的P腿C-四聚體和人抗CD8-FITC抗體克隆SKI進行染色，最后在FACSAria(BDBiosciences公司，德國)上進行FACSA分類。分類過的細胞在含有5X105細胞/ml照射過的新鮮異源PBMC、5X104細胞/ml照射過的LG2-EBV細胞、150U/mlIL-2(Chiron公司，慕尼黑，德國)和0.5iig/mlPHA-L(RocheDiagnostics公司，Mannheim,德國)的T細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)(培養(yǎng)基為RPMI-Glutamax，補充有10%熱滅活人AB血清、100U/ml青霉素、100iig/ml鏈霉素、ImM丙酮酸鈉和20yg/ml慶大霉素)。這些細胞在含150U/mlIL_2的T細胞培養(yǎng)基中擴展。為了讀出高親合力抗原特異性細胞的生成情況，如前述方法進行四聚體法染色并在四色FACSCalibur上進行了分析(BDBiosciences公司，德國)。功能性測試為了確定它們的功能，在以相應(yīng)的肽重剌激這些細胞后，用ELISPOT法(IFNyELISPOTSet,BD公司，德國)評估IFNy的產(chǎn)量。此外，細胞介導的特異性CTL的細胞毒性使用LIVE/DEAD(死/活)細胞介導的細胞毒性套件(L7010,Invitrogen公司，德國)殺死腫瘤細胞株而進行了研究。除非另有說明，否則上述兩種測定方法都根據(jù)制造商的指示進行。結(jié)果用低密度pMHCaAPC成功啟動后顯示，NOX-001和TGFBI-001這兩種肽具有體外免疫原性。對于NOX-001以及TGFBI-001特異性T細胞株可以用FACS建立，從而證明高親43合力CD8+T細胞前體存在于健康供體中。此外，對于N0X-001，可確定一個T細胞株，ELISP0T法也證明了其功能，因為在用這種肽重剌激后，NOX-001特異性表達IFNy(圖8)。9.將本發(fā)明中的HLA-I類限制肽與HLA_A*0201結(jié)合本分析的目的是評價HLA-I類肽CHI-OOl、DCA-OOl、JAK-001和PTP-001對HLA-A*0201等位基因編碼的MHC分子的親和力。所有的肽對HLA_A*0201的親和性都可與大家熟知的對照肽HBV-OOl進行比較，解離常數(shù)(KD)范圍為0.05到1.6nM。測試原理穩(wěn)定HLA/肽復(fù)合物包括三種分子HLA重鏈、P_2微球蛋白(b2m)和肽類配體。變性重組HLA-A*0201重鏈分子的活性便可進行保存，使之功能與"空載HLA-A*±0201"相當。被稀釋為包含b2m和相應(yīng)肽的水緩沖液后，這些分子以完全肽依賴方式迅速有效地折疊。這些可用的分子用于基于ELISA的檢測方法中，來衡量肽和HLA-I類分子相互作用間的親禾卩力(Sylvester-HvidC，KristensenN，BlicherT，F(xiàn)erreH，LauemollerSL，WolfXA，LamberthK，NissenMH，PedersenL0，B皿sS.EstablishmentofaquantitativeELISAcapableofdeterminingp印tide—MHCclassIinteraction.TissueAntigens2002,59，251-258)。純化的重組HLA_A*0201分子與b2m、不同等級劑量的肽一起培養(yǎng)。從頭折疊HLA/肽復(fù)合物的量用定量ELISA法測定。解離常數(shù)(KD值)使用從校準HLA/肽復(fù)合物稀釋液中記錄的標準曲線進行計算。結(jié)果結(jié)果如圖9所示。較低的KD值反映了HLA-A柳201具有較高的親和力。所有的肽對HLA-A柳201的親和性都可與大家熟知的對照肽HBV-001進行比較，解離常數(shù)(KD)范圍為0.05到1.6nM。4權(quán)利要求一種肽，其包括選自SEQIDNo.1至SEQIDNo.29群組的一個序列、或與SEQIDNo.1至SEQIDNo.29具有80％同源性的其變體、或誘導與該肽發(fā)生T細胞交叉反應(yīng)的一個變體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中該肽總長度為8至100個氨基酸、優(yōu)選為8至30個氨基酸，最優(yōu)選為8至16個氨基酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項中所述的肽，其具有與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I或II類分子結(jié)合的能力。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項中所述的肽，其中該肽系由或基本系由根據(jù)SEQIDNOl至SEQIDNO29所選的氨基酸序列組成。5.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項中所述的肽，其中該肽被修飾或包含非肽鍵。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項中所述的肽，其中該肽為融合蛋白，特別是含HLA-DR抗原相關(guān)不變鏈(Ii)的N-端氨基酸。7.—種核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項中所述的肽。8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的核酸，其可能為DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA，也可能為其組合物。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8中所述的一種能表達核酸的表達載體。10.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項中所述的一種肽、根據(jù)權(quán)利要求7或8任一項中所述的一種核酸、或根據(jù)權(quán)利要求9中所述的一種表達載體。11.根據(jù)權(quán)利要求7或8中所述的一種宿主細胞或根據(jù)權(quán)利要求9中所述的一種表達載體。12.根據(jù)權(quán)利要求ll中所述的宿主細胞，該宿主細胞為抗原提呈細胞，尤其是樹突狀細胞或抗原提呈細胞。13.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項中所述的一種制備肽的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求11中所述的培養(yǎng)宿主細胞，從宿主細胞或其培養(yǎng)基中分離出肽。14.一種體外制備激活的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法，該方法包括將CTL與載有抗原的人I或II類MHC分子進行體外連接，這些分子在合適的抗原提呈細胞表面表達足夠的一段時間從而以抗原特異性方式激活CTL，其中所述抗原為權(quán)利要求1至6任一項中所述的肽。15.根據(jù)權(quán)利要求14中所述的方法，其中抗原通過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結(jié)合被載入表達于合適抗原提呈細胞表面的I或II類MHC分子。16.根據(jù)權(quán)利要求14中所述的方法，其中該抗原提呈細胞包括一個表達載體，該載體有能力表達含SEQIDN01至SEQIDNO29的肽或所述變體氨基酸序列。17.根據(jù)權(quán)利要求14至16任一項中所述的按其方法制成的激活細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，該淋巴細胞會有選擇性地識別一種細胞，該細胞異常表達含權(quán)利要求1至4任一項中給定氨基酸序列的多肽。18.—種殺滅患者中靶向細胞的方法，其中靶向細胞異常表達一種多肽，該多肽含權(quán)利要求1至4任一項中給定的氨基酸序列；一種給藥方法，其中包括給予患者權(quán)利要求14至17任一項中定義的有效量細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。19.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項中所述的一種肽的用途、根據(jù)權(quán)利要求7至8中所述的一種核酸的用途、根據(jù)權(quán)利要求9中所述的一種表達載體的用途、根據(jù)權(quán)利要求11或12中所述的一種細胞的用途、根據(jù)權(quán)利要求17中所述的一種作為藥劑或制造藥劑的激活細胞毒性T淋巴細胞的用途。20.根據(jù)權(quán)利要求19中所述的用途，其中藥劑系指一種疫苗。21.根據(jù)權(quán)利要求19或20中所述的用途，其中藥劑有抗癌活性。22.根據(jù)權(quán)利要求21中所述的用途，其中所述癌細胞為膠質(zhì)母細胞瘤細胞、結(jié)直腸癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、腎癌細胞或胃癌細胞。全文摘要本發(fā)明涉及可與任一類MHC復(fù)合物相結(jié)合且引發(fā)免疫反應(yīng)的腫瘤相關(guān)抗原衍生肽的氨基酸序列，以及該肽在治療疾病中的用途。文檔編號A61K39/00GK101765610SQ200880100806公開日2010年6月30日申請日期2008年7月25日優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日發(fā)明者克勞迪婭·特勞特溫,哈普利特·辛格,奧利弗·斯庫爾,彼得·萊溫德洛斯基,托尼·溫斯切尼克,斯特芬·沃爾特,諾伯特·希勒夫申請人:伊瑪提克斯生物技術(shù)有限公司